TY - THES A1 - Dabas, Neelam T1 - Control of Nitrogen Regulated Virulence Traits of the Human Fungal Pathogen Candida albicans T1 - Steuerung von stickstoffregulierten Virulenzeigenschaften des human-pathogenen Pilzes Candida albicans N2 - Der Hefepilz Candida albicans ist ein harmloser Kommensale auf den Schleimhäuten des Gastrointestinal- und Urogenitaltrakts der meisten gesunden Menschen. Bei einer Störung der natürlichen Mikroflora oder des Wirtsimmunsystems kann der Pilz jedoch auch oberflächliche und sogar systemische Infektionen verursachen. C. albicans weist eine Reihe von Eigenschaften auf, die zur Virulenz des Erregers beitragen. Dazu gehören die Adhärenz an unterschiedliche Wirtsoberflächen, die morphologische Variabilität des Pilzes und die Sekretion von Aspartatproteasen. Die Expression vieler dieser Virulenzfaktoren wird unter anderem durch die Verfügbarkeit von Stickstoff reguliert. Unter Stickstoffmangelbedingungen wechselt C. albicans vom Wachstum als sprossende Hefe zum filamentösen Wachstum, und dieser Wechsel wird durch die Ammoniumpermease Mep2p reguliert. Wie die Induktion des filamentösen Wachstums durch Mep2p kontrolliert wird, ist jedoch weitgehend unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Mutationsanalyse von Mep2p durchgeführt, um Aminosäuren zu identifizieren, die an der Signalfunktion dieser Permease beteiligt sind. Die C-terminale cytoplasmatische Domäne von Mep2p wird für den Ammoniumtransport nicht benötigt, ist jedoch essentiell für die Signaltransduktion. Progressive C-terminale Verkürzungen von Mep2p zeigten, dass ein MEP2DC433-Allel immer noch in der Lage war, das filamentöse Wachstum zu induzieren, wohingegen die Deletion einer weiteren Aminosäure die Morphogenese blockierte. Das Tyrosin an Position 433 (Y433) ist deshalb die letzte Aminosäure, die für die Signalfunktion von Mep2p essentiell ist. Um besser zu verstehen, wie die Signalaktivität von Mep2p durch die Verfügbarkeit und den Transport von Ammonium reguliert wird, wurden verschiedene hochkonservierte Aminosäuren mutiert, die vermutlich an der Bindung oder dem Transport von Ammonium in die Zelle beteiligt sind. Die Mutation von D180, von dem postuliert wurde, dass es den initialen Kontakt mit extrazellulärem Ammonium ermöglicht, oder der im Transportkanal lokalisierten Histidine H188 und H342 hatte zur Folge, dass Mep2p nicht mehr exprimiert wurde, so dass diese Aminosäuren vermutlich für die Proteinstabilität wichtig sind. Die Mutation von F239, das zusammen mit F126 eine extracytosolische Pforte zur Transportpore bildet, verhinderte trotz korrekter Membranlokalisation sowohl den Ammoniumtransport als auch das filamentöse Wachstum. Allerdings führte auch die Mutation von W167, das vermutlich zusammen mit Y122, F126 und S243 an der Rekrutierung des Ammoniumions an der extrazellulären Seite der Membran beteiligt ist, zur Blockierung des filamentösen Wachstums, obwohl der Ammoniumtransport kaum beeinflusst war. Dies zeigte, dass die intrazelluäre Signaltransduktion durch extrazelluläre Veränderungen in Mep2p beeinflusst werden kann. Die Mutation von Y122 reduzierte die Ammoniumaufnahme weitaus starker als die Mutation von W167, erlaubte jedoch immer noch ein effizientes filamentöses Wachstum. Die Signalaktivität von Mep2p ist deshalb offensichtlich nicht direkt mit der Transportaktivität des Proteins korreliert. Ein wichtiger Aspekt in der Fähigkeit von Mep2p, die Morphogenese zu stimulieren, ist die vergleichsweise starke Expression des Proteins. Um die Regulation der MEP2-Expression aufzuklären, wurden die cis-regulatorischen Sequenzen und die trans-aktivierenden Faktoren, die die MEP2-Induktion unter Stickstoffmangel vermitteln, identifiziert. Eine Promotoranalyse zeigte, dass zwei mutmaßliche Bindungsstellen für GATA-Transkriptionsfaktoren eine zentrale Rolle in der MEP2-Expression haben, da die Deletion oder Mutation dieser GATAA-Sequenzen die Expression von MEP2 stark reduzierte. Um die Rolle der GATA-Transkriptionsfaktoren Gln3p und Gat1p bei der Regulation der MEP2-Expression zu untersuchen, wurden Mutanten hergestellt, in denen die entsprechenden Gene deletiert waren. Die Expression von Mep2p war in gln3D und gat1D Einzelmutanten stark verringert und in gln3D gat1D Doppelmutanten nicht mehr nachweisbar. Die Deletion von GLN3 hatte auch eine starke Reduktion des filamentösen Wachstums zur Folge, die durch die konstitutive Expression von MEP2 unter Kontrolle des ADH1-Promotors aufgehoben wurde. Dagegen hatte die Deletion von GAT1 keinen Einfluss auf das filamentöse Wachstum. Überraschenderweise war das filamentöse Wachstum in den gat1D Mutanten teilweise unabhängig von Mep2p, was darauf hinwies, dass in Abwesenheit von GAT1 andere Signalwege aktiviert werden, die die Morphogenese stimulieren. Diese Ergebnisse zeigten, dass die GATA-Transkriptionsfaktoren Gln3p und Gat1p die Expression der Ammoniumpermease MEP2 kontrollieren und dass Gln3p auch ein wichtiger Regulator des durch Stickstoffmangel induzierten filamentösen Wachstums von C. albicans ist. Mutanten, in denen die beiden GATA-Transkriptionsfaktoren Gln3p und Gat1p fehlten, waren nicht mehr in der Lage, in einem Medium zu wachsen, das bovines Serumalbumin (BSA) als einzige Stickstoffquelle enthält. Die Fähigkeit von C. albicans, Proteine als einzige Stickstoffquelle zum Wachstum zu verwenden, wird durch die sekretierte Aspartatprotease Sap2p, die die Proteine zu Peptiden abbaut, und durch Oligopeptidtransporter, die diese Peptide in die Zelle aufnehmen, vermittelt. Der Wachstumsdefekt der gln3D gat1D Doppelmutanten war hauptsächlich durch einen Defekt in der SAP2-Expression verursacht, da die Expression von SAP2 unter Kontrolle des konstitutiven ADH1-Promotors die Fähigkeit zum Wachstum auf BSA wieder herstellte. Es zeigte sich, dass Gln3p und Gat1p die Expression des Transkriptionsfaktors STP1, der für die Induktion von SAP2 in Gegenwart von Proteinen notwendig ist, regulieren. Bei einer Expression von STP1 unter Kontrolle des induzierbaren Tet-Promotors waren Gln3p und Gat1p nicht mehr notwendig für das Wachstum auf Proteinen. Wenn bevorzugte Stickstoffquellen verfügbar sind, wird SAP2 auch in Gegenwart von Proteinen reprimiert, und diese Stickstoff-Katabolitrepression korrelierte mit einer reduzierten STP1-Expression. Die Expression von STP1 unter Kontrolle des Tet-Promotors hob diese Repression auf, was zeigte, dass die Regulation der STP1-Expression durch die GATA-Transkriptionsfaktoren eine Schlüsselrolle sowohl bei der positiven als auch bei der negativen Kontrolle der SAP2-Expression spielt. Eine regulatorische Kaskade, in der die Expression des spezifischen Transkriptionsfaktors Stp1p durch die allgemeinen Regulatoren Gln3p und Gat1p kontrolliert wird, stellt die Expression von SAP2 in C. albicans deshalb unter Stickstoffkontrolle und gewährleistet eine angepasste Expression dieses Virulenzfaktors. Die Ergebnisse dieser Arbeit illustrieren, dass die GATA-Faktoren Gln3p und Gat1p zum Teil überlappende aber auch spezifische Funktionen in der Anpassung von C. albicans an die Verfügbarkeit verschiedener Stickstoffquellen haben. Diese Anpassungsmechanismen spielen auch eine Rolle in der Pathogenität des Pilzes, wobei die relative Bedeutung von Gln3p und Gat1p vom Zielgen und der Stickstoffquelle abhängt. Diese Erkenntnisse geben einen vertieften Eiblick in die molekularen Grundlagen der Anpassung von C. albicans an unterschiedliche Umweltbedingungen. N2 - The yeast Candida albicans is a member of the normal microflora on the mucosal surfaces of the gastrointestinal and urogenital tract in healthy persons. However, it is an opportunistic pathogen that can cause a range of infections from superficial to disseminated, in response to perturbation of the normal microflora or alterations in the host immunity. C. albicans exhibits a variety of characteristics such as adhesion, morphogenetic switching and secreted aspartic protease production that contribute to its virulence. Expression of many of these virulence factors is controlled by the availability of essential element, nitrogen. C. albicans undergoes morphogenetic transition to form filaments under nitrogen starvation conditions and this switch is controlled by the ammonium permease Mep2p. However, little is known about how this signaling function of Mep2p is regulated. Mutational analysis of Mep2p was carried out to identify the residues that confer signaling activity to this permease. The C-terminal cytoplasmic tail of Mep2p contains a signaling domain that is dispensable for ammonium transport but essential for the signaling activity of Mep2p. In this work, progressive C-terminal truncations analysis demonstrated that a MEP2DC433 allele was still able to induce filamentation while nitrogen starvation-induced filamentous growth was abolished in cells expressing a MEP2DC432 allele. Therefore, tyrosine at position 433 (Y433) is the last amino acid in Mep2p that is essential for signaling. To gain insights into how the signaling activity of Mep2p is regulated by ammonium availability and transport, conserved residues that have been implicated in ammonium binding or uptake were mutated. Mutation of D180, which has been proposed to mediate initial contact with extracellular ammonium, or the pore-lining residues H188 and H342 abolished Mep2p expression, indicating that these residues are important for protein stability. Mutation of F239, which together with F126 is predicted to form an extracytosolic gate to the conductance channel, abolished both ammonium uptake and Mep2p-dependent filamentation, despite proper localization of the protein. On the other hand, mutation of W167, which is assumed to participate along with Y122, F126, and S243 in the recruitment and coordination of the ammonium ion at the extracytosolic side of the cell membrane, also abolished filamentation without having a strong impact on ammonium transport, demonstrating that extracellular alterations in Mep2p can affect intracellular signaling. Mutation of Y122 reduced ammonium uptake much more strongly than mutation of W167 but still allowed efficient filamentation, indicating that the signaling activity of Mep2p is not directly correlated with its transport activity. An important aspect in the ability of Mep2p to stimulate filamentation in response to nitrogen limitation is its high expression levels. The cis-acting sequences and trans-acting regulators that mediate MEP2 induction in response to nitrogen limitation were identified. Promoter analysis revealed that two putative binding sites for GATA transcription factors have a central role in MEP2 expression, as deletion of the region containing these sites or mutation of the GATAA sequences in the full-length MEP2 promoter strongly reduced MEP2 expression. To elucidate the roles of the GATA transcription factors GLN3 and GAT1 in regulating MEP2 expression, mutants lacking one or both of these transcription factors were constructed. Mep2p expression was strongly reduced in gln3D and gat1D single mutants and virtually abolished in gln3D gat1D double mutants. Deletion of GLN3 strongly inhibited filamentous growth under limiting nitrogen conditions, which could be rescued by constitutive expression of MEP2 from the ADH1 promoter. In contrast, inactivation of GAT1 had no effect on filamentation. Surprisingly, filamentation became partially independent of the presence of a functional MEP2 gene in the gat1D mutants, indicating that the loss of GAT1 function results in the activation of other pathways that induce filamentous growth. These findings demonstrated that the GATA transcription factors Gln3p and Gat1p control expression of the MEP2 ammonium permease and that GLN3 is also an important regulator of nitrogen starvation-induced filamentous growth in C. albicans. C. albicans mutants lacking both the GATA transcription factors Gln3p and Gat1p were unable to grow in a medium containing an alternative nitrogen source, bovine serum albumin (BSA) as the sole nitrogen source. The ability to utilize proteins as sole source of nitrogen for growth of C. albicans is conferred by the secreted aspartic protease Sap2p, which degrades the proteins, and oligopeptide transporters that mediate uptake of the proteolytic products into cell. The growth defect of gln3D gat1D mutants was mainly caused by their inability to express the SAP2 gene, as SAP2 expression from the constitutive ADH1 promoter restored the ability of the mutants to grow on BSA. Expression of STP1, which encodes a transcription factor that is required for SAP2 induction in the presence of proteins, was regulated by Gln3p and Gat1p. Forced expression of STP1 from a tetracycline-inducible promoter bypassed the requirement of the GATA transcription factors for growth of C. albicans on proteins. When preferred nitrogen sources are available, SAP2 is repressed and this nitrogen catabolite repression of SAP2 was correlated with downregulation of STP1 under these conditions. Tetracycline-induced STP1 expression abolished nitrogen catabolite repression of SAP2, demonstrating that regulation of STP1 expression levels by the GATA transcription factors is a key aspect of both positive and negative regulation of SAP2 expression. Therefore, by using a regulatory cascade in which expression of the specific transcription factor Stp1p is controlled by the general regulators Gln3p and Gat1p, C. albicans places SAP2 expression under nitrogen control and ensures proper expression of this virulence determinant. In summary, the present study illustrated how GATA factors, Gln3p and Gat1p, play partially overlapping, but distinct roles, in mediating the appropriate responses of C. albicans to the availability of different nitrogen sources. These responses are also determinants of pathogenicity of the fungus. The relative contributions of Gln3p and Gat1p vary with their target genes and the availability of nitrogen source. Overall, these findings provide us with a better understanding of the molecular basis of some of the important processes that help in adaptation of C. albicans to various environmental conditions. The yeast Candida albicans is a member of the normal microflora on the mucosal surfaces of the gastrointestinal and urogenital tract in healthy persons. However, it is an opportunistic pathogen that can cause a range of infections from superficial to disseminated, in response to perturbation of the normal microflora or alterations in the host immunity. C. albicans exhibits a variety of characteristics such as adhesion, morphogenetic switching and secreted aspartic protease production that contribute to its virulence. Expression of many of these virulence factors is controlled by the availability of essential element, nitrogen. C. albicans undergoes morphogenetic transition to form filaments under nitrogen starvation conditions and this switch is controlled by the ammonium permease Mep2p. However, little is known about how this signaling function of Mep2p is regulated. Mutational analysis of Mep2p was carried out to identify the residues that confer signaling activity to this permease. The C-terminal cytoplasmic tail of Mep2p contains a signaling domain that is dispensable for ammonium transport but essential for the signaling activity of Mep2p. In this work, progressive C-terminal truncations analysis demonstrated that a MEP2DC433 allele was still able to induce filamentation while nitrogen starvation-induced filamentous growth was abolished in cells expressing a MEP2DC432 allele. Therefore, tyrosine at position 433 (Y433) is the last amino acid in Mep2p that is essential for signaling. To gain insights into how the signaling activity of Mep2p is regulated by ammonium availability and transport, conserved residues that have been implicated in ammonium binding or uptake were mutated. Mutation of D180, which has been proposed to mediate initial contact with extracellular ammonium, or the pore-lining residues H188 and H342 abolished Mep2p expression, indicating that these residues are important for protein stability. Mutation of F239, which together with F126 is predicted to form an extracytosolic gate to the conductance channel, abolished both ammonium uptake and Mep2p-dependent filamentation, despite proper localization of the protein. On the other hand, mutation of W167, which is assumed to participate along with Y122, F126, and S243 in the recruitment and coordination of the ammonium ion at the extracytosolic side of the cell membrane, also abolished filamentation without having a strong impact on ammonium transport, demonstrating that extracellular alterations in Mep2p can affect intracellular signaling. Mutation of Y122 reduced ammonium uptake much more strongly than mutation of W167 but still allowed efficient filamentation, indicating that the signaling activity of Mep2p is not directly correlated with its transport activity. An important aspect in the ability of Mep2p to stimulate filamentation in response to nitrogen limitation is its high expression levels. The cis-acting sequences and trans-acting regulators that mediate MEP2 induction in response to nitrogen limitation were identified. Promoter analysis revealed that two putative binding sites for GATA transcription factors have a central role in MEP2 expression, as deletion of the region containing these sites or mutation of the GATAA sequences in the full-length MEP2 promoter strongly reduced MEP2 expression. To elucidate the roles of the GATA transcription factors GLN3 and GAT1 in regulating MEP2 expression, mutants lacking one or both of these transcription factors were constructed. Mep2p expression was strongly reduced in gln3D and gat1D single mutants and virtually abolished in gln3D gat1D double mutants. Deletion of GLN3 strongly inhibited filamentous growth under limiting nitrogen conditions, which could be rescued by constitutive expression of MEP2 from the ADH1 promoter. In contrast, inactivation of GAT1 had no effect on filamentation. Surprisingly, filamentation became partially independent of the presence of a functional MEP2 gene in the gat1D mutants, indicating that the loss of GAT1 function results in the activation of other pathways that induce filamentous growth. These findings demonstrated that the GATA transcription factors Gln3p and Gat1p control expression of the MEP2 ammonium permease and that GLN3 is also an important regulator of nitrogen starvation-induced filamentous growth in C. albicans. C. albicans mutants lacking both the GATA transcription factors Gln3p and Gat1p were unable to grow in a medium containing an alternative nitrogen source, bovine serum albumin (BSA) as the sole nitrogen source. The ability to utilize proteins as sole source of nitrogen for growth of C. albicans is conferred by the secreted aspartic protease Sap2p, which degrades the proteins, and oligopeptide transporters that mediate uptake of the proteolytic products into cell. The growth defect of gln3D gat1D mutants was mainly caused by their inability to express the SAP2 gene, as SAP2 expression from the constitutive ADH1 promoter restored the ability of the mutants to grow on BSA. Expression of STP1, which encodes a transcription factor that is required for SAP2 induction in the presence of proteins, was regulated by Gln3p and Gat1p. Forced expression of STP1 from a tetracycline-inducible