TY - THES A1 - Salehi, Saeede T1 - Axonal hnRNP R: regulation by Ptbp2 and functions in neurodegenerative disorders T1 - Axonales hnRNP R: Regulation durch Ptbp2 und Funktionen bei neurodegenerativen Erkrankungen N2 - Axon growth, a fundamental process of neuron development, is regulated by both intrinsic and external guidance signals. Impairment of axon growth and maintenance is implicated in the pathogenesis of neurodegenerative disorders such as Amyotrophic Lateral Sclerosis and Alzheimer’s disease (AD). Axon growth is driven by several post-transcriptional RNA processing mechanisms, including alternative splicing, polyadenylation, subcellular localization, and translation. These mechanisms are controlled by RNA-binding proteins (RBPs) through interacting with their target RNAs in a sequence-dependent manner. In this study, we investigate the cytosolic functions of two neuronal RBPs, Ptbp2 and hnRNP R, which are essential for axon growth in motoneurons. Polypyrimidine tract binding protein 2 (Ptbp2) contributes to neuronal differentiation and axonogenesis by modulating different splicing programs to adjust the level of proteins involved in these processes. While the nuclear functions of Ptbp2 in alternative splicing have been studied in more detail, the cytosolic roles of Ptbp2 associated with axon growth have remained elusive. In the first part of the study, we show that Ptbp2 is present in cytosolic fractions of motoneurons including axons and axon terminals. Depletion of Ptbp2 impairs axon growth and growth cone maturation in cultured embryonic mouse motoneurons. Moreover, Ptbp2 knockdown affects the level of piccolo protein in the growth cone of cultured motoneurons. We detect Ptbp2 as a top interactor of the 3' UTR of the Hnrnpr transcript encoding the RBP hnRNP R. This interaction results in axonal localization of and thereby local translation of Hnrnpr mRNA in motoneurons. Consequently, axonal synthesis of hnRNP R was diminished upon depletion of Ptbp2 in motoneurons. We present evidence that Ptbp2 through cooperation with translation factor eIF5A2 controls hnRNP R synthesis. Additionally, we observe that re-expression of hnRNP R in Ptbp2-deficient motoneurons rescued axon growth defect while Ptbp2 overexpression failed to normalize the axon elongation defect observed in hnRNP R-deficient motoneurons. Our findings pinpoint axonal synthesized hnRNP R as a mediator of Ptbp2 functions in axon growth. In the second part of this study, we identify hnRNP R binds to the 3' UTR of microtubule-associated tau (Mapt) transcript encoding tau protein and regulates the axonal translocation and translation of Mapt mRNA. Tau protein has a central role in neuronal microtubule assembly and stability. However, in AD, the accumulation of abnormally hyperphosphorylated tau protein leads to axon outgrowth defects. Loss of hnRNP R reduces axonal tau protein but not the total level of tau. We observe that the brains of 5xFAD mice, as a mouse model of AD, deficient for hnRNP R contain lower phospho-tau and amyloid-β plaques. Likewise, Neurons treated with blocking antisense oligonucleotides (ASO) to prevent binding of hnRNP R to Mapt mRNA show reduced axonal Mapt mRNA and consequently newly synthesized tau protein levels. We show that blocking Mapt mRNA transport to axons impairs axon elongation. Our data thus suggest that reducing tau levels selectively in axons, a major subcellular site of tangle formation, might represent a novel therapeutic approach for the treatment of AD. N2 - Axonwachstum ist ein grundlegender Prozess der Neuronenentwicklung und wird sowohl durch intrinsische als auch externe Leitsignale reguliert. Eine Beeinträchtigung des Axonwachstums und der Aufrechterhaltung von Axonen ist mit der Pathogenese neurodegenerativer Erkrankungen wie der Amyotrophen Lateralsklerose und der AlzheimerKrankheit (AD) verbunden. Mehrere posttranskriptionelle RNA-Verarbeitungsmechanismen, darunter alternatives Spleißen, Polyadenylierung, subzelluläre Lokalisierung und Translation, steuern das Axonwachstum. RNA-bindende Proteine (RBPs) steuern diese Mechanismen, indem sie sequenzabhängig mit ihren Ziel-RNAs interagieren. In dieser Studie untersuchen wir die zytosolischen Funktionen von zwei neuronalen RBPs, Ptbp2 und hnRNP R, die für das Axonwachstum in Motoneuronen essentiell sind. Das Polypyrimidin-Trakt-Bindungsprotein 2 (Ptbp2) trägt zur neuronalen Differenzierung und Axonogenese bei, indem es verschiedene Spleißprogramme moduliert, um die Menge der an diesen Prozessen beteiligten Proteine anzupassen. Während die nukleären Funktionen von Ptbp2 beim alternativen Spleißen detaillierter untersucht wurden, sind die zytosolischen Rollen von Ptbp2 im Zusammenhang mit dem Axonwachstum noch unklar. Im ersten Teil der Studie zeigen wir, dass Ptbp2 in zytosolischen Fraktionen von Motoneuronen einschließlich Axonen und Axonterminals vorhanden ist. Die Reduktion von Ptbp2 beeinträchtigt das Axonwachstum und die Reifung der Wachstumskegel in kultivierten embryonalen Motoneuronen von Mäusen. Darüber hinaus beeinflusst der Ptbp2-Knockdown den Gehalt an Piccolo-Protein im Wachstumskegel kultivierter Motoneuronen. Wir identifizierten Ptbp2 als Top-Interaktor der 3'-UTR des Hnrnpr-Transkripts, welches das RBP hnRNP R kodiert. Diese Interaktion führt zur axonalen Lokalisierung und damit zur lokalen Translation der Hnrnpr-mRNA in Motoneuronen. Folglich wurde die axonale Synthese von hnRNP R durch Depletion von Ptbp2 in Motoneuronen verringert. Wir legen Beweise dafür vor, dass Ptbp2 durch die Zusammenarbeit mit dem Translationsfaktor eIF5A2 die hnRNP R-Synthese steuert. Darüber hinaus beobachten wir, dass die erneute Expression von hnRNP R in Motoneuronen mit Ptbp2-Mangel den Axonwachstumsdefekt rettete, während die Überexpression von Ptbp2 den auch bei Motoneuronen mit hnRNP R-Mangel beobachteten Axonwachstumsdefekt nicht normalisieren konnte. Unsere Ergebnisse zeigen, dass axonal synthetisiertes hnRNP R ein Vermittler der Ptbp2-Funktionen beim Axonwachstum ist. Im zweiten Teil dieser Studie beobachteten wir, dass hnRNP R an die 3'-UTR des Mikrotubuliassoziierten Tau-Transkripts (Mapt) bindet, welches das Protein tau kodiert. Die hnRNP RMapt Interaktion bewirkt die axonale Translokation und Translation der Mapt-mRNA. Tau spielt eine zentrale Rolle beim Aufbau und der Stabilität neuronaler Mikrotubuli. Bei AD führt die Anhäufung von abnormal hyperphosphoryliertem tau-Protein jedoch zu neuronaler Degeneration. Der Verlust von hnRNP R verringert das axonale tau-Protein, jedoch nicht den Gesamtspiegel von tau. Wir beobachten, dass die Gehirne von 5xFAD-Mäusen, einem AD Mausmodell, durch Reduktion von hnRNP R geringere Mengen an Phospho-tau- und Amyloidβ-Plaques aufweisen. Ebenso zeigen Neuronen, die mit blockierenden ntisenseOligonukleotiden (ASO) behandelt wurden, um die Bindung von hnRNP R an Mapt-mRNA zu verhindern, verringerte axonale Mapt-mRNA Mengen und reduzierte Mengen an neu synthetisiertem tau-Protein. Unsere Daten legen daher nahe, dass die selektive Reduzierung des tau-Spiegels in Axonen, einem wichtigen subzellulären Ort der Neurofibrillenbildung, einen neuen therapeutischen Ansatz für die Behandlung der AD darstellen könnte. KW - Motoneuron KW - Axonal RNA localization KW - Axonal translation KW - Axon growth KW - Ptbp2 KW - Axonaler Transport KW - axonal transport KW - Nervendegeneration Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-371039 ER - TY - THES A1 - Reichelt, Niklas T1 - Exploring the natural variation of heat-dependent metabolic rearrangements in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) to identify genes involved in thermotolerance T1 - Untersuchung der natürlichen Variation des hitzeregulierten Metaboloms in \(Arabidopsis\) \(thaliana\), um Gene der pflanzlichen Thermotoleranz zu identifizieren N2 - Climate change and associated extreme weather events are a threat not only for agricultural yields but the plant kingdom in general. Therefore, there is a great necessity to better understand the plants' intrinsic mechanisms to combat heat stress. The plant heat stress response already has been investigated in many studies, including the role of HSFA1 transcription factors as the central regulators. Other aspects such as the initial perception of heat and the role of heat-induced changes in plant metabolism are rather unknown. In this thesis, the natural variation of 250 different accessions of Arabidopsis thaliana was investigated regarding the temperature-dependent accumulation of raffinose and triacylglycerols. A connection between these phenotypes and respective genotypes was established using genome-wide association studies. As a result, the candidate gene TREHALOSE-6-PHOSPHATE SYNTHASE 1 (TPS1), was identified. Enzymatic TPS1 is responsible for the synthesis of trehalose 6-phosphate (T6P), which serves as an indicator and regulator of sucrose homeostasis. Subsequent analyses using tps1 tilling mutants demonstrated a link between T6P metabolism and an increased accumulation of various soluble carbohydrates and starch, including raffinose both under control conditions and during heat exposure. Furthermore, the mutant lines displayed enhanced thermotolerance and survival rates following long-term heat stress. Transcriptome analyses, however, did not show any difference in the regulation of canonical heat stress-associated genes. Instead, genes related to photosynthesis were overrepresented among the differentially upregulated genes in tps1 tilling lines during heat exposure. In this work, a direct connection of T6P signaling, sucrose homeostasis, and thermotolerance is shown for the first time. In a second project, two Arabidopsis thaliana accessions (Oberursel-0, accession ID: 7276; Nieps-0, accession ID: 7268) showing distinct capacities to acquire short-term thermotolerance were compared to identify the putative causative regulators or mechanisms that lead to the different levels of thermotolerance. An examination of the transcriptomes of 7268 and 7276 showed that several hundreds of genes were already differentially regulated within 10 minutes of exposure to 32 °C or 34 °C. Among these, several genes associated with sulfur metabolism were more highly induced in the more thermotolerant accession 7268. However, experimental as well as genetic manipulation of sulfur availability and metabolism did not result in altered thermotolerance. In addition to sulfur-related genes, most of the canonical heat stress-associated genes were more highly expressed in 7268 than in 7276. While we could not identify a causative regulator or mechanism of differential thermotolerances, the data strongly suggests that 7268 either has a higher overall sensitivity, i.e., the heat stress response is initiated at lower temperatures, or stronger overall heat stress response when exposed to a certain elevated temperature. N2 - Der Klimawandel und die damit einhergehenden extremen Wetterereignisse stellen eine große Bedrohung für den Ertrag der Landwirtschaft aber auch das Reich der Pflanzen im Allgemeinen dar. Es ist daher von großer Notwendigkeit, die der Pflanzen intrinsischen Mechanismen zur Bekämpfung von Hitzestress besser zu verstehen. Die hierbei zugrundeliegende Hitzestressantwort der Pflanzen ist bereits durch viele Studien untersucht worden, unter anderem die Rolle von HSFA1 Transkriptionsfaktoren als zentrale Regulatoren. Andere Aspekte wie die initiale Wahrnehmung von Hitze sowie die Rolle von hitzeinduzierten Veränderungen des Pflanzenmetabolismus sind eher unbekannt. In dieser Thesis wurde die natürliche Variation von 250 Populationen von Arabidopsis thaliana hinsichtlich der temperatur-abhängigen Akkumulation von Raffinose und Triacylglycerolen untersucht. Ein statistischer Zusammenhang dieser Phänotypen sowie zugrundeliegender Genotypen wurde mittels Genomweiter Assoziationsstudien erstellt. Als Ergebnis konnte das Kandidatengen Trehalose-6-Phosphate Synthase 1 (TPS1) identifiziert werden. Das Enzym TPS1 ist verantwortlich für die Synthese von T6P, welches als Indikator sowie Regulator der Homöostase von Saccharose fungiert. Folgestudien an tps1 tilling lines konnten sowohl unter Kontrollbedingungen als auch bei Hitzestress einen Zusammenhang zwischen dem T6P Metabolismus und einer erhöhten Akkumulation von Raffinose, weiterer löslicher Zucker, sowie Stärke nachweisen. Des Weiteren zeigten die tps1 tilling lines eine erhöhte Thermotoleranz und Überlebensrate gegenüber Langzeit-Hitzestress. Eine Analyse der Transkriptome zeigte keinen Unterschied in der Regulation klassischer Hitzestress-assoziierter Gene. In beiden tps1 tilling lines war in Folge von Hitzestress eine Überrepräsentation von signifikant hochregulierten Genen vorzufinden, welche mit der Photosynthese der Pflanze assoziiert sind. In dieser Arbeit konnte erstmalig ein direkter Zusammenhang von T6P Signaling, Zucker-Homöostase und Thermotoleranz gezeigt werden. In einem zweiten Projekt wurden zwei Arabidopsis thaliana Populationen (Oberursel-0, Populations-ID: 7276; Nieps-0, Populations-ID: 7268) verglichen, welche deutliche Unterschiede in ihrer Fähigkeit der kurzzeitig akquirierten Thermotoleranz aufweisen. Ziel war hierbei die Identifikation etwaiger kausaler Regulatoren oder Mechanismen, welche zu den unterschiedlich ausgeprägten Thermotoleranzen führen. Eine Untersuchung der Transkriptome von 7268 und 7276 konnte zeigen, dass bereits nach 10 Minuten einer 32 °C oder auch 37 °C Hitzebehandlung hunderte von Genen differentiell reguliert sind. Hierbei waren in der hitzetoleranteren Population 7268 mehrere Gene, welche mit dem Schwefel-Metabolismus assoziiert sind, im Vergleich zu 7276 höher exprimiert. Jedoch hatten sowohl die experimentelle Schwefelverfügbarkeit als auch die genetische Manipulation des Schwefelmetabolismus keinen Effekt auf die Thermotoleranz. Neben den Schwefel-assoziierten Genen waren auch die meisten der klassischen Hitzestress-assoziierten Gene in 7268 höher exprimiert als in 7276. Zwar konnte kein kausaler Regulator oder Mechanismus für die unterschiedlichen Thermotoleranzen identifiziert werden, jedoch weisen die generierten Daten auf eine allgemein stärkere Hitzestressantwort oder aber eine höhere Hitzesensitivität von 7268 gegenüber 7276 hin. KW - Schmalwand KW - Hitzestress KW - Stärke KW - Raffinose KW - Genomweite-Assoziationsstudien KW - Genome-wide association studies KW - RNA-Seq KW - Natürliche Variation KW - Natural Variation KW - Trehalose-6-Phosphate Synthase 1 (TPS1) KW - Triacylglycerole Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-371324 ER - TY - THES A1 - Hesen, Nienke Aiyuan T1 - The importance of antibody isotype and idiotype in FcγR-dependent agonism induced by anti-CD40 antibodies T1 - Die Bedeutung des Antikörper-Isotyps und des Idiotyps beim FcγR-abhängigen Agonismus, der durch Anti-CD40-Antikörper induziert wird N2 - The TRAF-binding receptor CD40 belongs to the TNFR superfamily and is broadly expressed on healthy cells, mainly on antigen-presenting cells, but also on other immune cells and non-immune cells. CD40 is bound by its ligand CD40L, which is essential for a wide range of immunological responses by inducing or inhibiting different pathways that are essential for a variety of cellular processes, including immune activation and maturation. (1,2) Dysregulated CD40 signalling has been implicated in inflammatory diseases, such as hyper-IgM syndrome, psoriasis, and cancer. (3–6) Due to its broad expression across various tumour types, it can serve as a tumour-associated antigen and has therefore been proposed as a target for antibodies for cancer treatment. (2,7,8) Agonistic anti-CD40 antibodies have been demonstrated to induce anti-tumoural immune responses as well as therapeutic immunity. (2) Furthermore, prolonged stimulation of CD40 in tumour cells in vitro has been shown to decrease proliferation, increase expression of cytotoxic TNFSFLs and induce apoptosis. (9,10) Their effect on anti-tumoral responses has been well studied and anti-tumoral responses by DC maturation and suppression of malignant growth of B-cells have been confirmed and were found to induce cell death in tumours in vitro. (11–14) Many agonistic anti-CD40 antibodies specifically have been reported to require secondary crosslinking by binding to either activating or inhibitory FcγRs to be agonistic in vitro, while in vivo studies have indicated inhibitory FcƴR2B expression as critical factor. (15–17) However, FcƴR independent agonism has also been reported for anti-CD40 antibodies. (18,19) While agonistic anti-CD40 IgG1, IgG3 and IgG4 antibodies have been shown to display FcƴR dependent agonism, agonistic anti-CD40 IgG2 antibodies have shown to display FcƴR independent agonism. Conversion of anti-CD40 IgG1 antibodies into IgG2 has also been shown to convert the antibody’s agonism into FcƴR independent agonism. (20) To overcome FcƴR dependency, bispecific antibody fusion proteins containing a scFv as anchoring domain allowing for crosslink independent of FcƴR binding have been designed before. This approach has been found to display strong agonism for other antibody fusion proteins when bound to both targets, with response levels resembling that of FcƴR bound antibodies. (21,22) The relevance of antibody isotype and idiotype for FcƴR-dependent agonism as well as the relevance of valency and antibody oligomerization for FcƴR-independent agonism were investigated in this study on a panel of different anti-CD40 antibodies. Several clinically investigated anti-CD40 antibodies (ADC-1013(23), APX005M(24), ChiLob7.4(25) and CP-870,893(26)) and one preclinical antibody (G28.5(27,28)) were considered. Selected antibodies were then cloned onto an IgG1, IgG1(N297A), IgG2 and IgG4 backbone. The IgG1(N297A) isotype is an IgG1 antibody with a point mutation (N297A) that is known to strongly reduce binding to FcƴR1, while reducing the binding affinity to FcƴR2B to undetectable levels. (29,30) In this work it is demonstrated that the investigated anti-CD40 antibody variants across different isotypes activate both