TY  - THES
A1  - Gassert, Evelyn
T1  - Die Bedeutung von Ceramiden für die Reorganisation des Zytoskeletts in T-Zellen, die Ausbildung einer immunologischen Synapse und die T-Zell-Aktivierung
T1  - Impact of ceramide accumulation on T lymphocyte cytoskeletal reorganisation,immune synapse formation and activation
N2  - Ceramide sind biologisch aktive Sphingolipide, die verschiedene zelluläre Signalwege regulieren, meist im Zusammenhang mit der Induktion von Apoptose oder der Regulation des Zellzyklus. Darüber hinaus wurde in der Literatur beschrieben, dass Ceramide die Zytoskelettdynamik unterschiedlicher Zelltypen beeinflussen, die Bedeutung von Ceramiden für die Funktion von T-Zellen wurde allerdings bisher wenig untersucht. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die exogene Akkumulation von Ceramiden ebenso wie die Generierung von Ceramiden durch bSMase die Adhärenz von T-Zellen an FN bzw. ICAM-1 beeinträchtigt. Des Weiteren konnte eine verminderte T-Zell-Polarisierung auf FN sowie eine reduzierte Chemotaxis und Motilität ceramidmodifizierter T-Zellen in Antwort auf SDF-1 nachgewiesen werden. In Übereinstimmung mit der Unfähigkeit ceramidmodifizierter Zellen morphologisch zu polarisieren wird ferner die Relokalisation von Oberflächenmolekülen und intrazellulärer Proteine durch die Akkumulation von Ceramiden gestört. Überdies konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Ceramide mit dem Aktivierungsstatus von Akt und ERM-Proteinen interferieren, da eine verminderte stimulationsabhängige Phosphorylierung von Akt und ERM-Proteinen in ceramidmodifizierten Zellen nachgewiesen wurde. Ein wesentlicher Schritt im Verlauf der T-Zell-Aktivierung ist die Ausbildung einer immunologischen Synapse mit dendritischen Zellen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass, obwohl ceramidreiche Membrandomänen von der Kontaktstelle ausgeschlossen werden, Konjugatfrequenz und Architektur der IS durch die Induktion von Ceramiden nicht beeinflusst werden, da eine normale Verteilung von CD3 und des MTOC beobachtet wurde. Allerdings wird die Funktionalität der Konjugate durch die Induktion von Ceramiden beeinträchtigt. Ceramidmodifizierte Zellen waren nur eingeschränkt in der Lage Orai1 und Stim1 zur Kontaktfläche mit DCs zu translozieren. In Übereinstimmung mit diesen Befunden wurde auch ein verminderter Calcium-Einstrom sowie eine verminderte Proliferation infolge der Akkumulation von Ceramiden detektiert. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Ceramide wesentliche Prozesse im Verlauf der T-Zell-Aktivierung beeinflussen, so dass die pathogeninduzierte Generierung von Ceramiden einen möglichen Mechanismus darstellt, die Funktion von T-Zellen zu beeinträchtigen.
N2  - Ceramides are sphingolipids regulating various signalling pathways mainly associated with the induction of apoptosis and cell cycle arrest. Besides their established role in these processes several lines of evidence suggest that ceramides also regulate cytoskeletal dynamics in non-hematopoietic cells, but their role in T lymphocyte function has not yet been addressed. In this study we show that accumulation of membrane ceramides affects several processes required for accurate T cell function. Treatment of T cells with bSMase or exogenously added ceramides interfered with T cell adhesion to FN and ICAM-1 as well as T cell polarisation, chemotaxis and motility in response to SDF-1. In line with the impairment to morphologically polarise, relocation of surface receptors as well as intracellular signalling molecules was also impaired upon ceramide treatment of T cells. Moreover, increase in cellular ceramide levels interfered with cellular signalling pathways as revealed by reduced phosphorylation levels of Akt and ERM proteins. T cell activation requires the formation of an IS with DCs. In this study we could show, that ceramides, although excluded from the DC/T cell interface, do not interfere with conjugate frequency or synapse organisation, since a normal distribution of CD3 and the MTOC was observed. Nevertheless, ceramide generation interfered with the translocation of Orai1 and Stim1 to the interface and in line with this observation a reduced calcium-influx in T cells was detected upon bSMase exposure. In addition to the decrease in cytosolic calcium levels ceramides also reduced the ability of T cells to proliferate in response to CD3/CD28 stimulation. Therefore the induction of ceramides by certain pathogens, including MV, might be a possible mechanism to interfere with essential processes required for T cell activation.