promoter bypassed the requirement of the GATA transcription factors for growth of C. albicans on proteins. When preferred nitrogen sources are available, SAP2 is repressed and this nitrogen catabolite repression of SAP2 was correlated with downregulation of STP1 under these conditions. Tetracycline-induced STP1 expression abolished nitrogen catabolite repression of SAP2, demonstrating that regulation of STP1 expression levels by the GATA transcription factors is a key aspect of both positive and negative regulation of SAP2 expression. Therefore, by using a regulatory cascade in which expression of the specific transcription factor Stp1p is controlled by the general regulators Gln3p and Gat1p, C. albicans places SAP2 expression under nitrogen control and ensures proper expression of this virulence determinant. In summary, the present study illustrated how GATA factors, Gln3p and Gat1p, play partially overlapping, but distinct roles, in mediating the appropriate responses of C. albicans to the availability of different nitrogen sources. These responses are also determinants of pathogenicity of the fungus. The relative contributions of Gln3p and Gat1p vary with their target genes and the availability of nitrogen source. Overall, these findings provide us with a better understanding of the molecular basis of some of the important processes that help in adaptation of C. albicans to various environmental conditions. KW - Transkriptionsfaktor KW - Candida albicans KW - Stickstoff KW - Stickstoffkontrolle KW - Ammoniumpermease KW - Sekretion von Aspartatproteasen KW - Candida albicans KW - ammonium permease KW - secreted aspartic protease KW - nitrogen regulation KW - transcription factor Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29769 ER - TY - THES A1 - Thoma, Eva Christina T1 - Directed differentiation of pluripotent stem cells induced by single genes T1 - Gerichtete Differenzierung pluripotenter Stammzellen induziert durch einzelne Gene N2 - Pluripotency describes the ability of stem cells to form every cell type of the body.. Pluripotent stem cells are e.g. embryonic stem cells (ESCs), but also the so called induced pluripotent stem cells (IPS cells), that are generated by reprogramming differentiated somatic cells into a pluripotent state. Furthermore, it has been shown that spermatogonia (SG) derived from adult testes of mouse or human are pluripotent. Because of their ability to differentiate into every somatic cell type, pluripotent stem cells have a unique status in research and regenerative medicine. For the latter, they offer a valuable opportunity to replace destroyed tissues or organs. For basic research, stem cells represent a useful system to study differentiation or developmental processes that are difficult to access in the physiological situation e.g. during embryogenesis. Both applications, however, require methods that allow efficient and directed differentiation of stem cells into defined specialized cell types. This study first aims to investigate the differentiation potential of SG derived from the teleost fish medaka (Oryzias latipes). My results demonstrate that medaka SG are able to form different somatic cell types, namely adipocytes, melanocytes, osteoblasts, and neurons. This indicates that medake SG have retained a broad differentiation potential suggesting that pluripotency is not restricted to mouse and human SG but might be conserved among vertebrates. Next, I wanted to establish a differentiation method that is solely based on ectopic expression of genes known to be essential for the formation of certain somatic cell types – so called master regulators (MRs). My findings show that ectopic expression of the melanocyte-specific transcription factor mitf-m that has previously been shown to induce differentiation of medaka ESCs into pigment cells resulted in the formation of the same cell type in medaka SG. This approach could be used to generate other somatic cell types. Thus, ectopic expression of the MRs cbfa1 and mash1 in MF-SG was sufficient to induce differentiation into osteoblasts and neurons, respectively. Interestingly, these differentiation processes included the activation of genes that are expressed earlier during embryogenesis than the differentiation-inducing MR. Furthermore, my findings show that the approach of MR-induced differentiation can be transferred to mammalian stem cell systems. Ectopic expression of the neural transcription factor ngn2 was sufficient to induce efficient and rapid differentiation of neurons in mouse ESCs. This differentiation process also included the induction of genes that in vivo are activated at earlier stages that ngn2. By generating a transgenic cell line allowing induction of ectopic ngn2 expression, it was possible to obtain a relatively pure culture of functional neurons. Ngn2-induced differentiation did not require any additional signals and occurred even under pluripotency promoting conditions. Moreover, ectopic expression of ngn2 did also induce the formation of cells with neuronal morphology in IPS cells indicating that MR-induced differentiation is operative in different stem cell types. Furthermore, protein transduction of Ngn2 into mouse ESCs also resulted in a neuronal differentiation process up to the appearance of neural precursor cells. Last, my results show that MR-induced differentiation can also be used to generate other cell types than neurons from mouse ESCs. Myoblasts and macrophage-like cells were generated by ectopic expression of the MRs myoD and cebpa, respectively. Using transgenic cell lines enabling induction of MR expression it was possible to obtain mixed cultures with two different differentiation processes occurring in parallel. Altogether this study shows that ectopic expression of single genes is sufficient to induce directed differentiation of stem cells into defined cell types. The feasibility of this approach was demonstrated for different MRs and consequently different somatic cell types. Furthermore, MR induced differentiation was operative in different stem cell types from fish and mouse. Thus, one can conclude that certain genes are able to define cell fates in in vitro stem cell systems and that this cell fate defining potential appears to be a conserved feature in vertebrates. These findings therefore provide new insights in the role of MRs in cell commitment and differentiation processes. Furthermore, this study presents a new method to induce directed differentiation of stem cells that offers several advantages regarding efficiency, rapidness, and reproducibility. MR-induced differentiation therefore represents a promising tool for both stem cell research and regenerative medicine. N2 - Pluripotenz bezeichnet die Fähigkeit einer Stammzelle, jede Zelle des Körpers zu bilden. Zu den pluripotenten Stammzellen gehören embryonale Stammzellen (ESZ), aber auch so genannte induzierte pluripotente Stammzellen (IPS Zellen), die durch Rückprogrammierung ausdifferenzierter Körperzellen in einen pluripotenten Status gewonnen werden. Außerdem wurde gezeigt, dass adulte Spermatogonien (SG) in Maus und Mensch pluripotent sind. Pluripotente Stammzellen sind von großer Wichtigkeit für Forschung und regenerative Medizin. Für letztere bieten diese Zellen aufgrund ihrer Fähigkeit, jede Körperzellen zu bilden, eine vielversprechende Möglichkeit, zerstörte Gewebe oder Organe zu ersetzen. In der Forschung stellen sie ein nützliches System dar, um Entwicklungs- und Differenzierungsprozesse zu untersuchen, die in der physiologischen Situation z.B. der Embryonalentwicklung – schwer zugänglich sind. Eine wichtige Grundlage für diese Anwendungen sind jedoch Methoden, die die effiziente und gerichtete Differenzierung von Stammzellen in einen bestimmten Zelltyp erlauben. In dieser Arbeit wird zunächst das Differenzierungspotential von SG der Fischspezies Medaka (Oryzias latipes) untersucht, um festzustellen, ob Pluripotenz von SG, die bisher nur in Maus und Mensch gezeigt wurde, auch in anderen Wirbeltieren außerhalb der Säuger erhalten ist. Meine Ergebnisse zeigen, dass Medaka-SG fähig sind verschiedene somatische Zelltypen zu bilden. Das zweite Ziel dieser Studie ist die Entwicklung einer Differenzierungsmethode, die nur auf der Expression einzelner so genannter Masterregulatoren (MR) beruht – Gene, die als essentiell für die Entwicklung bestimmter Zelltypen bekannt sind. Meine Ergebnisse zeigen, dass der Pigmentzell-spezifische Transkriptionsfaktor Mitf-M, von dem gezeigt wurde, dass er die Differenzierung von Medaka-ESZ in Pigmentzellen induzieren kann, die Bildung desselben Zelltyps in Medaka-SG induziert. Dieser Ansatz ermöglichte auch die Bildung anderer somatischer Zelltypen. So führte Überexpression der MR cbfa1 und mash1 in Medaka SG zur Differenzierung in Osteoblasten bzw. Neuronen. Interessanterweise wurde bei diesen Differenzierungsprozessen die Aktivierung von Genen beobachtet, die während der Embryonalentwicklung vor dem Differenzierung-auslösenden MR aktiviert werden. Weiterhin zeigen meine Ergebnisse, dass der Ansatz einer gerichteten Differenzierung, ausgelöst durch einzelne MR, auch auf Säuger-Stammzellen übertragen werden kann. So wurde durch Überexpression des neuronalen Genes ngn2 in murinen ESZ die effiziente und schnelle Bildung von Nervenzellen induziert, wobei auch hier die Aktivierung von Genen beobachtet wurde, deren Expression in der Embryogenese der von ngn2 vorangeht. Die Herstellung einer transgenen Zelllinie, in der die Überexpression von ngn2 aktiviert werden kann, erlaubte die Entstehung einer fast reinen Kultur funktionaler Neuronen. Der durch ngn2 ausgelöste Differenzierungsprozess war unabhängig von zusätzlichen Faktoren und lief sogar unter Bedingungen ab, die normalerweise den pluripotenten Zustand unterstützen. Außerdem führte Überexpression von ngn2 auch in IPS Zellen zur Bildung von Zellen mit neuronalem Phenotyp. Weiterhin konnte auch durch Transduktion des Ngn2-Proteins in murine ESZ neuronale Differenzierung ausgelöst werden, und zwar die Bildung neuronaler Vorläuferzellen. Zuletzt wird bewiesen, dass gerichtete Differenzierung von murinen ESZ durch einzelne MR Gene neben neuronalen Zelltypen auch die Bildung anderer somatischer Zellen erlaubt: Überexpression der Gene myoD oder cebpa induzierte die Differenzierung in Muskelzellen bzw. Macrophagen-ähnliche Zellen. Unter Verwendung transgener Zelllinien, die die Aktivierung jeweils eines MRs erlauben, war es möglich, gemischte Kulturen zu erhalten, in denen zwei verschiedene Differenzierungsprozesse parallel abliefen. Diese Studie zeigt, dass die Überexpression einzelner Gene ausreichend ist, um gerichtete Differenzierungsprozesse in einen bestimmten Zelltyp auszulösen. Die erfolgreiche Durchführung dieses Ansatzes wird nicht nur mit verschiedenen Genen und somit verschiedenen resultierenden Zelltypen nachgewiesen, sondern auch in verschiedenen Stammzelltypen aus Fisch und Maus. Dies erlaubt die Schlussfolgerung, dass bestimmte Gene in vitro das Schicksal von Stammzellen festlegen können und dass diese Fähigkeit eine konservierte Eigenschaft in Wirbeltieren zu sein scheint. Somit präsentiert diese Arbeit neuen Erkenntnisse über die Rolle von MR bei der Festlegung von Zellidentitäten und in Differenzierungsprozessen. Weiterhin wird eine neue Methode zur Induktion gerichteter Differenzierung in Stammzellen aufgezeigt, die mehrere Vorteile in Bezug auf Effizienz, Geschwindigkeit und Reproduzierbarkeit hat. Auslösung von Differenzierung durch MR Gene bietet somit einen neuen vielversprechenden Ansatz mit potentieller Anwendung sowohl in Stammzellforschung, als auch in regenerativer Medizin. KW - Stammzelle KW - Zelldifferenzierung KW - Transkriptionsfaktor KW - Pluripotenz KW - Pluripotent stem cells KW - differentiation KW - transcription factors Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-54706 ER - TY - THES A1 - Ehrig, Klaas T1 - Effects of stem cell transcription factor-expressing vaccinia viruses in oncolytic virotherapy T1 - Effekte von Stammzell-Transkriptionsfaktor exprimierenden Vaccinia Viren in onkolytischer Virotherapie N2 - Krebserkrankungen bleiben auch im Jahr 2012 die zweithäuftigste Todesursache in der industralisierten Welt. Zusätzlich hat die Etablierung der Krebsstammzell-Hypothese grundsätzliche Auswirkungen auf die Erfolgsaussichten konventioneller Krebstherapie, wie Chemotherapie oder Strahlentherapie. Deswegen ist es von gröβter Notwendigkeit, dass neue Ansätze zur Krebstherapie entwickelt werden, die den Ausgang der Behandlung verbessern und zu weniger Nebenwirkungen führen. Diverse vorklinische Studien haben gezeigt, dass die onkolytische Virotherapie mit Vaccinia-Viren ein potentes und gut tolerierbares neues Werkzeug in der Krebstherapie darstellt. Die Effizienz des Vaccinia-Virus als Therapeutikum allein oder in Kombination mit Strahlen- oder Chemotherapie wird aktuell in mehreren klinischen Studien der Phasen I & II getestet. Krebsstammzellen und Stammzellen teilen eine Vielzahl von Eigenschaften, wie die Fähigkeit zur Selbst-Erneuerung und Pluripotenz, Stilllegung der Zellproliferation, Resistenz gegen Medikamente oder Bestrahlung, die Expression von diversen Zelloberflächen-molekülen, die Aktivierung und Hemmung spezifischer Signaltransduktionswege oder die Expression von Stammzell-spezifischen Genen. In dieser Arbeit wurden zwei neue rekombinante Vaccinia-Viren entwickelt, welche die Stammzell-Transkriptionsfaktoren Nanog (GLV-1h205) und Oct4 (GLV-1h208) exprimieren, um tiefere Einblicke in die Rolle dieser Masterregulatoren in der Entstehung von Krebs und ihrem Einfluss auf die onkolytische Virotherapie zu gewinnen. Das Replikationspotential beider Virusstämme in menschlichen A549-Zellen und PC-3-Zellen wurde anhand von Replikations-Assays bestimmt. Die Expression der Virus-spezifischen Markergene Ruc-GFP und beta-Galaktosidase, wie auch die Expression der Transkriptionsfaktoren Nanog und Oct4 wurde mit Hilfe von RT-PCR, SDS-PAGE und Western blotting, sowie immunozytochemischen Experimenten nachgewiesen. Des Weiteren wurde der Einfluss einer GLV-1h205-Infektion von A549-Zellen auf den Zellzyklus untersucht. Zudem wurde die Bedeutung der Virus-vermittelten Transkriptionsfaktor-Expression auf die Behandlung von subkutanen A549-Tumoren in einem Xenograft-Modell untersucht. Zur Untersuchung, ob die beobachteten Vorteile in der Behandlung von Lungenadenokarzinomen in Mäusen mit GLV-1h205 Promoter- oder Transkriptionsfaktor-abhängig sind, wurde ein Kontroll-Virus (GLV-1h321) hergestellt, dass für eine unfunktionale Nanog-Mutante codiert. Mittels SDS-PAGE und Western blotting sowie Immunozytochemie wurde die Transgen-Expression analysiert. Ein weitere Aspekt dieser Arbeit war die Fragestellung, ob sich das onkolyische Vaccinia-Virus GLV-1h68 eignet, als neues und weniger invasives Therapeutikum effizient Darmkrebszellen zu infizieren um sich in ihnen zu replizieren und diese anschlieβend zu lysieren. Ein derartiger Therapieansatz würde besonders im Hinblick auf spät diagnostizierten, metastasierenden Darmkrebs eine interessante Behandlungsalternative darstellen. Virale Markergen-expression wurde anhand von Fluoreszenzmikroskopie und FACS-Analyse untersucht. Desweiteren wurde gezeigt, dass die einmalige Administration von GLV-1h68 in mindestens zwei verschiedenen Darmkrebszelllinien zu einer signifikanten Inhibierung des Tumorwachstums in vivo und zu signifikant verbessertem Überleben führt. Der Transkriptionsfaktor Klf4 wird zwar stark in ruhenden, ausdifferenzierten Zellen des Darmepithels exprimiert, ist hingegen bei Darmkrebs generell dramatisch herabreguliert. Die Expression von Klf4 führt zu einem Stop der Zellproliferation und inhibiert die Aktivität des Wnt-Signalweges, indem es im Zellkern an die Transaktivierungsdomäne von beta-Catenin bindet. Um die Behandlung von Darmkrebs mit Hilfe onkolytischer Virotherapie weiter zu verbessern, wurden verschiedene Vaccinia-Viren (GLV-1h290-292) erzeugt, die durch verschiedene Promoterstärken die Expression unterschiedlicher Mengen an Tumorsuppressor Klf4 vermitteln. Die anfängliche Charakterisierung der drei Virusstämme mittels Replikations-Assay, Zytotoxizitätstudien, SDS-PAGE und Western blotting, Immunozytochemie sowie die Analyse der Proteinfunktion mit Hilfe von qPCR- und ELISA-Analysen zur Bestimmung von zellulärem beta-Catenin, zeigten eine Promoter-abhängige Expression und Wirkung von Klf4. Für weitere Analysen wurde das Virus GLV-1h291 gewählt, welches nach Infektion die gröβte Menge an Klf4 produziert und zusätzlich durch die C-terminale Fusion einer TAT Transduktionsdomäne Membran-gängig gemacht (GLV-1h391). Die erhaltenen Befunde machen das Klf4-TAT-kodierende Vaccinia-Virus GLV-1h391 zu einem vielversprechenden Kandidaten für eine Behandlung von Darmkrebs beim Menschen. N2 - Cancer remains the second leading cause of death in the industrialized. The data from many different studies investigating the nature of cancer-initiating cells coined the description ‘cancer stem cells’ and has major implications on conventional cancer therapy. Thus, to improve the outcome of cancer treatment and to lower negative side effects, the development of novel therapeutic regimens is indispensable. It has been demonstrated in many preclinical studies that oncolytic virotherapy using vaccinia virus may provide a powerful and well-tolerable new tool in cancer therapy which is currently investigated in several clinical trials (Phase I & II) as stand-alone treatment or in combination with conventional cancer therapy. Cancer-initiating cells and stem cells share a variety of characteristics like the ability to self-renew, differentiation potential, quiescence, drug and radiation resistance, activation and inhibition of similar signaling pathways as well as expression of cell surface markers and stem cell-related genes. In this work, two new recombinant vaccinia viruses expressing the transcription factors Nanog (GLV-1h205) and Oct4 (GLV-1h208) were engineered to provide deeper insight of these stem cell master regulators in their significance of cancer-initiation and their impact on oncolytic virotherapy. Both viruses were analyzed for their replication potential in A549 and PC-3 human cancer cells. Marker gene expression was assessed by RT-PCR, SDS-PAGE and Western blotting, ELISA or immunocytochemistry.Furthermore, the effect of GLV-1h205 infection on the cell cycle in A549 cells was analyzed. Next, the effects of virus-mediated expression of stem cell transcription factors on therapeutic efficacy and survival rates in A549 xenograft mouse models was analyzed. A non-functional Nanog mutant-expressing virus strain (GLV-1h321) was engineered to analyze whether the observed therapeutic benefits were promoter- or payload-driven. Furthermore, this study analyzed the potential of GLV-1h68 to infect, replicate in, and lyse colorectal cancer cell lines to study whether oncolytic vaccinia viruses can be potential new and less invasive treatment regimens for late stage colorectal cancer. Marker gene expression was assessed by fluorescence microscopy and FACS. The transcription factor Klf4 is highly expressed in quiescent, terminally differentiated cells in the colonic epithelium whereas it is dramatically downregulated in colon cancers. Klf4 expression leads to cell