the classical and alternative NFκB pathway by stimulating U2OS cells in an FcƴR dependent manner. Stimulation in the presence of both human FcƴRs as well as murine FcƴRs resulted in CD40 stimulation. A difference in binding competition was observed for the various anti-CD40 IgG1 antibodies, but no indication of a CRD-dependent mechanism responsible for their agonistic activity was found. Moreover, this FcƴR dependency could be overcome by creation of tetravalent antibody fusion proteins. N2 - Zusammenfassung Der TRAF-bindende Rezeptor CD40 ist Teil der TNFR-Superfamilie. CD40 wird auf gesunden Zellen, vor allem auf Antigen-präsentierenden Zellen, aber auch auf anderen Immunzellen und Nicht-Immunzellen in großem Umfang exprimiert. Die Aktivierung von CD40 durch seinen Liganden CD40L ist für zahlreiche immunologische Reaktionen von entscheidender Bedeutung, da sie verschiedene Signalwege induziert oder hemmt, die für zahlreiche zelluläre Prozesse, einschließlich Immunaktivierung und -reifung, wichtig sind. (1,2) Defekte CD40-Signalwege werden mit Entzündungskrankheiten wie dem Hyper-IgM-Syndrom, Psoriasis und Krebs in Verbindung gebracht. (3–6) Da CD40 auf verschiedenen Tumorarten weit verbreitet ist, kann es als tumorassoziiertes Antigen verwendet werden, das dann von zytotoxischen Antikörpern angegriffen werden kann, und wurde als Ziel für Antikörper zur Krebsbehandlung vorgeschlagen. (2,7,8) Es hat sich gezeigt, dass agonistische Anti-CD40-Antikörper antitumorale Immunreaktionen und therapeutische Immunität auslösen können. (2) Es hat sich gezeigt, dass die kontinuierliche Stimulation von CD40 in Tumorzellen in vitro die Proliferation reduziert, die Expression zytotoxischer TNFSFLs hochreguliert und Apoptose induziert. (9,10) Ihre Wirkung auf antitumorale Reaktionen wurde gut untersucht, und antitumorale Reaktionen durch DCReifung und Unterdrückung des malignen Wachstums von B-Zellen wurden bestätigt und es wurde festgestellt, dass sie in vitro den Zelltod in Tumoren induzieren. (11–14) Viele agonistische Anti-CD40-Antikörper erfordern Berichten zufolge eine sekundäre Vernetzung durch Bindung an entweder aktivierende oder hemmende FcγRs, um in vitro agonistisch zu wirken, während In-vivo-Studien auf eine hemmende FcƴR2B-Expression als kritischen Faktor hinwiesen. (15–17) Allerdings wurde auch für Anti-CD40-Antikörper ein FcƴR-unabhängiger Agonismus festgestellt. (18,19) Während agonistische Anti-CD40-IgG1-, IgG3- und IgG4-Antikörper nachweislich einen FcƴR-abhängigen Agonismus aufweisen, haben agonistische Anti-CD40-IgG2-Antikörper einen FcƴR-unabhängigen Agonismus gezeigt. Die Umwandlung von Anti-CD40-IgG1-Antikörpern in IgG2-Antikörper hat ebenfalls gezeigt, dass der Agonismus des Antikörpers in einen FcƴR-unabhängigen Agonismus umgewandelt wird. (20) Um die FcƴR-Abhängigkeit zu überwinden, wurden bereits bispezifische AntikörperFusionsproteine entwickelt, die ein scFv als Verankerungsdomäne enthalten und eine von der FcƴR-Bindung unabhängige Vernetzung ermöglichen. Es hat sich gezeigt, dass dieser Ansatz einen starken Agonismus für andere Antikörper-Fusionsproteine aufweist, wenn sie an beide Zielmoleküle gebunden sind, wobei die Ansprechraten denen von FcƴRgebundenen Antikörpern ähneln. (21,22) Die Bedeutung des Antikörper-Isotyps und des Idiotyps für den FcƴR-abhängigen Agonismus sowie die Bedeutung der Valenz und der Antikörper-Oligomerisierung für den FcƴRunabhängigen Agonismus wurden in dieser Studie an einem Panel verschiedener Anti-CD40-Antikörper untersucht. Es wurden mehrere klinisch untersuchte Anti-CD40-Antikörper (ADC1013(23), APX005M(24), ChiLob7.4(25) und CP-870,893(26)) und ein präklinischer Antikörper (G28.5(27,28)) berücksichtigt. Die ausgewählten Antikörper wurden dann auf ein IgG1-, IgG1(N297A)-, IgG2- und IgG4-Backbone kloniert. Beim Isotyp gG1(N297A) handelt es sich um einen IgG1-Antikörper mit einer Punktmutation (N297A), von der bekannt ist, dass sie die Bindung an FcƴR1 stark reduziert, während sie die Bindungsaffinität zu FcƴR2B auf ein nicht nachweisbares Niveau verringert. (29,30)In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die Anti-CD40-Antikörper-Varianten verschiedener Isotypen sowohl den klassischen als auch den alternativen NFκB-Signalweg aktivieren, indem sie U2OS-Zellen in einer FcƴR-abhängigen Weise stimulieren. Die Stimulierung in Anwesenheit sowohl von humanen FcƴRs als auch von murinen FcƴRs führte zu einer CD40-Stimulierung. Während für die verschiedenen Anti-CD40-IgG1-Antikörper ein Unterschied in der Bindungskonkurrenz beobachtet wurde, konnten die CRD-Bindungsprofile keine Erkenntnisse über die zugrunde liegenden Mechanismen liefern. Darüber hinaus konnte diese FcƴR-Abhängigkeit durch die Herstellung von tetravalenten AntikörperFusionsproteinen überwunden werden. KW - Antigen CD40 KW - FcƴR Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-371872 ER - TY - THES A1 - Vialetto, Elena T1 - Outcomes of genome targeting with CRISPR-Cas systems in bacteria T1 - Folgen des Genom-Targeting mit CRISPR-Cas-Systemen in Bakterien N2 - CRISPR-Cas systems are a versatile tool in genetic engineering because they can be easily reprogrammed to cut a specific chromosomal region or RNA transcript. The choice of nuclease, gRNA design, and target region all influence targeting efficiency, so the appropriate CRISPR components should be chosen depending on the desired application. This thesis examines factors that influence targeting in both DNA- and RNA-targeting CRISPR systems. Chapter 1 discusses the importance of target RNA abundance in shaping the immunity of type VI CRISPR systems. In bacteria, the Cas13 nuclease is known to degrade RNA specifically and non-specifically, leading to cell growth arrest, also known as dormancy. In this chapter, the factors that determine dormancy are investigated by targeting genome- and plasmid-encoded transcripts in E. coli. The observations are extended to a gRNA library targeting the entire coding genome and gRNA design rules are extrapolated. Finally, the role of Cas13 in defense is investigated by testing how the system behaves during viral infection or plasmid transformation. Chapter 2 also looks at the factors that characterize targeting efficiency, but focuses on the Cas12a DNA-targeting system in K. pneumoniae. The ultimate goal is to develop CRISPR antimicrobials as alternatives to antibiotics to eliminate multidrug-resistant and hypervirulent bacteria. Several nucleases are tested for antimicrobial activity, the Cas12a nuclease is selected and the same gRNAs are used against different strains to understand the robustness of the method. Rules for gRNA design are also investigated by looking at secondary structure and testing a gRNA library across several genomic regions in two different strains. This information is used to develop a machine-learning algorithm to predict gRNA activity. In addition, the CRISPR-Cas systems are also packaged in a T7-like phage with engineered tail fibers and delivered to K. pneumoniae. While Chapter 2 uncovers various factors that improve targeting efficiency, Chapter 3 aims to reduce targeting by the Cas9 and Cas12a nucleases to favor homology-directed repair for genome editing in E. coli. Targeting is slowed down so that some copies of the chromosomes remain intact, allowing the bacterium to survive and integrate the desired edit. To reduce targeting, different gRNA formats or nuclease variations are used, gRNA expression is modulated, or gRNAs with attenuated targeting are designed. Attenuated gRNAs are tested to introduce point mutations as well as whole gene deletions and substitutions, and the method is extended to Klebsiella oxytoca and Klebsiella pneumoniae, where it is applied to block transcription of an antibiotic resistance gene in the genome, restoring sensitivity to ampicillin. Overall, this work discusses how changing the CRISPR components alters the outcome of targeting and highlights strategies to achieve efficient or attenuated targeting depending on the desired application. N2 - CRISPR-Cas-Systeme sind ein vielseitiges Werkzeug in der Gentechnik, da sie leicht umprogrammiert werden können, um eine bestimmte chromosomale Region oder ein RNA-Transkript zu schneiden. Die Wahl der Nuklease, das Design der gRNA und die Zielregion beeinflussen alle die Effizienz des Targetings, so dass die richtigen CRISPR-Komponenten je nach gewünschter Anwendung ausgewählt werden sollten. In dieser Arbeit werden die Faktoren untersucht, die das Targeting sowohl bei DNA-targeting als auch bei RNA-targeting CRISPR-Systemen beeinflussen. In Kapitel 1 wird erörtert, wie die Häufigkeit der Ziel-RNA die Immunität von Typ VI CRISPR-Systemen ausprägt. In Bakterien ist von der Cas13-Nuklease bekannt, dass sie RNA spezifisch und unspezifisch abbaut, was zu einem Stillstand des Zellwachstums führt, der auch als Dormanz bezeichnet wird. In diesem Kapitel werden die Faktoren untersucht, die Dormanz determinieren, indem genom- und plasmidkodierte Transkripte in E. coli ins Visier genommen werden. Die Beobachtungen werden auf eine gRNA-Bibliothek ausgeweitet, die auf das gesamte kodierende Genom abzielt, und es werden gRNA-Designregeln extrapoliert. Schließlich wird die Rolle von Cas13 bei der Verteidigung untersucht, indem getestet wird, wie sich das System während einer Virusinfektion oder Plasmidtransformation verhält. Kapitel 2 befasst sich ebenfalls mit den Faktoren, die die Targeteffizienz charakterisieren, konzentriert sich jedoch auf das Cas12a-DNA-Targeting-System in K. pneumoniae. Das Endziel ist die Entwicklung von CRISPR-Antimikroben als Alternative zu Antibiotika, um multiresistente und hypervirulente Bakterien zu eliminieren. Mehrere Nukleasen werden auf ihre antimikrobielle Aktivität getestet, die Cas12a-Nuklease wird ausgewählt und dieselben gRNAs werden gegen verschiedene Stämme eingesetzt, um die Robustheit der Methode zu verstehen. Außerdem werden die Regeln für das Design von gRNAs untersucht, indem die Sekundärstruktur betrachtet und eine gRNA-Bibliothek, die verschiedenen genomische Regionen in zwei verschiedenen Stämmen umfasst, getestet wird. Diese Informationen werden zur Entwicklung eines Algorithmus für maschinelles Lernen verwendet, um die gRNA-Aktivität vorherzusagen. Darüber hinaus werden die CRISPR-Cas-Systeme auch in einen T7-ähnlichen Phagen mit manipulierten Schwanzfasern verpackt und an K. pneumoniae übertragen. Während in Kapitel 2 verschiedene Faktoren aufgedeckt werden, die die Effizienz des Targetings verbessern, zielt Kapitel 3 darauf ab, das Targeting durch die Cas9- und Cas12a-Nukleasen zu reduzieren, um homology directed repair für Genom-Editierung in E. coli zu begünstigen. Das Targeting wird verlangsamt, so dass einige Kopien der Chromosomen intakt bleiben und das Bakterium überleben und die gewünschte Veränderung integrieren kann. Um das Targeting zu reduzieren, werden verschiedene gRNA-Formate oder Nuklease-Variationen verwendet, die gRNA-Expression wird moduliert, oder es werden gRNAs mit abgeschwächten Targeting entwickelt. Abgeschwächte gRNAs werden getestet, um Punktmutationen, Deletionen und Substitutionen ganzer Gene einzuführen, und die Methode wird auf Klebsiella oxytoca und Klebsiella pneumoniae ausgeweitet, wo sie zur Blockierung der Transkription eines Antibiotikaresistenzgens im Genom eingesetzt wird, um die Empfindlichkeit gegenüber Ampicillin wiederherzustellen. Insgesamt wird in dieser Arbeit erörtert, wie die Veränderung der CRISPR-Komponenten die Folgen des Targetings verändert und es werden Strategien hervorgehoben, um effizientes oder abgeschwächtes Targeting, je nach der gewünschten Anwendung, zu erreichen. KW - CRISPR/Cas-Methode KW - CRISPR KW - Genome editing KW - Antimicrobials KW - Cas13 KW - Cas12a Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-371264 ER - TY - THES A1 - Seal, Rishav T1 - Selective inhibition of the transcription factor NFAT in mitigating GvHD with small molecule inhibitors T1 - Selektive Hemmung des Transkriptionsfaktors NFAT bei der Milderung von GvHD durch kleine Molekül-Inhibitoren N2 - Hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is a promising therapy for various malignancies and immune deficiency diseases, but it is often associated with graft versus host disease (GvHD), a life-threatening complication arising from immunological incompatibility between donor T cells and host tissues. Current standard therapies for GvHD involve the use of calcineurin inhibitors (CNIs) such as cyclosporine A (CsA) and tacrolimus (FK506), which effectively suppress T cell activation and proliferation. However, these drugs also impair the graft versus leukemia (GvL) effect, which is the advantageous ability of donor T cells to eliminate malignant cells. Our previous studies demonstrated that the selective deletion of one or two members of the nuclear factor of activated T cells (NFAT) transcription factor family in donor T cells effectively prevented harmful GvHD without compromising GvL activity. This finding highlighted the potential of NFAT as a therapeutic target for GvHD. In this study, we developed and evaluated novel treatment strategies that specifically target NFAT during allogeneic HSCT. We focused on the development of small molecules that mimic the PxIxIT motif of NFAT, thereby competitively inhibiting its binding to CN (CN) without affecting CN phosphatase activity. We identified two promising candidates, C17 and MRD37, and evaluated their efficacy in inhibiting NFAT and suppressing pro-inflammatory cytokine production. Among these molecules, MRD37 demonstrated the highest potency in selectively inhibiting NFAT at a sub-IC50 concentration without compromising the functional capacity of regulatory T cells (Tregs) in vitro. Furthermore, we demonstrated that MRD37 could effectively protect mice from major mismatch GvHD in vivo. This protection was initially predicted to be due to the enhanced presence of Tregs and Tr1-type cells but when pretreated T cells devoid of Tregs were transplanted it unraveled an additional increase of Th2-like cytokine release. Finally, our in vitro studies on human T cells confirmed that MRD37 could specifically inhibit NFAT while preserving the Treg population, suggesting its potential as a novel therapeutic strategy for GvHD. Our findings provide compelling evidence for the development of MRD37 as promising alternative to CNIs in mitigating GvHD. N2 - Die hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT) ist eine vielversprechende Therapie für verschiedene bösartige Erkrankungen und Immunschwächekrankheiten, wird jedoch häufig mit der Graft versus Host Disease (GvHD) in Verbindung gebracht, einer lebensbe drohlichen Komplikation, die durch immunologische Inkompatibilität zwischen Spender T Zellen und Wirtsgewebe entsteht. Die derzeitigen Standardtherapien für die GvHD umfassen den Einsatz von Calcineurin Inhibitoren (CNI) wie Cyclosporin A (CsA) und Tacroli mus (FK506), die die Aktivierung und Vermehrung von T Zellen wirksam unterdrücken. Diese Medikamente beeinträchtigen jedoch auch den Transplantat gegen Leukämie Effekt (GvL), d. h. die vorteilhafte Fähigkeit von Spender T Zellen, bösartige Zellen zu elimin ieren. Unsere früheren Studien haben gezeigt, dass die selektive Deletion von einem oder zwei Mitgliedern der Transkriptionsfaktor Familie Nuclear Factor of Activated T Cells (NFAT) in Spender T Zellen die schädliche GvHD wirksam verhindert, ohne die GvL Aktivitä t zu beeinträchtigen. Dieses Ergebnis unterstreicht das Potenzial von NFAT als therapeutisches Ziel für GvHD. In dieser Studie haben wir neuartige Behandlungsstrategien entwickelt und evaluiert, die spezifisch auf NFAT bei allogener HSCT abzielen. Wir konzentrierten uns auf die Entwicklung kleiner Moleküle, die das PxIxIT Motiv von NFAT nachahmen und dadurch seine Bindung an Calcineurin (CN) kompetitiv hemmen, ohne die Phosphataseaktivität von CN zu beeinträchtigen. Wir haben zwei vielversprechende Kandidaten, C17 und MRD37, identifiziert und ihre Wirksamkeit bei der Hemmung von NFAT und der Unterdrückung der Produ ktion entzündungsfördernder Zytokine untersucht. Von diesen Molekülen zeigte MRD37 die höchste Wirksamkeit bei der selektiven Hemmung von NFAT in einer Konzentration unterhalb von IC50, ohne die Funktionsfähigkeit der regulatorischen T Zellen (Tregs) zu be einträchtigen. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass MRD37 Mäuse in vivo wirksam vor Major Mismatch GvHD schützen kann. Ursprünglich wurde angenommen, dass dieser Schutz auf das verstärkte Vorhandensein von Tregs und Zellen vom Tr1 Typ zurückzuführen ist , doch als vorbehandelte T Zellen ohne Tregs transplantiert wurden, zeigte sich darüberhinaus eine erhöhte Freisetzung von Th2 ähnlichen Zytokinen. Schließlich bestätigten unsere In vitro Studien an menschlichen T Zellen, dass MRD37 spezifisch NFAT hemmen kann, während die Treg 9 Population erhalten bleibt, was auf sein Potenzial als neuartige therapeutische Strategie für Population erhalten bleibt, was auf sein Potenzial als neuartige therapeutische Strategie für GvHD hindeutet.GvHD hindeutet. Unsere Ergebnisse liefern überzeugende Beweise für die Entwicklung von MRD37 als Unsere Ergebnisse liefern überzeugende Beweise für die Entwicklung von MRD37 als vielversprechende Alternative zu CNIs bei der Behandlung von GvHD.vielversprechende Alternative zu CNIs bei der Behandlung von GvHD. KW - GVHD KW - Transplantat-Wirt-Reaktion KW - Stammzelltransplantation KW - Graft versus host disease KW - NFAT inhibitor KW - Stem cell transplantation KW - CsA KW - T cell Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-370537 ER - TY - THES A1 - Beck [geb. Liebetanz], Lina T1 - Die Rolle CD8\(^+\) T-Zellen in der Atherosklerose T1 - The role of CD8\(^+\) T cells in atherosclerosis N2 - Atherosklerose ist eine chronisch inflammatorische Erkrankung der Gefäßwände, bei der sowohl die angeborene als auch die erworbene Immunantwort beteiligt ist. Von Monozyten abstammende Makrophagen spielen eine Schlüsselrolle bei der Entstehung atherosklerotischer Läsionen. Durch die Aufnahme modifizierte Lipide (z.B. oxLDL) werden sie zu Schaumzellen, sezernieren inflammatorische Zytokine und befeuern somit die vaskuläre Entzündungsreaktion. Makrophagen können jedoch auch schützende Funktionen wahrnehmen, bspw. durch die antiinflammatorische Aufnahme apoptotischer Zellen, die Efferozytose. Um den Einfluss CD8+ T-Zellen auf Makrophagen zu bestimmen, wurde ein in vitro Model gewählt, in dem aktivierte CD8+ T-Zellen mit aus Knochenmark isolierten Makrophagen kokultiviert wurden. Zunächst konnte gezeigt werden, dass CD8+ T-Zellen die oxLDL Aufnahme und Schaumzellbildung der Makrophagen fördern, assoziiert mit der gesteigerten Expression des oxLDL Rezeptors CD36 und verminderten Expression des reversen Cholesterintransporters ABCA1. Zusätzlich reduzierten CD8+ T-Zellen die Phagozytose apoptotischer Zellen und die Sekretion des antiinflammatorischen Zytokins IL-10 als Antwort auf die Aufnahme apoptotischer Zellen, was auf eine verminderte Efferozytose hindeutet. Zudem förderten CD8+ T-Zellen die Expression des proinflammatorischen M1-Polarisationsmarker iNOS in Makrophagen und die Sekretion des proatherogenen Chemokins CCL2. Durch die Zugabe neutralisierender Antikörper in die in vitro Kultur konnte gezeigt werden, dass die aufgeführten Prozesse teilweise von den klassischen Effektorzytokinen der CD8+ T-Zellen, INFγ und TNFα, abhängen. Zusammenfassend zeigen unsere Daten, dass CD8+ T-Zellen die Ausbildung eines proatherogenen Phänotyps der Makrophagen, durch die Steigerung der Schaumzellbildung und Förderung der proinflammatorischen Makrophagenpolarisation, sowie die Inhibierung der antiinflammatorischen Efferozytosefunktion, bewirken. N2 - Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vessel wall involving innate and adaptive immune responses. Monocyte-derived macrophages play a key role in atherosclerotic lesion formation, by developing into foam cells upon modified lipid (e.g. oxLDL) ingestion and secreting inflammatory cytokines to further fuel vascular inflammation. However, macrophages also have protective functions such as the anti-inflammatory disposal of apoptotic cells by efferocytosis. To determine the influence of CD8+ T cells on macrophages, we used an in vitro model system where activated CD8+ T cells were co-cultured with bone marrow derived macrophages. We first demonstrated that CD8+ T cells promoted macrophage oxLDL uptake and foam cell formation associated with increased expression of the oxLDL receptor CD36, and decreased expression of the reverse cholesterol transporter ABCA1. CD8+ T cells also reduced macrophage apoptotic cell phagocytosis and anti-inflammatory IL-10 release in response to apoptotic cell engulfment, indicating diminished efferocytosis. Finally, CD8+ T cells promoted expression of the pro-inflammatory M1 polarization marker iNOS in macrophages, as well as secretion of the pro-atherogenic chemokine CCL2. These processes were partially dependent on the CD8+ T cell effector cytokines IFNγ and TNFα, as revealed by the addition of neutralizing antibodies in our in vitro co-culture system. In conclusion, our data shows that CD8+ T cells promote a pro-atherogenic phenotype in macrophages in vitro, increasing their foam cell formation and pro-inflammatory potential while inhibiting efferocytosis. KW - Immunität KW - CD8+ T-Zellen KW - Arteriosklerose KW - Atherosklerose Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-371344 ER - TY - THES A1 - Kappenberger, Jeannette Sarah T1 - Biochemical characterization of the TFIIH translocase XPB from \(Chaetomium\) \(thermophilum\) T1 - Biochemische Charakterisierung der TFIIH Translokase XPB aus \(Chaetomium\) \(thermophilum\) N2 - DNA repair and gene expression are two major cellular processes that are fundamental for the maintenance of biological life. Both processes require the enzymatic activity of the super family 2 helicase XBP, which is an integral subunit of the general transcription factor TFIIH. During transcription initiation, XPB catalyzes the initial melting of promoter DNA enabling RNA polymerase II to engage with the coding DNA strand and start gene transcription. In nucleotide excision repair, XPB acts in concert with the other TFIIH helicase XPD causing strand separation around a lesion site. Mutations within the genes encoding XPB or other TFIIH subunits are associated with different cancer types as well as with the autosomal recessive disorders Xeroderma Pigmentosum and trichothiodystrophy and rarely combined features of Xeroderma Pigmentosum and Cockayne syndrome. In the last few years, great progress has been made towards unraveling the structure of TFIIH and its individual subunits including XPB. These structural insights tremendously improved our understandings with respect to the molecular interactions within this intriguing protein complex. However, the underlying regulation mechanisms that functionally control XPB during transcription and repair remained largely elusive. We thus executed the biochemical characterization of this protein to investigate the functional network that regulates XPB within the scaffold of TFIIH. Due to their enhanced stability compared to the human proteins, we utilized the proteins that originate from the thermophilic fungus Chaetomium thermophilum for this purpose as a model organism for eukaryotic TFIIH. The present work provides novel insights into the enzymatic function and regulation of XPB. We could show that both, DNA and the TFIIH subunit p52 stimulate XPB’s ATPase activity and that the p52-mediated activity is further boosted by p8, another subunit within TFIIH. Surprisingly, DNA can activate XPB’s ATPase activity to a greater extent than its TFIIH interaction partners p52/p8, but when both, i.e. p52/p8 and DNA are present at the same time, p52 dominates the activation and the enzymatic speed is maintained at the level observed through the sole activation of p52/p8. We thus defined p52 as the master regulator of XPB that simultaneously activates and represses XPB’s enzymatic activity. Based on a correlative mutagenesis study of the main interface between p52 and XPB that was set into context with recent structural data, a model for the p52-mediated activation and speed limitation of XPB’s ATPase was proposed. The research on XPB’s ATPase was expanded with the investigation of the inhibition mechanism of XPB’s ATPase via the natural compound Triptolide. Furthermore, we investigated XPB’s DNA translocase function and could observe that XPB can only perform its translocase movement when it is fully incorporated into core TFIIH and this translocase movement is further enhanced by the nucleotide excision repair factor XPA. Fluorescence polarization measurements with nucleotide analogues revealed that XPB displays the highest affinity towards DNA in the ADP + Pi bound state and its binding is weakened when ADP is bound or the nucleotide is dissociated from the enzyme, suggesting a movement on the DNA during the distinct states of the ATPase cycle. Finally, the well-known and highly conserved RED motif was found to be the crucial element in XPB to enable this translocase movement. Combined, the data presented in this work provide novel insights into the intricate regulation network that controls XPB’s enzymatic activity within TFIIH and furthermore show that XPB’s enzymatic activity is tightly controlled by various factors. N2 - DNA Reparatur und Genexpression sind zwei fundamentale zelluläre Prozesse die unabdingbar für die Aufrechterhaltung des biologischen Lebens sind. Beide Prozesse benötigen die Enzymaktivität der Superfamilie 2 Helikase XPB, welche eine Untereinheit des Transkriptionsfaktors TFIIH darstellt. Während der Transkriptions-Initiation katalysiert XPB das initiale Aufschmelzen der Promoter-DNA und befähigt dadurch die RNA-Polymerase II dazu an den codierenden DNA Strang zu binden und die Genexpression zu starten. In der Nukleotid-Exzisions-Reparatur agiert XPB zusammen mit der zweiten TFIIH Helikase, XPD, und bewirkt die Öffnung des DNA Stranges an der Stelle des DNA-Schadens. Mutationen des XPB-Gens oder der Gene der anderen TFIIH Untereinheiten sind mit verschiedenen Krebsarten, sowie den autosomal rezessiv vererbten Krankheiten Xeroderma Pigmentosum und Trichothiodystrophie assoziiert. In seltenen Fällen kann eine kombinierte Form von Xeroderma Pigmentosum und Cockayne Syndrom auftreten. In den letzten Jahren wurde mittels der Cryo-EM die Strukturaufklärung von TFIIH und seinen Untereinheiten einschließlich XPB signifikant vorangebracht. Diese neuen strukturellen Einsichten haben unser Verständnis über den molekularen Aufbau des TFIIH Komplexes entscheidend verbessert. Jedoch sind die Regulationsmechanismen, die XPB auf funktionaler Ebene kontrollieren, noch größtenteils unbekannt. Um das funktionelle Netzwerk, das XPB innerhalb von TFIIH reguliert, zu erforschen, haben wir die biochemische Charakterisierung von XPB verfolgt. Aufgrund ihrer erhöhten Stabilität gegenüber den humanen Proteinen wurden für diese Analyse die Proteine des thermophilen Pilzes Chaetomium thermophilum als Modellorganismus für TFIIH verwendet. Die vorgelegte Arbeit liefert neue Erkenntnisse über die enzymatische Funktion und Regulation von XPB. Wir konnten zeigen, dass sowohl DNA, als auch die TFIIH Untereinheit p52 die ATPase Aktivität von XPB stimulieren und dass die p52-vermittelte Aktivierung durch p8, eine weitere Untereinheit von TFIIH, noch weiter verstärkt wird. In Gegenwart von DNA beobachtet man jedoch die höchste ATPase Aktivität. Wenn beide Aktivatoren, also p52/p8 und DNA, gleichzeitig anwesend waren, dominierte die niedrige p52-vermittelte Aktivierung gegenüber der DNA-vermittelten Aktivierung. Das p52-Protein agiert also als Aktivator und Deaktivator indem es die enzymatische Aktivität des XPB-Proteins gleichzeitig aktiviert und hemmt und kann damit folglich als Hauptregulator von XPB bezeichnet werden. Basierend auf einer korrelativen Mutagenese-Analyse der Interaktionsfläche zwischen p52 und XPB sowie auf den aktuellsten Strukturdaten, wurde ein Modell für die p52-vermittelte Aktivierung und Geschwindigkeitsregulierung von XPBs ATPase generiert. Des Weiteren wurde der Einfluss des Naturproduktes Triptolid auf die Hemmung der enzymatischen Aktivität des XPB Proteins untersucht. Darüber hinaus haben wir die doppelsträngige DNA-Translokase-Aktivität von XPB analysiert und konnten feststellen, dass die Translokation nur erfolgen kann, wenn XPB vollständig in den Kern-TFIIH-Komplex integriert ist. Der Nukleotid-Exzisions-Reparatur- Faktor XPA stimulierte diese Translokase-Aktivität zusätzlich. Fluoreszenz-Polarisations-Messungen mit Nukleotid-Analoga zeigten, dass XPB die höchste Affinität für DNA im ADP + Pi gebundenen Zustand aufweist und dass diese Bindung gelockert wird, wenn ADP gebunden oder das Nukleotid dissoziiert ist. Dies deutet auf einen Bewegungsmechanismus auf der DNA während der verschiedenen Stadien des ATPase-Zyklus hin. Abschließend konnten wir zeigen, dass das hochkonservierte RED-Motiv eine entscheidende Rolle für die Translokase Bewegung des XPB-Proteins einnimmt. Zusammenfassend präsentiert diese Arbeit neue Erkenntnisse, die unser Verständnis des Regulierungsnetzwerkes, das die enzymatische Aktivität von XPB innerhalb von TFIIH steuert, entscheidend vorangebracht haben. KW - DNS-Reparatur KW - Xeroderma pigmentosum KW - Helicasen KW - Transkriptionsfaktor KW - Nucleotide Excision Repair Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-244096 ER - TY - THES A1 - Lechermeier, Carina T1 - Neuroanatomical and functional evaluation of ADHD candidate genes in the model organism zebrafish (\(Danio\) \(rerio\)) T1 - Neuroanatomische und funktionelle Auswertung von ADHS Kandidatengenen im Modellorganismus Zebrafisch (\(Danio\) \(rerio\)) N2 - Attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) is one of the most prevalent developmental disorders, affecting 5.9% children and adolescents and 2.5% adults worldwide. The core characteristics are age-inappropriate levels of hyperactivity, impulsivity and inattention, often accompanied by co-morbidities such as mood and conduct disorders as wells as learning deficits. In the majority of cases, ADHD is caused by an interplay of accumulated genetic and environmental risk factors. Twin studies report a very high heritability of 70–80%, however, common genetic variants in the population only explain a third of the heritability. The rest of the genetic predisposition is composed of rare copy number variations (CNVs) and gene x environment interactions including epigenetic alterations. Through genome wide association (GWAS) and linkage studies a number of likely candidate genes were identified. A handful of them play a role in dopamine or noradrenaline neurotransmitter systems, simultaneously those systems are the main targets of common drug treatment approaches. However, for the majority of candidates the biological function in relation to ADHD is unknown. It is crucial to identify those functions in order to gain a deeper understanding of the pathomechanism and genetic networks potentially responsible for the disorder. This work focuses on the three candidate genes GFOD1, SLC2A3 and LBX1 and their role in the healthy organism as well as in case of ADHD. The neuroanatomy was regarded through expression analysis and various behavioural assays of activity were performed to link alterations on the transcript level to phenotypes associated with the neurodevelopmental disorder. Zebrafish orthologues of the human risk genes were identified and extensive temporal and spacial expression characterisation performed via RNA in situ hybridisation. Through morpholino derived knock-down and mRNA overexpression zebrafish models with subsequent behavioural analysis, both hyper- and hypoactive phenotypes were discovered. Additional expression analysis through double in situ hybridisation revealed a co-localisation during zebrafish neurodevelopment of each gfod1 and slc2a3a together with gad1b, a marker for GABAergic neurons. Interestingly, both risk genes have previously been associated with glucose homeostasis and energy metabolism, which when disrupted could lead to alterations in signal transduction and neuron survival. Likewise, Lbx1 plays a pivotal role in GABAergic versus glutamatergic neuron specification during spinal cord and hindbrain development in mice and chicken. Preliminary results of this work suggest a similar role in zebrafish. Taken together, those findings on the one hand represent a sturdy basis to con- tinue studies of the function of the genes and on the other hand open up the opportunity to investigate novel aspects of ADHD research by exploring the role of the GABAergic neurotransmitter system or the connection between energy metabolism and psychiatric disorders. N2 - Die Aufmerksamkeitsdefizit-/Hyperaktivitätsstörung (ADHS) ist eine der am weitesten verbreiteten Entwicklungsstörungen, davon sind 5,9% Kinder und Jugendliche und 2,5% Erwachsene weltweit betroffen. Die Kernsymptome sind altersunangemessene Hyperaktivität, Impulsivität und Unaufmerksamkeit, oft begleitet von Begleiterkrankungen wie emotionale Dysregulation oder Verhal- tensauffälligkeiten sowie Lerndefiziten. In den meisten Fällen wird ADHS durch ein Zusammenspiel von angehäuften genetischen und umweltbedingten Risikofaktoren verursacht. Durch Zwillingsstudien gelang man zu einer errechneten Erblichkeit von 70–80%, jedoch erklären häufig auftretende genetische Varianten in der Bevölkerung nur ein Drittel der Erblichkeit. Der Rest der genetischen Veranlagung setzt sich aus seltenen Kopienzahlvariationen (CNV) und Interaktionen von Gen x Umwelt, einschließlich epigenetischer Veränderungen, zusammen. Durch genomweite Assoziationsstudien (GWAS) und Kopplungsanalysen wurden eine Reihe von wahrscheinlichen Kandidatengenen identifiziert. Eine Handvoll von ihnen spielen eine Rolle in den Dopamin oder Noradrenalin Neurotransmittersystemen. Diese Systeme sind gleichzeitig die Hauptangriffspunkte der gängigsten Medikamente, die zur Behandlung von ADHS eingesetzt werden. Allerdings ist für die Mehrheit der Kandidatengene die biologische Funktion in Bezug auf ADHS unbekannt. Es ist essentiell diese Funktionen zu identifizieren um ein tieferes Verständnis der Ätiopathogenese und der genetische Netzwerke, die möglicherweise für die Störung verantwortlich sind, zu erlangen. Diese Arbeit konzentriert sich auf die drei Kandidatengene GFOD1, SLC2A3 und LBX1 und ihre Rolle im gesunden Organismus sowie während ADHS. Die Neuroanatomie wurde durch Expressionsanalyse betrachtet und verschiedene aktivitätsbasierte Verhaltensessays wurden durchgeführt, um Veränderungen auf Transkriptebene mit den zugehörigen Phänotypen der neurologischen Entwick- lungsstörung in Verbindung zu bringen. Zebrafischorthologe der menschlichen Kandidatengene wurden identifiziert und umfangreiche zeitliche und räumli- che Expressionsanalysen via RNA in situ Hybridisierung durchgeführt. Durch Morpholino-Knockdown und mRNA-Überexpressions Zebrafischmodelle mit anschließender Verhaltensanalyse wurden sowohl hyper- als auch hypoaktive Phänotypen entdeckt. Eine zusätzliche Expressionsanalyse durch doppelte in situ Hybridisierung ergab eine Kolokalisierung während der Zebrafischneuroentwicklung von jeweils gfod1 und slc2a3a zusammen mit gad1b, einem Marker für GABAerge Neuronen. Interessanterweise wurden beide Risikogene zuvor mit der Glukosehomöostase und dem Energiestoffwechsel in Verbindung gebracht, die, wenn sie gestört werden, zu Veränderungen der Signalübertragung und der Lebensdauer von Neuronen führen können. Desgleichen spielt Lbx1 eine entscheidende Rolle bei der Spezifikation von GABAergen versus glutamatergenen Neuronen während der Entwicklung des Rückenmarks in der Wirbelsäule und im Hinterhirn von Mäusen und Hühnern. Vorläufige Ergebnisse dieser Arbeit deuten auf eine ähnliche Rolle beim Zebrafisch hin. Zusammengenommen stellen diese Erkenntnisse einerseits eine solide Grundlage für weitere Untersuchungen zur Funktion der Gene dar, andererseits eröffnet sich