KW  - Ceramide
KW  - T-Lymphozyt
KW  - T-Zell-Aktivierung
KW  - Zytoskelettreorganisation
KW  - immunologische Synapse
KW  - Masernvirus
KW  - ceramide
KW  - T cell activation
KW  - cytoskeletal reorganisation
KW  - immunological synapse
KW  - measles virus
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65123
ER  - 
TY  - THES
A1  - Önal-Hartmann, Cigdem
T1  - Emotional Modulation of Motor Memory Formation
T1  - Emotionale Modulation des Motorischen Gedächtnises
N2  - Hintergründe: Wie eine Vielzahl von Studien belegt, kann das explizite Gedächtnis, das die bewusste Erinnerung an enkodierte Informationen beinhaltet, durch Emotionen beeinflusst werden, und zwar über den Einfluss auf verschiedene Verarbeitungsebenen (Enkodierung, Konsolidierung, Abruf usw.). Bisher wenig untersucht ist, ob und wie Emotionen Vorgänge der motorischen Gedächtnisbildung, die nicht auf bewusster Erinnerung beruhen und sich stattdessen durch Veränderungen im Verhalten darstellen, modulieren. Experiment 1: Das Ziel des ersten Experimentes war es, den Einfluss von Emotionen auf motorisches Lernen zu untersuchen. Vier Gruppen von Probanden mussten in einer motorischen Lernaufgabe schnelle, seitliche Bewegungen mit dem Daumen ausführen. Während dieser Aufgabe hörten die Probanden emotionale Klänge, die in Valenz und Arousal variierten: 1. Valenz negativ/ Arousal niedrig (V-/A-), 2. Valenz negativ/ Arousal hoch (V-/A+), 3. Valenz positiv/ Arousal niedrig (V+/A-), 4. Valenz positiv/ Arousal hoch (V+/A+). Die deskriptive Analyse aller Daten sprach für beste Ergebnisse für das motorische Lernen in der Bedingung V-/A-, aber die Unterschiede zwischen den Bedingungen waren nicht signifikant. Die Interaktion zwischen Valenz und Arousal emotionaler Töne scheint demnach motorische Enkodierungsprozesse zu modulieren, jedoch müssen zukünftige Studien mit unterschiedlichen emotionalen Stimuli die Annahme weiter untersuchen, dass negative Stimuli mit niedrigem Arousal während der Enkodierung einen fördernden Effekt auf das motorische Kurzzeitgedächtnis haben. Experiment 2: Die Absicht des zweiten Experimentes war es, die Auswirkungen emotionaler Interferenzen auf die Konsolidierung beim Sequenzlernen zu untersuchen. Sechs Gruppen von Probanden trainierten zuerst in getrennten Sitzungen eine SRTT-Aufgabe (serial reaction time task). Um die Konsolidierung der neu erlernten Fertigkeit zu modulieren, wurden die Probanden nach dem Training einer von drei unterschiedlichen Klassen emotionaler Stimuli (positiv, negativ oder neutral) ausgesetzt. Diese bestanden aus einem Set emotionaler Bilder, die mit emotional kongruenten Musikstücken oder neutralen Klängen kombiniert waren. Bei den Probandengruppen wurde die emotionale Interferenz nach zwei unterschiedlichen Zeitintervallen realisiert, entweder direkt nach der Trainingssitzung oder sechs Stunden später. 72 Stunden nach der Trainingssitzung wurde jede Gruppe erneut mit der SRTT-Aufgabe getestet. Die Leistung in diesem Nachtest wurde mittels Reaktionszeit und Genauigkeit bei der Ausführung der Zielsequenz analysiert. Die emotionale Interferenz beeinflusste weder die Nachtestergebnisse für die Reaktionszeit noch die für die Genauigkeit. Allerdings konnte eine Steigerung der expliziten Sequenzerkennung durch erregende negative Stimuli festgestellt werden, wenn diese direkt nach der ersten Trainingseinheit (0h) dargeboten wurden. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass die Konsolidierung der expliziten Aspekte prozeduralen Lernens in einer stärkeren Wechselwirkung mit emotionalen Interferenzen stehen könnte als die der impliziten Aspekte. Die Konsolidierung unterschiedlicher Ebenen des Fertigkeitserwerbs könnte demnach von unterschiedlichen Mechanismen gesteuert werden. Da Performanz und explizites Sequenzerkennen nicht korrelierten, vermuten wir, dass implizite und explizite Modalitäten bei der Durchführung der SRTT-Aufgabe nicht komplementär sind. Experiment 3: Es sollte untersucht werden, ob es eine Präferenz der linken Gehirnhemisphäre bei der Kontrolle von Flexionsreaktionen auf positive Stimuli gibt und der rechten Hemisphäre bei der Kontrolle von Extensionsreaktionen auf negative Stimuli. Zu diesem Zweck sollten rechtshändige Probanden einen Joystick zu sich ziehen oder von sich weg drücken, nachdem sie einen positiven oder negativen Stimulus in ihrem linken oder rechten Gesichtsfeld gesehen hatten. Die Flexionsreaktionen waren bei positiven Stimuli schneller, Extensionsreaktion hingegen bei negativen Stimuli. Insgesamt war die Performanz am schnellsten, wenn die emotionalen Stimuli im linken Gesichtsfeld präsentiert wurden. Dieser Vorrang der rechten Gehirnhemisphäre war besonders deutlich für negative Stimuli, wohingegen die Reaktionszeiten auf positive Bilder keine hemisphärische Differenzierung zeigten. Wir konnten keine Interaktion zwischen Gesichtsfeld und Reaktionstyp belegen, auch fand sich keine Dreifachinteraktion zwischen Valenz, Gesichtsfeld und Reaktionstyp. In unserem experimentellen Kontext scheint die Interaktion zwischen Valenz und Gesichtsfeld stärker zu sein als die Interaktion zwischen Valenz und motorischem Verhalten. Auf Grund dieser Ergebnisse vermuten wir, dass unter gewissen Bedingungen eine Hierarchisierung der asymmetrischen Muster Vorrang hat, die möglicherweise andere vorhandene Asymmetrien maskieren könnte.