growth arrest and inhibits Wnt signaling by binding to beta-catenin. To further improve the treatment of colorectal cancers, new recombinant vaccinia viruses (GLV-1h290-292) mediating the expression of differing amounts of the tumor suppressor Klf4 by using different promoter strengths were engineered. Initial characterization of recombinant vaccinia viruses expressing Klf4 by replication assay, cell viability assay, SDS-PAGE and Western blotting, immuncytochemistry and analysis of protein functionality by qPCR and ELISA analysis for cellular beta-catenin expression, demonstrated promoter strength-dependent expression of and impact of Klf4. To further boost the effects of tumor suppressor Klf4, a vaccinia virus strain expressing Klf4 with a C-terminal fusion of the TAT transduction domain (GLV-1h391) was engineered. Treatment of HT-29 non-responder tumors in vivo with GLV-1h291 and GLV-1h391 led to significant tumor growth inhibition and improved overall survival compared to GLV-1h68. This makes the Klf4-TAT expressing GLV-1h391 a promising candidate for the treatment of colorectal cancer in man. KW - Lungenkrebs KW - Darmkrebs KW - Vaccinia-Virus KW - Transkriptionsfaktor KW - Cancer KW - Vaccinia virus KW - oncolytic virotherapy KW - stem cells Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85139 ER - TY - THES A1 - Akimzhanov, Askar M. T1 - Epigenetic repression of the NFATc1 transcription factor in human lymphomas T1 - Epigenetische Repression des NFATc1 Transkriptionsfakors in menschlichen Lymphomen N2 - We examined the regulation of NFATc1 in different lymphomas and observed an inversed correlation between the methylation status and expression of NFATc1. Our data demonstrate that aberrant DNA methylation associated with chromatin remodeling within nfatc1 locus is a major mechanism for the repression of NFATc1 expression, suggesting that the DNA methylation-mediated transcriptional silencing of NFATc1 may be a critical event in the tumorogenesis of ALCLs and cHLs. Furthermore, the DNA methylation of human nfatc1 promoter region could be used as a novel biomarker of tumor progression. Our results indicate a close link between the loss of immunoreceptor signaling and NFATc1 expression in human lymphomas. For both ALCLs and cHLs, defects in immunoreceptor signaling have been described which result in a loss of receptor-mediated gene expression programs (Schwering et al., 2003; Bonzheim et al., 2004; Marafioti et al., 2004). In T cells, one indicator gene of these programs appears to be the nfatc1 gene whose expression is controlled by TCR signals (Chuvpilo et al., 2002a). In contrast, in T cells NFATc1 expression is unaffected by TCR signals, and NFATc2 was found to be expressed at normal levels in ALCLs and cHLs (L.K., unpubl. data). Moreover, the activity of NF-kappaB factors which can bind to certain NFAT binding sites and share a distantly-related DNA binding domain with NFATs is strongly elevated in cHL cells (Bargou et al., 1997; Hinz et al., 2001; Hinz et al., 2002) suggesting that NFATs and NF-kappaBs exert very different effects on generation and maintenance of Hodgkin’s lymhomas. However, it should be mentioned that in Burkitt’s and further B cell lymphomas in which NFATc1 proteins are strongly expressed and controlled by receptor signals (Kondo et al., 2003), they could exert a promoting function in tumor development. The genes of p53 family members p63 and p73 are prominent examples for mammalian genes whose products can act both as oncoproteins and tumor suppressor genes (Hibi et al., 2000; Stiewe and Putzer, 2002), and it is likely that more genes exist which encode both tumor suppressors and oncoproteins. It remains to be shown whether the nfatc1 gene is one of them. N2 - Wir haben die Regulation von NFATc1 in verschiedenen Lymphomen untersucht und beobachteten eine umgekehrte Korrelation zwischen dem Ausmaß an Methylierung und der Expression von NFATc1. Unsere Daten demonstrieren, dass eine aberrante DNA-Methylierung, die mit veränderter Chromatinstruktur innerhalb des nfatc1 Lokus assoziiert ist, der Hauptmechanismus für die Repression der NFATc1-Expression ist. Es wäre zu vermuten, dass die durch DNA-Methylierung verursachte transkriptionelle Abschaltung von NFATc1 der kritische Schritt bei der Tumorgenese von ALCLs und cHLs ist. Des weiteren könnte das Ausmaß der DNA-Methylierung in der humanen nfatc1-Promotorregion als neuer Biomarker für Tumorprogression genutzt werden. Unsere Daten indizieren eine enge Verbindung zwischen dem Verlust von Immunrezeptorsignalen und der NFATc1-Expression in humanen Lymphomen. Für sowohl ALCLs als auch cHLs wurden Defekte in der Immunrezeptorsignalgebung beschrieben, welche sich im Verlust des Rezeptor vermittelten Genexpressionsprogramms niederschlagen (Schwering et al., 2003; Bonzheim et al., 2004; Marafioti et al., 2004). In T-Zellen scheint das nfatc1-Gen eins der Indikatorgene dieses Programms zu sein, dessen Expression durch TCR-Signale kontrolliert wird (Chuvpilo et al., 2002a). Im Gegensatz dazu bleibt die NFATc2-Expression in T-Zellen unbeeinflusst von TCR-Signalen, weshalb NFATc2 in ALCLs und cHLs auch in normalem Ausmaß exprimiert wird (L.K., unpubl. data). Andererseits ist die Aktivität der NF-kappaB-Faktoren, die auch an bestimmte NFAT-Bindungsstellen binden können und deren DNA-Bindungsdomäne entfernt mit der der NFATs verwandt ist, in cHL-Zellen stark erhöht (Bargou et al., 1997; Hinz et al., 2001; Hinz et al., 2002). Das lässt vermuten, dass NFATc1 und die NF-kappa-Faktoren eine sehr unterschiedliche Rolle bei der Entstehung und dem Erhalt der Hodgkinlymphome spielen. Es sollte aber erwähnt werden, dass in Burkitts und anderen B-Zelllymphomen, in denen NFATc1-Proteine stark exprimiert und darüber hinaus durch Rezeptorsignale kontrolliert sind (Kondo et al., 2003), diese eine Tumor fördernde Funktion ausüben könnten. Die Gene der p53-Familienmitglieder p63 und p73 sind prominente Beispiele für Säugergene, deren Produkte sowohl als Onkoproteine als auch als Tumorsuppressoren fungieren können (Hibi et al., 2000; Stiewe and Putzer, 2002), und es ist wahrscheinlich, dass es noch weitere Gene gibt, die beide Funktionen ausüben. Es wird zu zeigen sein, ob das nfatc1-Gen eins von ihnen ist. KW - Lymphom KW - T-Lymphozyt KW - Transkriptionsfaktor KW - Methylierung KW - Epigenese KW - NFATc1 KW - Lymphome KW - Epigenetik KW - Methylierung KW - NFATc1 KW - Lymphoma KW - Epigenetics KW - Methylation Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12921 ER - TY - THES A1 - Friedrich, Anna-Lena T1 - FoxO3-mediated, inhibitory effects of CNP on the profibrotic activation of lung fibroblasts T1 - FoxO3-vermittelte, hemmende Wirkungen von CNP auf die profibrotische Aktivierung von Lungenfibroblasten N2 - Idiopathic Pulmonary Fibrosis (IPF) is a progressive parenchymal lung disease with limited therapeutic treatments. Pathologically altered lung fibroblasts, called myofibroblasts, exhibit increased proliferation, migration, and collagen production, and drive IPF development and progression. Fibrogenic factors such as Platelet derived growth factor-BB (PDGF-BB) contribute to these pathological alterations. Endogenous counter-regulating factors are barely known. Published studies have described a protective role of exogenously administered C-type Natriuretic Peptide (CNP) in pathological tissue remodeling, for example in heart and liver fibrosis. CNP and its cyclic GMP producing guanylyl cyclase B (GC-B) receptor are expressed in the lungs, but it is unknown whether CNP can attenuate lung fibrosis by this pathway. To address this question, we performed studies in primary cultured lung fibroblasts. To examine the effects of the CNP/GC-B pathway on PDGF-BB-induced collagen production, proliferation, and migration in vitro, lung fibroblasts were cultured from wildtype control and GC-B knockout mice. Human lung fibroblasts from patients with IPF and healthy controls were obtained from the UGMLC Biobank. In RIA experiments, CNP, at 10nM and 100nM, markedly and similarly increased cGMP levels in both the murine and human lung fibroblasts, demonstrating GC-B/cGMP signaling. CNP reduced PDGF-BB induced proliferation and migration of lung fibroblasts in BrdU incorporation and gap closure assays, respectively. CNP strongly decreased PDGF-BB-induced collagen 1/3 expression as measured by immunocytochemistry and immunoblotting. Importantly, the protective actions of CNP were preserved in IPF fibroblasts. It is known that the profibrotic actions of PDGF-BB are partly mediated by phosphorylation and nuclear export of Forkhead Box O3 (FoxO3), a transcription factor downregulated in IPF. CNP prevented PDGF-BB elicited FoxO3 phosphorylation and nuclear exclusion in both murine and human control and IPF fibroblasts. CNP signaling and functions were abolished in GC-B-deficient lung fibroblasts. Taken together, the results show that CNP moderates the PDGF-BB-induced activation and differentiation of human and murine lung fibroblasts to myofibroblasts. This effect is mediated CNP-dependent by GC-B/cGMP signaling and FoxO3 regulation. To follow up the patho-physiological relevance of these results, we are generating mice with fibroblast-restricted GC-B deletion for studies in the model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis. N2 - Idiopathische pulmonale Fibrose (IPF) ist eine progressiv fortschreitende, parenchymale Lungenerkrankung mit beschränkten therapeutischen Behandlungsmöglichkeiten. Pathologisch veränderte Lungenfibroblasten, sogenannte Myofibroblasten, zeigen eine verstärkte Proliferation, Migration und Kollagenproduktion, die zu einem permanenten Fortschreiten der Erkrankung führen. Während fibrogene Faktoren wie Platelet derived growth factor-BB (PDGF-BB) zu dieser pathologischen Veränderung beitragen, sind endogene Faktoren, die diesem Wandel entgegenwirken, kaum bekannt. Allerdings konnten Studien bereits eine protektive Wirkung von exogen verabreichten C-typ natriuretischen Peptid (CNP) auf krankhaft verändertes Gewebe beschreiben, wie beispielsweise bei Herz- und Leberfibrose. Es ist bekannt, dass CNP und sein cGMP produzierender Rezeptor Guanylyl-Cyclase-B Rezeptor (GC-B) in der Lunge exprimiert werden. Allerdings konnte noch nicht nachgewiesen werden, ob CNP durch diesen Signalweg den Fortschritt einer Lungenfibrose verzögern kann. Um dies herauszufinden, wurden Experimente mit kultivierten, primären Lungenfibroblasten durchgeführt. Um die Effekte des CNP/ GC-B Signalwegs auf die PDGF-BB induzierte Kollagenproduktion, Proliferation und Migration in vitro zu überprüfen, wurden Lungenfibroblasten von Kontroll- und GC-B-Knock-Out Mäusen kultiviert. Weiterhin erhielten wir von der UGMLC Biobank menschliche Fibroblasten von IPF-erkrankten Patienten, sowie gesunde Kontrollfibroblasten. Zur Bestätigung der Funktionalität des GC-B/cGMP Weges, wurde in murinen und humanen Fibroblasten mithilfe eines RIAs ein durch CNP (10nM und 100nM) deutlich erhöhtes cGMP-Level gemessen. CNP reduzierte die durch PDGF-BB induzierte Beschleunigung von Proliferation und Migration der Lungenfibroblasten, was mit Hilfe von BrdU incorporation und Gap closure assay nachgewiesen wurde. Ebenfalls zeigten Immunocytochemistrie und -blotting, dass CNP den PDGF-BB induzierten Anstieg an Kollagenexpression verhindert. Somit wurde festgestellt, dass der schützende Effekt von CNP auch in IPF Fibroblasten erhalten bleibt. Weiterhin ist bekannt, dass die PDGF-BB-induzierten, profibrotischen Veränderungen durch Phosphorylierung und Export des Transkriptionsfaktors Forkhead Box O3 (FoxO3) aus dem Zellkern vermittelt werden, welcher in IPF Fibroblasten vermindert exprimiert ist. CNP verhindert diese PDGF-BB aktivierte Phosphorylierung und Translokation in murinen und humanen Kontroll- und IPF-Fibroblasten. In Lungenfibroblasten mit Deletion des GC-B- Rezeptors war das CNP-Signal und auch dessen Effekt ausgelöscht. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse, dass CNP die PDGF-BB induzierte Aktivierung und Differenzierung von menschlichen und murinen Lungenfibroblasten zu Myofibroblasten beeinflusst. Dieser Effekt wird CNP-abhängig durch den GC-B/cGMP Signalweg und durch die Regulierung von FoxO3 vermittelt. Um abschließend die pathophysiologische Relevanz dieser Erkenntnisse zu zeigen, werden zukünftig Mäuse mit einer fibroblasten-spezifischen Deletion des GC-B Rezeptors für Studien in Bleomycin-induzierter Lungenfibrose genutzt. KW - Idiopathische pulmonale Fibrose KW - Transkriptionsfaktor KW - Natriuretisches Hormon KW - C-type natriuretic peptide KW - FoxO3 Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-359845 ER - TY - THES A1 - Weber, David T1 - Hey target gene regulation in embryonic stem cells and cardiomyocytes T1 - Regulation von Hey Zielgenen in embryonalen Stammzellen und Kardiomyozyten N2 - The Notch signaling pathway is crucial for mammalian heart development. It controls cell-fate decisions, coordinates patterning processes and regulates proliferation and differentiation. Critical Notch effectors are Hey bHLH transcription factors (TF) that are expressed in atrial (Hey1) and ventricular (Hey2) cardiomyocytes (CM) and in the developing endocardium (Hey1/2/L). The importance of Hey proteins for cardiac development is demonstrated by knockout (KO) mice, which suffer from lethal cardiac defects, such as ventricular septum defects (VSD), valve defects and cardiomyopathy. Despite this clear functional relevance, little is known about Hey downstream targets in the heart and the molecular mechanism by which they are regulated. Here, I use a cell culture system with inducible Hey1, Hey2 or HeyL expression to study Hey target gene regulation in HEK293 cells, in murine embryonic stem cells (ESC) and in ESC derived CM. In HEK293 cells, I could show that genome wide binding sites largely overlap between all three Hey proteins, but HeyL has many additional binding sites that are not bound by Hey1 or Hey2. Shared binding sites are located close to transcription start sites (TSS) where Hey proteins preferentially bind to canonical E boxes, although more loosely defined modes of binding exist. Additional sites only bound by HeyL are more scattered across the genome. The ability of HeyL to bind these sites depends on the C-terminal part of the protein. Although there are genes which are differently regulated by HeyL, it is unclear whether this regulation results from binding of additional sites by HeyL. Additionally, Hey target gene regulation was studied in ESC and differentiated CM, which are more relevant for the observed cardiac phenotypes. ESC derived CM contract in culture and are positive for typical cardiac markers by qRT PCR and staining. According to these markers differentiation is unaffected by prolonged Hey1 or Hey2 overexpression. Regulated genes are largely redundant between Hey1 and Hey2. These are mainly other TF involved in e.g. developmental processes, apoptosis, cell migration and cell cycle. Many target genes are cell type specifically regulated causing a shift in Hey repression of genes involved in cell migration in ESC to repression of genes involved in cell cycle in CM. The number of Hey binding sites is reduced in CM and HEK293 cells compared to ESC, most likely due to more regions of dense chromatin in differentiated cells. Binding sites are enriched at the proximal promoters of down-regulated genes, compared to up-or non-regulated genes. This indicates that up-regulation primarily results from indirect effects, while down-regulation is the direct results of Hey binding to target promoters. The extent of repression generally correlates with the amount of Hey binding and subsequent recruitment of histone deacetylases (Hdac) to target promoters resulting in histone H3 deacetylation. However, in CM the repressive effect of Hey binding on a subset of genes can be annulled, likely due to binding of cardiac specific activators like Srf, Nkx2-5 and Gata4. These factors seem not to interfere with Hey binding in CM, but they recruit histone acetylases such as p300 that may counteract Hey mediated histone H3 deacetylation. Such a scenario explains differential regulation of Hey target genes between ESC and CM resulting in gene and cell-type specific regulation. N2 - Der Notch Signalweg ist essenziell für die Herzentwicklung in Säugetieren. Er kontrolliert Zell-differenzierung, koordiniert Musterbildungsprozesse und reguliert Proliferation und Differenzierung. Kritische Notch Effektoren sind Hey bHLH Transkriptionsfaktoren, welche im Herzen in atrialen (Hey1) und ventrikulären (Hey2) Kardiomyozyten und dem sich entwickelnden Endokardium (Hey1/2/L) exprimiert werden. Die Bedeutung von Hey Proteinen während der Herzentwicklung wird an Hand von verschiedenen KO Mäusen ersichtlich, welche letale Herzdefekte, wie ventrikuläre Septumdefekte, Herzklappendefekte und Kardiomyopathien, entwickeln. Trotz dieser klaren funktionalen Relevanz ist wenig über Hey Zielgene im Herzen und den molekularen Mechanismus bekannt, über den diese reguliert werden. Hier wurde ein Zellkultursystem mit induzierbarer Expression von Hey1, Hey2 oder HeyL verwendet, um Hey Zielgene in HEK293, murinen embryonalen Stammzellen und in differenzierten Kardiomyozyten zu studieren. In HEK293 Zellen konnte ich zeigen, dass die Bindestellen im Genom weitestgehend zwischen allen drei Hey Proteinen überlappen, HeyL jedoch viele zusätzliche Bindestellen aufweist, welche weder von Hey1 noch Hey2 gebunden werden. Gemeinsame Bindestellen befinden sich nahe Transkriptionsstartstellen, präferentiell an kanonische E boxen. Die nur von HeyL gebunden Bindestellen sind mehr über das Genom verteilt. Dabei ist die Fähigkeit von HeyL diese Stellen zu binden vom C-terminalen Teil abhängig. Obwohl es Gene gibt, die unterschiedlich von HeyL reguliert werden, ist es auf Grund der sehr viel größeren Anzahl an HeyL Bindestellen unklar, ob diese Regulation das Resultat von zusätzlicher HeyL Bindung ist. Zusätzlich wurde die Regulation von Hey Zielgenen in embryonalen Stammzellen und differenzierten Kardiomyozyten untersucht, da diese Zellen für die beobachteten kardialen Phänotypen relevanter sind. Differenzierte Kardiomyozyten kontrahieren in Kultur und sind positiv für typische kardiale Marker an Hand von qRT-PCR und Färbungen. Nach diesen Markern ist die Differenzierung durch kontinuierliche Überexpression von Hey1 oder Hey2 unverändert. Die Hey1 und Hey2 regulierten Gene sind weitestgehend redundant. Viele Zielgene sind andere Transkriptionsfaktoren, die zum Beispiel an Entwicklungsprozessen, Apoptose, Zellmigration und dem Zellzyklus beteiligt sind. Diese werden oft Zelltyp spezifisch reguliert, was zur Folge hat, dass in embryonalen Stammzellen auch an der Zellmigration beteiligte Gene reprimiert werden, während es in Kardiomyozyten vor allem Gene sind, die den Zellzyklus betreffen. Die Zahl der Hey Bindestellen ist in Kardiomyozyten und HEK293 Zellen verglichen mit embryonalen Stammzellen reduziert, höchstwahrscheinlich da differenzierte Zellen weniger offenes Chromatin besitzen. Die Bindestellen sind in reprimierten Genen verglichen mit induzierten oder nicht regulierten Genen angereichert. Dies deutet an, dass eine Induktion meist durch indirekte Effekte zu Stande kommt, während eine Repression das direkte Ergebnis der