daraus die Möglichkeit neue Aspekte der ADHS-Forschung zu untersuchen, bei denen der Fokus auf der Rolle des GABAergen Neurotransmittersystems oder der Beziehung zwischen Energiestoffwechsel und psychiatrischen Erkrankungen liegt. KW - Aufmerksamkeitsdefizit-Syndrom KW - Zebrabärbling KW - ADHD KW - zebrafish KW - genes KW - behaviour KW - ADHS Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-371084 ER - TY - THES A1 - Zhu, Yan T1 - Small RNA-associated RNA-binding proteins in \(Fusobacterium\) \(nucleatum\) T1 - Kleine RNA-assoziierte RNA-bindende Proteine in \(Fusobacterium\) \(nucleatum\) N2 - Fusobacterium nucleatum is an emerging cancer-associated bacterium belonging to the Fusobacteriota phylum, which is evolutionary distant from all model bacteria. Recent analysis generated global fusobacterial RNA maps, which enabled the discovery of 24 small noncoding RNAs (sRNAs) in F. nucleatum. Notably, the σE-dependent sRNA FoxI and FoxJ act as a posttranscriptional regulator of several cell envelope proteins. The σE-dependent sRNAs in Escherichia coli and Salmonella require the RNA chaperone Hfq for their functions. Intriguingly, F. nucleatum seems to have no homologs of the three common RNA-binding proteins (RBPs) CsrA, Hfq and ProQ. However, it remains unclear if other families of RBPs act in concert with FoxI, FoxJ and other fusobacterial sRNAs. This work has successfully established a 14-mer capture tagged-sRNA affinity purification procedure initially using 6S RNA as a proof-of-concept. Applying this method to 19 different F. nucleatum sRNAs led to a comprehensive mapping of sRNA-binding proteins in this bacterium. This screen identified a total of 75 proteins significantly enriched across all sRNAs and prominent in ribosomal proteins, uncharacterized proteins and enzymes associated with metabolism. This work further focused on the homologs of two KH domain proteins KhpA and KhpB, which were recently recognized as global RBPs in various Gram-positive bacteria such as Streptococcus pneumoniae, Clostridioides difficile, and Enterococcus faecalis. Comparative analyses revealed conserved domain composition and gene synteny of KhpA and KhpB across F. nucleatum, S. pneumoniae, C. difficle and E. faecalis, indicating conserved roles of these proteins in bacteria. Further protein-protein interaction assays and global RNA targets profiling demonstrated that KhpA and KhpB form dimers and act together as broad RBPs, binding to sRNAs, mRNAs and tRNAs in F. nucleatum. Further functional characterizations unveiled that KhpA/B are required for the growth of F. nucleatum under nutrient limitation conditions and impact cell morphology. Additionally, the two RBPs also influence global gene expression in F. nucleatum affecting various bacterial physiological processes, including ethanolamine utilization. In summary, this work established a sRNA-centric approach for screening sRNA-binding proteins in F. nucleatum. Further, the assay could be applied in other non-model organisms and is feasible to screen multiple sRNA baits in parallel for sRNA-interactors. By applying this procedure to nearly all known fusobacterial sRNAs, this work generated an extensive map of sRNA-interacting proteins in F. nucleatum. Molecular and genetic studies identified that KhpA/B act as major RBPs and gene regulators in F. nucleatum, representing important first steps in elucidating key players of post-transcriptional control at the root of the bacterial phylogenetic tree. N2 - Fusobacterium nucleatum ist ein relevantes krebsassoziiertes Bakterium des Phylums Fusobacteriota, welches sich evolutionär von allen anderen Modellbakterien abgrenzt. In einer kürzlich durchgeführten Analyse wurden fusobakterielle RNAs global kartiert, was die Entdeckung von 24 kleinen nichtkodierenden RNAs (sRNAs) in F. nucleatum ermöglichte. Besonders hervorzuheben ist die σE-abhängige sRNAs FoxI und FoxJ, die als posttranskriptioneller Regulator von mehreren Proteine der Zellhülle fungiert. Die σE-abhängigen sRNAs in Escherichia coli und Salmonella benötigen das RNA-Chaperonprotein Hfq für ihre Funktionen. Interessanterweise scheint F. nucleatum aber keine Homologe der drei verbreiteten RNA-Bindeproteine (RBPs) CsrA, Hfq und ProQ zu besitzen. Es bleibt jedoch unklar, ob andere RBP-Familien mit FoxI, FoxJ und sonstigen fusobakteriellen sRNAs interagieren. Diese Arbeit hat erfolgreich ein 14-mer Capture-Markierung basierendes sRNA Affinitätsreinigungsverfahren etabliert, das zunächst unter Verwendung von 6S RNA erprobt wurde. Die Anwendung dieser Methode auf 19 verschiedene sRNAs in F. nucleatum führte zu einer umfassenden Übersicht von sRNA-bindenden Proteinen in diesem Bakterium. Unter allen sRNAs konnten mit Hilfe dieses Screenings insgesamt 75 signifikant angereicherte Proteine identifiziert werden, so vor allem ribosomale Proteine, uncharakterisierte Proteine und Metabolismus-assoziierte Enzyme. Diese Arbeit konzentrierte sich weiterführend auf die Homologe der zwei KH-Domänenproteine KhpA und KhpB, die kürzlich als globale RBPs in verschiedenen Gram-positiven Bakterien, wie Streptococcus pneumoniae, Clostridioides difficile und Enterococcus faecalis beschrieben wurden. Vergleichende Analysen bewiesen eine konservierte Domänenzusammensetzung und Gensyntenie von KhpA und KhpB in F. nucleatum, S. pneumoniae, C. difficile und E. faecalis, was wiederum auf konservierte Funktionen dieser Proteine in Bakterien hinweist. Weitere Protein-Protein-Interaktionsassays und globale Assays zur Identifizierung der Ziel-RNAs zeigten, dass KhpA und KhpB Dimere bilden und gemeinsam als umfangreiche RBPs wirken, die an sRNAs, mRNAs und tRNAs in F. nucleatum binden. Funktionelle Charakterisierungen der Proteine ergaben, dass KhpA/B für das Wachstum von F. nucleatum unter Nährstoffmangel erforderlich sind und die Zellmorphologie beeinflussen. Zusätzlich spielen die beiden RBPs auch eine Rolle in der globalen Genexpression in F. nucleatum und wirken sich auf verschiedene physiologische Prozesse aus, einschließlich der Ethanolamin-Nutzung. Zusammenfassend etablierte diese Arbeit einen sRNA-orientierten Ansatz zur Untersuchung von sRNA-Bindeproteinen in F. nucleatum. Darüber hinaus kann dieser Ansatz potenziell in anderen Nicht-Modellorganismen angewendet werden und eignet sich um mehrere sRNA-Baits parallel auf deren sRNA-Interaktionspartner zu untersuchen. Durch die Anwendung dieses Verfahrens auf nahezu allen bekannten fusobakteriellen sRNAs wurde eine umfangreiche Kartierung der sRNA-Interaktoren in F. nucleatum generiert. Die hier beschriebenen molekularen und genetischen Studien, in welchen KhpA/B als wichtige RBPs und Genregulatoren von F. nucleatum identifiziert wurden, stellen wichtige erste Schritte bei der Aufklärung der Schlüsselakteure der posttranskriptionellen Kontrolle am Ursprung des bakteriellen Stammbaums dar. KW - Fusobacterium nucleatum KW - RNA-binding proteins KW - Small non-coding RNAs KW - Proteine Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-370731 ER - TY - THES A1 - Drakopoulos, Antonios T1 - Opioid receptor oligomerization study through fluorescent selective ligands T1 - Untersuchung der Opioid Rezeptor Oligomerisierung mittels fluoreszierender selektiver Liganden N2 - Opioid receptors (ORs) are among the most intensively studied members of the G protein-coupled receptor (GPCR) family due to their important role in pain management and their involvement in psychological and neurological disorders. However, currently available opioid drugs exhibit both serious drawbacks, such as addiction, and life-threatening side effects, such as respiratory depression. Contrary to the classic monomeric model, indirect evidence suggests that ORs might form dimers, which could be endowed with a distinct pharmacological profile, and, thus, be exploited to develop innovative drugs. However, direct evidence for the spontaneous formation of OR dimers in living cells under physiological condition are missing. The focus of this thesis was the design, synthesis and characterization of new, highly subtype-selective OR fluorescent ligands to be used as tools for state-of-the-art microscopy methods, such as single molecule microscopy (SMM), in heterologous cells and potentially in native tissue, in order to investigate OR organization and mobility on the surface of intact, living cells, at low/physiological expression levels. The μOR is the OR subtype which plays the most critical role in pain modulation, while mediating the effects of the most powerful analgesic drugs. Also, it is the OR subtype which is mostly responsible for the major adverse effects of the currently marketed opioid drugs. We aimed to develop a new μOR-selective fluorescent ligand with a potential irreversible binding mode. Although the approach was in principle successful, i.e. the labelled cells were visible and distinguishable; this initial attempt was not suitable for SMM due to the ligands’ poor selectivity and affinity as well as due to its high background noise. A second generation of the fluorescent ligand was designed; however the synthesis and characterization are part of another doctoral thesis. Lately, δOR has received attention as a promising drug target, due to its distinct pharmacological profile which features low abuse liability and lack of physical dependence. In addition, δOR expression has been associated with cancer regulation in the periphery, thus further highlighting the interest of imaging tools for this receptor. In this thesis, the development and characterization of two new δOR-selective fluorescent probes with excellent optical properties, based on the well-studied ligand naltrindole (NTI) is presented. Their application in SMM studies is currently underway at the group of Prof. Dr. Davide Calebiro at the University of Birmingham. The κOR is a subtype which has also emerged as a drug target due to its low abuse potential. Despite a growing interest in this receptor, κOR-selective fluorescent probes have been particularly scarce in literature. Herein, the design, synthesis and characterization of the first reported set of fluorescent κOR-selective probes with antagonistic properties, based on the established ligand 5’-guanidinonaltrindole (5’-GNTI) is presented. Two of these were employed for SMM experiments to investigate κOR homodimerization, localization and trafficking. Our findings do not support homodimerization of the κOR-bound probe complexes, while showing that the majority of them follow a normal Brownian diffusion on the cell surface. N2 - Opioid-Rezeptoren (OR) gehören aufgrund ihrer wesentlichen Rolle bei der Schmerztherapie und ihrer Beteiligung an physiologischen und neurologischen Störungen zu den am intensivsten untersuchten Mitgliedern der G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) Familie. Jedoch haben aktuell erhältliche Opioid-Arzneimittel schwerwiegende Nachteile, wie Abhängigkeit, und lebensbedrohliche Nebenwirkungen, wie Atemdepression. Im Gegensatz zu dem klassischen Monomer-Modell legen indirekte Hinweise nahe, dass ORs Dimere formen können, welche mit einem spezifischen pharmakologischen Profil ausgestattet sein könnten und daher für die Entwicklung innovativer Arzneimittel verwendet werden könnten. Jedoch gibt es keinen direkten Beweis für die spontane Bildung von OR-Dimeren in lebenden Zellen unter physiologischen Bedingungen. Der Fokus dieser Doktorarbeit war daher das Design, die Synthese und Charakterisierung von neuen hoch subtyp-selektiven fluoreszierenden OR Liganden, welche als Hilfsmittel für hochmoderne Mikroskopie-Anwendungen Anwendung finden sollen, wie Einzelmolekül-Mikroskopie (EMM) in heterologen Zellen und potentiell in nativem Gewebe, um OR-Organisierung und Mobilität auf der Oberfläche von intakten lebenden Zellen bei niedrigen/physiologischen Expressions-Spiegeln zu untersuchen. Der μOR ist der OR Subtyp, der die entscheidenste Rolle bei der Schmerzmodulierung spielt, indem er die Wirkung der stärksten analgetischen Arzneien vermittelt. Des Weiteren ist dieser OR-Subtyp der Subtyp, der größtenteils für die wesentlichen unerwünschten Nebenwirkungen der aktuell vermarkteten Opioid-Arzneimittel verantwortlich ist. Das Ziel dieser Arbeit war daher, einen neuen μOR-selektiven fluoreszierenden Liganden mit einem potentiell irreversiblen Bindungsmodus zu entwickeln. Obwohl dieser Ansatz prinzipiell erfolgreich war, das heißt die markierten Zellen waren sicht- und unterscheidbar, war dieser erste Ansatz aufgrund der geringen Selektivität und Affinität des Liganden und aufgrund seines hohen Hintergrundrauschens nicht für EMM geeignet. Daher wurde eine zweite Generation fluoreszierender Liganden entworfen. Deren Synthese und Charakterisierung ist jedoch Teil einer anderen Doktorarbeit. Kürzlich erhielt der δOR aufgrund seines spezifischen pharmakologischen Profils, welches ein geringes Missbrauchsrisiko und das Fehlen körperlicher Abhängigkeit beinhaltet, vielseitige Beachtung als ein vielversprechendes Arznei-Target. Des Weiteren wurde δOR-Expression mit Krebsregulation in der Peripherie assoziiert, was das Interesse an einem bildgebenden Werkzeug für diesen Rezeptor zusätzlich unterstreicht. In dieser Doktorarbeit wird die Entwicklung und Charakterisierung von zwei neuen, auf dem gut untersuchten Liganden Naltrindol (NTI) basierenden, δOR-selektiven fluoreszierenden Sonden mit sehr guten optischen Eigenschaften gezeigt. Ihre Anwendung in EMM Untersuchungen läuft derzeit bei Kooperationspartnern im Arbeitskreis von Professor Davide Calebiro an der Universität Birmingham an. Der κOR ist der Subtyp, der auch als Arznei-Target aufgrund seines geringen Missbrauchspotentials in Erscheinung getreten ist. Obwohl steigendes Interesse an diesem Rezeptor besteht, sind κOR-selektive fluoreszierende Sonden in der Literatur bisher kaum beschrieben. In dieser Arbeit wird das Design, die Synthese und Charakterisierung des ersten beschriebenen Sets von fluoreszierenden κOR-selektiven Sonden mit antagonistischen Eigenschaften, basierend auf dem Liganden 5’-Guanidinonaltrindol (5’-GNTI) gezeigt. Zwei dieser Liganden wurden für EMM Experimente verwendet, um die κOR Homodimerisierung, Lokalisation und Transportwege zu untersuchen. Unsere Ergebnisse zeigen keine Homodimerisierung des κOR-gebundenen Sondenkomplexes und außerdem, dass die Mehrheit der Rezeptoren einer normalen Brown’schen Diffusion auf der Zelloberfläche folgt. KW - Opioidrezeptor KW - fluorescent ligands KW - opioid receptors KW - TIRF microscopy KW - GPCR oligomerization KW - Oligomerisation KW - Ligand KW - Fluoreszierende Liganden KW - GPCR Oligomerisierung Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-207179 ER - TY - THES A1 - Steinmüller, Sophie Anna Maria T1 - Benzimidazole-Based Photoswitches and Photoswitchable Cannabinoid 2 Receptor Ligands T1 - Benzimidazol-Basierte Photoschalter und Photoschaltbare Liganden für den Cannabinoid 2 Rezeptor N2 - The field of photopharmacology has attracted considerable attention due to applying the spatial and temporal precision of light to pharmacological systems. Photoswitchable biologically active compounds have proven useful in the field of G protein-coupled receptors (GPCRs), which are of tremendous therapeutic relevance. Generally, the pharmacology of GPCRs is complex, perhaps even more complex than originally thought. Suitable tools are required to dissect the different signalling pathways and mechanisms and to unravel how they are connected in a holistic image. This is reflected in the enormous scientific interest in CB2R, as the neuroprotective and immunomodulatory effects attributed to CB2R agonists have not yet translated into effective therapeutics. This work focused on the development of a novel photoswitchable scaffold based on the privileged structure of benzimidazole and its application in photoswitchable CB2R ligands as photopharmacological tools for studying the CB2R. The visible-light photoswitchable ligand 10d enables the investigation of CB2R activation with regard to βarr2 bias, exhibiting a unique pharmacological profile as a “cis-on” affinity switch at receptor level and as a “trans-on” efficacy-switch in βarr2-mediated receptor internalization. The novel photoswitchable scaffold developed in this work further serves as a guide for the development of novel photoswitchable GPCR ligands based on the privileged structure of benzimidazole. To obtain a different tool compound for studying CB2R activation and signalling mechanisms, a previously reported putatively dualsteric CB2R ligand was rendered photoswitchable, by linking the orthosteric agonist to a CB2R-selective PAM via photoswitchable azobenzene. Compound 27-para exhibits a desirable “cis-on” behaviour across all investigated assays with >10-fold higher potency compared to its trans-isomer and can be used as an efficacy-switch employing specific concentrations. N2 - Das Forschungsfeld der Photopharmakologie hat stark an Beachtung gewonnen, da es die Anwendung der räumlichen und zeitlichen Präzision von Licht auf pharmakologische Systeme ermöglicht. Photoschaltbare biologisch aktive Verbindungen haben sich besonders für die Erforschung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) als nützlich erwiesen, welche sich durch ihr enormes therapeutisches Potenzial auszeichnen. Die Pharmakologie der GPCRs ist komplex, vielleicht sogar komplexer als ursprünglich angenommen. Um die verschiedenen Signalwege und Mechanismen zu verstehen und zu entschlüsseln, wie sie in einem ganzheitlichen Bild zusammenhängen, werden geeignete Instrumente benötigt. Dies zeigt sich auch in dem enormen wissenschaftlichen Interesse am CB2R, da die den CB2R-Agonisten zugeschriebenen neuroprotektiven und immunmodulatorischen Effekte noch nicht in wirksame Therapeutika umgesetzt werden konnten. Die vorliegende Arbeit konzentrierte sich auf die Entwicklung eines neuartigen photoschaltbaren Gerüsts, das auf der privilegierten Struktur von Benzimidazol basiert, und dessen Anwendung in photoschaltbaren CB2R-Liganden als photopharmakologische Werkzeuge zur Untersuchung des