N2  - Background: There is extensive evidence that explicit memory, which involves conscious recall of encoded information, can be modulated by emotions; emotions may influence encoding, consolidation or retrieval of information. However, less is known about the modulatory effects of emotions on procedural processes like motor memory, which do not depend upon conscious recall and are instead demonstrated through changes in behaviour. Experiment 1: The goal of the first experiment was to examine the influence of emotions on motor learning. Four groups of subjects completed a motor learning task performing brisk isometric abductions with their thumb. While performing the motor task, the subjects heard emotional sounds varying in arousal and valence: (1) valence negative / arousal low (V-/A-), (2) valence negative / arousal high (V-/A+), (3) valence positive / arousal low (V+/A-), and (4) valence positive / arousal high (V+/A+). Descriptive analysis of the complete data set showed best performances for motor learning in the V-/A- condition, but the differences between the conditions did not reach significance. Results suggest that the interaction between valence and arousal may modulate motor encoding processes. Since limitations of the study cannot be ruled out, future studies with different emotional stimuli have to test the assumption that exposure to low arousing negative stimuli during encoding has a facilitating effect on short term motor memory. Experiment 2: The purpose of the second experiment was to investigate the effects of emotional interference on consolidation of sequential learning. In different sessions, 6 groups of subjects were initially trained on a serial reaction time task (SRTT). To modulate consolidation of the newly learned skill, subjects were exposed, after the training, to 1 of 3 (positive, negative or neutral) different classes of emotional stimuli which consisted of a set of emotional pictures combined with congruent emotional musical pieces or neutral sound. Emotional intervention for each subject group was done in 2 different time intervals (either directly after the training session, or 6 h later). After a 72 h post-training interval, each group was retested on the SRTT. Re-test performance was evaluated in terms of response times and accuracy during performance of the target sequence. Emotional intervention did not influence either response times or accuracy of re-testing SRTT task performance. However, explicit awareness of sequence knowledge was enhanced by arousing negative stimuli applied at 0 h after training. These findings suggest that consolidation of explicit aspects of procedural learning may be more responsive toward emotional interference than are implicit aspects. Consolidation of different domains of skill acquisition may be governed by different mechanisms. Since skill performance did not correlate with explicit awareness we suggest that implicit and explicit modes of SRTT performance are not complementary. Experiment 3: The aim of the third experiment was to analyze if the left hemisphere preferentially controls flexion responses towards positive stimuli, while the right hemisphere is specialized towards extensor responses to negative pictures. To this end, right-handed subjects had to pull or push a joystick subsequent to seeing a positive or a negative stimulus in their left or right hemifield. Flexion responses were faster for positive stimuli, while negative stimuli were associated with faster extensions responses. Overall, performance was fastest when emotional stimuli were presented to the left visual hemifield. This right hemisphere superiority was especially clear for negative stimuli, while reaction times towards positive pictures showed no hemispheric difference. We did not find any interaction between hemifield and response type. Neither was there a triple interaction between valence, hemifield and response type. In our experimental context the interaction between valence and hemifield seems to be stronger than the interaction between valence and motor behaviour. From these results we suppose that under certain conditions a hierarchy scaling of the asymmetry patterns prevails, which might mask any other existing asymmetries.