Hey Bindung an Zielpromotoren ist. Die Stärke der Repression korreliert dabei generell mit der Menge an Promoter gebundenem Hey Protein, welches Histon-Deacetylasen rekrutiert und zu einer Reduktion der Histon H3 Acetylierung führt. In Kardiomoyzyten wird der repressive Effekt von Hey für bestimmte Gene unterbunden, wahrscheinlich durch Bindung herzspezifischer Aktivatoren, wie Srf, Nkx2 5 und Gata4. Diese Faktoren scheinen nicht die Bindung von Hey zu beeinflussen, aber sie rekrutieren Acetylasen wie p300, welche Hey vermittelter Histon H3 Deacetylierung entgegenwirken. Dieses Model erklärt die unterschiedliche Regulation von Hey Zielgenen zwischen embryonalen Stammzellen und Kardiomyozyten. KW - Transkriptionsfaktor KW - Gen notch KW - Gene regulation KW - Notch signalling KW - Hey proteins KW - Genregulation KW - Notch Signalweg KW - Hey Proteine Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-101663 ER - TY - THES A1 - Orth, Barbara T1 - Identification of an atypical peptide binding mode of the BTB domain of the transcription factor MIZ1 with a HUWE1-derived peptide T1 - Identifikation eines neuen Bindungsmodus zwischen der BTB-Domäne des Transkriptionsfaktors MIZ1 und eines Peptids aus der HECT-E3-Ligase HUWE1 N2 - Ubiquitination is a posttranslational modification with immense impact on a wide range of cellular processes, including proteasomal degradation, membrane dynamics, transcription, translation, cell cycle, apoptosis, DNA repair and immunity. These diverse functions stem from the various ubiquitin chain types, topologies, and attachment sites on substrate proteins. Substrate recruitment and modification on lysine, serine or threonine residues is catalyzed by ubiquitin ligases (E3s). An important E3 that decides about the fate of numerous substrates is the HECT-type ubiquitin ligase HUWE1. Depending on the substrate, HUWE1 is involved in different processes, such as cell proliferation and differentiation, DNA repair, and transcription. One of the transcription factors that is ubiquitinated by HUWE1 is the MYC interacting zinc finger protein 1 (MIZ1). MIZ1 is a BTB/POZ (Bric-à-brac, Tramtrack and Broad-Complex/Pox virus and zinc finger) zinc finger (ZF) protein that binds to DNA through its 13 C2H2-type zinc fingers and either activates or represses the transcription of target genes, including genes involved in cell cycle arrest, such as P21CIP1 (CDKN1A). The precise functions of MIZ1 depend on its interactions with the MYC-MAX heterodimer, but also its heterodimerization with other BTB-ZF proteins, such as BCL6 or NAC1. How MIZ1 interacts with HUWE1 has not been studied and, as a consequence, it has not been possible to rationally develop tools to manipulate this interaction with specificity in order to better understand the effects of the interaction on the transcriptional function of MIZ1 on target genes or processes downstream. One aspect of my research, therefore, aimed at characterizing the MIZ1-HUWE1 interaction at a structural level. I determined a crystal structure of the MIZ1-BTB-domain in complex with a peptide, referred to as ASC, derived from a C terminal region of HUWE1, previously named ‘activation segment’. The binding mode observed in this crystal structure could be validated by binding and activity assays in vitro and by cell-based co-IP experiments in the context of N-terminally truncated HUWE1 constructs. I was not able to provide unambiguous evidence for the identified binding mode in the context of full-length HUWE1, indicating that MIZ1 recognition by HUWE1 requires yet unknown regions in the cell. While the structural details of the MIZ1-HUWE1 interaction remains to be elucidated in the context of the full-length proteins, the binding mode between MIZ1BTB and ASC revealed an interesting, atypical structural feature of the BTB domain of MIZ1 that, to my knowledge, has not been described for other BTB-ZF proteins: The B3 region in MIZ1BTB is conformationally malleable, which allows for a HUWE1-ASC-peptide-mediated β-sheet extension of the upper B1/B2-strands, resulting in a mixed, 3 stranded β-sheet. Such β-sheet extension does not appear to occur in other homo- or heterodimeric BTB-ZF proteins, including MIZ1-heterodimers, since these proteins typically possess a pre-formed B3-strand in at least one subunit. Instead, BCL6 co repressor-derived peptides (SMRT and BCOR) were found to extend the lower β-sheet in BCL6BTB by binding to an adjacent ‘lateral groove’. This interaction follows a 1:1 stoichiometry, whereas the MIZ1BTB-ASC-complex shows a 2:1 stoichiometry. The crystal structure of the MIZ1BTB-ASC-complex I determined, along with comparative binding studies of ASC with monomeric, homodimeric, and heterodimeric MIZ1BTB variants, respectively, suggests that ASC selects for MIZ1BTB homodimers. The structural data I generated may serve as an entry point for the prediction of additional interaction partners of MIZ1 that also have the ability to extend the upper β-sheet of MIZ1BTB. If successful, such interaction partners and structures thereof might aid the design of peptidomimetics or small-molecule inhibitors of MIZ1 signaling. Proof-of-principle for such a structure-guided approach targeting BTB domains has been provided by small-molecule inhibitors of BCL6BTB co-repressors interactions. If a similar approach led to molecules that interfere with specific interactions of MIZ1, they would provide intriguing probes to study MIZ1 biology and may eventually allow for the development of MIZ1-directed cancer therapeutics. N2 - Ubiquitinierung ist eine posttranslationale Modifikation mit weitreichendem Einfluss auf eine Vielzahl von zellulären Prozessen, wie proteasomale Degradation, Membrandynamik, Transkription, Translation, Zellzyklus, Apoptose, DNA-Reparatur und Immunität. Grundlage für diese Diversität ist die Möglichkeit, dass Substrate an unterschiedlichen Stellen mit verschiedenen Ubiquitin-Kettentypen modifiziert werden können. Die Substratrekrutierung und -modifikation an Lysin-, Serin oder Threonin Resten wird durch Ubiquitin-Ligasen (E3s) katalysiert. Eine wichtige Ubiquitin-Ligase, die zahlreiche Substrate reguliert, ist die HECT-Ligase HUWE1. Abhängig vom Substrat ist HUWE1 an verschiedenen Prozessen, wie der Zellproliferation und -differenzierung, DNA-Reparatur, aber auch Transkription beteiligt. Ein Transkriptionsfaktor, der von HUWE1 ubiquitiniert wird, ist MIZ1 (MYC interacting zinc finger protein 1). MIZ1 ist ein BTB/POZ (Bric-à-brac, Tramtrack and Broad-Complex/Pox Virus and Zinc finger) Zinkfinger(ZF)-Protein, das über seine 13 C2H2 Zinkfinger an DNA bindet und so die Transkription von verschiedenen Zielgenen aktivieren oder reprimieren kann. MIZ1-Zielgene sind unter anderem am Zellzyklusarrest beteiligt, wie z.B. das Gen P21CIP1 (CDKN1A). Die biologischen Funktionen von MIZ1 werden unter anderem durch seine Interaktion mit dem MYC MAX-Heterodimer, aber auch durch Heterodimerisierung mit anderen BTB ZF Proteinen, wie BCL6 oder NAC1, reguliert. Wie MIZ1 mit der HUWE1-Ligase interagiert, wurde bislang strukturell noch nicht untersucht, weshalb noch nicht gezielt kleine Moleküle zur Manipulation der Interaktion entwickelt werden konnten, um Einfluss auf die transkriptionellen Funktionen von MIZ1 oder seiner Zielgene zu nehmen. Meine Untersuchungen zielten daher unter anderem darauf ab, die MIZ1-HUWE1-Interaktion auf struktureller Ebene zu charakterisieren. Ich konnte eine Kristallstruktur der MIZ1-BTB-Domäne in Komplex mit dem HUWE1-Peptid ASC lösen, dessen Sequenz in der C-terminalen Region von HUWE1 zu finden ist und zuvor als „activation segment“ definiert wurde. Der in dieser Kristallstruktur beobachtete Bindungsmodus konnte durch Bindungs- und Aktivitätsassays in vitro und durch co-IP-Experimente in zellbasierten Assays validiert werden, jedoch nur im Zusammenhang mit N-terminal verkürzten HUWE1 Konstrukten. Es war mir nicht möglich, diesen Bindungsmodus im Kontext des HUWE1-Proteins voller Länge nachzuweisen, was darauf hindeutet, dass bei der MIZ1-Erkennung durch HUWE1 in der Zelle andere Regionen beteiligt sein könnten. Während die strukturellen Details der MIZ1-HUWE1-Interaktion im Kontext der Proteine voller Länge noch aufgeklärt werden müssen, zeigte der Bindungsmodus zwischen MIZ1BTB und ASC ein atpyisches Strukturmerkmal der BTB-Domäne von MIZ1, das meines Wissens bislang in keinem anderen BTB-ZF-Protein beschrieben wurde: Die B3-Region in MIZ1BTB zeigt eine untypische konformationelle Flexibilität, die es erlaubt, dass das HUWE1-ASC-Peptid die B1/B2-Stränge im oberen Segment von MIZ1BTB zu einem 3-strängigen β-Faltblatt erweitert. Eine solche β-Faltblatt-Erweiterung scheint in anderen homo- oder heterodimeren BTB-ZF-Proteinen, einschließlich MIZ1-Heterodimeren, nicht aufzutreten, da diese Proteine typischerweise bereits einen B3-Strang in mindestens einer Untereinheit aufweisen. Stattdessen konnte beobachtet werden, dass Peptidliganden, wie sie von den BCL6 Co-Repressoren SMRT und BCOR abgeleitet wurden, ein β-Faltblatt im unteren Segment von BCL6BTB erweitern, indem sie in der sogenannten „lateral groove“ binden, die in unmittelbarer Nähe des betreffenden β-Faltblattes lokalisiert ist. Während die Interaktion von BCL6BTB mit Co-Repressor-Peptiden eine 1:1 Stöchiometrie zeigt, beobachtete ich für den MIZ1BTB-ASC-Komplex eine 2:1 Stöchiometrie. Die Kristallstruktur des MIZ1BTB-ASC-Komplexes, zusammen mit Bindungsassays, die die Interaktion zwischen ASC und monomerem, homodimerem bzw. heterodimerem MIZ1BTB untersuchten, deuten darauf hin, dass ASC spezifisch mit MIZ1BTB-Homodimeren interagiert. Daher könnten die von mir gewonnenen Strukturinformationen dazu dienen, weitere MIZ1-Bindungspartner vorherzusagen. Falls erfolgreich, könnten die neu identifizierten Interaktionspartner und zugehörige Strukturen dazu genutzt werden, Peptidomimetika und niedermolekulare Inhibitoren zu entwickeln, die spezifische Interaktionen von MIZ1 und die zugehörigen zellulären Prozesse stören und somit als Werkzeuge zum besseren Verständnis der MIZ1 Biologie dienen könnten. Vorbild dabei können zahlreiche niedermolekulare Verbindungen sein, die zur Störung der Co-Repressor-Peptid-Bindung an BCL6BTB entwickelt wurden. Wenn es auf ähnliche Weise gelänge, spezifischen Einfluss auf die transkriptionelle Funktion von MIZ1 zu nehmen, so könnte dies von hohem therapeutischen Nutzen in der Bekämpfung verschiedener Krebsarten sein. KW - Ubiquitin KW - Ubiquitin-Protein-Ligase KW - Ubiquitinierung KW - Transkriptionsfaktor KW - Zink-Finger-Proteine KW - HUWE1 KW - MIZ1 KW - BTB domain KW - binding mode KW - peptide Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-250447 ER - TY - THES A1 - Carstensen, Anne Carola T1 - Identification of novel N-MYC interacting proteins reveals N-MYC interaction with TFIIIC T1 - Identifizierung von neuen N-MYC interagierenden Proteinen offenbart N-MYC's Interaktion mit TFIIIC N2 - N-MYC is a member of the human MYC proto-oncogene family, which comprises three transcription factors (C-, N- and L-MYC) that function in multiple biological processes. Deregulated expression of MYC proteins is linked to tumour initiation, maintenance and progression. For example, a large fraction of neuroblastoma displays high N-MYC levels due to an amplification of the N-MYC encoding gene. MYCN-amplified neuroblastoma depend on high N-MYC protein levels, which are maintained by Aurora-A kinase. Aurora-A interaction with N-MYC interferes with degradation of N-MYC via the E3 ubiquitin ligase SCFFBXW7. However, the underlying mechanism of Aurora-A-mediated stabilisation of N-MYC remains to be elucidated. To identify novel N-MYC interacting proteins, which could be involved in N-MYC stabilisation by Aurora-A, a proteomic analysis of purified N-MYC protein complexes was conducted. Since two alanine mutations in MBI of N-MYC, T58A and S62A (N-MYC mut), disable Aurora-A-mediated stabilisation of N-MYC, N-MYC protein complexes from cells expressing either N-MYC wt or mut were analysed. Proteomic analysis revealed that N-MYC interacts with two deubiquitinating enzymes, USP7 and USP11, which catalyse the removal of ubiquitin chains from target proteins, preventing recognition by the proteasome and subsequent degradation. Although N-MYC interaction with USP7 and USP11 was confirmed in subsequent immunoprecipitation experiments, neither USP7, nor USP11 was shown to be involved in the regulation of N-MYC stability. Besides USP7/11, proteomic analyses identified numerous additional N-MYC interacting proteins that were not described to interact with MYC transcription factors previously. Interestingly, many of the identified N-MYC interaction partners displayed a preference for the interaction with N-MYC wt, suggesting a MBI-dependent interaction. Among these were several proteins, which are involved in three-dimensional organisation of chromatin domains and transcriptional elongation by POL II. Not only the interaction of N-MYC with proteins functioning in elongation, such as the DSIF component SPT5 and the PAF1C components CDC73 and CTR9, was validated in immunoprecipitation experiments, but also with the POL III transcription factor TFIIIC and topoisomerases TOP2A/B. ChIP-sequencing analysis of N-MYC and TFIIIC subunit 5 (TFIIIC5) revealed a large number of joint binding sites in POL II promoters and intergenic regions, which are characterised by the presence of a specific motif that is highly similar to the CTCF motif. Additionally, N-MYC was shown to interact with the ring-shaped cohesin complex that is known to bind to CTCF motifs and to assist the insulator protein CTCF. Importantly, individual ChIP experiments demonstrated that N-MYC, TFIIIC5 and cohesin subunit RAD21 occupy joint binding sites comprising a CTCF motif. Collectively, the results indicate that N-MYC functions in two biological processes that have not been linked to MYC biology previously. Furthermore, the identification of joint binding sites of N-MYC, TFIIIC and cohesin and the confirmation of their interaction with each other suggests a novel function of MYC transcription factors in three-dimensional organisation of chromatin. N2 - N-MYC ist ein Mitglied der humanen MYC proto-Onkogen Familie, welche drei Transkriptionsfaktoren umfasst (C-,N- und L-MYC), die in zahlreichen biologischen Prozessen fun-gieren. Deregulierte Expression der MYC Proteine ist mit Tumorinitiierung, -erhalt und -progression verbunden. Zum Beispiel zeigt ein großer Anteil an Neuroblastomen aufgrund einer Amplifizierung des N-MYC kodierenden Gens hohe N-MYC Level. MYCN-amplifizierte Neuroblastome hängen von den hohen N-MYC Protein Leveln ab, die durch die Aurora-A Kinase erhalten werden. Die Interaktion von Aurora-A mit N-MYC behindert den Abbau von N-MYC durch die E3 Ubiquitin Ligase SCFFBXW7. Allerdings muss der zugrunde liegende Mechanismus der Aurora-A vermittelten Stabilisierung von N-MYC noch aufgedeckt werden. Um neue N-MYC interagierende Proteine zu identifizieren, welche in der N-MYC Stabilisierung durch Aurora-A involviert sind, wurde eine Proteom Analyse der aufgereinigten N-MYC Proteinkomplexe durchgeführt. Da zwei Alanin-Mutationen in MBI von N-MYC, T58A und S62A (N-MYC mut), die Aurora-A vermittelte Stabilisierung von N-MYC verhindern, wurden N-MYC Protein-Komplexe von Zellen, die entweder N-MYC wt oder mut exprimieren analysiert. Die Proteom Analyse offenbarte, dass N-MYC mit zwei Deubiquitinierenden Enzymen, USP7 und USP11, interagiert, welche das Entfernen von Ubiquitinketten von Zielproteinen katalysieren und dadurch die Erkennung durch das Proteasom und den darauf folgenden Abbau verhindern. Obwohl die Interaktion von N-MYC mit USP7 und USP11 in darauf folgenden Immunpräzipitationsexperimenten bestätigt wurde, konnnte weder für USP7, noch für USP11 gezeigt werden, dass es in die Regulierung der Stabilität von N-MYC involviert ist. Neben USP7/11 wurden in der Proteom Analyse zusätzlich zahlreiche mit N-MYC interagierende Proteine identifiziert, die zuvor noch nicht beschrieben wurden mit MYC Transkriptionsfaktoren zu interagieren. Interessanterweise zeigten viele der identifizierten N-MYC Interaktionspartner eine Präferenz für die Interaktion mit N-MYC wt, was eine MBI-abhängige Interaktion suggeriert. Unter diesen waren einige Proteine, die in die drei-dimensionale Organisation von Chromatindomänen und transkriptioneller Elongation durch POL II involviert sind. Nicht nur die Interaktion von N-MYC mit Proteinen, die in der Elongation agieren, wie die DSIF Komponente SPT5 und die PAF1C Komponenten CDC73 und CTR9, wurden in Immunpräzipitationsexperimenten bestätigt, sondern auch mit dem POL III Transkriptionsfaktor TFIIIC und den Topoisomerasen TOP2A/B. Analyse von ChIP-Sequenzierungsexperimenten für N-MYC und TFIIIC Untereinheit 5 (TFIIIC5) offenbarte eine große Anzahl von gemeinsamen Bindungsstellen in POL II Promotoren und intergenen Regionen, welche durch das Vorkommen eines speziellen Motivs gekennzeichent waren, das dem CTCF Motiv sehr ähnlich ist. Zusätzlich wurde gezeigt, dass N-MYC mit dem ringförmigen Cohesin Komplex interagiert, der dafür bekannt ist an CTCF Motive zu binden und dem Insulator Protein CTCF zu assistieren. Entscheidender Weise zeigten individuelle ChIP Experimente, dass N-MYC, TFIIIC5 und die Cohesin Untereinheit RAD21 gemeinsame Bindungstellen haben, die ein CTCF Motiv enthalten. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse darauf hin, dass N-MYC in zwei biologischen Prozessen fungiert, die zuvor nicht mit der Biologie von MYC verbunden wurden. Zudem suggeriert die Identifizierung von gemeinsamen Bindungstellen von N-MYC, TFIIIC und Cohesin und die Bestätigung der Interaktion untereinander eine neue Funktion von MYC Transkriptionsfaktoren in der drei-dimensionalen Organisation von Chromatin. KW - Biologie KW - Transkriptionsfaktor KW - Onkogen KW - N-MYC KW - neuroblastoma KW - TFIIIC KW - Aurora-A KW - mass spectrometry KW - cohesin Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-143658 ER - TY - THES A1 - Hoffmann, Helene T1 - Identifying regulators of tumor vascular morphology T1 - Identifizierung von Regulatoren der Tumorgefäßmorphologie N2 - In contrast to normal vessels, tumor vasculature is structurally and functionally abnormal. Tumor vessels are highly disorganized, tortuous and dilated, with uneven diameter and excessive branching. Consequently, tumor blood flow is chaotic, which leads to hypoxic and acidic regions in tumors. These conditions lower the therapeutic effectiveness and select for cancer cells that are more malignant and metastatic. The therapeutic outcome could be improved by increasing the functionality and density of the tumor vasculature. Tumor angiogenesis also shows parallels to epithelial to mesenchymal transition (EMT), a process enabling metastasis. Metastasis is a multi-step process, during which tumor cells have to invade the surrounding host tissue to reach the circulation and to be transported to distant sites. We hypothesize that the variability in the phenotype of the tumor vasculature is controlled by the differential expression of key transcription factors. Inhibiting these transcription factors might be a promising way for angiogenic intervention and vascular re-engineering. Therefore, we investigated the interdependence of tumor-, stroma- and immune cell-derived angiogenic factors, transcription factors and resulting vessel phenotypes. Additionally, we evaluated whether transcription factors that regulate EMT are promising targets for vascular remodeling. We used formalin fixed paraffin embedded samples from breast cancer patients, classified according to estrogen-, progesterone- and human epidermal growth factor receptor (HER) 2 status. Establishing various techniques (CD34 staining, laser microdissection, RNA isolation and expression profiling) we systematically analyzed tumor and stroma-derived growths factors. In addition, vascular parameters such as microvessel size, area, circularity and density were assessed. Finally the established expression profiles were correlated with the observed vessel phenotype. As the SNAI1 transcriptional repressor is a key regulator of EMT, we examined the effect of vascular knockdown of Snai1 in murine cancer models (E0771, B16-F10 and lewis lung carcinoma). Among individual mammary carcinomas, but not among subtypes, strong differences of vascular parameters were observed. Also, little difference between lobular carcinomas and ductal carcinomas was found. Vessel phenotype of Her2 enriched carcinomas was similar to that of lobular carcinomas. Vessel morphology of luminal A and B and basal-like tumors resembled each other. Expression of angiogenic factors was variable across subtypes. We discovered an inverse correlation of PDGF-B and VEGF-A with vessel area in luminal A tumors. In these tumors expression of IL12A, an inhibitor of angiogenesis, was also correlated with vessel size. Treatment of endothelial cells with growth factors revealed an increased expression of transcription factors involved in the regulation of EMT. Knockdown of Snai1 in endothelial cells of mice increased tumor growth and decreased hypoxia in the E0771 and the B16-F10 models. In the lewis lung carcinomas, tumor vascularity and biodistribution of doxorubicin were improved. Here, doxorubicin treatment in combination with the endothelial cell-specific knockdown did slow tumor growth. This shows that SNAI1 is important for a tumor's vascularization, with the significance of its role depending on the tumor model. The methods established in this work open the way for the analysis of the expression of key transcription factors in vessels of formalin fixed paraffin embedded tumors. This research enables us to find novel targets for vascular intervention and to eventually design novel targeted drugs to inhibit these targets. N2 - In Tumoren, im Vergleich zu gesundem Gewebe, sind Aufbau und Funktionsweise von Blutgefäßen abnormal. Tumorgefäße sind unorgansiert, stark gewunden und geweitet, und weisen einen ungleichmäßigen Durchmesser sowie häufige Verzweigungen auf. Die chaotische Durchblutung führt zu hypoxischen und sauren Regionen. Diese abnormale Gefäßstruktur verringert sowohl die Einbringung, als auch die Wirksamkeit von Medikamenten und fördert zudem Invasivität und Metastasierung. Die Tumorbehandlung könnte durch eine "Normalisierung" der Gefäße sowie durch die Verbesserung der Dichte der Tumorblutgefäße erleichtert werden, da Medikamente so leichter das Tumorzentrum erreichen. In Tumoren weist der Prozess der Angiogenese Parallelen zur epithelial-mesenchymalen Transition (EMT) auf. Die EMT spielt eine zentrale Rolle bei der Metastasierung. Hierbei handelt es sich um einen mehrstufigen Prozess, bei dem Tumorzellen in das umgebende Wirtsgewebe eindringen um den Blutkreislauf zu erreichen und so zu weiter entfernten Organen zu gelangen. Laut unserer Hypothese werden die unterschiedlichen Phenotypen der Tumorblutgefäße durch die Expression verschiedener Schlüssel-Transkriptionsfaktoren kontrolliert. Die Hemmung dieser Transkriptionsfaktoren wäre folglich eine vielversprechende Möglichkeit in die Gefäßsturktur einzugreifen und sie zu restrukturieren. Deshalb wurde die Wechselwirkungen zwischen angiogenen Faktoren, die von Tumorzellen, Stromazellen und Zellen des Immunsystems abgesondert werden und Transkriptionsfaktoren sowie den resultierenden Gefäßphenotypen untersucht. Zudem wurde evaluiert, ob Transkriptionsfaktoren, die bei der EMT von Bedeutung sind, ein therapeutisches Ziel zur Umorganisation der Gefäßstruktur darstellen könnten. Für diese Studie wurden humane, in Formalin fixierte und in Paraffin eingebette, Proben von Brustkrebspatienten verwendet. Diese Proben wurden anhand des Rezeptorstatus von Östrogen-, Progesteron- und humanem epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (HER) 2 in tumorbiologische Untergruppen eingeordnet. Die Etablierung verschiedener Techniken (CD34 Gewebefärbung, Laser-Mikrodissektion, RNA-Isolierung und Erstellung von Expressionsprofilen) ermöglichte es, systematisch Wachstumsfaktoren, die von den Tumoren und ihrem umgebenden Stroma sezerniert werden, zu analysieren. Zusätzlich untersuchten wir vaskuläre Parameter wie Gefäßgröße, -fläche, -dichte und -zirkularität. Schließlich wurden die erstellten Expressionsprofile mit den Gefäßeigenschaften korreliert. In verschiedenen murinen Krebsmodellen (E0771, B16-F10 und Lewis-Lungenkarzinom) untersuchten wir die Auswirkung der Herrunterregulierung des Transkriptionsfaktors SNAI1 in Blutgefäßen. SNAI1 spielt eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der EMT. Es zeigte sich, dass die einzelnen Brustkrebsproben sich bezüglich der untersuchten Gefäßparameter stark voneinander unterschieden. Zwischen den Subtypen hingegen waren keine Unterschiede zu sehen. Lobuläre und duktale Karzinome unterschieden sich kaum voneinander. Der Gefäßphenotyp der HER2-positiven Proben ähnelte dem der lobulären. Des Weiteren ähnelten sich Karzinome vom Luminal A- und B-Typ so wie vom Basal-Zell-Typ in ihrer Gefäßmorphologie. Das Expressionsmuster der Wachstumsfaktoren variierte von Tumor zu Tumor und innerhalb der Subytpen. Es stellte sich heraus, dass die Expression von PDGF-B und VEGF-A im Subtyp Luminal A invers mit der Gefäßfläche korreliert ist. Außerdem war in dieser Gruppe die Expression des Angiogenese-Hemmers IL-12A direkt mit der Gefäßgröße korreliert. Die Behandlung von Endothelzellen mit Wachstumsfaktoren zeigte eine erhöhte Expression von Transkriptionsfaktoren, die an der Regulierung der EMT beteiligt sind. Die Herrunterregulierung von Snai1 in Endothelzellen im Tierversuch führte zu einer Zunahme des Tumorwachstums sowie zu einem Rückgang der Hypoxie in den Tumormodellen E0771 und B16-F10. In den Lewis-Lungenkarzinomen kam es zu einer Verbesserung der Blutgefäßmorphologie und der Verteilung von Doxorubicin im Tumorgewebe. Die Therapie mit Doxorubicin in Kombination mit der endothellzell-spezifischen Herrunterregulierung von Snai1 zeigte zudem eine stärkere Hemmung des Tumorwachstums. Die Methoden, die in dieser Arbeit etabliert wurden, ermöglichen die Analyse der Expression von Schlüssel-Transkriptionsfaktoren in den Gefäßen von Formalin fixierten und in Paraffin eingebetten Proben. Dies macht es wiederum möglich neue Angriffspunkte für die Gefäßmodulation zu finden und schlußendlich neue, darauf gerichtete Medikamente zu entwickeln. KW - Antiangiogenese KW - Angiogenese KW - Tumor KW - Transkriptionsfaktor KW - tumor angiogenesis KW - epithelial-mesenchymal transition KW - tumor vascular morphologie KW - Tumorangiogenese KW - Epithelial-mesenchymale Transition KW - Tumorgefäßmorphologie Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142348 ER - TY - THES A1 - Maurus, Katja T1 - Melanoma Maintenance by the AP1 Transcription Factor FOSL1 T1 - Der Einfluss des Transkriptionsfaktors FOSL1 auf protumorigene Effekte im Melanom N2 - Identifying novel driver genes in cancer remains a crucial step towards development of new therapeutic approaches and the basic understanding of the disease. This work describes the impact of the AP1 transcription activator component FOSL1 on melanoma maintenance. FOSL1 is strongly upregulated during the progression of melanoma and the protein abundance is highest in metastases. I found that the regulation of FOSL1 is strongly dependent on ERK1/2- and PI3K- signaling, two pathways frequently activated in melanoma. Moreover, the involvement of p53 in FOSL1 regulation in melanoma was investigated. Elevated levels of the tumor suppressor led to decreased FOSL1 protein levels in a miR34a/miR34c- dependent manner. The benefit of elevated FOSL1 amounts in human melanoma cell lines was analyzed by overexpression of FOSL1 in cell lines with low endogenous FOSL1 levels. Enhanced levels of FOSL1 had several pro-tumorigenic effects in human melanoma cell lines. Besides increased proliferation and migration rates, FOSL1 overexpression induced the colony forming ability of the cells. Additionally, FOSL1 was necessary for anchorage independent growth in 3D cell cultures. Microarray analyses revealed novel downstream effectors of FOSL1. On the one hand, FOSL1 was able to induce the transcription of different neuron-related genes, such as NEFL, NRP1 and TUBB3. On the other hand, FOSL1 influenced the transcription of DCT, a melanocyte specific gene, in dependence of the differentiation of the melanoma cell line, indicating dedifferentiation. Furthermore, FOSL1 induced the transcription of HMGA1, a chromatin remodeling protein with reprogramming ability, which is characteristic for stem cells. Consequently, the influence of HMGA1 on melanoma maintenance was investigated. In addition to decreased proliferation and reduced anoikis resistance, HMGA1 knockdown reduced melanoma cell survival. Interestingly, the FOSL1 induced pro-tumorigenic effects were demonstrated to be dependent on the HMGA1 level. HMGA1 manipulation reversed FOSL1 induced proliferation and colony forming ability, as well as the anchorage independent growth effect. In conclusion, I could show that additional FOSL1 confers a clear growth benefit to melanoma cells. This benefit is attributed to the induction of stem cell determinants, but can be blocked by the inhibition of the ERK1/2 or PI3K signaling pathways. N2 - Die Identifizierung von neuen onkogenen Mutationen in Tumoren ist nach wie vor ein unerlässlicher Schritt für die Entwicklung neuer Therapieansätze und für das grundlegende Verständnis der Tumorerkrankungen. Die vorliegende Arbeit beschreibt den Einfluss der AP1-Transkriptionskomplexkomponente FOSL1 auf die Tumorigenität des humanen Melanoms. FOSL1 wird im Verlauf der Melanomentwicklung stark hochreguliert und ist in Metastasen am stärksten exprimiert. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass FOSL1 Expression stark von ERK1/2- und PI3K- vermittelten Signalen abhängig ist, welche im Melanom sehr häufig übermäßig aktiviert sind. Auch p53 ist an der Regulierung von FOSL1 im Melanom beteiligt. Durch eine Erhöhung der Proteinmenge dieses Tumorsuppressors konnte ich die Verminderung des FOSL1-Levels beobachten und konnte weiterhin zeigen, dass dieser Regulation ein miR34a/c- vermittelter Mechanismus unterliegt. Weiterhin untersuchte ich den Vorteil einer erhöhten FOSL1- Menge in menschlichen Melanomzellen, indem FOSL1 in Zellen mit niedrigem endogenen FOSL1- Gehalt konstitutiv überexprimiert wurde. Erhöhte FOSL1- Mengen hatten unterschiedliche protumorigene Effekte auf humane Melanomzellen. Neben deutlich gesteigerter Proliferation und Migration konnte ich auch die FOSL1- induzierte Koloniebildung der Zellen demonstrieren. Ergänzend konnte gezeigt werden, dass FOSL1- Expression für Anoikisresistenz von Zellen notwendig ist. Des Weiteren konnte mit Hilfe einer Microarrayanalyse neue FOSL1- regulierte Effektoren identifiziert werden. Zunächst konnte demonstriert werden, dass FOSL1 zahlreiche neuronale Gene in ihrer Expression beeinflusst. Im Speziellen wurde NEFL, NRP1 und TUBB3 validiert. Zusätzlich nahm FOSL1 Einfluss auf die Expression von DCT, einem melanozytenspezifisch exprimierten Gen. Die Regulierung von DCT durch FOSL1 war abhängig vom Differenzierungsgrad der untersuchten Melanomzelllinien und wies, zusammen mit der Induktion von neuronal-assoziierten Genen, auf Dedifferenzierungsvorgänge hin. Neben den neuronalen Genen wurde auch die Expression von HMGA1, einem Chromatin-Remodeling-Faktor mit Reprogrammierungseigenschaften, durch FOSL1 induziert, was unter anderem charakteristisch für Stammzelligkeit ist. Infolge dieser Beobachtungen wurde der Einfluss von HMGA1 auf das humane Melanom untersucht. Die Herabregulierung von HMGA1 hatte unterschiedliche antitumorigene Effekte auf Melanomzellen. Zusätzlich zu stark verminderter Proliferation und Anoikisresistenz zeigten die Melanomzellen auch reduzierte Überlebensraten. Interessanterweise waren die FOSL1- induzierten, protumorigenen Effekte stark abhängig vom HMGA1- Gehalt der Zellen. Die Manipulation der HMGA1- Level machte die FOSL1- induzierte Proliferation, die Fähigkeit zur Koloniebildung und die Anoikisresistenz rückgängig. Zusammenfassend konnte ich darstellen, dass zusätzliches FOSL1 einer Melanomzelle einen klaren Wachstumsvorteil verschafft. Dieser Vorteil ist der Induktion von Stammzelldeterminanten zu verdanken und kann durch die spezifische Inhibierung von ERK1/2- und PI3K- Signalkaskaden verhindert werden. KW - Melanom KW - FOSL1 KW - Melanoma Maintenance KW - Transkriptionsfaktor Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-142995 ER - TY - THES A1 - Alrefai, Hani Gouda Alsaid T1 - Molecular Characterization of NFAT Transcription Factors in Experimental Mouse Models T1 - Molekulare Charakterisierung von NFAT-Transkriptionsfaktoren in experimentellen Mausmodellen N2 - In this work we wanted to investigate the role of NFATc1 in lymphocyte physiology and in pathological conditions (eg. psoriasis). NFATc1 is part of the signal transduction pathways that regulates B cells activation and function. NFATc1 has different isoforms that are due to different promoters (P1 and P2), polyadenylation and alternative splicing. Moreover, we tried to elucidate the points of interactions between the NFAT and the NF-κB pathways in activated B-cell fate. NFAT and NF-κB factors share several properties, such as a similar mode of induction and architecture in their DNA binding domain. We used mice which over-express a constitutive active version of NFATc1/α in their B cells with -or without- an ablated IRF4. IRF4 inhibits cell cycle progression of germinal center B cell-derived Burkitt’s lymphoma cells and induces terminal differentiation toward plasma cells. Our experiments showed that a ‘double hit’ in factors affecting B cell activation (NFATc1 in this case) and late B cell Differentiation (IRF4 in this case) alter the development of the B cells, lead to increase in their numbers and increase in stimulation induced proliferation. Therefore, the overall picture indicates a link between these 2 genes and probable carcinogenic alterations that may occur in B cells. We also show that in splenic B cells, c-Rel (of the NF-κB canonical pathway) Support the induction of NFATc1/αA through BCR signals. We also found evidence that the lack of NFATc1 affects the expression of Rel-B (of the NF-κB non-canonical pathway). These data suggest a tight interplay between NFATc1 and NF-κB in B cells, influencing the competence of B cells and their functions in peripheral tissues. We also used IMQ-induced psoriasis-like inflammation on mice which either lack NFATc1 from B cell. Psoriasis is a systemic chronic immunological disease characterized primarily by abnormal accelerated proliferation of the skin keratinocytes. In psoriasis, the precipitating event leads to immune cell activation. Our experiments showed that NFATc1 is needed for the development of psoriasis. It also showed that IL-10 is the link that enables NFAT from altering the B cell compartment (eg Bregs) in order to affect inflammation. The important role of B cell in psoriasis is supported by the flared up psoriasis-like inflammation in mice that lack B cells. Bregs is a special type of B cells that regulate other B cells and T cells; tuning the immunological response through immunomodulatory cytokines. N2 - Diese Arbeit befasst sich mit der Regulation und der Funktion des Transkriptionsfaktors NFATc1 (“nuclear factor of activated T-cells c1) in B-Lymphozyten. Hierzu wurde zum einen die transkriptionelle Kontrolle des Nfatc1-Gens in aktivierten B-Lymphozyten und zum anderen die Bedeutung dieses Faktors für die Wachstumskontrolle und Autoimmunität anhand verschiedener Modellsysteme analysiert. Sechs verschiedene NFATc1-Isoformen können in B-Lymphozyten durch die Nutzung zweier verschiedener Promotoren, zweier Polyadenylierungsstellen und eines alternativen Splicings generiert werden. Wir zeigen hier, dass insbesondere die NF-kB Faktoren c-Rel und p50 eine essentielle Bedeutung für die starke Induktion des Promoters P1 und damit der Expression der kurzen Isoform NFATc1A in B-Zell-Rezeptor-stimulierten B-Zellen spielen. Interessanterweise zeigen NFATc1-defiziente B-Lymphozyten eine geschwächte Aktivierung der NF-kB-Faktoren, was auf eine enge Verknüpfung dieser zwei Signalwege hindeutet. NFATc1-defiziente B-Lymphozyten weisen eine Aktivierungs- und Wachstumsschwäche auf (Bhattacharyya S., et.al.). Hier zeigen wir, dass die Überexpression von konstitutiv aktivem NFATc1A in B-Lymphozyten, insbesondere wenn dies im Kontext einer IRF4-Defizienz geschieht, zu einer verstärkten Expansion der B-Zellpopulation, insbesondere nach deren Aktivierung, führt. Dies belegt die kritische Bedeutung, die der wohldosierten Expressions- und Aktivierungskontrolle der NFATc1-Faktoren in B-Lymphozyten zukommt. Dies zeigt sich auch in einem Imiquimod-induziertem Psoriasis Mausmodell. Hier wird durch Applikation von Imiquimod auf die Haut eine der Schuppenflechte ähnelnde entzündliche Reaktion ausgelöst, die insbesondere durch eine stark verstärkte Proliferation der Keratinozyten gekennzeichnet ist. Wir können zeigen, dass die NFATc1-Faktoren in B-Lymphozyten kritisch an dieser Reaktion beteiligt sind. Fehlt den B-Lymphozyten das NFATc1-Gen, so produziert eine Subpopulation, die sogenannten regulatorischen B-Zellen, verstärkt das immunmodulatorischen Zytokins IL-10, wodurch die entzündliche Reaktion fast komplett unterdrückt wird. Dies ähnelt vorhergehenden Beobachtungen, in denen wir zeigen konnten, dass auch in einem Mausmodell der Multiplen Sklerose (EAE) die Immunreaktion durch den Verlust von NFATc1 in B-Zellen erheblich gelindert werden kann (Bhattacharyya S., et.al.). KW - Schuppenflechte KW - Maus KW - Transkriptionsfaktor KW - B-Lymphozyt KW - NFAT KW - NF-kB KW - Transgenic mice KW - Psoriasis KW - Cancer KW - B cells Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-97905 ER - TY - THES A1 - Porsch, Matthias T1 - OMB and ORG-1 T1 - OMB und ORG-1 N2 - Members of the T-box gene family encode transcription factors that play key roles during embryonic development and organogenesis of invertebrates and vertebrates. The defining feature of T-box proteins is an about 200 aa large, conserved DNA binding motif, the T domain. Their importance for proper development is highlighted by the dramatic phenotypes of T-box mutant animals. My thesis was mainly focused on two Drosophila T-box genes, optomotor-blind (omb) and optomotor-blind related 1 (org-1), and included (i) a genetic analysis of org-1 and (ii) the identification of molecular determinants within OMB and ORG-1 that confer functional specificity. (i) Genetic analysis of org-1 initially based on a behavioral Drosophila mutant, C31. C31 is a X-linked, recessive mutant and was mapped to 7E-F, the cytological region of org-1. This pleiotropic mutant is manifested in walking defects, structural aberrations in the central brain, and "held-out" wings. Molecular analysis revealed that C31 contains an insertion of a 5' truncated I retrotransposon within the 3' untranslated transcript of org-1, suggesting that C31 might represent the first org-1 mutant. Based on this hypothesis, we screened 44.500 F1 female offspring of EMS mutagenized males and C31 females for the "held-out" phenotype, but failed to isolate any C31 or org-1 mutant, although this mutagenesis was functional per se. Since we could not exclude the possibility that our failure is due to an idiosyncracy of C31, we intended not to rely on C31 in further genetic experiments and followed a reverse genetic strategy . All P element lines cytologically mapping to 7E-7F were characterized for their precise insertion sites. 