CB2R. Der mit sichtbarem Licht schaltbare Ligand 10d ermöglicht die Untersuchung der CB2R-Aktivierung in Hinblick auf bevorzugte βarr2-Rekrutierung gegenüber G-Proteinen, mit einem einzigartigen pharmakologischen Profil als „cis-on"-Affinitätsschalter auf Rezeptorebene und als „trans-on"-Wirksamkeitsschalter bei der βarr2-vermittelten Rezeptorinternalisierung. Das in dieser Arbeit entwickelte neuartige photoschaltbare Gerüst dient als Leitfaden für die Entwicklung neuartiger photoschaltbarer GPCR-Liganden basierend auf der privilegierten Struktur von Benzimidazol. Um ein anderes Werkzeug für die Untersuchung der CB2R-vermittelten Signalmechanismen zu erhalten, wurde ein zuvor beschriebener, vermeintlich dualsterischer CB2R-Ligand photoschaltbar gemacht. Hierfür wurde ein orthosterischer Agonist mit einem CB2R-selektiven PAM über ein photoschaltbares Azobenzol verknüpft. Die Verbindung 27-para zeigt in allen untersuchten Assays das bevorzugte „cis on"-Verhalten mit einer >10-fach höheren Potenz im Vergleich zu ihrem trans-Isomer. KW - Cannabinoide KW - Photoswitchable KW - Cannabinoids Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-348943 ER - TY - THES A1 - Hadi, Naji Said Aboud T1 - In vitro Studies on the Genotoxicity of Selected Pyrrolizidine Alkaloids T1 - In-vitro-Studien zur Genotoxizität ausgewählter Pyrrolizidinalkaloide N2 - Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Toxic contaminants in human food or medicinal products, such as substances like pyrrolizidine alkaloids (PAs), have been thought to contribute to cancer incidence. PAs are found in many plant species as secondary metabolites, and they may affect humans through contaminated food sources, herbal medicines, and dietary supplements. Hundreds of compounds belonging to PAs have been identified, differing in their chemical structures, either in their necine base moiety or esterification at their necic acid moiety. PAs undergo hepatic metabolism, and after this process, they can induce hepatotoxicity, genotoxicity, and carcinogenicity. However, the mechanism of inducing genotoxicity and carcinogenicity is still unclear and warrants further investigation. Therefore, the present study aims to investigate the mechanism of genotoxicity induced by selected PAs with different chemical structures in in vitro systems. Primarily, human hepatoma HepG2 cells were utilized, and in co-culture, metabolically active HepG2 cells were combined with non-metabolically active human cervical HeLa H2B-GFP cells. First, the genotoxicity of the PAs europine, lycopsamine, retrorsine, riddelliine, seneciphylline, echimidine, and lasiocarpine was investigated in the cytokinesis-block micronucleus (CBMN) assay. All seven selected PAs caused the formation of micronuclei in a dose-dependent manner, with the maximal increase of micronucleus formation ranging from 1.64 to 2.0 fold. The lowest concentrations at which significant induction of micronuclei was found were 3.2 µM for lasiocarpine and riddelliine, 32 µM for retrorsine and echimidine, and 100 µM for seneciphylline, europine, and lycopsamine. These results confirmed previously published potency rankings in the micronucleus assay. The same PAs, with the exception of seneciphylline, were also investigated in a crosslink-modified comet assay, and reduced tail formation after hydrogen peroxide treatment was found in all diester-type PAs. Meanwhile, an equimolar concentration of the monoesters europine and lycopsamine did not significantly reduce DNA migration. Thus, the crosslinking activity was related to the ester type. Next, the role of metabolic enzymes and membrane transporters in PA-induced genotoxicity was assessed. Ketoconazole (CYP 450-3A4 inhibitor) prevented lasiocarpine-induced micronucleus formation completely, while furafylline (CYP 450-1A2 inhibitor) reduced lasiocarpine-induced micronucleus formation, but did not abolish it completely. This implies that the CYP 450 enzymes play an important role in PA-induced genotoxicity. Carboxylesterase 2 enzyme (CES 2) is commonly known to be involved in the detoxification of xenobiotics. Loperamide (CES 2 inhibitor) yielded an increased formation of lasiocarpine-induced micronuclei, revealing a possible role of CES-mediated detoxification in the genotoxicity of lasiocarpine. Also, intracellular glutathione (GSH) plays an important role in the detoxification of xenobiotics or toxins in the cells. Cells which had been pretreated with L-buthionine sulfoximine (BSO) to reduce GSH content were significantly more sensitive for the induction of micronucleus formation by lasiocarpine revealing the importance of GSH in PA-induced genotoxicity. Quinidine (Q) and nelfinavir (NFR) are OCT1 and OATP1B1 influx transporter inhibitors, respectively, which reduced micronucleus induction by lasiocarpine (only quinidine significantly), but not completely, pointing to a relevance of OCT1 for PA uptake in HepG2 cells. Verapamil (V) and benzbromarone (Bz) are MDR1 and MRP2 efflux transporter inhibitors, respectively, and they caused a slightly increased micronucleus induction by lasiocarpine (significant only for benzbromarone) thus, revealing the role of efflux transporters in PA-induced genotoxicity. The mechanistic approach to PA-induced genotoxicity was further studied based on oxidative stress via the formation of reactive oxygen species (ROS) in HepG2 cells. Overproduction of ROS can cross-link cellular macromolecules such as DNA, leading to genomic damage. An equimolar concentration of 10 µM of lasiocarpine (open-diester PA), riddelliine (cyclic-diester PA), and europine (monoester) significantly induced ROS production, with the highest ROS generation observed after lasiocarpine treatment, followed by riddelliine and then europine. No significant increase in ROS production was found with lycopsamine (10 µM; monoester PA), even at a higher concentration (320 µM). The generation of ROS by these PAs was further analyzed for confirmation by using 5 mM of the thiol radical scavenger antioxidant N-acetyl cysteine (NAC) combined with lasiocarpine, riddelliine, or europine. This analysis yielded a significant decrease in ROS after combining NAC with lasiocarpine, riddelliine, and europine. In addition, lasiocarpine, riddelliine, and europine induced a loss of mitochondrial membrane potential, pointing to mitochondria as the source of ROS generation. In vivo, hepatic sinusoidal epithelial cells (HSECs) are known to be damaged first by PAs after hepatic metabolization, but HSECs themselves do not express the required metabolic enzymes for activation of PAs. To mimic this situation, HepG2 cells were used to metabolically activate PA in a co-culture with HeLa H2B-GFP cells as non-metabolically active neighbours. Due to the green fluorescent GFP label the HeLa cells could be identified easily based in the co-culture. The PAs europine, riddelliine and lasiocarpine induced micronucleus formation in HepG2 cells, and in HeLa H2B-GFP cells co-cultured with HepG2 cells, but not in HeLa H2B-GFP cells cultured alone. Metabolic inhibition of CYP 450 enzymes with ketoconazole abrogated micronucleus formation induced by the same PAs tested in the co-culture. The efflux transporter inhibitors verapamil and benzbromarone reduced the micronucleus formation in the co-culture. Furthermore, mitotic disturbances as an additional genotoxic mechanism of action were observed in HepG2 cells and in HeLa H2B-GFP cells co-cultured with HepG2 cells, but not in HeLa H2B-GFP cells cultured alone. Overall, we were able to show that PAs were activated by HepG2 cells and the metabolites induced genomic damage in co-cultured non-metabolically active green HeLa cells. Finally, in HepG2 cells as well as the co-culture, combinations of PAs lasiocarpine and riddelliine favoured an additive effect rather than synergism. Thus, this study therefore provides support that the assumption of dose-addition can be applied in the characterization of the genotoxicity risk of PAs present in a mixture. N2 - Krebs ist eine der häufigsten Todesursachen weltweit. Toxische Verunreinigungen in Lebensmitteln oder pflanzlichen Arzneimitteln, wie Pyrrolizidinalkaloide (PAs), können zur Krebsinzidenz beitragen. PAs kommen in vielen Pflanzenarten als Sekundärmetabolite vor. Menschen können diese über kontaminierte Nahrungsquellen, pflanzliche Arzneimittel und Nahrungsergänzungsmittel aufnehmen. Eine Vielzahl von Verbindungen, die zu pyrrolizidinalkaloidhaltigen Substanzen (PAs) gehören, wurden identifiziert. Diese unterscheiden sich in ihrer chemischen Struktur entweder durch ihre Necinbaseneinheit oder ihre Veresterung an der Necicsäureeinheit. Nach metabolischer Aktivierung in der Leber können PAs Hepatotoxizität, Genotoxizität und Karzinogenität induzieren. Jedoch ist der Genotoxizitätsmechanismus nicht vollständig aufgeklärt und erfordert weitere Untersuchungen. Das Ziel dieser Studie liegt in der Untersuchung des Mechanismus der Genotoxizität, die in vitro durch bestimmte PAs mit unterschiedlicher chemischer Struktur induziert wird. Hierbei wurden primär humane Hepatom-HepG2-Zellen verwendet sowie in Co-Kultur metabolisch aktive HepG2-Zellen und nicht-metabolisch aktive humane zervikale HeLa H2B-GFP-Zellen. Zunächst wurde die Genotoxizität der PAs Europin, Lycopsamin, Retrorsin, Riddelliin, Seneciphyllin, Echimidin und Lasiocarpin im Zytokinese-Block-Mikronukleus-Assay (CBMN) untersucht. Die sieben (7) ausgewählten PAs führten dosisabhängig zur Bildung von Mikrokernen. Der maximale Anstieg der Mikronukleusbildung lag für alle PAs im Bereich des 1,64- bis 2,0-fachen des Ausgangswertes. Die niedrigsten Konzentrationen, bei denen eine signifikante Induktion von Mikrokernen gefunden wurde, waren 3,2 μM für Lasiocarpin und Riddelliin, 32 μM für Retrorsin und Echimidin sowie 100 μM für Seneciphyllin, Europin und Lycopsamin. Diese Ergebnisse bestätigen zuvor veröffentlichte Potenz-Rankings im Mikronukleus-Assay. Die Genotoxizität der gleichen PAs, mit Ausnahme von Seneciphyllin, wurde zusätzlich mittels eines Crosslink-modifizierten Comet-Assay untersucht. Es wurde eine reduzierte Schweifbildung nach der Behandlung mit Wasserstoffperoxid in allen PAs des Diestertyps gefunden, während eine äquimolare Konzentration der Monoester Europin und Lycopsamin die DNA-Migration nicht signifikant reduzierte. Dies deutet darauf hin, dass die Vernetzungsaktivität von PAs auf der Ester-Einheit beruht. Als nächstes wurde die Rolle von Stoffwechselenzymen und Membrantransportern in der PA-induzierten Genotoxizität untersucht. Ketoconazol (CYP 450-3A4-Inhibitor) verhinderte die Lasiocarpin-induzierte Mikronukleusbildung vollständig, während Furafyllin (CYP 450-1A2-Inhibitor) die Lasiocarpin-induzierte Mikronukleusbildung reduzierte, aber nicht vollständig beseitigte. Dies deutet darauf hin, dass CYP 450-Enzyme eine wichtige Rolle bei der PA-induzierten Genotoxizität spielen. Es ist allgemein bekannt, dass das Enzym Carboxylesterase 2 (CES-2) an der Entgiftung von Xenobiotika beteiligt ist. Loperamid (CES-2-Inhibitor) führte zu einer erhöhten Bildung von Lasiocarpin-induzierten Mikrokernen, was auf eine mögliche Rolle der CES-vermittelten Entgiftung bei der Genotoxizität von Lasiocarpin hindeutet. Auch intrazelluläres Glutathion (GSH) spielt eine wichtige Rolle bei der Entgiftung von Xenobiotika oder Toxinen. Zellen, die mit L-Buthioninsulfoximin (BSO) vorbehandelt worden waren, um den GSH-Gehalt zu reduzieren, waren signifikant empfindlicher für die Induktion der Mikronukleusbildung durch Lasiocarpin, was die Bedeutung von GSH für die PA-induzierte Genotoxizität zeigt. Chinidin (Q) und Nelfinavir (NFR) sind OCT1- bzw. OATP1B1-Influx-Transporter-Inhibitoren, die die Mikronukleus-Induktion durch Lasiocarpin reduzierten (nur Chinidin signifikant), aber nicht vollständig, was auf eine Relevanz von OCT1 für die PA-Aufnahme in HepG2-Zellen hindeutet.Verapamil (V) und Benzbromaron (Bz) sind MDR1- bzw. MRP2-Efflux-Transporter-Inhibitoren und verursachten eine leicht erhöhte Mikronukleus-Induktion durch Lasiocarpin (signifikant nur für Benzbromaron), was die Rolle von Efflux-Transportern bei der PA-induzierten Genotoxizität aufzeigt. Der Mechanismus der PA-induzierten Genotoxizität wurde auf der Grundlage von oxidativem Stress durch die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in HepG2-Zellen weiter untersucht. Eine Überproduktion von ROS kann zelluläre Makromoleküle wie DNA vernetzen, was zu genomischen Schäden führt. Eine äquimolare Konzentration von 10 μM von Lasiocarpin (Open-Diester PA), Riddelliin (Cyclic-Diester PA) und Europin (Monoester) induzierte signifikant die ROS-Produktion, wobei die höchste ROS-Erzeugung nach Lasiocarpin-Behandlung beobachtet wurde, gefolgt von Riddelliin und Europin. Mit Lycopsamin (10 μM; Monoester PA) wurde auch bei höherer Konzentration (320 μM) keine signifikante Steigerung der ROS-Produktion gefunden. Um die Beteiligung von ROS am Mechanismus der Genotoxizität einzelner PAs genauer zu betrachten und die bisherigen Ergebnisse zu bestätigen, wurden weitere Untersuchungen in Anwesenheit des Sauerstoffradikalfängers N-Acetylcysteine (NAC) in Kombination mit Lasiocarpin, Riddelliin oder Europin durchgeführt. Diese Analyse ergab eine signifikante Abnahme der ROS-Produktion nach der Kombination von NAC mit Lasiocarpin, Riddelliin und Europin. Darüber hinaus induzierten Lasiocarpin, Riddelliin und Europin Veränderungen im mitochondrialen Membranpotenzial. Dies deutet darauf hin, dass ROS vermehrt in den Mitochondrien der Zellen gebildet werden. Aus in vivo Daten ist bekannt, dass hepatische sinusoidale Epithelzellen (HSECs) die Zelltypen innerhalb der Leber sind, die nach der metabolischen Aktivierung von PAs zuerst geschädigt werden. Jedoch exprimieren HSECs nicht die erforderlichen Stoffwechselenzyme für die Aktivierung von PAs. Um diese Situation nachzuahmen, wurden HepG2-Zellen verwendet, um PAs in einer Kokultur mit HeLa H2B-GFP-Zellen als nicht-metabolisch aktive Nachbarn metabolisch zu aktivieren. Durch die grün fluoreszierende GFP-Markierung konnten die HeLa-Zellen in der Co-Kultur leicht identifiziert werden. Die PAs Europine, Riddelliin und Lasiocarpin induzierten die Bildung von Mikrokernen in HepG2-Zellen und in HeLa H2B-GFP-Zellen, die mit HepG2-Zellen kokultiviert wurden, jedoch nicht in HeLa H2B-GFP-Zellen, die allein kultiviert wurden. Die metabolische Hemmung von CYP 450-Enzymen mit Ketoconazol hob die Mikronukleusbildung, welche durch die zuvor getesteten PAs induziert wurde, auf. Die Efflux-Transporter-Inhibitoren Verapamil und Benzbromaron reduzierten die Mikronukleusbildung in der Kokultur. Darüber hinaus wurden mitotische Störungen als zusätzlicher genotoxischer Wirkmechanismus in der Co-Kultur aus HepG2-Zellen und in HeLa H2B-GFP-Zellen beobachtet, jedoch nicht in HeLa H2B-GFP-Zellen, die allein kultiviert wurden. Zusammengefasst deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass PAs durch HepG2-Zellen bioaktiviert werden können und aus PAs gebildete Metabolite genomische Schäden in kokultivierten, nicht-metabolisch aktiven HeLa-Zellen induzierten. Abschließend zeigen Kombinationen der PAs Lasiocarpin und Riddelliin sowohl in HepG2-Zellen als auch in der Co-Kultur eher einen additiven Effekt als einen Synergismus. Diese Studie liefert daher Unterstützung für die Annahme, dass die Dosisaddition zur Charakterisierung des genotoxischen Risikos von in einem Gemisch vorhandenen PAs angewendet werden kann. KW - Pyrrolizidine alkaloids KW - HeLa H2B-GFP-Zellen KW - Pyrrolizidinalkaloide KW - Kleinkern KW - Mutagenität KW - Genotoxizität KW - DNA-Vernetzung KW - mitotische Störung KW - Co-culture KW - metabolische Aktivierung KW - Membrantransporter KW - metabolische Enzyme KW - HepG2-Zellen KW - Genotoxicity KW - Micronuclei KW - DNA crosslink KW - Mitotic disturbance KW - Metabolic activation KW - Membrane transporters KW - Metabolic enzymes KW - HepG2 cells KW - HeLa H2B-GFP cells KW - micronucleus Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-370376 ER - TY - THES A1 - Koch, Hanna Ulrike T1 - Funktionelle Untersuchung von IGF1R Mutationen im Multiplen Myelom T1 - Functional Investigation of IGF1R Mutations in Multiple Myeloma N2 - Das Mutationsspektrum einzelner Gene beziehungsweise zusammengefasster Gengruppen innerhalb von Signalwegen bei Patienten mit Multiplem Myelom wurde in den letzten Jahren eingehend untersucht und charakterisiert. Die Herausforderung besteht nun in der Interpretation der erhobenen Daten, insbesondere der Bewertung einzelner durch Sequenzierung identifizierter Biomarker bezüglich deren prognostischer Aussagekraft und konkreter therapeutischer Relevanz. Als übergeordnetes Ziel gilt die Ableitung von klinischen (Therapie-) Ansätzen. Auf dem Weg zu einem individualisierten Therapieansatz ist entscheidend, dass wir unser Wissen über die funktionelle Relevanz einzelner Mutationen wie hier im IGF1R im Hinblick auf deren Einbettung in Signalnetzwerke und auf das Proliferationsverhalten der MM Zellen erweitern. Konkret wurde im Rahmen der vorliegende Doktorarbeit der Einfluss von zwei IGF1R Punktmutationen, nämlich D1146N (Punktmutation des IGF1R der HMCL L-363) und N1129S (Punktmutation des IGF1R eines Patienten der DSMM XI Kohorte) auf die Proliferation und das nachgeschaltete Signalling in IGF1R-Überexpressionsmodellen der MM Zelllinien AMO-1 und U-266 untersucht. Zur stabilen Transfektion der HMCLs mit IGF1RWT und den zwei IGF1R Mutanten wurde ein Protokoll auf Grundlage des Sleeping Beauty (SB) Transposase Systems genutzt. In dieser und anderen assoziierten Arbeit konnte unter zu Hilfenahme von insgesamt vier verschiedenen gentechnisch veränderter HMCLs gezeigt werden, dass funktionelle Mutationen im IGF1R Effekte auf das Downstream Signalling zum Beispiel die Aktivierung von AKT und ERK, jedoch nicht auf die Zellproliferation haben. Im Vergleich der untersuchten HMCLs konnten jedoch keine verallgemeinerbaren Schlüsse gezogen werden, was die Heterogenität der Erkrankung und die Wichtigkeit der Einzelfallbetrachtung unterstreicht. N2 - Multiple myeloma (MM) is a malignant disease of the plasma cell and represents around 15% of all hematological neoplasms. There is a marked heterogeneity in terms of the severity of the disease, the progression and prognosis of the patients. This is also reflected in the underlying genetic heterogeneity. Genetic screenings at diagnosis and during the course of the disease are therefore essential. However, a better understanding of the pathogenesis of MM and the influence of individual genetic aberrations is essential to achieve improvements in personalized, targeted and, above all, risk-adapted therapy. The dysregulation of Receptor Tyrosine Kinases (RTKs), which significantly influences growth and progression, plays a decisive role in many types of cancer. Hence, RTKs also represent interesting target structures for cancer therapy. Specific RTK inhibitors have been a fixed element of oncological therapy in guidelines for many years with good therapeutic results, e. g. for breast, colon, or lung cancer. RTK signal transduction also plays an important role in MM. In a next generation sequencing study on a MM cohort, tumor-associated mutations were detected in RTK genes, which were associated with a significantly poorer prognosis. IGF1R was among the most frequently mutated RTKs in this. It has a decisive influence on e. g. cell proliferation of MM cells and therefore plays an important role in the pathogenesis of MM. Studies also suggest a connection between IGF1R overexpression and disease progression. IGF1R inhibitors were tested in clinical phase 1 studies as a monotherapy without significantly improved clinical response. However, in combination schemes with dexamethasone and bortezomib in patients with relapsed or refractory disease better results have been achieved. They cause manageable side effects and are promising concerning the length and depth of remission, especially in proteasome inhibitor refractory patients. Based on this information a project of the AG Leich aimed to study the influence of IGF1R and specifically IGF1R mutations in different HMCLs by means of functional analysis to identify patient cohorts, who might benefit from a therapy with IGF1R inhibitors. More specifically, the influence of two IGF1R mutations, namely D1146N (point mutation of IGF1R in the HMCL L-363) and N1129S (point mutation of IGF1R in a patient of the DSMM XI cohort), on proliferation and downstream signaling was to be investigated in IGF1R-overexpression models of the HMCLs AMO-1 and U-266 in this doctoral thesis. A protocol based on the Sleeping Beauty (SB) Transposase System was used for stable transfection of the HCMLs with IGF1RWT and the two IGF1R mutants. An increased expression or activation of downstream effectors could be detected in AMO-1. For example, the degree of phosphorylation of MEK and ERK in all three AMO-1 IGF1R overexpression cell lines (WT and two IGF1R mutant cell lines) under normal cell culture conditions seemed to be elevated in comparison to the empty vector control. However, no mutant specific differences could be detected even after stimulation with IGF1. Regarding IGF1R overexpression cell lines that were derived from U-266, expression and activation of IGF1R was especially pronounced for the IGF1R mutant IGF1RN1129S. In contrast, expression and activation of AKT, MEK and ERK in this IGF1R mutant overexpression cell line compared to the WT overexpression cell line, were not distinctively higher. Thus, it seems as if the role of IGF1R in different HMCLs varies, which could be also shown in other MM in vitro studies. The proliferation rate of the individual cell lines was not measured higher due to the overexpression of IGF1R, although important kinases such as AKT, MEK and ERK with their great importance concerning survival, growth and proliferation had been induced. Examinations with the IGF1R inhibitor Linsitinib on different HMCLs in subsequent studies of the AG Leich showed a reduction in metabolism in six out of seven cell lines, whereby the response was highly variable across cell lines and was independent of the IGF1R expression level or the IGF1R mutational status. Clear signs of apoptosis could be only detected in the HMCL MM1.S. An additive effect when combining Linsitinib with the proteasome inhibitor Carfilzomib, mostly used for therapy of refractory MM, was only detected in the IGF1R mutated HMCL L-363. Therefore, this combination might be a promising approach for patients with refractory MM, especially for patients with a IGF1R mutation. However, those compiled preliminary findings should be examined more closely in further in vitro and in vivo studies to determine the therapeutic potential of IGF1R inhibitors applied solely or in combination schemes with other specific inhibitors (e. g. iAKT or iMEK) or licensed standard drugs for patients with IGF1R mutations. KW - Plasmozytom KW - IGF1R Mutationen KW - Multiples Myelom KW - Funktionelle Untersuchung KW - Insulin-like Growth Factor I KW - IGF1 Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-370406 ER - TY - THES A1 - Kawan, Mona T1 - The membrane trafficking protein myoferlin is a novel interactor of p97 T1 - Das Membrantransportprotein Myoferlin ist ein neuer Interaktor von p97 N2 - p97 uses the energy of ATP hydrolysis to unfold and thereby segregate proteins. It is involved in various cellular processes such as proteasomal degradation, DNA damage repair, autophagy, and endo-lysosomal trafficking. The specificity for these processes is controlled by more than 30 regulatory cofactors. Interactions of p97 with cofactors and target proteins are known to be highly dynamic and transient. To identify new interaction partners and to uncover novel cellular functions of p97, the interactome of endogenous p97 was determined by using in cellulo crosslinking followed by immunoprecipitation and mass spectrometry. Myoferlin (MYOF) was identified as a novel interactor of p97 and the interaction was validated in reciprocal immunoprecipitation experiments for different cell lines. The ferlin family member MYOF is a tail-anchored membrane protein containing multiple C2 domains. MYOF is involved in various membrane repair and trafficking processes such as the endocytic recycling of cell surface receptors. The MYOF interactome was determined by mass spectrometry. Among others, the p97 cofactor PLAA, CD71 and Rab14 were identified as common interactors of p97 and MYOF. Immunoprecipitation experiments with PLAA KO cells revealed that the interaction between MYOF and p97 depends on PLAA. Immunofluorescence microscopy showed a co-localization of MYOF with Rab14 and Rab11, which are both involved in endocytic recycling pathways. Furthermore, immunofluoroscence experiments revealed that MYOF and the p97 cofactor PLAA are localized to Rab14- and Rab5-positive endosomal compartments. Using p97 inhibitors and p97 trapping mutants, the presence of p97 at MYOF-positive and Rab14-positive structures could be demonstrated. Consistent with this finding, the endocytic recycling of transferrin was delayed upon inhibition of p97. Taken together, this work identified MYOF as a novel interactor of p97 and suggests a role for p97 in the recycling of endocytic cargo. N2 - p97 nutzt die aus der ATP-Hydrolyse gewonnene Energie, um Proteine zu entfalten und dadurch zu trennen. Es ist an verschiedenen zellulären Prozessen wie dem proteasomalen Abbau, der Reparatur von DNA-Schäden, der Autophagie und dem endo-lysosomalen Transport beteiligt. Die Spezifität für diese Prozesse wird durch mehr als 30 regulatorische Cofaktoren gesteuert. Wechselwirkungen von p97 mit Cofaktoren und Zielproteinen sind bekanntermaßen hochdynamisch und treten oft nur vorübergehend auf. Um neue Interaktionspartner zu identifizieren und neue zelluläre Funktionen von p97 aufzudecken, wurde das Interaktom von endogenem p97 unter Verwendung von in cellulo crosslinking, gefolgt von IP und Massenspektrometrie bestimmt. Dabei wurde MYOF als neuartiger Interaktor von p97 entdeckt und diese Interaktion wurde in reziproken IP-Experimenten und für verschiedene Zelllinien bestätigt. MYOF gehört der Ferlin Familie an und besitzt mehrere C2-Domänen sowie eine Trans-membrandomäne. MYOF ist bekanntermaßen an verschiedenen Membranreparatur- und Transportvorgängen wie beispielsweise dem endozytischen Recycling von Zelloberflächenrezeptoren beteiligt. Das Interaktom von MYOF wurde durch Massenspektrometrie bestimmt. Dabei wurden unter anderem der p97 Cofaktor PLAA, CD71 und Rab14 als gemeinsame Interaktoren von p97 und MYOF identifiziert. Durch IP-Experimente mit PLAA KO Zellen wurde eine Abhängigkeit der Interaktion zwischen MYOF und p97 von PLAA nachgewiesen. Mit IF-Mikroskopie konnte eine Kolokalisation von MYOF mit Rab14 und Rab11, die beide an endosomalen Recycling-Wegen beteiligt sind, beobachtet werden. Des Weiteren zeigten IF-Experimente, dass MYOF und der p97-Cofaktor PLAA an Rab14- und Rab5-positiven endosomalen Kompartimenten lokalisiert sind. Durch die Verwendung von p97-Inhibitoren oder p97 Mutanten, die ATP nicht hydrolysieren können und so verstärkt Substrate anreichern, konnte gezeigt werden, dass p97 an MYOF-positiven und Rab14-positiven Strukturen nachgewiesen werden kann. In Übereinstimmung mit diesem Befund wurde das endozytische Recycling von Transferrin durch die Inhibierung von p97 verzögert. Zusammengefasst zeigt diese Arbeit, dass MYOF ein neuer Interaktor von p97 ist, und deutet auf eine Rolle von p97 beim Recycling von endozytischer Fracht hin. KW - Endosom KW - p97 KW - Myoferlin Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-281218 ER - TY - JOUR A1 - Jarick, Katja J. A1 - Mokhtari, Zeinab A1 - Scheller, Lukas A1 - Hartweg, Julia A1 - Thusek, Sina A1 - Le, Duc-Dung A1 - Ranecky, Maria A1 - Shaikh, Haroon A1 - Qureischi, Musga A1 - Heinze, Katrin G. A1 - Beilhack, Andreas T1 - Photoconversion of Alloreactive T Cells in Murine Peyer’s Patches During Acute Graft-Versus-Host Disease: Tracking the Homing Route of Highly Proliferative Cells In Vivo JF - Frontiers in Immunology N2 - The regulation of immune cell migration throughout the body is essential to warrant immunosurveillance and to maintain immune homeostasis. Marking and tracking of these cells has proven important to study mechanisms of immune cell trafficking and cell interaction in vivo. Photoconversion is a well-suited technique for intravital application because it enables contactless time- and location-specific marking of cells in the tissue without surgically manipulating the microenvironment of the cells in question. However, in dividing cells the converted fluorescent protein may decline quickly. Here, we provide a detailed description of the photoconversion technique and its applicability to tracking highly proliferating T cells from the priming site of T cell activation to peripheral target organs of effector function in a preclinical model. Dendra2+ T cells were photoconverted in the Peyer’s patches during the initiation phase of acute graft-versus-host disease (GvHD) and tracked through the mesenteric lymph nodes and the peripheral blood to the small intestine with flow cytometry and intravital two-photon microscopy. Photoconverted alloreactive T cells preserved the full proliferative capacity, homing, and migration of alloreactive T cells in the intestinal lamina propria. We conclusively proved that photoconversion of highly proliferative alloreactive T cells in the Peyer’s patches is an effective tool to study trafficking of alloreactive T cells under physiologic conditions and to GvHD target tissues. This technique can also be applied to the study of immune cell tracking under inflammatory and non-inflammatory conditions. KW - T cell migration KW - acute graft-versus-host disease KW - mouse models KW - photoconversion KW - Dendra2 KW - Peyer's patch KW - in vivo cell tracking KW - lymphocyte homing Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-323309 VL - 9 ER - TY - THES A1 - Waltmann, Maria T1 - Neurocognitive mechanisms of loss of control in Binge Eating Disorder T1 - Neurokognitive Mechanismen des Kontrollverlusts im Rahmen der Binge- Eating-Störung N2 - Binge Eating Disorder (BED) is a common, early-onset mental health condition characterised by uncontrollable episodes of overeating followed by negative emotions such as guilt and shame. An improved understanding of the neurocognitive mechanisms underlying BED is central to the development of more targeted and effective treatments. This thesis comprises a systematic review and three empirical studies contributing to this endeavour. BED can be thought of as a disorder of cognitive-behavioural control. Indeed, self-report evidence points towards enhanced impulsivity and compulsivity in BED. However, retrospective self-reports do not capture the mechanisms underlying impulsive and compulsive lapses of control in the moment. The systematic review therefore focussed on the experimental literature on impulsivity and compulsivity in BED. The evidence was very mixed, although there was some indication of altered goal-directed control and behavioural flexibility in BED. We highlight poor reliability of experimental paradigms and the failure to properly account for weight status as potential reasons for inconsistencies between studies. Moreover, we propose that impulsivity and/or compulsivity may be selectively enhanced in negative mood states in BED and may therefore not be consistently detected in lab-based studies. In the empirical studies, we explored the role of behavioural flexibility in BED using experimental and neuroimaging methods in concert with computational modelling. In the first empirical study, we assessed the reliability of a common measure of behavioural flexibility, the Probabilistic Reversal Learning Task (PRLT). We demonstrate that the behavioural and computational metrics of the PRLT have sufficient reliability to justify past and future applications if calculated using hierarchical modelling. This substantially improves reliability by reducing error variance. The results support the use of the PRLT in the second and third empirical studies on development and BED. Because a majority of patients develop BED as adolescents or young adults, we speculated that it may emerge as a consequence of disrupted or deficient maturation of behavioural flexibility. Little is known about typical development in this domain. We therefore investigated normative development of reversal learning from adolescence to adulthood in the second empirical study. Typically- developing adolescents exhibited less adaptive and more erratic and explorative behaviour than adults. This behaviour was accounted for by reduced sensitivity to positive feedback in a reinforcement learning model, and partially mediated by reduced activation reflecting uncertainty in the medial prefrontal cortex, a region known to mature substantially during adolescence. In the third empirical study, we investigated reversal learning in BED, paying special attention to potential biases associated with learning from wins vs learning from losses. We speculated that negative urgency could make it more difficult for BED patients to learn and make decisions under pressure to avoid losses. To dissociate between effects of excess weight and BED, we collected data from obese individuals with and without BED as well as normal-weight controls. As hypothesised, there were subtle neurocognitive differences between obese participants with and without BED with regard to learning to obtain rewards and to avoid losses. Obese individuals showed relatively impaired learning to obtain rewards, while BED patients showed relatively impaired learning to avoid losses. This was reflected in differential learning signals in the brain and associated with BED symptom severity. In sum, this thesis shows that the evidence on impulsivity and compulsivity in BED is inconsistent and offers potential explanations for this inconsistency. It highlights the need for reliability in interindividual difference research and indicates ways to improve it. Further, it charts the typical development of reversal learning from adolescence to adulthood and underscores the relevance of exploration in the context of learning and decision-making in adolescence. Finally, it demonstrates qualitative differences between BED and obesity, hinting at a pivotal role of aversive states in loss of control in BED. N2 - Binge-Eating-Störung (BES) ist eine weit verbreitete psychische Erkrankung, die häufig im Jugend- oder jungen Erwachsenenalter beginnt und von Episoden unkontrollierten Überessens gefolgt von negativen Emotionen wie Schuld und Scham gekennzeichnet ist. Ein verbessertes Verständnis der neurokognitiven Mechanismen, die der BES zugrunde liegen, ist zentral für die Entwicklung zielgerichteterer und effektiverer Therapieansätze. Die vorliegende Dissertation umfasst eine systematische Übersichtsarbeit und drei empirische Studien, die zu diesem Vorhaben beitragen. BES kann als eine Störung der kognitiven oder Verhaltenskontrolle betrachtet werden. Selbsteinschätzungsdaten aus Fragebogenstudien deuten klar auf erhöhte Impulsivität und Zwanghaftigkeit hin. Retrospektive Selbsteinschätzungsdaten können jedoch wenig Aufschluss über die Mechanismen geben, die impulsiven und zwanghaften Kontrollverlusten zugrunde liegen. Als Ausgangspunkt dieser Arbeit haben wir daher eine systematische Übersicht der experimentellen Literatur zu Impulsivität und Zwanghaftigkeit bei BES erstellt, die in dieser Hinsicht mehr Einblick verspricht. Die Studienlage war sehr heterogen, aber es gab vorläufige Hinweise auf veränderte zielgerichtete Kontrolle und Verhaltensflexibilität bei BES. Wir zeigen auf, dass unzureichende Reliabilität experimenteller Paradigmen und mangelnde Berücksichtigung wichtiger Störvariablen wie Körpergewicht mögliche Gründe für die großen Inkonsistenzen zwischen Studien sein könnten. Weiterhin vermuten wir, dass Impulsivität und/oder Zwanghaftigkeit im Rahmen der BES selektiv erhöht sein könnten, wenn Patient*innen sich in negativen