KW  - Motorisches Lernen
KW  - Gefühl
KW  - Motorisches Gedächtnis
KW  - Emotionen
KW  - Konsolidierung
KW  - Motor Memory
KW  - Emotion
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-64838
ER  - 
TY  - THES
A1  - Deb, Jolly
T1  - Role of Transcription Factor NFATc1 in Development, Survival and Function of B Lymphocytes
T1  - Die Bedeutung des Transkriptionsfaktors NFATc1 für die Entwicklung, das Überleben und die Funktion von B-Lymphozyten
N2  - Die Transkriptionsfaktoren der NFAT-Proteinfamilie (Nuclear Factor of Activated T cells, NFATc1-4) sind an entscheidender Stelle in die Regulation des Zellzyklus, des programmierten Zelltodes und der Kanzerogenese involviert. NFATc1 nimmt innerhalb dieser Familie eine Sonderrolle ein, da dessen Aktivität auch durch eine stark induzierbare Expression gesteigert werden kann. Dies ist insbesondere für die Differenzierung und Funktion von T- und B-Lymphozyten von Bedeutung. Weiterhin ist NFATc1 für die Muskel- oder Herzentwicklung notwendig. Eine Reihe von Arbeiten belegen darüber hinaus eine Beteiligung dieses Transkriptionsfaktors an der Entstehung von Leukämien und Lymphomen. Während klassische Hodgkin-Lymphome allerdings durch eine abgeschaltete NFATc1-Expression gekennzeichnet sind, wird für T-ALL (Akute Lymphatische Leukämie der T-Zelle) eine Überexpression beschrieben. Die Kernlokalisation dieses Transkriptionsfaktors erfolgt nach Dephosphorylierung des zytoplasmatischen Proteins durch die Phosphatase Calcineurin. Deren Phosphataseaktivität wird durch einen Anstieg des intrazellulären Ca++-Spiegels aktiviert. Inwiefern die Calcineurin-abhängige Kerntranslokalisation den einzigen Aktivierungsmechanismus für NFAT-Faktoren darstellt, ist noch nicht eindeutig geklärt. Nach optimaler Aktivierung von T- bzw. B-Zellen ist die kurze, induzierbare Isoform NFATc1/A das Hauptprodukt des NFATc1-Gens. In dieser Arbeit wurden für die gezielte Deletion des NFATc1-Gens in der Maus zwei verschiedene konditionelle Systeme verwandt. Hierzu wurden Tiere, die ein mit „flox“-Sequenzen versehenes drittes Exon des NFATc1-Gens in der Keimbahn tragen, mit verschiedenen Cre-Rekombinase expremierenden Linien verkreuzt. Der Verlust funktionellen NFATc1-Proteins erfolgt dann früh in der B-Zell-Differenzierung im Knochenmark (Cd79a/mb-1-cre x Nfatc1flx/fl) bzw. in reifen B-Zellen (Cd23-cre x Nfatc1flx/flx). Während in keiner dieser Linien signifikante Defekte in der Differenzierung “konventioneller B2” B-Lymphozyten beobachtet wurden, hatte die frühe Inaktivierung des NFATc1-Gens im Knochenmark den Verlust der B1a-Zell-Population im Peritoneum zur Folge. In vitro zeigten NFATc1-/--B-Zellen aus der Milz nach Aktivierung über den B-Zell-Rezeptor deutliche Defekte in der Zellteilung bei einer gleichzeitigen Zunahme des aktivierungsinduzierten Zelltodes (AICD, activation induced cell death). Die vergleichende Transkriptomanalyse identifizierte wichtige Gene des Ca++/Calcineurin-Signalweges als NFATc1-Zielgene und mitverantwortlich für die Proliferationsdefekte. In NFATc1-defizienten B-Zellen konnte Re-Expression von NFATc1 in geringer Konzentration den aktivierten Zelltod inhibieren, wohingegen hohe Konzentrationen diesen noch weiter förderten. Zusammengenommen lässt sich daher schließen, dass NFATc1 entscheidend an der Kontrolle von Proliferation und Zelltod peripherer B-Lymphozyten beteiligt ist. Eine weitere wichtige Funktion kommt NFATc1 beim Klassenwechsel im Immunglobulin-Lokus zu. In den untersuchten Mäusen war die IgG3-Produktion nach Immunisierung mit NP-Ficoll (einem T-Zell-unabhängigen Antigen des Typs II) deutlich reduziert, wenn das NFATc1-Gen in den B-Lymphozyten funktionslos war. Auch die Bildung von IgG3+-Plasmablasten war gehemmt. Zu ähnlichen Ergebnissen führten Untersuchungen an isolierten B-Lymphozyten in einem in vitro Klassenwechsel-Modell. Demgegenüber zeigten Immunisierungen der Tiere mit NP-KLH (einem T-Zell-abhängigen Antigen) keine signifikanten Abweichungen im Klassenwechsel. Zusammengefasst zeigen diese Daten die große Bedeutung des Transkriptionsfaktors NFATc1 für das Überleben und die Funktion peripherer B-Lymphozyten.
