TY - THES A1 - Pietschmann, Thomas T1 - Molekularbiologische Untersuchungen zur Funktion des Hüllproteins des Humanen Foamyvirus T1 - Molecular studies on the envelope protein of the human foamy virus N2 - Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass fremde virale Hüllproteine wie das Env Protein des murinen Leukämievirus (MLV) oder das Glykoprotein des Virus der vesiklären Stomatitis (VSV) nicht in der Lage sind, die Funktion des homologen HFV Hüllproteins in Bezug auf die Viruspartikelfreisetzung des Humanen Foamyvirus zu übernehmen. Offenbar werden für die HFV Viruspartikelmorphogenese und -freisetzung spezifische Interaktionen zwischen dem Kapsid und dem homologen Hüllprotein benötigt. Mutationsanalysen ergaben, dass die membranspannende Domäne des HFV Hüllproteins in diesem Zusammenhang spezifische Aufgaben erfüllt, die nicht durch heterologe Formen der Membranverankerung übernommen werden können. Die Analyse der Fusionsaktivität verschiedener Hüllproteinmutanten zeigte, dass die zytoplasmatische Domäne des Proteins nicht essentiell für die Fusionsaktivität benötigt wird. Umfangreichere Deletionen, die auch Teile der langen membranspannenden Domäne des Proteins einschlossen, führten dagegen zum Verlust der Fusionseigenschaften des Hüllproteins. Innerhalb der membranspannenden Domäne des HFV Hüllproteins befindet sich ein konserviertes Lysin-Prolin Motiv, dessen Mutation sich auf den zellulären Transport und auf die Fusionsaktivität des Proteins auswirkte. Es zeichnet sich ab, dass die lange membranspannende Domäne des HFV Hüllproteins nicht nur als Membranverankerung dient, sondern zusätzlich für verschiedene Funktionen des Hüllproteins von Bedeutung ist. N2 - In the course of these studies it was shown that heterologous viral envelope proteins like the Env protein of MLV (murine leukemia virus) and the glycoprotein of VSV (vesicular stomatitis virus) are not able to substitute for the HFV Env protein in HF virus (human foamy virus) particle morphogenesis. These data suggest that HFV capsids require specific interactions with their homologous envelope protein in order to be enveloped and released from the cell. A mutational analysis revealed that the long membrane-spanning domain (MSD) of HFV Env plays a key role in this respect, since it cannot be replaced by alternative forms of membrane anchorage. The analysis of fusion activity of various HFV env mutants showed that the cytoplasmic domain (CyD) is not required to mediate membrane fusion. However, fusogenicity was lost when C-terminal parts of the MSD were deleted. Furthermore, it was shown, that mutations of the conserved lysine-proline motif within the MSD result in altered transport and fusion activity of HFV Env. Together, these data imply that the MSD of HFV Env does not only function as a domain that anchors the protein in the lipid bilayer. Instead, it appears that it adopts a specific conformation that is required to mediate different functions of the HFV Env protein. KW - Spumaviren KW - Hüllproteine KW - Molekularbiologie KW - Foamyvirus KW - Retroviren KW - Hüllprotein KW - Morphogenese KW - Fusion KW - foamy virus KW - retro virus KW - envelope protein KW - morphogenesis KW - fusion Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1879 ER - TY - THES A1 - Zabka, Vanessa T1 - The Plasticity of Barley (Hordeum vulgare) Leaf Wax Characteristics and their Effects on Early Events in the Powdery Mildew Fungus (Blumeria graminis f.sp. hordei): Interactive Adaptations at the Physiological and the Molecular Level T1 - Die Plastizität von Blattwachsen der Gerste (Hordeum vulgare) und deren Effekte auf initiale Ereignisse der Mehltaukrankheit (Blumeria graminis f.sp. hordei): wechselseitige Anpassungen auf physiologischer und molekularer Ebene N2 - In order to test the effects of environmental factors on different characteristics of plant leaf waxes, barley plants (Hordeum vulgare) were abiotically stress treated (exposure to darkness, heavy metal, high salt concentrations and drought), and biotically stressed by the infection with powdery mildew (Blumeria graminis f.sp. hordei; Bgh). Different wax parameters like amount, chemical composition, and micromorphology of epicuticular wax crystals, were investigated. Etiolated leaves of barley showed distinctly