Gemütszuständen befinden, und daher in Laborstudien nicht konsistent nachgewiesen werden können. Die empirischen Studien untersuchten die Rolle von Verhaltensflexibilität bei BES anhand experimenteller und bildgebender Verfahren sowie mathematischer Modellierung. In der ersten empirischen Studie untersuchten wir die Reliabilität der Probabilistic Reversal Learning Task (PRLT), eines gängigen Maßes der Verhaltensflexibilität. Wir konnten zeigen, dass die Verhaltensmaße und Metriken der mathematischen Modelle der PRLT adäquate Reliabilität aufweisen – allerdings nur, wenn sie anhand von hierarchischen Modellen errechnet werden. Letzteres reduziert die Fehlervarianz und verbessert die Reliabilität damit erheblich. Die Ergebnisse stützen die Verwendung der PRLT in unseren Studien zu Verhaltensflexibilität in der Entwicklung und bei BES. Da BES seine Erstmanifestation oft im Jugend- oder frühen Erwachsenenalter hat, liegt die Vermutung nahe, dass sie sich als Folge einer gestörten oder defizitären Reifung der Verhaltensflexibilität entwickeln könnte. Da jedoch wenig über die typische Entwicklung in diesem Bereich bekannt ist, haben wir in der zweiten empirischen Studie zunächst die normative Entwicklung von Reversal- Learning vom Jugend- zum Erwachsenenalter untersucht. Gesunde Jugendliche zeigten weniger adaptives, erratischeres und explorativeres Verhalten als Erwachsene. Unser mathematisches Modell des Verstärkungslernens erklärt dieses Muster durch eine verringerte Empfindlichkeit gegenüber positivem Feedback. Zudem konnten wir zeigen, dass dieses Verhalten teilweise durch reduzierte Aktivierung des medialen prefrontalen Kortex vermittelt war, einer Region, die im Jugendalter eine substanzielle Reifung durchmacht. In der dritten empirischen Studie haben wir schließlich Reversal-Learning bei BES untersucht und dabei spezielles Augenmerk auf potenzielle Verzerrungen im Lernen zum Erlangen von Belohnungen im Gegensatz zum Lernen zur Verlustvermeidung gelegt. Um Effekte von BES und Adipositas zu unterscheiden, haben wir Daten von adipösen Personen mit und ohne BES, sowie gesunden Normalgewichtigen erhoben. Wie erwartet gab es subtile neurokognitive Unterschiede zwischen adipösen Proband*innen mit und ohne BES im Hinblick auf Lernen zum Erlangen von Belohnungen und Vermeiden von Verlusten. So war Adipositas durch relativ beeinträchtigtes Lernen zum Erlangen von Belohnungen gekennzeichnet, während BES durch relativ beeinträchtigtes Lernen zur Vermeidung von Verlusten gekennzeichnet war. Dieser Unterschied spiegelte sich in der neuronalen Kodierung von Lernsignalen wieder und korrelierte mit der Symptomschwere der BES. Zusammenfassend zeigt diese Dissertation, dass die Literatur zu Impulsivität und Zwanghaftigkeit in BES inkonsistent ist und legt Gründe für diese Inkonsistenzen nahe. Sie hebt die kritische Rolle der Reliabilität von Instrumenten in der Forschung in differentieller und klinischer Psychologie sowie Psychiatrie hervor und zeigt Möglichkeiten auf, diese zu verbessern. Weiterhin zeichnet sie ein Bild der Entwicklung von Reversal Learning vom Jugend- zum Erwachsenenalter und unterstreicht die Relevanz von Explorationsverhalten im Kontext von Lernen und Entscheiden im Jugendalter. Schließlich zeigt sie qualitative Unterschiede zwischen BES und Adipositas auf und legt weitere Forschung in Hinblick auf eine möglicherweise zentrale Rolle negativer Emotionen für Kontrollverlust bei BES nahe. KW - Binge-eating Disorder KW - Kognitive Entwicklung KW - Reliabilität KW - Impulsivität KW - Computational Psychiatry KW - fMRI / Neuroimaging KW - Binge-Eating-Störung Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-364300 ER - TY - THES A1 - Jorgacevic, Ivana T1 - Elucidating the interconnection of GvHD and Western diet-induced atherosclerosis T1 - Aufklärung des Zusammenhangs von GvHD und durch westliche Ernährung induzierter Atherosklerose N2 - Allogeneic hematopoietic cell transplantation (Allo-HCT) is the main and only treatment for many malignant and non-malignant haematological disorders. Even though the treatment has improved through the years and patient life expectancy has increased, graft versus host disease (GvHD) is still considered the main obstacle and one of the main reasons for increased mortality. Furthermore, improved patient’s survival and life expectancy brought into question the late post-HCT complications. The leading cause of late death after allo-HCT is the relapse of primary disease as well as chronic GvHD (cGvHD). However, a clear relationship was also described with pulmonary complications, endocrine dysfunction and infertility, and cataracts in post-HCT patients. In the last years big concern regarding a cumulative cardiovascular incidence in long-term survivors has been raised. Severe cardiovascular disease (CVD) is caused by atherosclerosis which is considered a chronic inflammatory disease of blood vessels. As such, it takes a long time from endothelial damage, as the onset event, and followed plaque formation to a manifestation of severe consequences, such as stroke, coronary heart disease, or peripheral arterial disease. Endothelial damage is well documented in patients post-HCT. In the context of allo-HCT, the endothelial damage is induced by the conditioning regimen with or without total body irradiation (TBI). Furthermore, endothelial cells (ECs) have been documented as a target of GvHD and increased concentration of circulating endothelial cells (CEC) coinciding with an increase in the number of circulating alloreactive T cells. According to 2021 ESC Guidelines on CVD prevention, the main atherosclerotic CVD (ASCVD) risk factors are blood apolipoprotein B (ApoB)-containing lipoproteins (of which low-density lipoprotein (LDL) is the most abundant), high blood pressure, cigarette smoking and diabetes mellitus (DM). GvHD is considered a high-risk factor for the onset of dyslipidaemia, hypertension, and DM. Overall, the risk of premature cardiovascular death is 2.7 fold increased in comparison to the general population, while the cumulative incidence of cardiovascular complications was shown to be up to 47% at ten years after reduced intensity conditioning (RIC), post-HCT. However, up to date, there are no available studies elucidating the interconnection between GvHD and atherosclerosis. The goal of this study was, therefore, to investigate the involvement of GvHD in the progression of atherosclerosis as well as to elucidate whether cytotoxic, CD8+ T cells that were shown to play a significant role in endothelial damage during the course of skin GvHD on one hand, and inducers of formation of unstable plaque on the other, are involved in this interconnection. For that purpose we established a novel minor histocompatibility anti gens (miHAg) allo-HCT Western diet (WD)-induced atherosclerosis mouse model. We were able to show that GvHD has a significant impact on atherosclerosis development in B6.Ldlr−/− recipient mice even in the absence of overt clinical disease activity. It seems that the impact is at least partly induced by CD8+ T cells, that showed significantly increased infiltration of aortic lesions in mice facing subclinical GvHD. As studies have shown in regular atherosclerotic mouse models as well as in humans, these CD8+ T cells exhibited not only increased expression of genes involved in activation, survival and differentiation to cytotoxic phenotype, but also some genes pointing out their exhaustion, that were absent in CD4+ T cell cluster. When anti-CD8β antibody was applied once per week along with WD feeding for eight weeks, the plaque formation was significantly reduced in aorta and aortic root pointing out the importance of these cells in an alloreactivity induced lesion formation. Furthermore, anti-CD8β treatment led to significantly decreased necrotic core formation followed by overall increase in plaque stability. Strikingly, bone marrow plus T cells (BMT) recipients fed WD showed significantly increased serum cholesterol levels in comparison to bone marrow (BM) (a group lacking alloreactive T cells that induce GvHD). This effect was reversed when anti-CD8β treatment was applied, suggesting, at least partly, an impact of alloreactive CD8+ T cells on cholesterol levels. Expression of genes responsible for lipid metabolism pointed out the tendency of the liver to regulate the increased cholesterol levels, however, the mechanism behind this phenotype still remains to be revealed. On the other hand, the impact of obesity, induced by chronic high-fat diet (HFD) feeding, has been shown to be an independent risk factor for gastrointestinal GvHD. Similarly, in major histocompatibility complex (MHC) disparate allo-HCT mouse model, we have noticed that even short-term WD intake leads to a significant decrease in survival of mice post-HCT. When the concentration of transplanted alloreactive T cells was reduced, the survival was improved, pointing out the involvement of these cells in the pathogenesis. Additionally, bioluminescence imaging (BLI) during initiation and effector phase of acute GvHD (aGvHD) revealed increased infiltration of alloreactive T cells in mice fed WD. Studies in an obesity model, we could confirm the involvement of specifically CD4+ T cells in WD induced impact, as the relative number of these cells was significantly increased in small intestine on day six post-HCT in mice fed WD. This increased intestinal infiltration was preceded by increase in the number of alloreactive T cells expressing intestine homing receptor (α4β7 integrin) in peripheral lymph nodes (LNs). Even though the number of T cells was not changed in the spleen of WD fed mice, the subset of CD4+ and CD8+ T cells that were highly secreting TNFα was increased as well as the expression of genes regulating pro-inflammatory cytokines such as IL-6 and interferon (IFN)γ pointing out significant WD-induced inflammation. Moreover, slight tendency towards increased intestinal permeability and load of translocated luminal bacteria, that we observed, could induce severe endotoxemia and dysregulated systemic immune response that could lead to detrimental induction of cell death. Justifying our speculations, we noted increased levels of transaminases and an increase in lactate dehydrogenase (LDH) levels (pointing out significant tissue damages). However, the exact mechanism behind this detrimental WD impact still remains to be elucidated. N2 - Die allogene hämatopoetische Zelltransplantation (engl.: allogeneic hematopoietic cell transplantation; allo-HCT) ist die wichtigste und einzige Behandlung für viele bösartige und nicht bösartige hämatologische Erkrankungen. Auch wenn sich die Behandlung im Laufe der Jahre verbessert hat und die Lebenserwartung der Patienten gestiegen ist, gilt die Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit (engl.: graft versus host disease; GvHD) nach wie vor als Haupthindernis und ist einer der Hauptgründe für die erhöhte Sterblichkeit. Darüber hinaus hat die Verbesserung der Überlebensrate und der Lebenserwartung der Patienten dazu geführt, dass die Spätkomplikationen nach der HCT in Frage gestellt wer den. Die Hauptursache für den späten Tod nach einer allo-HCT ist das Wiederauftreten der Primärerkrankung und die chronische GvHD (cGvHD). Es wurde jedoch auch ein ein deutiger Zusammenhang mit pulmonalen Komplikationen, endokriner Dysfunktion und Unfruchtbarkeit sowie Katarakten bei Patienten nach einer HCT beschrieben. In den letzten Jahren wurde große Besorgnis hinsichtlich einer kumulativen kardio vaskulären Inzidenz bei Langzeitüberlebenden geäußert. Schwere Herz-Kreislauf Erkrankungen werden durch Atherosklerose verursacht, die als chronische Entzündu ngserkrankung der Blutgefäße gilt. Von der Endothelschädigung als Beginn und der anschließenden Plaquebildung bis zur Manifestation schwerwiegender Folgen wie Schla ganfall, koronare Herzkrankheit oder periphere arterielle Verschlusskrankheit vergeht eine lange Zeit. Endothelschäden sind bei Patienten nach HCT gut dokumen tiert. Im Zusammenhang mit der allo-HCT wird die Endothelschädigung durch das Konditionierungsschema mit oder ohne TBI induziert. Darüber hinaus wurde dokumentiert, dass Endothelzellen ein Ziel der GvHD sind und dass eine erhöhte Konzentration zirkulierender Endothelzellen (engl: circulating endothelial cells; CEC) mit einem Anstieg der Anzahl zirkulierender alloreaktiver T-Zellen korreliert. Nach den ESC-Leitlinien 2021 zur Prävention von Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind die wichtigsten Risikofaktoren für atherosklerotische Herz-Kreislauf-Erkrankungen (engl.: atherosclerotic cardiovascular disease; ASCVD) Apolipoprotein B (ApoB)-haltige Lipoproteine im Blut (von denen das Low-Density-Lipoprotein (LDL) am häufigsten vorkommt), Bluthochdruck, Zigarettenrauchen und Diabetes mellitus (DM). GvHD gilt als Hochrisikofaktor für das Auftreten von Dyslipidämie, Bluthochdruck und DM. Insgesamt ist das Risiko eines vorzeitigen kardiovaskulären Todes im Vergleich zur Allgemeinbevölkerung um das 2,7-fache erhöht, während die kumulative Inzidenz kardiovaskulärer Komp likationen zehn Jahre nach einer Konditionierung mit reduzierter Intensität (RIC) nach einer HCT bei bis zu 47% lag. Bislang gibt es jedoch keine Studien, die den Zusam menhang zwischen GvHD und Atherosklerose aufklären. Ziel dieser Studie war es daher, die Beteiligung der GvHD am Fortschreiten der Atherosklerose zu untersuchen und zu klären, ob zytotoxische CD8+ T-Zellen, die einerseits eine bedeutende Rolle bei der En dothelschädigung im Verlauf der Haut-GvHD spielen und andererseits die Bildung insta biler Plaques induzieren, an diesem Zusammenhang beteiligt sind. Zu diesem Zweck haben wir ein neuartiges miHAg-allo-HCT Atherosklerose-Mausmodell etabliert. Wir konnten zeigen, dass GvHD einen signifikanten Einfluss auf die Entwicklung von Atherosklerose in B6.Ldlr−/−-Empfängermäusen hat, selbst wenn keine klinische Krankheitsaktivität vor 3 Chapter 1. Summary liegt. Es scheint, dass dieser Einfluss zumindest teilweise durch CD8+ T-Zellen induziert wird, die bei Mäusen mit subklinischer GvHD eine signifikant erhöhte Infiltration von Aortenläsionen zeigten. Dies wurde auch in Studien in regulären Atherosklerose-Modellen sowie beim Menschen gezeigt. Diese CD8+-T-Zellen wiesen nicht nur eine erhöhte Expression von Genen auf, die an der Aktivierung, dem Überleben und der Differenzierung zum zytotoxischen Phänotyp beteiligt sind, sondern auch einige Gene, die auf zelluläre Erschöpfung hinweisen, die im CD4+-T-Zell-Cluster fehlten. Wurde ein Anti-CD8β-Antikörper einmal wöchentlich zusammen mit der Fütterung von WD acht Wochen lang verabreicht, so wurde die Plaquebildung in der Aorta und der Aortenwurzel signifikant reduziert, was auf die Bedeutung dieser Zellen bei der durch Alloreaktivität induzierten Läsionsbildung hinweist. Darüber hinaus führte eine Anti-CD8β-Behandlung zu einer signifikant verringerten Bildung eines nekrotischen Kerns, gefolgt von einer allge meinen Zunahme der Plaquestabilität. Auffallend ist, dass BMT-Empfänger, die mit WD gefüttert wurden, im Vergleich zu BM (einer Gruppe ohne alloreaktive T-Zellen, die GvHD induzieren) signifikant erhöhte Serumcholesterinwerte aufwiesen. Dieser Effekt kehrte sich um, wenn eine Anti-CD8β-Behandlung durchgeführt wurde, was zumindest teilweise auf einen Einfluss alloreaktiver CD8+-T-Zellen auf den Cholesterinspiegel schließen lässt. Die Expression von Genen, die für den Lipidstoffwechsel verantwortlich sind, wies auf die Tendenz der Leber hin, den erhöhten Cholesterinspiegel zu regulieren; der Mechanismus, der diesem Phänotyp zugrunde liegt, muss jedoch noch aufgeklärt werden. Andererseits hat sich gezeigt, dass die durch chronische Fütterung induzierte Fettleibigkeit ein un abhängiger Risikofaktor für gastrointestinale GvHD ist. In ähnlicher Weise haben wir in dem MHC disparaten allo-HCT-Mausmodell festgestellt, dass selbst eine kurzfristige WD-Zufuhr zu einer signifikanten Verringerung des Überlebens der Mäuse nach der HCT führte. Wenn die Konzentration der transplantierten alloreaktiven T-Zellen reduziert wurde, verbesserte sich die Überlebensrate, was auf die Beteiligung dieser Zellen an der Pathogenese hinweist. Darüber hinaus zeigte die Biolumineszenz-Bildgebung (engl.: bio luminiscence imaging; BLI) während der Initiations- und Effektorphase der aGvHD eine erhöhte Infiltration alloreaktiver T-Zellen bei Mäusen, die mit WD gefüttert wurden. Wie Studien gezeigt in einem Adipositasmodell vorgeschlagen haben, konnten wir die Beteili gung von spezifisch CD4+ T-Zellen an der WD-induzierten Wirkung bestätigen, da die relative Anzahl dieser Zellen im Dünndarm am sechsten Tag nach der HCT bei Mäusen, die mit WD gefüttert wurden, signifikant erhöht war. Dieser erhöhten Darminfiltration ging ein Anstieg der Zahl alloreaktiver T-Zellen voraus, die den Darm-Homing-Rezeptor (α4β7-Integrin) in den peripheren LNs exprimieren. Obwohl sich die Anzahl der T-Zellen in der Milz von mit WD gefütterten Mäusen nicht veränderte, war die Untergruppe der CD4+- und CD8+-T-Zellen, die in hohem Maße TNFα sezernierten, ebenso erhöht wie die Expression von Genen, die pro-inflammatorische Zytokine wie IL-6 und IFNγ reg ulieren, was auf eine signifikante WD-induzierte Entzündung hinweist. Darüber hinaus könnte die von uns beobachtete leichte Tendenz zu einer erhöhten intestinalen Perme abilität und Belastung mit translozierten luminalen Bakterien eine schwere Endotoxämie und eine dysregulierte systemische Immunantwort auslösen, die zu einer schädlichen In duktion des Zelltods führen könnte. Zur Untermauerung unserer Spekulationen stellten wir erhöhte Transaminasenwerte und einen Anstieg der LDH-Werte fest (was auf erhe bliche Gewebeschäden hinweist).Jedoch verbleibt der genaue Mechanismus, der zu den verheerenden Auswirkungen von WD führt, ungeklärt. KW - Periphere Stammzellentransplantation KW - Arteriosklerose KW - GvHD KW - HCT KW - Atherosclerosis Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-325792 ER - TY - THES A1 - Fleißner, Janik Frank Hans-Werner T1 - Die Bedeutung