N2  - The Nuclear Factors of Activated T cells (NFATs) are critical transcription factors playing major roles in the control of the cell cycle, apoptosis and, probably, also cancerogenesis. Of all the four genuine NFATc family members, NFATc1 has the unique induction property which appears to be essential for T and B cell development, along with its considerable role in cytokine gene expression and function in non-lymphoid tissues and during organ development (such as in the development of muscle and heart cells). A number of studies have proved the potential role of NFATc1 protein in development of lymphomas and leukemias and provided evidence of differential expression of the same gene in different tumours (Suppression in classical Hodgkin lymphomas but overexpression in T-ALLs). Although the most commonly accepted pathway is the dephosphorylation of NFAT by calcineurin upon a rise in intracellular Ca++ leading to nuclear translocation followed by transcription of Il2 gene and related cytokines, it is quite possible that signaling mechanisms other than (or in addition to) calcineurin activation lead to NFATc1 induction as well. One of the major isoforms of NFATc1, NFATc1/αA, is the short inducible factor, produced upon full T and B cell activation. Here we used two different conditional knock-out mice as our study model. Inactivation of the murine Nfatc1 gene in bone marrow (of Cd79a/mb-1-cre x Nfatc1flx/flx mice) and spleen (of Cd23-cre x Nfatc1flx/flx mice) resulted in complete ablation of NFATc1 expression in splenic B cells. Although no severe developmental defects were found for the generation of ‘conventional’ B2 cells, NFATc1 inactivation in bone marrow B-cells led to a strong decrease in the peritoneal B1a cell population. In-vitro studies showed a clear-cut decrease in proliferation and an increase in Activation Induced Cell Death (AICD) of NFATc1-/- splenic B cells upon BCR stimulation. While NFATc1 appears to control directly the AICD of peripheral B cells, further studies revealed an effect of NFATc1 on proliferation by a sustained differentiation program controlling Ca++ flux and calcineurin activity which are needed to maintain transcription and proliferation of primary B cells. Re-expression of NFATc1 at a low dose could protect cells against AICD, whereas at a higher dose it initiated AICD. These data suggest an important dual role of NFATc1 in controlling proliferation and apoptosis of peripheral B lymphocytes. NFATc1 ablation also impaired the Ig class switch to IgG3 by T cell-independent (TI) type II antigens and impaired IgG3+ plasmablast formation when studied in-vivo by NP-Ficoll immunization or in-vitro using an in-vitro class-switch model. Contrary to the immunizations with TI-type II antigen, no significant differences were documented in Ig class switch upon immunization with NP-KLH, a T-cell dependent (TD) antigen. Taken together, the data indicate NFATc1/αA as a crucial player in the activation and function of splenic B cells upon BCR stimulation. Missing or incomplete NFATc1/αA induction appears to be one reason for the generation of B cell unresponsiveness, whereas uncontrolled NFATc1/αA expression could lead to unbalanced immune reactions and autoimmune diseases.
KW  - NFATc1
KW  - B-Lymphozyten
KW  - NFATc1
KW  - B Lymphocytes
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57050
ER  - 
TY  - THES
A1  - Polzien, Lisa
T1  - BAD Phosphorylation: A Novel Link between Apoptosis and Cancer
T1  - BAD Phosphorylierung: Eine Neue Verbindung zwischen Apoptose und Krebs
N2  - BAD (Bcl-2 antagonist of cell death, Bcl-2 associated death promoter) is a pro-apoptotic member of the Bcl-2 protein family that is regulated by phosphorylation in response to survival factors. Although much attention has been devoted to the identification of phosphorylation sites in murine BAD (mBAD), little data are available with respect to phosphorylation of human BAD (hBAD) protein. In this work, we investigated the quantitative contribution of BAD targeting kinases in phosphorylating serines 75, 99 and 118 of hBAD (Chapter 3.1). Our results indicate that RAF kinases phosphorylate hBAD in vivo at these established serine residues. RAF-induced phosphorylation of hBAD was not prevented by MEK inhibitors but could be reduced to control levels by use of the RAF inhibitor Sorafenib (BAY 43-9006). Consistently, expression of active RAF suppressed apoptosis induced by hBAD and the inhibition of colony formation caused by hBAD could be prevented by RAF. In addition, using surface plasmon resonance technique we analyzed the direct consequences of hBAD phosphorylation by RAF with respect to complex formation of BAD with 14-3-3 proteins and Bcl-XL. Phosphorylation of hBAD by active RAF promotes 14-3-3 protein association, whereby the phosphoserine 99 represents the major binding site. Furthermore, we demonstrate in this work that hBAD forms channels in planar bilayer membranes in vitro. This pore-forming capacity is dependent on phosphorylation status and interaction with 14-3-3 proteins. Additionally, we show that hBAD pores possess a funnel-shaped geometry that can be entered by ions and non-charged molecules up to 200 Da (Chapter 3.2). Since both lipid binding domains of hBAD (LBD1 and LBD2) are located within the C-terminal region, we investigated this part of the protein with respect to its structural properties (Chapter 3.3). Our results demonstrate that the C-terminus of hBAD possesses an ordered β-sheet structure in aqueous solution that adopts helical disposition upon interaction with lipid membranes. Additionally, we show that the interaction of the C-terminal segment of hBAD with the BH3 domain results in the formation of permanently open pores, whereby the phosphorylation of serine 118 proved to be necessary for effective pore-formation. In contrast, phosphorylation of serine 99 in combination with 14-3-3 association suppresses formation of channels. These results indicate that the C-terminal part of hBAD controls hBAD function by structural transitions, lipid binding and phosphorylation. Using mass spectrometry we identified in this work, besides the established in vivo phosphorylation sites at serines 75, 99 and 118, several novel hBAD phosphorylation sites (serines 25, 32/34, 97, 124 and 134, Chapter 3.1). To further analyze the regulation of hBAD function, we investigated the role of these newly identified phosphorylation sites on BAD-mediated apoptosis. We found that in contrast to the N-terminal phosphorylation sites, the C-terminal serines 124 and 134 act in an anti-apoptotic manner (Chapter 3.4). Our results further indicate that RAF kinases and PAK1 effectively phosphorylate BAD at serine 134. Notably, in the presence of wild type hBAD, co-expression of survival kinases, such as RAF and PAK1, leads to a strongly increased proliferation, whereas substitution of serine 134 by alanine abolishes this process. Furthermore, we identified hBAD serine 134 to be strongly involved in survival signaling in B-RAF-V600E containing tumor cells and found phosphorylation of this residue to be crucial for efficient proliferation in these cells. Collectively, our findings provide new insights into the regulation of hBAD function by phosphorylation and its role in cancer signaling.