reduced wax amounts and modifications in their relative composition. The alterations of these wax parameters might be a result of a developmental delay, which could have been caused by a decreased availability of energy for cellular processes, due to lack of light. Cadmium exposure led to a 1.5-fold increase of wax amount, while chemical composition was unaffected. In drought- and salt-stressed plants, all investigated leaf wax parameters remained unaltered. In each of the abiotic treatments, the microstructure of epicuticular wax crystals, formed as typical platelets, was not modified. Even after 6d infection with powdery mildew (Bgh), neither locally nor systemically enforced modifications of wax features were revealed. The analyzed leave surfaces, resulting from these four abiotic and the biotic treatment (phenotypic approach), were compared to altered leaf surfaces’ characteristics of 18 analyzed eceriferum (cer-) wax mutants (genotypic approach). Within the screening, 5 mutants were selected which distinctly differed from the wild-type in wax amount, portions of epi- and intracuticular wax fraction, relative chemical composition, crystal morphology, and surface wettability (hydrophobicity). Apart from quantitative and qualitative effects on the leaf waxes, environmentally enforced modifications in cuticular waxes might be reflected in molecular processes of wax biogenesis. Therefore, a barley wax-microarray was established. 254 genes were selected, which are putatively involved in processes of de novo fatty acid biosynthesis, fatty acid elongation, and modification, and which are supposed to take part in lipid-trafficking between cell compartments, and transport of wax components to the outer cell surface. The regulations within the expression pattern evoked by the respective treatments were correlated with the corresponding analytical wax data, and the observed molecular effects of a 3d powdery mildew infection were compared with succeeding fungal morphogenesis. Etiolation and cadmium exposition pointed to transcriptional modifications in the de novo fatty acid synthesis, and in the screened, transport-related mechanisms, which correlate with respective alterations in surface wax characteristics. Moderate changes in the gene expression pattern, evoked by drought- and salinity-stress, might give hints for evolved adaptations in barley to such common habitat stresses. Theinvasion of powdery mildew into the epidermal host cells was reflected in the regulation of several genes. Beside other functions, these genes take part in pathogen defense, and intracellular component transport, or they encode transcription factors. The different modifications within the molecular responses evoked by the investigated abiotic treatments, and the effects of powdery mildew infection representing a biotic stressor, were compared between the different treatments. In order to test the potential impact of different wax parameters on Bgh, conidia germination and differentiation was comparably investigated on leaf surfaces of abiotically stressed wild-type and cer-mutants, isolated cuticles, and further artificial surfaces. The rates of conidial development were similar on each of the leaf surfaces resulting from the abiotic treatments, while a significant reduction of the germination and differentiation success was revealed for the wax mutant cer-yp.949. Compared to the wild-type, developmental rates on isolated cuticles and extracted leaf waxes of the mutant cer-yp.949 indicated a modified embedding of cuticular waxes, and a possibly changed three-dimensional structure of the cer-yp.949 cuticle, which might explain the reduced conidial developmental rates on leaf surfaces of this particular mutant. Experiments with Bgh conidia on mechanically de-waxed leaf surfaces (selective mechanical removal of the epicuticular leaf waxes with glue-like gum arabic, followed by an extraction of the intracuticular wax portion with chloroform) demonstrated the importance of the wax coverage for the germination and differentiation of the fungal conidia. On all dewaxed leaf surfaces, except those of cer-yp.949, the differentiation success of the germlings was significantly reduced, by about 20% (“wax-effect”). This result was verified through an artificial