13 of the 19 analyzed lines had P element insertions within a hot-spot 37 kb downstream of org-1. No P element insertions within org-1 could be identified, but several P element insertions were determined on either side of org-1. The org-1 nearest insertions were used for local-hop experiments, in which we associated 6 new genes with P insertions, but failed to target org-1. The closest P elements are still 10 kb away from org-1. Subsequently, we employed org-1 flanking P elements to induce precise deletions in 7E-F spanning org-1. Two org-1 flanking P elements were brought together on a recombinant chromosome. Remobilization of P elements in cis configuration frequently results in deletions with the P element insertion sites as deficiency endpoints. In a first attempt, we expected to identify deficiencies by screening for C31 alleles. 8 new C31 alleles could be isolated. The new C31 chromosomes, however, did not carry the desired deletion. Molecular analysis indicated that C31 is not caused by aberrations in org-1, but by mutations in a distal locus. We repeated the P element remobilization and screened for the absence of P element markers. 4 lethal chromosomes could be isolated with a deletion of the org-1 locus. (ii) The consequences of ectopic org-1 were analyzed using UAS-org-1 transgenic flies and a number of different Gal4 driver lines. Misexpression of org-1 during imaginal development interfered with the normal development of many organs and resulted in flies with a plethora of phenotypes. These include a homeotic transformation of distal antenna (flagellum) into distal leg structures, a strong size reduction of the legs along their proximo-distal axis, and stunted wings. Like ectopic org-1, ectopic omb leads to dramatic changes of normal developmental pathways in Drosophila as well. dpp-Gal4/ UAS-omb flies are late pupal lethal and show an ectopic pair of wings and largely reduced eyes. GMR-Gal4 driven ectopic omb expression in the developing eye causes a degeneration of the photoreceptor cells, while GMR-Gal4/ UAS-org-1 flies have intact eyes. Hence, ectopic org-1 and omb induce profound phenotypes that are qualitatively different for these homologous genes. To begin to address the question where within OMB and ORG-1 the specificity determinants reside, we conceptionally subdivided both proteins into three domains and tested the relevance ofthese domains for functional specificity in vivo. The single domains were cloned and used as modules to assemble all possible omb-org-1 chimeric trans- genes. A method was developed to determine the relative expression strength of different UAS-transgenes, allowing to compare the various transgenic constructs for qualitative differences only, excluding different transgene quantities. Analysis of chimeric omb-org-1 transgenes with the GMR-Gal4 driver revealed that all three OMB domains contribute to functional specificity. N2 - Die Mitglieder der T-box Genfamilie kodieren Transkriptionsfaktoren mit Schlüsselrollen in der Embryogenese und der Organentwicklung von Invertebraten und Vertebraten. Charakteristisch für T-box Proteine ist der Besitz einer T Domäne, eines ungefähr 200 Aminosäuren großen, homologen DNA Bindungsmotivs. Die Relevanz dieser Proteine in vielen Entwicklungsprozessen zeigt sich deutlich in den dramatischen Phänotypen von Tieren mit Mutationen in T-box Genen. Die vorliegende Arbeit konzentrierte sich vor allem auf das Studium von zwei Drosophila T-box Genen, optomotor-blind (omb) und optomotor-blind related 1 (org-1) und beinhaltet (i) eine genetische Analyse der org-1 Gens und (ii) die Identifikation der molekularen Determinanten innerhalb OMB und ORG-1, die den verwandten Proteinen ihre funktionelle Spezifität verleihen. (i) Die genetische Analyse des org-1 Gens stützte sich anfänglich auf die Drosophila Mutante C31. C31 ist eine X-gekoppelte, rezessive Mutation und wurde in den Bereich 7E-7F kartiert, in dem sich auch org-1 befindet. C31 Fliegen zeigen Defekte im Laufverhalten, Strukturdefekte im Zentralkomplex des Gehirns und eine Flügelfehlstellung. Eine Molekularanalyse ergab, daß C31 eine Insertion eines 5' verkürzten I Retrotransposons innerhalb des 3' untranslatierten org-1 Transkripts enthält und ließ vermuten, daß C31 das erste mutante org-1 Allel darstellen könnte. Dieser Hypothese folgend durchsuchten wir ca 44.500 F1 Weibchen aus der Kreuzung von EMS mutagenisierten Männchen mit C31 Weibchen auf den C31 Flügelphänotyp, konnten allerdings keine org-1 oder C31 Mutante isolieren. Da wir nicht ausschließen konnten, daß unser Scheitern durch eine Eigentümlichkeit der C31 Mutante verursacht wurde, verfolgten wir nun eine revers-genetische Strategie mit dem Ziel, P Element Insertionen im org-1 Gen zu isolieren. Alle Fliegenlinien mit P Elementen in 7E-7F wurden molekular charakterisiert und ihre Integrationsstellen präzise bestimmt. 13 der 19 analysierten Linien trugen ihre Insertionen in einem hot-spot ungefähr 37 kb distal zu org-1. Keine P Element Insertion konnte im org-1 Gens gefunden werden, jedoch wurden mehrere P Elemente auf beiden Seiten von org-1 identifiziert. Die beiden org-1 nächsten Insertionen wurden für mehrere local-hop Experimente verwendet, in denen wir 6 neue Gene mit P Insertionen assoziieren konnten, jedoch nicht org-1. Nachfolgend wurden zwei org-1 flankierende P Elemente verwendet, um präzise Deletionen über den org-1 Genlokus zu erzeugen. Zwei org-1 flankierende P Elemente wurden zunächst auf ein Chromosom rekombiniert. Die Remobilisierung von P Elementen in cis Anordnung führt häufig zu Deletionen mit den P Element Insertionsstellen als Defizienz-Endpunkten. In einem ersten Versuch erwarteten wir mutmaßliche Defizienzen als neue C31 Allele zu identifizieren. Acht C31 Allele konnten isoliert werden. Zu unserer Überraschung trugen diese neuen C31 Chromosomen aber nicht die gewünschte Deletion. Weitere Analysen ergaben, daß C31 nicht durch Mutationen im org-1 Gen verursacht wird, sondern durch Mutationen in einem distalen Gen. Wir wiederholten die P Element Remobilisierung, suchten nun aber auf Verlust der P Element-Marker nach Defizienzen. Vier lethale Chromosomen konnten isoliert werden, die eine Deletion über org-1 tragen. (ii) Die Konsequenzen einer ektopischen Expression von org-1 wurden mit Hilfe von UAS-org-1 transgenen Fliegen und einer Reihe Gal4 Treiberlinien studiert. Mißexpression von org-1 während der Imaginalentwicklung stört die normale Entwicklung in vielen Organen und führt zu Fliegen mit einer Vielzahl von Phänotypen. Diese beinhalten eine homeotische Transformation distaler Antennensegmente in distale Beinstrukturen, stark verkürzte Beine und verkrüppelte Flügel. Ebenso wie ektopische org-1 Expression bewirkt auch die ektopische Expression von omb eine dramatische Veränderung des normalen Entwicklungsprogramms. dpp-Gal4/ UAS-omb Fliegen sind puppal lethal und weisen ein ektopisches Flügelpaar und verkleinerte Augen auf. GMR-Gal4 getriebene ektopische omb Expression in der Augenentwicklung verursacht eine Degeneration der Photorezeptorzellen, während GMR-Gal4/ UAS-org-1 Tiere intakte Augen besitzen. Die ektopische Expression von omb und org-1 verursacht also jeweils deutliche, jedoch qualitativ sehr unterschiedliche Phänotypen für die homologen Gene. Um zu bestimmen, wo sich innerhalb der OMB und ORG-1 Proteine die Spezifitätsdeterminanten befinden, haben wir beide Proteine konzeptionell in drei Domänen unterteilt und die Bedeutung der einzelnen Domänen für funktionelle Spezifität mit Hilfe von chimären omb-org-1 Transgenen in vivo untersucht. Die Analyse der chimären omb-org-1 Transgene mit der GMR-Gal4 Treiberlinie ergab, daß alle drei OMB Domänen zur funktionellen Spezifität von OMB beitragen. KW - Taufliege KW - Transkriptionsfaktor KW - Embryonalentwicklung KW - Drosophila KW - Transkriptionsfaktor KW - chimär KW - Spezifität KW - Beinentwicklung KW - Drosophila KW - transcription factor KW - chimeric KW - specificity KW - appendage development Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3614 ER - TY - THES A1 - Busch, Rhoda T1 - Redundancy and indispensability of NFATc1-isoforms in the adaptive and innate immune system T1 - Redundanz und Unentbehrlichkeit der NFATc1-Isoformen im adaptiven und natürlichen Immunsystem N2 - Peritonitis is a common disease in man, frequently caused by fungi, such as Candida albicans; however, in seldom cases opportunistic infections with Saccharomyces cerevisiae are described. Resident peritoneal macrophages (prMΦ) are the major group of phagocytic cells in the peritoneum. They express a broad range of surface pattern recognition receptors (PRR) to recognize invaders. Yeast infections are primarily detected by the Dectin-1 receptor, which triggers activation of NFAT and NF-κB pathways. The transcription of the Nfatc1 gene is directed by the two alternative promoters, inducible P1 and relatively constitutive P2 promoter. While the role of P1-directed NFATc1α-isoforms to promote survival and proliferation of activated lymphocytes is well-established, the relevance of constitutively generated NFATc1β-isoforms, mainly expressed in resting lymphocytes, myeloid and non-lymphoid cells, remains unclear. Moreover, former work at our department indicated different roles for NFATc1α- and NFATc1β-proteins in lymphocytes. Our data revealed the functional role of NFATc1 in peritoneal resident macrophages. We demonstrated that the expression of NFATc1β is required for a proper immune response of prMΦ during fungal infection-induced acute peritonitis. We identified Ccl2, a major chemokine produced in response to fungal infections by prMΦ, as a novel NFATc1 target gene which is cooperatively regulated through the NFAT- and canonical NF-κB pathways. Consequently, we showed that NFATc1β deficiency in prMΦ results in a decreased infiltration of inflammatory monocytes, leading to a delayed clearance of peritoneal fungal infection. We could further show that the expression of NFATc1β-isoforms is irrelevant for homeostasis of myeloid and adaptive immune system cells and that NFATc1α- (but not β-) isoforms are required for a normal development of peritoneal B1a cells. In contrast to the situation in myeloid cells, NFATc1β deficiency is compensated by increased expression of NFATc1α-isoforms in lymphoid cells. As a consequence, NFATc1ß is dispensable for activation of the adaptive immune system. Taken together our results illustrate the redundancy and indispensability of NFATc1-isoforms in the adaptive and innate immune system, indicating a complex regulatory system for Nfatc1 gene expression in different compartments of the immune system and likely beyond that. N2 - Peritonitis ist eine alltägliche Erkrankung des Menschen, die häufig durch Pilze wie Candida albicans verursacht wird. In seltenen Fällen sind opportunistische Infektionen mit Saccharomyces cerevisiae beschrieben. Residente peritoneale Makrophagen (prMΦ) stellen die größte Gruppe phagozytischer Zellen im Peritoneum dar. Sie exprimieren eine Vielzahl an Oberflächenrezeptoren (PRR), mit denen sie Eindringlinge erkennen. Hefeinfektionen werden dabei vorrangig durch den Dectin-1 Rezeptor erkannt, der die Signalkaskaden von NFAT und NF-κB aktiviert. Die Transkription des Nfatc1 Gens wird von zwei Promotoren gelenkt, dem induzierbaren P1-Promotor und dem relativ konstitutiven P2-Promotor. Während die Funktionen der vom P1-Promotor erzeugten NFATc1α-Isoformen beim Überleben und der Proliferation von aktivierten Lymphozyten wohl bekannt sind, blieb die Rolle der NFATc1β-Isoformen, die vor allem in ruhenden lymphoiden, myeloiden und nicht-lymphoiden Zellen exprimiert sind, bisher ungeklärt. Unser Labor konnte zudem zeigen, dass NFATc1α- und NFATc1β- Proteine unterschiedliche Funktionen in Lymphozyten haben. Unsere Daten lassen die Funktion von NFATc1 in peritonealen Makrophagen erkennen. Wir konnten zeigen, dass während einer pilzinduzierten Peritonitis die Expression von NFATc1β für eine vollständige Immunantwort der prMΦ erforderlich ist. Wir haben Ccl2, das am stärksten von prMΦ als Antwort auf Pilzinfektionen produzierte Chemokin, als neues NFATc1 Zielgen identifiziert, welches kooperativ von den NFATc1- und NF-κB-Signalwegen reguliert wird. Folglich konnten wir zeigen, dass das Fehlen von NFATc1β in prMΦ zu einer Abnahme der eindringenden entzündlichen Monozyten führt, was eine verspätete Abwehr von peritonealen Pilzinfektionen zur Folge hat. Des Weiteren konnten wir zeigen, dass die Expression von NFATc1β-Isoformen irrelevant für die Homöostase von myeloiden und adaptiven Immunzellen ist, und dass NFATc1α- (aber nicht β-) Isoformen für die normale Entwicklung von B1a-Zellen erforderlich sind. In lymphoiden Zellen wird das Fehlen von NFATc1β, im Gegensatz zur Situation in myeloiden Zellen, durch eine erhöhte Expression von NFATc1α kompensiert. Demzufolge ist NFATc1β entbehrlich für die Aktivierung des adaptiven Immunsystems. Zusammengenommen zeigen unsere Ergebnisse die Redundanz und die Unentbehrlichkeit der NFATc1-Isoformen im adaptiven und natürlichen Immunsystem, welche auf ein komplexes regulatorisches System der Genexpression von NFATc1 in den verschiedenen Kompartimenten des Immunsystems und wahrscheinlich darüber hinaus hinweist. KW - Immunsystem KW - NFATc1 KW - fungal infection KW - Ccl2 KW - Bauchfellentzündung KW - Mykose KW - Transkriptionsfaktor Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-91096 ER - TY - THES A1 - Duttu, Vallabhapurapu Subrahmanya T1 - Regulation of B lymphocyte terminal differentiation and death by the transcription factor Blimp-1 T1 - Regulation von B zell terminalen differenzierung und death by transcriptionfaktor Blimp-1 N2 - B lymphocyte induced maturation protein-1 (Blimp-1) und X-box-binding protein-1” (XBP-1) sind als Transkriptionsfaktoren unverzichtbar für die terminale Differenzierung von B-Lymphozyten zu Immunglobulin (Ig)-sezernierenden Plasmazellen. Ebenso stellen die unfolded protein response (UPR) und das Spleißen von XBP-1, beides ausgelöst durch erhöhte Ig-Produktion, entscheidende Schritte auf dem Weg zur Plasmazellentstehung dar. Allerdings ist das Molekül/ sind die Moleküle nach wie vor unbekannt, die diesen beiden Ereignissen in der Signalkaskade vorgeschaltet sind. Da die ektope Expression von Blimp-1 in B-Zellen hinreicht, diese zu Plasmazellen zu differenzieren, erscheint es plausibel, dass Blimp-1 das Molekül sein könnte, das die Auslösung einer UPR und das Spleißen von XBP-1 steuert. Dieser Möglichkeit wurde durch ektope Expression von Blimp-1 in der Maus-B-Zell-Lymphomlinie WEHI 231 und in primären B-Zellen aus der Milz von Mäusen nachgegangen. Die ektope Expression von Blimp-1 führte in beiden Zelltypen zur Erhöhung der Ig Produktion, zum Spleißen von XBP-1 und zur Sekretion von Immunglobulinen. Interessanterweise war der N-terminale Anteil von Blimp-1, bestehend aus den Aminosäuren 1-751, hinreichend, um diese Effekte auszulösen, während der C-Terminus, der die Aminosäuren 465-856 umfaßte, keinen Effekt hatte. Darüberhinaus, wurde die Expression von BIP, dessen Gen ein UPR-Zielgen ist, durch ektope Expression von Blimp-1 bzw. dessen N-Terminus in primären B-Zellen erhöht. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass Blimp-1, speziell dessen N-terminale Domäne, hinreichend ist, um eine UPR und die Prozessierung von XBP-1 auszulösen, was zur Ig-Sekretion von B-Zellen führt. N2 - B lymphocyte induced maturation protein-1 (Blimp-1) and X-box-binding protein-1 (XBP-1) are indispensible transcription factors required for B lymphocyte terminal differentiation into Ig secreting plasma cells. Occurrence of an unfolded protein response (UPR) and XBP-1 splicing, due to elevated Ig levels, are critical events during plasma cell generation. However, the upstream molecule sufficient to trigger these events remain elusive. Because ectopic expression of Blimp-1 in B cells is sufficient to generate plasma cells, it is plausible that Blimp-1 might be the upstream molecule, sufficient for the induction of UPR and XBP-1 splicing. The results from the current study indicate that ectopic expression of Blimp-1 or its N-terminal domain, in B cells, is sufficient to induce XBP-1 splicing, UPR and Ig (immunoglobulin) secretion. Further more Blimp-1 is able to directly repress the antiapoptotic gene A1, by binding to specific DNA elements in A1 promoter. This repression of A1 by Blimp-1 seems to be an important prerequisite for Plasma cell differentiation because ectopic expression of A1 in primary B cells resulted in reduced immunoglobulin secretion. KW - B-Lymphozyt KW - Zelldifferenzierung KW - Transkriptionsfaktor KW - Blimp-1 KW - B-zells KW - Immunologie KW - Blimp-1 KW - B-cells KW - Immunology Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17158 ER - TY - THES A1 - Kölmel, Wolfgang T1 - Structural and functional characterization of TFIIH from \(Chaetomium\) \(thermophilum\) T1 - Strukturelle und funktionale Charakterisierung von TFIIH aus \(Chaetomium\) \(thermophilum\) N2 - Gene expression and transfer of the genetic information to the next generation forms the basis of cellular life. These processes crucially rely on DNA, thus the preservation, transcription and translation of DNA is of fundamental importance for any living being. The general transcription factor TFIIH is a ten subunit protein complex, which consists of two subcomplexes: XPB, p62, p52, p44, p34, and p8 constitute the TFIIH core, CDK7, CyclinH, and MAT1 constitute the CAK. These two subcomplexes are connected via XPD. TFIIH is a crucial factor involved in both, DNA repair and transcription. The central role of TFIIH is underlined by three severe disorders linked to failure of TFIIH in these processes: xeroderma pigmentosum, Cockayne syndrome, and trichothiodystrophy. Only limited structural and functional data of TFIIH are available so far. Here, the model organism Chaetomium thermophilum was utilized with the aim to structurally and functionally characterize TFIIH. By combining the expression and purification of single TFIIH subunits with the co-expression and co-purification of dual complexes, a unique and powerful modular system of the TFIIH core subunits could be established, encompassing all proteins in high quality and fully functional. This system permits the step-wise assembly of TFIIH core, thereby making it possible to assess the influence of the intricate interaction network within TFIIH core on the overall enzymatic activities of TFIIH, which has not been possible so far. Utilizing the single subunits and dual complexes, a detailed interaction network of TFIIH core was established, revealing the crucial role of the p34 subunit as a central scaffold of TFIIH by linking the two proteins p44 and p52. Our studies also suggest that p62 constitutes the central interface of TFIIH to the environment rather than acting as a scaffold. TFIIH core complexes were assembled and investigated via electron microscopy. Preliminary data indicate that TFIIH adopts different conformational states, which are important to fulfill its functions in transcription and DNA repair. Additionally, a shortened construct of p62 was used to develop an easy-to-use, low cost strategy to overcome the crystallographic phase problem via cesium derivatization. N2 - Die Expression von Genen und die Weitergabe des Erbguts an die nächste Generation bilden die Grundlage jeden Lebens. Bei diesen Vorgängen spielt die DNA eine entscheidende Rolle. Deshalb sind der Erhalt, die Transkription und die Translation der DNA von fundamentaler Bedeutung für alle Lebewesen. Der generelle Transkriptionsfaktor TFIIH ist ein Multi-Proteinkomplex und umfasst insgesamt zehn Untereinheiten. TFIIH kann in zwei Teilkomplexe unterteilt werden: XPB, p62, p52, p44, p34 und p8 bilden den TFIIH Core Komplex, CDK7, CyclinH und MAT1 bilden den CAK Komplex. Diese beiden Teilkomplexe werden durch XPD verbunden. TFIIH spielt eine entscheidende Rolle sowohl in der DNA Reparatur, als auch in der Transkription. Diese zentrale Rolle wird durch das Auftreten dreier schwerer Krankheiten deutlich, die mit dem Ausfall von TFIIH bei diesen Aufgaben in Verbindung stehen: Xeroderma pigmentosum, Cockayne-Syndrom und Trichothiodystrophie. Daten bezüglich der Struktur und Funktion von TFIIH stehen bisher nur in begrenztem Umfang zur Verfügung. In dieser Arbeit kam der Modellorganismus Chaetomium thermophilum zum Einsatz, mit dem Ziel die Struktur und Funktion von TFIIH näher zu beleuchten. Durch die Kombination der Expression und Aufreinigung einzelner TFIIH Untereinheiten mit der Koexpression und Koaufreinigung von dualen Komplexen konnte ein einmaliges und leistungsfähiges modulares System entwickelt werden, das die Darstellung aller Untereinheiten in hoher Qualität und voller Funktionalität erlaubt. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde die schrittweise modulare Zusammensetzung von TFIIH Core ermöglicht, was es nun erlaubt den Einfluss der komplexen Wechselwirkungen innerhalb von TFIIH Core auf die enzymatischen Aktivitäten im Ganzen zu untersuchen, was bisher nicht möglich war. Mit Hilfe der Einzelproteine und dualen Komplexe wurde ein detailliertes Netzwerk aus Wechselwirkungen innerhalb TFIIH Core etabliert, welches die entscheidende Rolle der p34 Untereinheit als zentrales Gerüst für TFIIH offenbarte, da sie die Verbindung zwischen p44 und p52 herstellt. Unsere Untersuchungen deuten zudem darauf hin, dass p62 die zentrale Schnittstelle zur Umgebung von TFIIH darstellt, anstatt als Gerüst zu fungieren. Des Weiteren gelang die Assemblierung von TFIIH Core Komplexen, die mittels Elektronenmikroskopie untersucht wurden. Die Strukturen, die daraus hervorgingen, legen das Vorhandensein verschiedener TFIIH Konformationen nahe, welche vermutlich bei den verschiedenen Aufgaben von TFIIH in der Transkription und DNA Reparatur zum Tragen kommen. Außerdem wurde mit Hilfe eines gekürzten p62 Konstrukts eine einfach zu handhabende, kostengünstige Strategie zur Lösung des kristallografischen Phasenproblems mittels Cäsiumderivatisierung entwickelt. KW - Transkriptionsfaktor KW - DNS-Reparatur KW - TFIIH Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-161769 ER - TY - THES A1 - Schmitt, Dominik T1 - Structural Characterization of the TFIIH Subunits p34 and p44 from C. thermophilum T1 - Strukturelle Charakterisierung der TFIIH Untereinheiten p34 und p44 aus C. thermophilum N2 - Several important cellular processes, including transcription, nucleotide excision repair and cell cycle control are mediated by the multifaceted interplay of subunits within the general transcription factor II H (TFIIH). A better understanding of the molecular structure of TFIIH is the key to unravel the mechanism of action of this versatile protein complex within these pathways. This becomes especially important in the context of severe diseases like xeroderma pigmentosum, Cockayne syndrome and trichothiodystrophy, that arise from single point mutations in some of the TFIIH subunits. In an attempt to structurally characterize the TFIIH complex, we harnessed the qualities of the eukaryotic thermophile Chaetomium thermophilum, a remarkable fungus, which has only recently been recognized as a novel model organism. Homologues of TFIIH from C. thermophilum were expressed in E. coli, purified to homogeneity and subsequently utilized for crystallization trials and biochemical studies. The results of the present work include the first crystal structure of the p34 subunit of TFIIH, comprising the N-terminal domain of the protein. The structure revealed a von Willebrand Factor A (vWA) like fold, which is generally known to be involved in a multitude of protein-protein interactions. Structural comparison allowed to delineate similarities as well as differences to already known vWA domains, providing insight into the role of p34 within TFIIH. These results indicate that p34 assumes the role of a structural scaffold for other TFIIH subunits via its vWA domain, while likely serving additional functions, which are mediated through its C-terminal zinc binding domain and are so far unknown. Within TFIIH p34 interacts strongly with the p44 subunit, a positive regulator of the XPD helicase, which is required for regulation of RNA Polymerase II mediated transcription and essential for eukaryotic nucleotide excision repair. Based on the p34 vWA structure putative protein-protein interfaces were analyzed and binding sites for the p34 p44 interaction suggested. Continuous crystallization efforts then led to the first structure of a p34 p44 minimal complex, comprising the N-terminal vWA domain of p34 and the C-terminal C4C4 RING domain of p44. The structure of the p34 p44 minimal complex verified the previous hypothesis regarding the involved binding sites. In addition, careful analysis of the complex interface allowed to identify critical residues, which were subsequently mutated and analyzed with respect to their significance in mediating the p34 p44 interaction, by analytical size exclusion chromatography, electrophoretic mobility shift assays and isothermal titration calorimetry. The structure of the p34 p44 complex also revealed a binding mode of the p44 C4C4 RING domain, which differed from that of other known RING domains in several aspects, supporting the hypothesis that p44 contains a novel variation of this domain. N2 - Zelluläre Prozesse, wie beispielsweise die Transkription, die Nukleotid-Exzisionsreparatur und die Kontrolle des Zellzyklus sind abhängig vom vielschichtigen Zusammenspiel der zehn Protein-Untereinheiten des allgemeinen Transkriptionsfaktors II H (TFIIH). Zur Aufklärung der genauen Funktion dieses Komplexes ist ein besseres Verständnis seiner molekularen Struktur essentiell. Besondere Bedeutung erhält der TFIIH dabei im Hinblick auf verschiedene schwerwiegende Krankheiten, wie z.B. Xeroderma pigmentosum (XP), Cockayne-Syndrom (CS) und Trichothiodystrophie (TTD), die als Folge von einzelnen Punkt-Mutationen in bestimmten Untereinheiten des Komplexes entstehen. In der vorliegenden Arbeit wurden zur strukturellen Charakterisierung der TFIIH Untereinheiten p34 und p44 die homologen Proteine aus Chaetomium thermophilum verwendet. Hierbei handelt es sich um einen eukaryotischen und thermophilen Pilz, der erst kürzlich als neuer und vielversprechender Modellorganismus an Bedeutung gewann. Die TFIIH Homologe aus C. thermophilum wurden rekombinant exprimiert, gereinigt und anschließend für Kristallisations-Versuche eingesetzt. Darüber hinaus wurden die Proteine mittels verschiedener biochemischer Verfahren analysiert. Die erzielten Resultate beinhalten unter anderem die erste Kristall-Struktur der p34 Untereinheit des TFIIH und zeigen eine von Willebrand Faktor A (vWA) ähnliche Domäne im N-terminalen Bereich des Proteins. Vergleiche mit bereits bekannten vWA Proteinen liefern Gemeinsamkeiten sowie Unterschiede und erlauben erste Einblicke in die Funktion der p34 Untereinheit innerhalb des TFIIH Komplexes. Die gewonnenen Erkenntnisse legen nahe, dass p34 über seine vWA Domäne anderen TFIIH Untereinheiten als strukturelles Gerüst dient, während die C-terminale Zinkfinger-Domäne des Proteins sehr wahrscheinlich zusätzliche Aufgaben übernimmt, die bisher noch nicht genau bekannt sind. Innerhalb des TFIIH Komplexes ist p34 eng mit der p44 Untereinheit assoziiert. Letztere ist als positiver Regulator der XPD Helikase bekannt, die im Rahmen der RNA Polymerase II vermittelten Transkription und der eukaryotischen Nukleotid-Exzisionsreparatur eine entscheidende Rolle spielt. Basierend auf der erzielten p34ct vWA Struktur wurden verschiedene Interaktions-Flächen zwischen p34 und p44 analysiert und mögliche Bindestellen für die beiden Proteine ermittelt. Weitere Kristallisations-Experimente ermöglichten schließlich die Aufklärung der Struktur eines p34 p44 Minimal-Komplexes, bestehend aus der N-terminalen vWA Domäne von p34 und der C-terminalen C4C4 RING Domäne von p44. Die gewonnenen Struktur-Daten bestätigten die zuvor ermittelte Bindestelle der beiden Proteine. Eine genauere Untersuchung der Kontakt-Fläche zwischen p34 und p44 lieferte darüber hinaus entscheidende Hinweise auf besonders wichtige Interaktions-Bereiche und Aminosäuren, die im Folgenden mutiert wurden, um deren Bedeutung für die Komplexbildung zu ermitteln. Mit Hilfe der analytischen Größenausschluss-Chromatographie, elektro-phoretischer Mobilitäts-Verlagerungs-Assays und isothermaler Titrations-Kalorimetrie konnten hierbei verschiedene Aminosäuren identifiziert werden, die für eine stabile p34 p44 Interaktion erforderlich sind. Ferner zeigte die Struktur des p34 p44 Minimal-Komplexes eine Bindungsweise der p44 C4C4 RING Domäne, die sich von der anderer, bereits bekannter RING Domänen in verschiedenen Punkten unterschied. Diese Erkenntnis bestätigt die zuvor aufgestellte Hypothese, dass es sich im Falle von p44 um eine neue Variante der bereits gut charakterisierten RING Domäne handelt. KW - DNA-Reparatur KW - Transkription KW - Transkriptionsfaktor KW - TFIIH KW - General Transcription Factor II H KW - p34 KW - p44 KW - Tfb4 KW - Ssl1 KW - Chaetomium thermophilum Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-104851 ER - TY - THES A1 - Reuter-Weissenberger, Philipp T1 - The role of a fungal-specific transcription regulator on vacuolar biology and host interaction in \(Candida\) \(albicans\) T1 - Die Rolle eines pilzspezifischen Transkriptionsfaktors für die Vakuole und Wirtsinteraktion von \(Candida\) \(albicans\) N2 - Microorganisms that colonize the human body face large fluctuations in their surroundings. Therefore, those microbes developed sophisticated mechanisms that allow them to adapt their cell biology and maintain cellular homeostasis. One organelle vital to preserve cell physiology is the vacuole. The vacuole exhibits a wide range of functions and is able to adjust itself in response to both external and internal stimuli. Moreover, it plays an important role in host interaction and virulence in fungi such as Candida albicans. Despite this connection, only a few regulatory proteins have been described to modulate vacuolar biology in fungal pathogens. Furthermore, whether such regulation alters fungus-host interplay remains largely unknown. This thesis focuses on the characterization of ZCF8, a fungus-specific transcription regulator in the human-associated yeast C. albicans. To this end, I combined genome-wide protein-DNA interaction assays and gene expression analysis that identified genes regulated by Zcf8p. Fluorescence microscopy uncovered that several top targets of Zcf8p localize to the fungal vacuole. Moreover, deletion and overexpression of ZCF8 resulted in alterations in vacuolar morphology and in luminal pH and rendered the fungus resistant or susceptible to a vacuole-disturbing drug. Finally, in vitro adherence assays showed that Zcf8p modulates the attachment of C. albicans to human epithelial cells in a vacuole-dependent manner. Given those findings, I posit that the previously uncharacterized transcription regulator Zcf8p modulates fungal attachment to epithelial cells in a manner that depends on the status of the fungal vacuole. Furthermore, the results highlight that vacuolar physiology is a substantial factor influencing the physical interaction between Candida cells and mammalian mucosal surfaces. N2 - Mikroorganismen, die den Menschen besiedeln, sind großen Schwankungen in ihrer Umgebung ausgesetzt. Daher haben sie ausgeklügelte Mechanismen entwickelt, die es ihnen ermöglichen, ihre Zellbiologie anzupassen und die zelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten. Eine für die Aufrechterhaltung der Zellphysiologie wichtige Organelle ist die Vakuole. Sie verfügt über ein breites Spektrum an Funktionen und ist in der Lage, auf externe und interne Stimuli zu reagieren. Außerdem spielt dieses Organell eine wichtige Rolle bei der Pilz-Wirt-Interaktion und somit für die Pathogenität von Pilzen wie Candida albicans. Trotz dieses Zusammenhangs wurden bisher nur wenige regulatorische Proteine beschrieben, welche die Biologie der Vakuolen in pathogenen Pilzen modulieren. Zudem ist weitgehend unbekannt, ob eine solche Regulierung das Zusammenspiel von Pilz und Wirt verändert. Diese Arbeit konzentriert sich auf die Charakterisierung von ZCF8, einem pilzspezifischen Transkriptionsregulator in der pathogenen Hefe C. albicans. Zu diesem Zweck wurden Protein-DNA-Interaktionstests und Genexpressionsanalysen kombiniert, um Gene zu identifizieren, die direkt von Zcf8p reguliert werden. Fluoreszenzmikroskopie zeigte zudem, dass mehrere der wichtigsten Ziele von Zcf8p in der Pilzvakuole lokalisiert sind. Darüber hinaus führte die Deletion und Überexpression von ZCF8 zu Veränderungen der Morphologie und des luminalen pH-Werts der Vakuole, und veränderte die Sensitivität des Pilzes gegenüber Stoffen, welche Funktionen der Vakuole beeinträchtigen. Schließlich deuteten In-vitro-Adhärenztests daraufhin, dass Zcf8p die Anheftung von C. albicans an menschliche Epithelzellen auf eine Weise moduliert, die abhängig von der Vakuole ist. Angesichts dieser Ergebnisse kann davon ausgegangen werden, dass der bisher unbekannte Transkriptionsregulator ZCF8 die Interaktion zwischen Pilz- und Epithelzellen des Wirts kontrolliert, und das auf eine Weise, die von der Pilzvakuole abhängig ist. Des Weiteren, unterstreichen die Ergebnisse, dass die Physiologie der Vakuole ein wesentlicher Faktor ist, welcher die Interaktion zwischen C. albicans und dem Wirt beeinflusst. KW - Vakuole KW - Transkriptionsfaktor KW - Candida albicans KW - vacuole KW - host colonization KW - Candida albicans KW - transcription regulator Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-259287 ER - TY - THES A1 - Murti, Krisna T1 - The Role of NFATc1 in Burkitt Lymphoma and in Eµ-Myc induced B cell Lymphoma T1 - Die Role des NAFTc1 Transkriptionsfaktors im Burkitt Lymphom und im Eµ-Myc-induzierten B-Zell Lymphom N2 - Burkitt lymphoma (BL) is a highly aggressive B cell malignancy. Rituximab, a humanized antibody against CD20, in a combination with chemotherapy is a current treatment of choice for B-cell lymphomas including BL. However, certain group of BL patients are resistant to Rituximab therapy. Therefore, alternative treatments targeting survival pathways of BL are needed. In BL deregulation of MYC expression, together with additional mutations, inhibits differentiation of germinal centre (GC) B cells and drives proliferation of tumor cells. Pro-apoptotic properties of MYC are counteracted through the B-cell receptor (BCR) and phosphoinositide-3-kinase (PI3K) pathway to ensure survival of BL cells. In normal B-cells BCR triggering activates both NF-κB and NFAT-dependent survival signals. Since BL cells do not exhibit constitutive NF-κB activity, we hypothesized that anti-apoptotic NFATc1A isoform might provide a major survival signal for BL cells. We show that NFATc1 is constitutively expressed in nuclei of BL, in BL cell lines and in Eµ-Myc–induced B cell lymphoma (BCL) cells. Nuclear residence of NFATc1 in these entities depends on intracellular Ca2+ levels but is largely insensitive to cyclosporine A (CsA) treatment and therefore independent from calcineurine (CN) activity. The protein/protein interaction between the regulatory domain of NFATc1 and DNA binding domain of BCL6 likely contributes to sustained nuclear residence of NFATc1 and to the regulation of proposed NFATc1-MYC-BCL6-PRDM1 network in B-cell lymphomas. Our data revealed lack of strict correlation between the expression of six NFATc1 isoforms in different BL-related entities suggesting that both NFATc1/alphaA and -betaA isoforms provide survival functions and that NFATc1alpha/betaB and -alpha/betaC isoforms either do not possess pro-apoptotic properties in BL cells or these properties are counterbalanced. In addition, we show that in BL entities expression of NFATc1 protein is largely regulated at post-transcriptional level, including MYC dependent increase of protein stability. Functionally we show that conditional inactivation of Nfatc1 gene in Eµ-Myc mice prevents development of BCL tumors with mature B cell immunophenotype (IgD+). Loss of NFATc1 expression in BCL cells ex vivo results in apoptosis of tumor cells. Together our results identify NFATc1 as an important survival factor in BL cells and, hence, as a promising target for alternative therapeutic strategies for BL. N2 - Das Burkitt Lymphom (BL) ist eine hoch aggressive B-Zellentartung. Rituximab, ein humanisierter Antikörper gegen CD20, in Kombination mit Chemotherapie ist die augenblickliche Behandlung der Wahl für B-Zelllymphome inklusive dem BL. Allerdings sind bestimmte Gruppen der BL-Patienten resistent gegenüber einer Rituximabtherapie. Deshalb werden alternative Behandlungsmöglichkeiten, die das Überleben der BL gezielt beeinflussen, gesucht. Die Deregulation der MYC-Expression, zusammen mit weiteren Mutationen, inhibiert die Differenzierung der Keimzentrums- (GC-) B-Zellen im BL und treibt die Proliferation der Tumorzellen. Die pro-apoptotischen Eigenschaften von MYC sind durch den B-Zellrezeptor (BCR) und Phosphoinositid-3-Kinase (PI3K)-Signalwege gegenreguliert, was zum Überleben der BL-Zellen führt. Da BL-Zellen keine konstitutive NF-κB-Aktivität aufweisen, stellten wir die Hypothese auf, dass die anti-apoptotischen Isoformen von NFATc1A ein Hauptüberlebenssignal für BL-Zellen bereitstellen könnten. Wir zeigen, dass NFATc1 konstitutiv in den Kernen primärer BL-Zellen, der BL-Zelllinien und in den Zellen eines Eµ-MYC-induzierten B-Zelllymphoms (BCL) vorliegt. Nukleäre NFATc1-Präsenz in diesen Entitäten