N2  - BAD (Bcl-2 antagonist of cell death, Bcl-2 associated death promoter) ist ein pro-apoptotisches Mitglied der Bcl-2 Proteinfamilie und wird in Abhängigkeit von Wachstumsfaktoren durch Phosphorylierung reguliert. Obwohl der Identifizierung von Phosphorylierungsstellen in murinem BAD (mBAD) in den vergangenen Jahren viel Aufmerksamkeit gewidmet wurde, ist die Phosphorylierung des humanen BAD (hBAD) Proteins kaum charakterisiert. In der vorliegenden Arbeit wird der quantitative Beitrag unterschiedlicher Kinasen in Bezug auf die Phosphorylierung der etablierten Phosphorylierungsstellen Serin 75, 99 und 118 von hBAD dargestellt (Kapitel 3.1). Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass RAF-Kinasen hBAD in vivo an diesen etablierten Stellen phosphorylieren. Die RAF-bedingte Phosphorylierung konnte nicht durch MEK-Inhibitoren beeinflusst werden, dagegen bewirkte die Gabe des RAF-Inhibitors Sorafenib (BAY 43-9006) eine Reduktion der Phosphorylierung auf das Niveau der Kontrollproben. Übereinstimmend konnte durch die Expression von aktiven RAF-Kinasen die BAD-induzierte Apoptose sowie die BAD-bedingte Inhibierung der Koloniebildung unterdrückt werden. Zusätzlich verwendeten wir Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Spektroskopie um die Auswirkungen der RAF-bedingten BAD-Phosphorylierung auf die Komplexbildung von hBAD mit 14-3-3-Proteinen und Bcl-XL zu analysieren. Dabei wurde festgestellt, dass die Phosphorylierung von hBAD durch aktive RAF-Kinasen die Assoziierung von 14-3-3 begünstigt, wobei Phosphoserin 99 die Hauptbindungsstelle darstellt. Weiterhin gelang der Nachweis, dass hBAD in vitro Poren in Lipid-Doppelschicht-Membranen bilden kann. Wir wiesen nach, dass die Fähigkeit von hBAD Poren zu bilden phosphorylierungsabhängig ist und durch die Interaktion mit 14-3-3-Proteinen beeinflusst wird. Außerdem demonstrieren wir in dieser Arbeit, dass die BAD-Poren eine zylinderförmige Geometrie aufweisen und sowohl für Ionen als auch für ungeladene Moleküle mit einer Größe von bis zu 200 Da zugänglich sind (Kapitel 3.2). Da beide Lipid-Bindungsstellen (LBD1 und LBD2) am C-Terminus des hBAD lokalisiert sind, charakterisierten wir des Weiteren diesen Teil des Proteins in Hinblick auf seinen strukturellen Aufbau (Kapitel 3.3). Unsere Ergebnisse demonstrieren, dass der hBAD-C-Terminus in wässriger Lösung eine geordnete β-Faltblattstruktur aufweist und bei Eintritt in eine Lipidumgebung helikale Elemente ausbildet. Zusätzlich zeigen wir in dieser Arbeit, dass die Interaktion des C-terminalen hBAD-Segments mit der BH3-Domäne zur Ausbildung von permanent offenen Poren führt, wobei die Phosphorylierung an Serin 118 eine Notwendigkeit für effektive Porenbildung darstellt. In Gegensatz dazu bewirkte die Phosphorylierung von Serin 99 in Kombination mit der Assoziierung von 14-3-3-Protein eine Inhibierung der Porenbildung. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass der C-terminale Teil von hBAD durch strukturelle Veränderungen, Lipidbindung und Phosphorylierung entscheidend die Funktion von hBAD reguliert. Mit Hilfe von Massenspektroskopie konnten wir im Rahmen dieser Arbeit, zusätzlich zu den etablierten Phosphorylierungsstellen Serin 75, 99 und 118, einige neue in vivo Phosphorylierungsstellen von hBAD identifizieren (Serin 25, 32/34, 97, 124 und 134, Kapitel 3.1). Um die Regulierung der Funktion von hBAD weiter zu analysieren, untersuchten wir die Rolle dieser neu identifizierten Phosphorylierungsstellen in Bezug auf die BAD-induzierte Apoptose (Kapitel 3.4). Wir fanden heraus, dass im Gegensatz zu den N-terminalen Phosphorylierungsstellen, die Phosphorylierungsstellen am C-Terminus an der Apoptoseregulation mitwirken. Weiterhin weisen unsere Ergebnisse darauf hin, dass RAF-Kinasen, neben PAK1, an der Phosphorylierung von Serin 134 von hBAD beteiligt sind. Interessanterweise bewirkte die Co-Expression von RAF oder PAK1 mit dem wildtypischen hBAD eine erhebliche Verstärkung der Zellproliferation. Diese verstärkte Proliferation konnte durch einen Serin-zu-Alanin-Austausch in hBAD an der Stelle 134 vollständig verhindert werden. Weiterhin entdeckten wir, dass die Phosphorylierung dieser Stelle in B-RAF-V600E enthaltenden Tumorzellen bei der Regulation der Zellproliferation mitwirkt und für eine effiziente Proliferation entscheidend ist. Zusammenfassend gewähren unsere Ergebnisse neue Einblicke in die Regulierung der Funktion von hBAD durch Phosphorylierung sowie in die Rolle von hBAD bei der Krebsentwicklung.