system with increased conidia developmental rates on glass slides covered with extracted leaf waxes. Further comparative tests with the major components of barley leaf wax, hexacosanol and hexacosanal, showed that the germination and differentiation of powdery mildew conidia not only depends on the different chemistry, but is also influenced by the respective surface hydrophobicity. Compared to hexacosanol, on hexacosanal coated glass surfaces, higher germination and differentiation rates were achieved, which correlated with increased levels of surface hydrophobicity. Developmental rates of conidia on hydrophobic foils demonstrated that hydrophobicity, as a sole surface factor, may stimulate the conidial germination and differentiation processes. Moreover, the survival of conidia on artificial surfaces is determined by additional surface derived factors, e.g. the availability of water, and a pervadable matrix. N2 - Abiotische und biotische Umweltfaktoren können sowohl die Struktur als auch die chemischen Eigenschaften pflanzlicher Oberflächenwachse beeinflussen. In der vorliegenden Studie wurde vergleichend untersucht, inwiefern sich verschiedene Parameter von Gersten (Hordeum vulgare) Blattwachsen, wie deren Menge, chemische Zusammensetzung und die Morphologie epikutikulärer Wachskristalle unter dem Einfluss unterschiedlicher abiotischer Stressoren (Wachstum in Dunkelheit, Schwermetallbelastung, erhöhte Salzkonzentrationen, Trockenheit) und eines biotischen Stressors, dem Befall von Gerstenmehltau (Blumeria graminis fsp. hordei; Bgh), verändern können. Die Aufzucht ohne natürliches Licht führte zu etiolierten Blättern, die deutlich reduzierte Wachsmengen und quantitative Veränderungen in der Zusammensetzung einzelner Wachskomponenten zeigten. Die Veränderung dieser Wachscharakteristika könnte das Resultat einer pflanzlichen Entwicklungsverzögerung darstellen, die auf den Mangel an Licht, und damit einem Mangel an Energie für die zelluläre Triebkraft zurückzuführen ist. Cadmium-Belastung führte zu einer 1.5-fach erhöhten Wachsauflage der Versuchspflanzen bei unveränderter Chemie. Unter Trocken- und Salzstress zeigten sich keine Veränderungen der untersuchten Wachsparameter. Die plättchenförmige Kristallstruktur der epikutikulären Wachse blieb in jeder der untersuchten abiotischen Behandlungen unverändert. Um Auswirkungen von biotischem Stress auf die Wachsauflage zu testen, wurde eine Infektion mit Gerstenmehltau (Bgh) vorgenommen. Nach sechstägiger Pilzinfektion konnten hierbei weder lokale, noch systemische Veränderungen der unterschiedlichen Wachsparameter der Gerstenblätter detektiert werden. Zusätzlich zu solchen Blattoberflächen, die aus den vier abiotischen und der biotischen Behandlung resultierten (phänotypischer Ansatz), wurden die Oberflächenwachse von 18 cer-Wachsmutanten untersucht (genotypischer Ansatz). Hieraus wurden diejenigen fünf Mutanten ausgewählt, die die stärksten Abweichungen an Wachsmengen, Mengenverteilung zwischen epi- und intrakutikulärer Wachsfraktion und/ oder Anteilen der Einzelkomponenten, der Morphologie der epikutikulären Wachskristalle, und somit auch in der davon abhängenden Oberflächenbenetzbarkeit (Hydrophobizität) gegenüber dem Wildtyp aufwiesen. Um zu überprüfen, inwiefern sich die Modifizierung der Oberflächenwachse durch Umweltfaktoren in den zugrunde liegenden molekularen Prozessen der Wachsbiosynthese widerspiegelt, wurde ein Gerstenwachs-Microarray etabliert. Eine Auswahl von 254 Genen wurde zusammengestellt, denen potentiell Funktionen in der Fettsäurebiosynthese, Kettenverlängerung von Fettsäuren und deren Modifikation zu Wachskomponenten, sowie im Transport von Lipid- und Wachskomponenten zwischen den Zellkompartimenten zukommen. Die Veränderung der Expression einzelner Gene während der abiotischen Stress-Behandlungen wurde mit den Daten der Wachsanalyse dieser Behandlungen korreliert, sowie der Einfluss einer dreitägigen Mehltauinfektion auf molekulare Prozesse der Wirtspflanze mit der Pilzmorphogenese kombiniert. Hinweise auf transkriptionelle Veränderungen in der de novo Fettsäuresynthese und den untersuchten Transportmechanismen, die mit den Veränderungen der Oberflächenwachse korrelieren, waren insbesondere unter Cadmiumstress und durch Etiolierung zu verzeichnen. Die durch