hängt von intrazellulären Ca2+-Mengen ab, ist aber weitestgehend unempfindlich gegenüber Cyclosporine A (CsA)-Behandlung und unabhängig von Calcineurin (CN)-Aktivität. Stattdessen trägt wahrscheinlich die Protein/Proteininteraktion zwischen der regulatorischen Domäne von NFATc1 und der DNA-Bindungsdomäne von BCL6 zur anhaltenden nukleären Präsenz von NFATc1 und dem vorgeschlagenen NFATc1-MYC-BCL6-PRDM1-Netzwerk in B-Zelllymphomen bei. Unsere Daten ergaben keine strenge Korrelation zwischen der Expression der sechs NFATc1-Isoformen in verschiedenen BL-verwandten Entitäten. Dies suggeriert, dass sowohl NFATc1/αA wie –βA Überlebenssignale vermitteln und dass NFATc1α/βB und –α/βC-Isoformen in BL-Zellen keine pro-apoptotischen Eigenschaften besitzen oder diese Funktionen gegenreguliert werden. Des Weiteren zeigen wir, dass in BL-Entitäten die Expression der NFATc1-Proteine auf post-transkriptioneller Ebene reguliert werden. Dies schließt einen MYC-abhängigen Anstieg der Proteinstabilität ein. In Bezug auf die Funktion von NFATc1 zeigen wir, dass seine konditionelle Inaktivierung in Eµ-MYC-Mäusen die Entwicklung von BCL-Tumoren mit reifem T-Zellimmunphänotyp (IgD+) verhindert. Dementsprechend resultiert der Verlust der NFATc1-Expression in BCL-Zellen ex vivo in einer Apoptose der Tumorzellen. Zusammengefasst brandmarken unsere Resultate NFATc1 als einen entscheidenden Überlebensfaktor in BL-Zellen bzw. identifizieren es als vielversprechendes Ziel alternativer therapeutischer Strategien in BL. KW - Transkriptionsfaktor KW - Burkitt Lymphom KW - B-Zell-Lymphom KW - NFATc1 KW - Burkitt Lymphoma Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-106448 ER - TY - THES A1 - Staykov, Nikola T1 - The Role of the GABPα/β Transcription Factor In the Proliferation of NIH-3T3 Cells T1 - Die Rolle des GABPα/β Transkriptionsfaktors bei der Proliferation von NIH-3T3 Zellen N2 - SUMMARY GABP is a heterodymeric member of Ets-family transcription factors. It consists of two subunits – GABPa which contains DNA binding domain and GABPb, which provides transcriptional activation domain and nuclear localization signal. GABPa/b complex is essential for transcriptional activation of multiple lineage-restricted and housekeeping genes, several viral genes, and in some cases might function as transcriptional repressor. Large variety of data indicates involvement of GABP in the complex regulation of cell growth, specified by quiescence, stimulation/proliferation, apoptosis and senescence. Expression level of GABPa subunit is rapidly increased when resting cells enter S-phase, and GABPa/b complex is critical to promote the continuity of the cell cycle. Conditional inactivation of GABPa expression in mouse embryonic fibroblasts results in a complete block of proliferation and acquisition of senescence-like phenotype. However, the influence of GABP on the other cell growth determinant – the apoptosis – remains largely obscure. Therefore we aimed to investigate the influence of GABPa/b expression level on the cell growth in vitro. Using siRNA approach we achieved efficient but only transient down-regulation of GABPa expression which precluded further cell growth studies. Persistent increase of the expression of GABPb subunit only resulted in a positive effect on the cell growth speed. Simultaneous conditional overexpression of both GABPa and GABPb subunits though, strongly reduced the growth of the affected cell cultures in reversible and in expression level dependent manner. Interestingly, GABPa/b overexpressing cells did show neither cell cycle arrest nor massive induction of apoptosis. However, more detailed analyses revealed that dampened apoptotic processes were taking place in GABPa/b−overexpressing cells, starting with a prominent activation of caspase-12. Interestingly, activation of downstream effector caspases was rather suppressed explaining a weak increase of apoptotic cells in GABPa/b overexpressing cultures. This effect suggests that the activation of caspase-12 by elevated amounts of exogenous GABPa/b reflects the normal physiological mechanism of caspase-12 regulation. N2 - ZUSAMMENFASSUNG GABP ist ein heterodimerisches Mitglied aus der Familie der Ets- Transkriptionsfaktoren. Es besteht aus zwei Untereinheiten – GABPa, welche die DNA-Bindedomäne enthält, sowie GABPb, welche sowohl die Transkriptions-Aktvierungsdomäne als auch das Kernimportsignal umfasst. GABPa/b ist für die Transkriptions-Aktivierung mehrerer differenzierungstypischer als auch sog. Housekeeping Gene, sowie einiger viraler Gene essentiell und kann, in einigen Fällen, auch als Transkriptionsrepressor fungieren. Eine Vielzahl von Daten deutet darauf hin, dass GABP in der komplexen Kontrolle des Wachstums von Zellen ein wichtige Rolle zukommt. Dies zeigt sich z. B. im Einfluss von GABP auf zelluläre Vorgänge wie der Stimulation/Proliferation, Apoptose und Seneszenz. So steigt z. B. der Spiegel der GABPa Untereinheit rapide an, nachdem ruhende Zellen die G0-Phase verlassen und in die S-Phase eintreten. Der aus beiden Untereinheiten gebildete Komplex ist dann für die Progression der Zellen durch den gesamten Zellzyklus von entscheidender Bedeutung. Die Unterdrückung der Expression der GABPa Untereinheit in embryonalen Mausfibroblasten hingegen führt zu einem vollkommenen Proliferations-Stopp dieser Zellen und induziert in diesen einen Seneszenz-artigen Phänotyp. Andererseits ist über den Einfluss von GABP auf andere wichtige das Zellwachstums beeinflussende Faktoren wie z. B. der Apoptose bislang noch recht wenig bekannt. Daher lag es im Fokus dieser vorliegenden Arbeit, den Einfluss der GABPa/b-Spiegels auf das Zellwachstum in vitro näher zu untersuchen. Mithilfe von siRNA-Ansätzen gelang uns die effiziente Herunterregulierung von GABPa. Diese war jedoch nur von vorübergehender Natur, so dass weitere Studien zum Zellwachstum nicht möglich waren. Die stabile Überexpression der GABPb Untereinheit führte dagegen nur zu einem Anstieg der Zellwachstumsgeschwindigkeit. Wurden jedoch sowohl beide Untereinheit gleichzeitig überexprimiert, so resultierte dies in einer deutlichen, Expressionsspiegel-abhängigen und reversiblen Wachstumshemmung der Zellen. Bemerkenswerterweise zeigte die GABPa/b-überexprimierende Zellpopulation weder einen erhöhten Anteil an G0-Phase noch war eine deutlich ausgeprägte Zunahme der Apoptose-Rate zu verzeichnen. In weiteren Experimenten konnte dennoch eine leichte Erhöhung der Apoptose-Rate in den überexprimierenden Zellen gezeigt werden, was sich durch die deutliche Aktivierung von Caspase-12 belegen ließ. Die Aktivierung von Effektor-Caspasen der Caspase-12 schien allerdings nicht zu erfolgen, was den nur schwach ausgeprägten Charakter der Apoptose zu erklären vermag. Diese Beobachtungen suggerieren, dass die Aktivierung der Caspase-12 durch erhöhte Mengen von exogenem GABPa/b den normalen physiologischen Mechanismus der Caspase-12 Regulation widerspiegelt. KW - Proliferation KW - Transkriptionsfaktor KW - Zellzyklus KW - GABP KW - Caspase 12 KW - NIH-3T3 KW - Apoptosis KW - GABP KW - Caspase 12 KW - NIH-3T3 Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67655 ER - TY - THES A1 - Pusch, Tobias T1 - The transcription factor NFATc1 mediates cytotoxic T cell function in vitro and in vivo T1 - Der Transkriptionsfaktor NFATc1 vermittelt die Funktion von zytotoxischen T Zellen in vitro und in vivo N2 - While numerous experiments on NFAT were already performed with CD4+ T cells showing defective cytokine release and a reduced T helper cell development, no detailed studies existed for CD8+ T cells. From this point, we wanted to examine the impact of NFATc1 and c2 on the physiological functions of CD8+ T cells in vitro and in vivo. Therefore, we used a murine infection model with the bacteria Listeria monocytogenes and mice in which NFATc1 was specifically depleted in the T cell compartment. Our first in vitro studies showed a typical NFATc1 and c2 nuclear translocation and changes on mRNA levels upon T cell activation similarly in CD4+ as well as in CD8+ T cells extracted from wild type mice. NFAT nuclear translocation is important for target gene activation and generation of effector functions. Stimulated T cell populations lacking NFATc1 and/or NFATc2 showed a markedly decreased expression of Th1/Tc1 cytokines, as e.g. IL 2 and IFNγ being important for the clearance of intracellular pathogens. From our in vitro model for the generation of allogenically reactive cytotoxic CD8+ T cells, we revealed a decreased killing and lytic granule-release capacity in Nfatc1 inactivated CD8+ T cells whereas NFATc2-/- cytotoxic T cells did not show an altered cytotoxic response compared to wild type cells. Interestingly, we found lytic granules accumulated and mitochondria not getting translocated to the immunological synapse upon re-stimulation in NFATc1-deficient CD8+ T cells. Together with results showing the CsA insensitivity of the CTL killing/degranulation capacities, we assume that some major cellular processes are affected by NFATc1 which are not directly linked to the TCR-induced signal transduction cascade. We also showed the importance of NFATc1 in T cells during intracellular infections with the bacteria Listeria monocytogenes in an in vivo mouse model. After five days, only few bacteria were detected in wt mice whereas high amounts of Listeria particles were extracted from livers of Nfatc1fl/fl x Cd4 cre mice. Although the reactivity towards the pathogen was similar in both groups, a decreased cytokine expression in NFATc1-/- CD8+ T cells was observed together with an altered memory cell generation. Our results show the importance of NFATc1 in CD8+ T cells and give some clue for a possible connection to other basal cellular functions, as e.g. the formation of an immunological synapse. N2 - Viele Experimente zur Rolle von NFAT wurden bereits anhand von CD4+ T Zellen durchgeführt und zeigten eine veränderte Zellphysiologie. Hingegen wurden CD8+ T Zellen diesbezüglich noch nicht intensiv studiert. Deshalb untersuchten wir den Einfluss von NFATc1 und NFATc2 auf die Funktion von CD8+ T Zellen in vitro und in vivo anhand des murinen Infektionsmodells mit dem Bakterium Listeria monocytogenes. Für die Versuche benutzen wir Mäuse, in denen das Protein NFATc1 spezifisch im T Zellkompartiment entfernt wurde. Erste Ergebnisse zeigten eine typische Translokation von NFATc1 und NFATc2 in den Zellkern. Eine Veränderung in der mRNA Expression nach Aktivierung, sowohl in CD4+ T Zellen als auch in CD8+ T Zellen, fand ebenfalls statt. NFATc defiziente CD4+ und CD8+ T Zellen wiesen eine verminderte Expression von Th1/Tc1 Zytokinen wie z.B. Interleukin-2 und Interferon γ auf, welche für die Bekämpfung intrazellulärer Pathogene wichtig sind. In unserem in vitro Modell fanden wir eine verminderte Abtötungsfähigkeit und eine Reduktion in der Freisetzung lytischer Granula in NFATc1-/- CD8+ T Zellen wohingegen eine NFATc2 Defizienz keine Auswirkungen auf die Zytotoxizität - verglichen mit wildtypischen Zellen - aufweist. Interessanterweise fanden wir eine Anhäufung von lytischen Granula und eine verminderte intrazelluläre Migration von Mitochondrien nach Ausbildung einer immunologischen Synapse in NFATc1-/- CD8+ T Zellen. Zusammen mit den Ergebnissen unserer CsA-Inhibierungsversuche nehmen wir an, dass einige allgemeine zelluläre Prozesse von NFATc1 beeinflusst werden, die nicht direkt von der T Zellrezeptor-induzierten Signalkaskade abhängen. Anhand eines in vivo Mausmodells zeigten wir auch die wichtige Rolle von NFATc1 in T Zellen während der Infektion mit Listeria monocytogenes. Fünf Tage nach Infektion konnten aus Nfatc1fl/fl x Cd4 cre Mäusen mehr Bakterienpartikel extrahiert werden als aus wt Mäusen. Wie in den in vitro Versuchen konnte auch hier eine geringere Zytokinproduktion der CD8+ T Zellen festgestellt werden allerdings wiesen die Mäuse auch eine geringere Bildung von Gedächniszellen auf. Unsere Ergebnisse zeigen, dass NFATc1 in CD8+ T Zellen eine wichtige Rolle spielt und auch Auswirkungen auf grundlegendere zelluläre Funktionen, wie die Ausbildung einer immunologischen Synapse, hat. KW - Transkriptionsfaktor KW - Killerzelle KW - Antigen CD8 KW - Cytotoxizität KW - NFAT KW - CTL function KW - CD8 Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-123690 ER - TY - THES A1 - Rudolf, Ronald T1 - Transcriptional Regulation of and by NFATc1 in Lymphocytes T1 - Transkriptionelle Regulation von und durch NFATc1 in Lymphozyten N2 - The transcription factor NFATc1 has been shown to regulate the activation and differentiation of T-cells and B-cells, of DCs and megakaryocytes. Dysregulation of NFAT signaling was shown to be associated with the generation of autoimmune diseases, malignant transformation and the development of cancer [71]. The primary goal of this work was to gain insights on Nfatc1 induction and regulation in lymphocytes and to find new direct NFATc1 target genes. Three new BAC -transgenic reporter mouse strains (tgNfatc1/Egfp, tgNfatc1/DE1 and tgNfatc1/DE2) were applied to analyze Nfatc1 induction and regulation in primary murine B- and T-cells. As a result, we were able to show the persistent requirement of immunoreceptor-signaling for constant Nfatc1 induction, particularly, for NFATc1/αA expression. Furthermore, we showed that NF-κB inducing agents, such as LPS, CpG or CD40 receptor engagement, in combination with primary receptor-signals, positively contributed to Nfact1 induction in B-cells [137]. We sought to establish a new system which could help to identify direct NFATc1 target genes by means of ChIP and NGS in genom-wide approaches. We were able to successfully generate a new BAC-transgene encoding a biotinylatable short isoform of NFATc1, which is currently injected into mice oocyte at the TFM in Mainz. In addition, in vivo biotinylatable NFATc1–isoforms were cloned and stably expressed in the murine B-cell lymphoma line WEHI-231. The successful use of these cells stably overexpressing either the short NFATc1/αA or the long NFATc1/βC isoform along with the bacterial BirA biotin ligase was confirmed by intracellular stainings, FACS analysis, confocal microscopy and protein IP. By NGS, we detected 2185 genes which are specifically controlled by NFATc1/αA, and 1306 genes which are exclusively controlled by NFATc1/βC. This shows that the Nfatc1 locus encodes “two genes” which exhibit alternate, in part opposite functions. Studies on the induction of apoptosis and cell-death revealed opposed roles for the highly inducible short isoform NFATc1/αA and the constantly expressed long isoform NFATc1/βC. These findings were confirmed by whole transcriptome-sequencing performed with cells overexpressing NFATc1/αA and NFATc1/βC. Several thousand genes were found to be significantly altered in their expression profile, preferentially genes involved in apoptosis and PCD for NFATc1/βC or genes involved in transcriptional regulation and cell-cycle processes for NFATc1/αA. In addition we were able to perform ChIP-seq for NFATc1/αA and NFATc1/βC in an ab-independent approach. We found potential new target-sites, but further studies will have to address this ambitious goal in the future. In individual ChIP assays, we showed direct binding of NFATc1/αA and NFATc1/βC to the Prdm1 and Aicda promoter regions which are individually controlled by the NFATc1 isoforms. N2 - Der Transkriptionsfaktor NFATc1 wurde als Regulator der Aktivierung und Differenzierung für T-Zellen, B-Zellen, Dendritische-Zellen und Megakaryozyten beschrieben. Autoimmunerkrankungen und die Entstehung von Krebs wurden mit Fehlregulationen der NFAT-Signalwege in Verbindung gebracht [71]. Ziel dieser Arbeit war der Gewinn neuer Erkenntnisse über die Induktion und Regulation von NFATc1 in Lymphozyten. Darüber hinaus sollten Gene, welche direkt durch NFATc1 gebunden und reguliert werden, identifiziert werden. Um die Induktion und Regulation von NFATc1 in primären T- und B-Zellen untersuchen zu können, wurden drei BAC transgene Reporter Maus Linien (tgNfatc1/Egfp, tgNfatc1/DE1 and tgNfatc1/DE2) verwendet. Dadurch war es uns möglich zu zeigen, dass es einer ununterbrochenen Antigen-Rezeptor Stimulation bedarf, um NFATc1, im Besonderen die Transkription der kurzen Isoform NFATc1/αA, dauerhaft zu induzieren. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass Induktoren wie LPS, CpG oder auch die Stimulation des CD40-Rezeptors, die die Expression des Transkriptionsfaktors NF-B zur Folge haben, einen positiven Einfluss auf die Nfatc1-Induktion haben [137]. Unser Interesse lag darin, ein System zu etablieren, dass es uns ermöglichen sollte, neue NFATc1-Zielgene durch ChIP assays und Genom-weite Sequenzierungen zu ermitteln. Es ist uns gelungen, ein neues BAC-Transgen, welches für eine in vivo biotinylierbare Variante des NFATc1/αA Proteins kodiert, zu erzeugen. Dieses Konstrukt wird zum gegenwärtigen Zeitpunkt - in Zusammenarbeit mit der Universität Mainz (TFM) - in die Vorkerne von Maus-Eizellen injiziert. Ferner wurden biotinylierbare NFATc1-Isoformen kloniert und mit Hilfe retroviraler Plasmide stabil in WEHI-231 B-Lymphom-Zellen integriert. Durch intrazellulare Färbungen, FACS-Analysen, Konfokalmikroskopie und Immunpräzipitationen konnten wir eine erfolgreiche in vivo Biotinylierung in NFATc1/αA- und NFATc1/βC-exprimierenden WEHI-231 Zellen nachweisen. Mittels Next-Generation-Sequencing, in Kollaboration mit TRON, Univ. Mainz, konnten wir 2185 Gene, die spezifisch durch NFATc1/αA kontrolliert wurden, und 1306 Gene, die ausschließlich durch die Überexpression von NFATc1/βC reguliert wurden, identifizieren. Diese Ergebnisse zeigen, dass im Nfatc1 Locus „zwei Gene“ mit alternativer, zum Teil gegensätzlicher Funktion, kodiert sind. Untersuchungen zu Apoptose und Zelltod haben entgegengesetzte Eigenschaften der stark induzierbaren, kurzen Isoform NFATc1/αA und der stetig exprimierten langen Isoform NFATc1/βC aufgezeigt. Daten von Sequenzierungen des gesamten Transkriptoms, die mit NFATc1/αA und -βC überexprimierenden WEHI-231 Zellen durchgeführt wurden (TRON, Mainz), bestätigten diese Befunde. Es zeigte sich, dass es wesentliche Veränderungen der Expressionsprofile Tausender von Genen gab. In WEHI-231-Zellen, die NFATc1/βC überexprimierten, waren viele dieser Gene an Apoptose und Zelltod beteiligt. Demgegenüber waren in NFATc1/αA-Zellen vor allem Gene betroffen, die an transkriptionaler Regulation und dem Zellzyklus beteiligt waren. Überdies war es uns möglich, ChIPseq Assays für NFATc1/αA und NFATc1/βC in einem Antikörper-unabhängigen Ansatz durchzuführen. Dadurch konnten wir neue NFATc1-Bindungstellen identifizieren. Es bedarf jedoch noch weiterer Untersuchungen, um diese Ergebnisse der Genom-weiten ChIPseq Assays zu bestätigen. Durch weitere ChIP Experimente konnten wir eine direkte Bindung von NFATc1/αA und NFATc1/βC an die regulatorischen Regionen der Prdm1- und Aicda-Gene nachweisen. Die Transkription beider Gene wurde durch die Überexpression von NFATc1/αA und -βC deutlich reguliert und spielt offenbar bei der Bildung von Plasma-B-Zellen, die für die Antikörper-Produktion verantwortlich sind, eine wesentliche Rolle. KW - Lymphozyt KW - Transkriptionsfaktor KW - Lymphozyten KW - NFATc1 KW - Lymphocytes KW - NFATc1 KW - Genregulation KW - Maus Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83993 ER -