KW  - Krebs <Medizin>
KW  - Apoptosis
KW  - Bcl-2-Proteinfamilie
KW  - Raf <Biochemie>
KW  - BH3-only proteins
KW  - BAD
KW  - cancer
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56919
ER  - 
TY  - THES
A1  - Puschmann, Anne-Katrin
T1  - Migräne, Stress und Emotionen - Psychophysiologische und neuroimmunologische Faktoren
T1  - Migraine, stress and emotions - psychophysiological and neuroimmunological correlates
N2  - Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der Reaktionen von Migränepatientinnen mit episodischer (EM) und häufiger Migräne (HM) auf verschiedene Aspekte des Triggerfaktors „Negativer Affekt“ wie Stress und negative Emotionen. Die Ergebnisse der beiden Gruppen wurden mit denen gesunder Kontrollpersonen verglichen (KG). Zur Ermittlung des Aufmerksamkeitsverhaltens gegenüber emotionalen Reizen wurden zwei Emotionale Stroop Tests (EST) durchgeführt. Erwartet wurde ein Aufmerksamkeitsbias der Patientinnen hinsichtlich negativer emotionaler Reize. Im EST 1 wurden allgemeine affektive Wörter der Valenzen positiv, neutral und negativ verwendet. Die Probandinnen sollten auf die Wortfarbe mit Tastendruck reagieren und den Wortinhalt ignorieren. Im EST 2 wurden emotionale Gesichtsausdrücke (ärgerlich, freundlich, neutral) als Reize verwendet. Dabei sollte die Rahmenfarbe der Bilder per Tastendruck bestimmt werden und der Inhalt ignoriert werden. Zur Auswertung wurden Emotionale Stroop Interferenzen (ESI) zum Vergleich Reaktionszeitdifferenzen negativ-neutral und negativ-positiv berechnet. Der erwartete Aufmerksamkeitsbias der HM für negative emotionale Reize wurde dabei nicht gefunden. Dafür zeigten im EST 2 die KG einen Aufmerksamkeitsbias für ärgerliche Gesichter. Ein signifikanter Gruppenunterschied in EST 2 mit sehr niedrigen, im Vergleich negativ-positiv sogar negativen ESI der HM ließ auf ein Vermeidungsverhalten dieser Gruppe ärgerlichen Gesichtern gegenüber schließen. Dieses wurde als Vermeidung negativer sozialer Reize interpretiert und zum gelernten, möglicherweise dysfunktionalen Vermeidungsverhalten von Migränepatienten potentiellen Triggersituationen gegenüber in Bezug gesetzt. Weiterhin wurden die Probandinnen mit dem „Paradigma der Öffentlichen Rede“ psychosozialem Stress ausgesetzt, indem sie vor einer Videokamera unter Beobachtung eine Rede halten sowie eine Kopfrechenaufgabe lösen sollten. Vorher und nachher wurden insgesamt vier Speichelproben zur Bestimmung des Stresshormons Kortisol genommen. Zudem wurden die Druckschmerzschwellen vor und nach dem Experimentalteil gemessen. Die erwartete Kortisolreaktion als Antwort auf die psychosoziale Stressaufgabe blieb aus. Ursache dafür kann die Stichprobenzusammensetzung mit 98% Frauen sein, deren Kortisolreaktion auf Stress durch hormonelle Schwankungen im Experiment nur unzuverlässig stimulierbar ist. Bei der Berechnung der Gesamtkortisolausschüttung über die Zeit zeigte sich im Gegensatz zu dem erwarteten erhöhten Kortisolspiegel der Migränepatientinnen ein linearer Abfall des Spiegels von KG, über EM zu HM, mit den niedrigsten Werten der HM. Diese Ergebnisse könnten auf Veränderungen der Hypophysen-Nebennieren (HHN)-Achse im Sinne eines Hypokortisolismus bei Migränepatientinnen widerspiegeln, der weiterer Klärung bedarf, z.B. durch die Bestimmung eines Kortisoltagesprofils bei Patientinnen. Eine veränderte Funktion der HHN-Achse könnte außerdem zu einer inadäquaten Reaktion auf Stresssituationen beitragen. Die bei Patientinnen ausbleibende Veränderung der Druckschmerzschwelle in Reaktion auf Stress lässt ebenfalls auf eine ungenügende Stressreaktion der Patientinnen schließen. Am Ende der Untersuchung, nach einer Entspannungsphase von 50 Minuten, wurde den Probandinnen Blut abgenommen, in dem die mRNA- und Proteinkonzentrationen ausgewählter pro- und antiinflammatorischer Zytokine bestimmt wurden. Die Analyse der Zytokinkonzentrationen mit Luminex ergab für die Proteindaten aufgrund zu geringer verwertbarer Daten kein interpretierbares Bild. Die mittels Real Time Quantitativer PCR erhaltenen mRNA-Konzentrationen spiegelten die Schmerzfreiheit der Patienten wieder, mit im Vergleich zu KG verringerten proinflammatorischen Zytokinen (TNF-alpha, IL-1beta, IL-2, IL-6) und dem ebenfalls verringerten antiinflammatorischen Zytokin IL-10, sowie dem deutlich erhöhten antiinflammatorischen IL-4. Die im Vergleich zur KG überregulierten Zytokine im schmerzfreien Intervall weisen auf veränderte Regulierungsmechanismen des Immunsystems für die Schmerzmediatoren Zytokine hin. Weitere Schmerzmediatoren könnten ebenfalls verändert sein, was weiterer Klärung in nachfolgenden Studien bedarf. Alles in allem konnten verschiedene Veränderungen in den psychologischen und endokrinen Reaktionen der Migränepatientinnen auf Bestandteile des Triggers „Negativer Affekt“ sowie in der Schmerzregulierung gefunden werden, wobei die Veränderungen bei Patientinnen mit Häufiger Migräne stärker auftraten. Dies weist auf eine mögliche Rolle der einzelnen untersuchten Komponenten bei der Migränechronifizierung hin, was in weiteren Studien vertiefend untersucht werden sollte.