Trocken- und Salzstress verursachten, moderaten Veränderungen im Expressionsmuster untersuchter Gene könnten auf eine erworbene Toleranz von Gerste gegenüber solcher Art von Umweltstress hinweisen. Das Eindringen des Pilzes in die Epidermis spiegelte sich in zahlreichen Genregulierungen wider, die besonders der Pathogenabwehr und dem intrazellulären Komponententransport dienen, oder Transkriptionsfaktoren codieren. Der Einfluss der untersuchten abiotischen Faktoren und der Pilzbefall als biotischer Stressor lösten unterschiedliche Modifikationen der molekularen Antworten aus, die miteinander verglichen wurden. Um zu klären welche Wachsparameter die Auskeimung und Differenzierung der Konidien von B. graminis beeinflussen, wurden alle analysierten Blattoberflächen (abiotisch gestresster Wildtyp und cer-Mutanten) und weitere artifizielle Oberflächen in Biotests eingesetzt. Auf allen Blattoberflächen des abiotisch behandelten Wildtyps war die Konidienentwicklung gleichermaßen erfolgreich, während sich innerhalb des genotypischen Ansatzes eine signifikante Reduktion des Keimungs- und Differenzierungserfolgs auf Blättern der Mutante cer-yp.949 zeigte. Durch vergleichende Untersuchungen mit isolierten Kutikeln und extrahierten Blattwachsen von Wildtyp und der Mutante cer-yp.949 konnte gezeigt werden, dass der herabgesetzte Entwicklungserfolg der Konidien auf Blättern der Mutante cer-yp.949 auf eine modifizierte Einbettung der Wachse und eine veränderte dreidimensionale Struktur der cer-yp.949 Kutikula zurückzuführen sein könnte. Untersuchungen zur Entwicklung von Konidien auf sukzessiv entwachsten Blattoberflächen von Wildtyp und Mutanten (zunächst mechanisches Abheben der epikutikulären Wachskristalle durch Gummi arabicum, gefolgt von einer Extraktion der intrakutikulären Wachse mit Chloroform) zeigte die Bedeutung des Vorhandenseins von Wachs für die Auskeimung und Differenzierung der Konidien. Mit Ausnahme der Mutante cer-yp.949 wurde der Differenzierungserfolg der Konidien auf allen Blattflächen durch Wachsextraktion signifikant um ca. 20% reduziert („Wachseffekt“). Durch die Beschichtung von Glasobjektträgern mit extrahierten Blattwachsen konnte dieses Ergebnis auf ein artifizielles System übertragen und bestätigt werden. Zusätzliche Tests mit den Hauptkomponenten der Gerstenwachse Hexacosanol und Hexacosanal zeigten, dass Auskeimung und Differenzierung von Mehltau-Konidien von der unterschiedlichen Chemie, und auch von der Hydrophobizität der Oberfläche beeinflusst werden. Im Vergleich mit Hexacosanol zeigten Hexacosanal beschichtete Glasoberflächen sowohl den größten Keimungs- und Differenzierungserfolg, als auch die höchste Hydrophobizität. Entwicklungsraten auf hydrophoben Folien bestätigten, dass allein die Hydrophobizität der Oberfläche die Auskeimung und die Differenzierung der Konidien stimulieren kann. Das Überleben der Konidien auf artifiziellen Oberflächen wird darüber hinaus durch weitere Faktoren wie Wasserverfügbarkeit und eine durchdringbare Matrix bestimmt. KW - Mehltau KW - Gerstenkrankheit KW - Konidie KW - Keimung KW - Morphogenese KW - Wachs KW - Microarray KW - Differentielle Genexpression KW - powdery mildew desease KW - conidial differentiation KW - leaf wax analysis KW - microarray KW - wax biosynthesis KW - gene expression Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26402 ER - TY - THES A1 - Klengel, Torsten T1 - Molekulare Charakterisierung der Carboanhydrase Nce103 im Kontext des CO2 induzierten Polymorphismus in Candida albicans T1 - Molecular characterisation of the carbonic anhydrase Nce103 in the context of carbon dioxide induced polymorphism in Candida albicans N2 - Die Detektion von Umweltsignalen und die gezielte zelluläre Reaktion ist eine zentrale und für das Überleben aller Lebewesen essentielle Fähigkeit. Candida albicans, als dominierender humanpathogener Pilz, ist hochgradig verschiedenen biochemischen und physikalischen Umweltbedingungen ausgesetzt, welche sowohl die Zellmorphologie als auch die Virulenz dieses Erregers beeinflussen. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Kohlendioxid, als ubiquitär vorkommendes Gasmolekül, auf die Zellmorphologie und Virulenz untersucht. Erhöhte Konzentrationen von Kohlendioxid stellen ein äußerst robustes Umweltsignal dar, welches die morphologische Transition vom Hefewachstum zum hyphalen Wachstum, einem Hauptvirulenzfaktor, in Candida albicans stimuliert. In diesem Zusammenhang wurde die Rolle der putativen Carboanhydrase Nce103 durch die Generation von knock – out Mutanten untersucht. Die Disruption von NCE103 in C. albicans führt zu einem Kohlendioxid – abhängigen Phänotyp, welcher Wachstum unter aeroben Bedingungen (ca. 0,033% CO2) nicht zulässt, jedoch unter Bedingungen mit einem erhöhten CO2 Gehalt von ca. 5% ermöglicht. NCE103 ist also für das Wachstum von C. albicans in Wirtsnischen mit aeroben Bedingungen essentiell. Durch Untersuchungen zur Enzymkinetik mittels Stopped – flow wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass Nce103 die Funktion einer Carboanhydrase erfüllt. Die biochemische Funktion dieser Carboanhydrase besteht in der Fixation von CO2 bzw. HCO3ˉ in der Zelle zur Unterhaltung der wesentlichen metabolischen Reaktionen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Induktion hyphalen Wachstums durch CO2 in C. albicans nicht durch den Transport von CO2 mittels des Aquaporins Aqy1 beeinflusst wird. CO2 bzw. HCO3ˉ aktiviert in der Zelle direkt eine Adenylylcyclase (Cdc35), welche sich grundlegend von den bisher gut charakterisierten G-Protein gekoppelten Adenylylcylasen unterscheidet. Die Generation von cAMP beeinflusst in der Folge direkt die Transkription hyphenspezifischer Gene und nachfolgend die morphologische Transition vom Hefewachstum zum elongierten, hyphalen Wachstum. Dieser Mechanismus konnte sowohl in Candida albicans als auch in Cryptococcus neoformans nachgewiesen werden, was auf einen panfungal konservierten Signaltransduktionsmechanismus schliessen lässt. Die Inhibition dieser spezifischen Kaskade eröffnet neue Ansätze zur Entwicklung spezifischer antimykotischer Wirkstoffe. N2 - Detection of environmental signals and subsequently directed reaction is essential for the survival of all living organisms. Candida albicans, as the predominant human fungal pathogen is exposed to severely different physical and chemical conditions, which influence cell morphology as well as virulence in human. In the present work, the influence of carbon dioxide as ubiquitous gaseous molecule on virulence and cell morphology was analysed. Elevated concentrations of carbon dioxide are a robust signal to induce the morphological transition from yeast growth to an elongated hyphal growth form, which is believed to be one of the main virulence factors in Candida albicans. The role of the putative carbonic anhydrase Nce103p in carbon dioxide signalling is reviewed by generating knockout mutant strains, which exhibited a carbon dioxide dependent phenotype. Growth under aerobic conditions (0,033 % carbon dioxide) is inhibited but feasible in 5% carbon dioxide. Therefore, Nce103p is essential for growth in host niches with aerobic conditions. Analysis of the biochemical properties of Nce103p by stopped – flow kinetics revealed carbonic anhydrase activity. It is hypothesised, that Nce103p is essential for fixation of carbon dioxide and bicarbonate within the cell in order to sustain basic metabolic reactions. Furthermore, the induction of hyphal growth was independent of aquaporine-mediated transport of carbon dioxide. Bicarbonate rather carbon dioxide activates directly the adenylyl cyclase Cdc35p generating cyclic AMP as second messenger and influencing the transcription of hyphal specific genes in Candida albicans thus promoting the morphological transition from yeast growth to elongated hyphal growth. This signal transduction cascade is present in Candida albicans as well as Cryptococcus neoformans and it is believed to be a pan fungal signal transduction cascade. The specific inhibition of carbon dioxide mediated polymorphism may serve as a new target for antifungal therapeutic agents. KW - Candida KW - Candida albicans KW - Kohlendioxid KW - Kohlendioxidfixierung KW - Virulenz KW - Morphologie KW - Signaltransduktion KW - Cyclo-AMP KW - Soor KW - Carboanhydrase KW - Cryptococcus neoformans KW - Morphogenese KW - Hyphe KW - Hefeartige Pilze KW - Knockout KW - Aquaporin KW - Candida albicans KW - Morphology KW - carbon dioxide KW - carbonic anhydrase KW - aquaporine Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34573 ER -