N2  - The aim of the study was the assessment of the reactions of migraine patients with episodic or frequent migraine concerning several aspects of the psychological migraine trigger „Negative Affect“, such as stress and negative emotions. The results of the two groups were compared to those of healthy controls. To assess an attentional bias towards emotional cues two Emotional Stroop Tasks (EST) were conducted. The attentional bias towards negative emotional cues was expected to be present in migraine patients. In EST 1 general affective words (negative, neutral, positive) were used as stimuli. The task was to indicate word colour while ignoring word content. In EST 2 emotional faces (angry, neutral, happy) were used. Here, the colour of the frame had to be recognized. For analyses emotionals stroop interference indizes (ESI) were calculated to compare the reaction time differences for negative vs neutral and negative vs positive stimuli, respectively. The expected attentional bias of FM for negative emotional stimuli was not found. But, in EST 2 the controls showed this bias for angry faces. A significant group difference in EST 2 with very low, even negative ESI when comparing negative vs. positive, indicated avoidance behavior away from angry faces. This was interpreted as avoidance behaviour away from negative social stimuli, which is possibly part of the learned avoidance behavior for trigger situations migraine patients learn during their disease history. Furthermore, subjects conducted a public speech paradigm as a psychosocial stress task. Before and after the task saliva probes were collected to obtain salivary cortisol. The expected cortisol increase in response to psychosocial stress did not occur. One possible reason for the absence of the cortisol reaction is the sample of 98% women. It is known, that a stress response with an increase in salivary cortisol is difficult to obtain in women due to the hormonal cycle. The analysis of the overall cortisol secretion revealed an unexpected result: the migraine groups had lower overall cortisol than the controls, with FM displaying the lowest levels. This result could be an indicator for alterations of the HPA-Axis in terms of a hypocortisolism which requires further investigations. For example a diurnal cortisol profile of patients should be assessed. Alterations in HPA-Axis functioning could furthermore contribute to an inadequate stress reaction of migraine patients and therefore increase their vulnerability in experiencing migraine attacks in response to stressful situations. The absence of the expected changes in pressure pain thresholds in patients also points towards alterations in migraineurs´ stress response. After a relaxation period of 50 minutes after the experimental phase blood was taken from the subjects to assess alterations in pro- and antiinflammatory cytokine levels. Due to methodological problems no conclusive protein data could be obtained. The mRNA analysis revealed decreased proinflammatory cytokines (TNF-alpha, IL-1beta, IL-2, IL-6), decreased antiinflammatory cytokine IL-10 and increased antiinflammatory cytokine IL-4. These data reflect the pain free state of the migraine subjects. Compared to the controls the cytokines of the migraineurs seem to be overregulated which points to a dysregulation of the immune system. All in all several alterations in psychological and endocrine reactions to parts of the trigger “Negative Affect” and also in pain regulation could be found in migraine patients. These alterations were stronger in patients with frequent migraine indicating a role in migraine chronification. Further studies should investigate the influence of these components more profoundly.
KW  - Migräne
KW  - Stress
KW  - Gefühl
KW  - Physiologie
KW  - Kopfschmerz
KW  - Cytokine
KW  - Hydrocortison
KW  - Aufmerksamkeit
KW  - Stroop-Verfahren
KW  - Emotionen
KW  - Migraine
KW  - stress
KW  - emotions
KW  - stroop task
KW  - cytokines
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55985
ER  -