von Oncostatin M für die Lipidhomöostase Apoe- und Ldlr-deletierter Mäuse T1 - The Significance of Oncostatin M for the Lipid Homeostasis in Apoe and Ldlr Knockout Mice N2 - OSM, ein Vertreter der IL-6-Typ-Zytokine, ist nicht nur für entzündliche, sondern auch für metabolische Prozesse von Bedeutung. Vorarbeiten der Arbeitsgruppe GEIER/HERMANNS und Studien von KOMORI et al. legen protektive Eigenschaften des Zytokins nahe, da Mäuse, denen OSMR fehlte, Charakteristika des metabolischen Syndroms aufwiesen. Zur eingehenderen Untersuchung der von OSM vermittelten Wirkung auf den murinen Lipidstoffwechsel wurden zwei für die NAFLD und Atherosklerose anfällige Modelle herangezogen und jeweils in Gegenwart und Abwesenheit des Osmr studiert: Weibliche Apoe-/-(Osmr-/-) und Ldlr-/-(Osmr-/-) Mäuse wurden über einen Zeitraum von zwölf Wochen mit westlicher Diät gefüttert, wöchentlich gewogen, am Ende der Diät geopfert und geerntet. Wildtypische C57Bl/6-Mäuse erfuhren die gleiche Behandlung und dienten als Referenzgruppe. Im Rahmen des Promotionsprojektes wurden Leberfettgehalt, Serumlipidspiegel, Lipoproteinfraktionen und Stuhllipide von Apoe-deletierten Mäusen bestimmt und mit bereits vorhandenen Daten der Ldlr-/-(Osmr-/-) und wildtypischen Mäuse in Beziehung gesetzt. Expressionsanalysen von am Lipidstoffwechsel beteiligten Genen in Darm-, Leber- und Fettgewebe trugen dazu bei, OSM-abhängige Regulationen aufzudecken. Ldlr-/- Tiere nahmen unter der Diät exzessiv zu, hatten hohe Serumspiegel an Leptin, Gluco-se und Lipiden, eine Lebersteatose und, begleitet von einer Induktion des Vldlr, erhöhte inflammatorische Marker im visceralen Fettgewebe. Der zusätzliche Knockout des Osmr ging mit einer geringeren Vldlr-Expression im Fettgewebe und einer hepatozytären Induktion von Cyp7a1 einher und resultierte in einem metabolisch günstigeren Phänotyp. Apoe-defiziente Tiere unterschieden sich hinsichtlich ihrer Gewichtszunahme nicht von Ldlr-/-Osmr-/- und C57Bl/6-Mäusen. Überraschenderweise zeigten sich im Serum von Apoe-/-Osmr-/- jedoch gegenüber Apoe-/- Mäusen erhöhte Konzentrationen des Gesamt- und VLDL-Cholesterins, der Triglyceride und freien Fettsäuren. Obwohl Lebern der Apoe-/-Osmr-/- Mäuse geringere Ldlr- und Lrp1-mRNA-Spiegel als die der Apoe-/- Mäuse aufwiesen, hatten sie einen höheren hepatischen Cholesteringehalt. Bei gesteigerter Cpt1a-Expression fiel der hepatische Tri-glyceridgehalt Apoe-deletierter Mäuse geringer aus als in Ldlr-/-(Osmr-/-) und wildtypischen Tieren. Unter Umgehung einer Fettgewebsentzündung präsentierten Apoe-defiziente Mäuse Hinweise einer inflammatorischen Leberschädigung, die pathogenetisch am ehesten mit einer gestörten Cholesterinhomöostase in Verbindung zu bringen war. Abhängig vom genetischen Hintergrund des Mausmodells hatte OSM schützende oder schädliche Effekte auf den Lipidmetabolismus. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit betonen die entscheidende Bedeutung entzündlicher, von OSM modulierter Prozesse für den Fettstoffwechsel in Leber- und Fettgewebe. Weiterführende Experimente sind nötig, um die den Beobachtungen zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu entschlüsseln. N2 - OSM, a member of the IL-6-type family, plays a pivotal role not only in inflammatory pro-cesses, but also in the regulation of metabolism. In line with studies conducted by KOMORI et al., findings obtained by GEIER/HERMANNS revealed characteristics of the metabolic syndrome in mice lacking the OSMR. Therefore, protective properties of OSM were suggested. In order to further investigate OSM-mediated effects on murine lipid metabolism, two models prone to NAFLD and atherosclerosis were employed and studied in the presence and absence of Osmr: Female Apoe-/-(Osmr-/-) and Ldlr-/-(Osmr-/-) mice were fed a Western-type diet for twelve weeks, weighed weekly, sacrificed and harvested at the end of the diet. Wild-type C57Bl/6 mice underwent the same procedure and were used as a reference group. Thereafter, lipid levels and lipoprotein fractions in the sera of Apoe-deleted mice were deter-mined. In addition, their lipid content in liver tissue and stool was measured. Findings were compared with data from Ldlr-/-(Osmr-/-) and wild-type mice. To reveal OSM-dependent regulations of genes playing a key role in lipid metabolism, gene expression analyses were performed in intestinal, liver, and adipose tissue samples from all mice groups. Ldlr-/- animals excessively gained weight during the diet, had high serum levels of leptin, glucose, and lipids, hepatic steatosis, and, accompanied by induction of Vldlr, increased inflammatory markers in visceral adipose tissue. The additional knockout of Osmr was accom-panied by a lower Vldlr expression in adipose tissue and an induction of liver Cyp7a1, resulting in a metabolically favorable phenotype. In terms of weight gain, Apoe-deficient animals were not different from Ldlr-/-Osmr-/- and C57Bl/6 mice. Surprisingly, however, serum from Apoe-/-Osmr-/- mice showed increased concentrations of total and VLDL cholesterol, triglyc-erides, and free fatty acids when compared to Apoe-/- animals. Despite lower hepatic Ldlr and Lrp1 mRNA levels, Apoe-/-Osmr-/- mice had a higher hepatic cholesterol content than Apoe-/- mice. Fitting to an increased Cpt1a expression, the hepatic triglyceride content of Apoe-deleted mice was lower than in Ldlr-/-(Osmr-/-) and wild-type mice. Most likely due to an impaired hepatic cholesterol homeostasis, liver sections of Apoe-deleted mice displayed features of inflammation, whereas the adipose tissues of these animals remained rather unscathed. Depending on the genetic background of the mouse model, OSM had protective or deleterious effects on lipid metabolism. The results of this project emphasize the significance of OSM regarding both inflammation and metabolism in liver and adipose tissue. Further ex-periments are needed to unravel the molecular mechanisms underlying these observations. KW - Apolipoprotein E KW - LDL-Rezeptor KW - Oncostatin M KW - Oncostatin-M-Rezeptor KW - Lipoprotein KW - Oncostatin M receptor KW - lipoprotein KW - Interleukin-6-Typ-Zytokine KW - Interleukin-6 type cytokines Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-280592 ER - TY - THES A1 - Kreisz, Philipp T1 - Group S1 bZIP transcription factors regulate sink tissue development by controlling carbon and nitrogen resource allocation in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) T1 - Gruppe S1 bZIP Transkriptionsfaktoren regulieren die Entwicklung von sink-Geweben durch Kontrolle der Verteilung von Kohlen- und Stickstoff Ressourcen in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) N2 - The evolutionary success of higher plants is largely attributed to their tremendous developmental plasticity, which allows them to cope with adverse conditions. However, because these adaptations require investments of resources, they must be tightly regulated to avoid unfavourable trade-offs. Most of the resources required are macronutrients based on carbon and nitrogen. Limitations in the availability of these nutrients have major effects on gene expression, metabolism, and overall plant morphology. These changes are largely mediated by the highly conserved master kinase SNF1-RELATED PROTEIN KINASE1 (SnRK1), which represses growth and induces catabolic processes. Downstream of SnRK1, a hub of heterodimerising group C and S1 BASIC LEUCINE ZIPPER (bZIP) transcription factors has been identified. These bZIPs act as regulators of nutrient homeostasis and are highly expressed in strong sink tissues, such as flowers or the meristems that initiate lateral growth of both shoots and roots. However, their potential involvement in controlling developmental responses through their impact on resource allocation and usage has been largely neglected so far. Therefore, the objective of this work was to elucidate the impact of particularly S1 bZIPs on gene expression, metabolism, and plant development. Due to the high homology and suspected partial redundancy of S1 bZIPs, higher order loss-of-function mutants were generated using CRISPR-Cas9. The triple mutant bzip2/11/44 showed a variety of robust morphological changes but maintained an overall growth comparable to wildtype plants. In detail however, seedlings exhibited a strong reduction in primary root length. In addition, floral transition was delayed, and siliques and seeds were smaller, indicating a reduced supply of resources to the shoot and root apices. However, lateral root density and axillary shoot branching were increased, suggesting an increased ratio of lateral to apical growth in the mutant. The full group S1 knockout bzip1/2/11/44/53 showed similar phenotypes, albeit far more pronounced and accompanied by growth retardation. Metabolomic approaches revealed that these architectural changes were accompanied by reduced sugar levels in distal sink tissues such as flowers and roots. Sugar levels were also diminished in leaf apoplasts, indicating that long distance transport of sugars by apoplastic phloem loading was impaired in the mutants. In contrast, an increased sugar supply to the proximal axillary buds and elevated starch levels in the leaves were measured. In addition, free amino acid levels were increased in bzip2/11/44 and bzip1/2/11/44/53, especially for the important transport forms asparagine and glutamine. The increased C and N availability in the proximal tissues could be the cause of the increased axillary branching in the mutants. To identify bZIP target genes that might cause the observed shifts in metabolic status, RNAseq experiments were performed. Strikingly, clade III SUGARS WILL EVENTUALLY BE EXPORTED (SWEET) 8 genes were abundant among the differentially expressed genes. As SWEETs are crucial for sugar export to the apoplast and long-distance transport through the phloem, their reduced expression is likely to be the cause of the observed changes in sugar allocation. Similarly, the reduced expression of GLUTAMINE AMIDOTRANSFERASE 1_2.1 (GAT1_2.1), which exhibits glutaminase activity, could be an explanation for the abundance of glutamine in the mutants. Additional experiments (ATAC-seq, DAP� seq, PTA, q-RT-PCR) supported the direct induction of SWEETs and GAT1_2.1 by S1 bZIPs. To confirm the involvement of these target genes in the observed S1 bZIP mutant phenotypes, loss-of-function mutants were obtained, which showed moderately increased axillary branching. At the same time, the induced overexpression of bZIP11 in axillary meristems had the opposite effect. Collectively, a model is proposed for the function of S1 bZIPs in regulating sink tissue development. For efficient long-distance sugar transport, bZIPs may be required to induce the expression of clade III SWEETs. Thus, reduced SWEET expression in the S1 bZIP mutants would lead to a decrease in apoplastic sugar loading and a reduced supply to distal sinks such as shoot or root apices. The reduction in long� distance transport could lead to sugar accumulation in the leaves, which would then increasingly be transported via symplastic routes towards proximal sinks such as axillary branches and lateral roots or sequestered as starch. The reduced GAT1_2.1 levels lead to an abundance of glutamine, a major nitrogen transport form. The combined effect on C and N allocation results in increased nutrient availability in proximal tissues, promoting the formation of lateral plant organs. Alongside emerging evidence highlighting the power of bZIPs to steer nutrient allocation in other species, a novel but evolutionary conserved role for S1 bZIPs as regulators of developmental plasticity is proposed, while the generation of valuable data sets and novel genetic resources will help to gain a deeper understanding of the molecular mechanisms involved N2 - Der evolutionäre Erfolg höherer Pflanzen wird weitgehend auf ihre enorme Entwicklungsplastizität zurückgeführt, die es ihnen ermöglicht, widrigen Bedingungen zu trotzen. Da diese Anpassungen jedoch einen immensen Ressourceneinsatz erfordern, müssen sie streng reguliert werden, um unvorteilhafte Reaktionen zu vermeiden. Den Großteil der benötigten Ressourcen machen Makronährstoffe auf der Basis von Kohlenstoff und Stickstoff aus. Eine eingeschränkte Verfügbarkeit dieser Nährstoffe hat erhebliche Auswirkungen auf die Genexpression, den Stoffwechsel und die Morphologie der Pflanzen. Diese Veränderungen werden größtenteils durch die hochkonservierte Kinase SNF1-RELATED PROTEIN KINASE1 (SnRK1) vermittelt, die das Wachstum unterdrückt und katabole Prozesse einleitet. Downstream von SnRK1 wurde ein Netzwerk von heterodimerisierenden Transkriptionsfaktoren der Gruppe C und S1 BASIC LEUCINE ZIPPER (bZIP) identifiziert. Diese bZIPs wirken als Regulatoren der Nährstoffhomöostase und werden vor allem in starken sink-Geweben wie Blüten oder den Meristemen, die das Seitenwachstum von Sprossen und Wurzeln ermöglichen, exprimiert. Ihre potenzielle Beteiligung an der Steuerung von Entwicklungsreaktionen durch ihren Einfluss auf die Ressourcenzuteilung und -nutzung wurde bisher jedoch weitgehend vernachlässigt. Ziel dieser Arbeit war es daher, die Auswirkungen insbesondere von S1 bZIPs auf die Genexpression, den Stoffwechsel und die Pflanzenentwicklung zu erforschen. Aufgrund der hohen Homologie und der vermuteten teilweisen Redundanz der S1 bZIPs wurden mithilfe von CRISPR-Cas9 loss-of-function Mutanten höherer Ordnung erzeugt. Die Dreifachmutante bzip2/11/44 zeigte eine Vielzahl robuster morphologischer Veränderungen, behielt aber insgesamt ein mit Wildtyp-Pflanzen vergleichbares Wachstum bei. Im Detail jedoch wiesen die Keimlinge eine starke Verringerung der Primärwurzellänge auf. Darüber hinaus verzögerte sich der Blühzeitpunkt, und die Schoten und Samen waren kleiner, was auf eine geringere Versorgung der Spross- und Wurzelspitzen mit Ressourcen hinweist. Die Dichte der Seitenwurzeln und die axilläre Verzweigung des Sprosses waren jedoch erhöht, was auf ein erhöhtes Verhältnis von lateralem zu apikalem Wachstum in der Mutante hindeutet. Die Knockout-Mutante bzip1/2/11/44/53 zeigte ähnliche Phänotypen, wenn auch weitaus ausgeprägter und begleitet von Wachstumsverzögerungen. Metabolische Untersuchungen ergaben, dass diese Veränderungen in der Architektur mit reduzierten Zuckerspiegeln in distalen sink� Geweben wie Blüten und Wurzeln einhergingen. Die Zuckerspiegel waren auch in den Apoplasten der Blätter vermindert, was darauf hindeutet, dass der Ferntransport von Zucker durch apoplastische Phloembeladung in den Mutanten beeinträchtigt war. Im Gegensatz dazu wurden eine erhöhte Zuckerzufuhr zu den proximalen Achselknospen und erhöhte Stärkekonzentrationen in den Blättern gemessen. Zusätzlich war die Konzentration freier Aminosäuren in bzip2/11/44 und bzip1/2/11/44/53 10 erhöht, insbesondere für die wichtigen Transportformen Asparagin und Glutamin. Die erhöhte C- und N-Verfügbarkeit in den proximalen Geweben könnte die Ursache für die verstärkte axilläre Verzweigung in den Mutanten sein. Um bZIP-Zielgene zu identifizieren, die die beobachteten Verschiebungen im Stoffwechselstatus verursachen könnten, wurden RNAseq-Experimente durchgeführt. Auffallend ist, dass die Gene der Gruppe III SUGARS WILL EVENTUALLY BE EXPORTED (SWEET) unter den unterschiedlich exprimierten Genen sehr häufig vorkamen. Da SWEETs für den Zuckerexport in den Apoplasten und den Langstreckentransport durch das Phloem von entscheidender Bedeutung sind, ist ihre verringerte Expression wahrscheinlich die Ursache für die beobachteten Veränderungen in der Zuckerallokation. Ebenso könnte die verringerte Expression von GLUTAMIN AMIDOTRANSFERASE 1_2.1 (GAT1_2.1), die Glutaminase-Aktivität aufweist, eine Erklärung für die Häufigkeit von Glutamin in den Mutanten sein. Zusätzliche Experimente (ATAC-seq, DAP-seq, PTA, q-RT-PCR) bestätigten die direkte Induktion von SWEETs und GAT1_2.1 durch S1 bZIPs. Um die Beteiligung dieser Zielgene an den in den S1 bZIP� Mutanten beobachteten Phänotypen zu bestätigen, wurden loss-of-function-Mutanten untersucht, die eine mäßig erhöhte axilläre Verzweigung aufwiesen. Gleichzeitig hatte die induzierte Überexpression von bZIP11 in axillären Meristemen den gegenteiligen Effekt. Auf Basis dieser Ergebnisse wird ein Modell für die Funktion von S1 bZIPs bei der Regulierung der Entwicklung von sink-Geweben vorgeschlagen. Für einen effizienten Zuckertransport über große Entfernungen könnten bZIPs erforderlich sein, um die Expression von SWEETs der Gruppe III zu induzieren. Eine verringerte SWEET-Expression in den S1 bZIP-Mutanten würde zu einem Rückgang der apoplastischen Zuckerbeladung und einer verringerten Versorgung von distalen sink-Geweben wie den Spross- oder Wurzelspitzen führen. Die Verringerung des Ferntransports könnte zu einer Anhäufung von Zucker in den Blättern führen, der dann verstärkt über symplastische Wege zu proximalen sink� Geweben wie den axillären Meristem und Seitenwurzeln transportiert oder als Stärke gespeichert wird. Die verringerte GAT1_2.1 Expression führt zu einem Überfluss an Glutamin, einer wichtigen Stickstofftransportform. Die kombinierte Wirkung auf die C- und N-Allokation führt zu einer erhöhten Nährstoffverfügbarkeit in den proximalen Geweben und fördert die Bildung von seitlichen Pflanzenorganen. Neben neuen Erkenntnissen, die die Wirksamkeit von bZIPs bei der Steuerung der Nährstoffallokation in anderen Arten unterstreichen, wird eine neuartige, jedoch evolutionär konservierte Rolle für S1 bZIPs als Regulatoren der Entwicklungsplastizität vorgeschlagen, während die Generierung wertvoller Datensätze und neuer genetischer Ressourcen dazu beitragen wird, ein tieferes Verständnis der beteiligten molekularen Mechanismen zu gewinnen. KW - Molekularbiologie KW - Sugar allocation KW - Nitrogen allocation KW - Basic leucine zipper KW - Developmental plasticity KW - CRISPR Cas9 KW - Ackerschmalwand KW - CRISPR/Cas-Methode KW - Arabidopsis thaliana Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-321925 ER - TY - THES A1 - Kumar, Manish T1 - Structural and compositional effects on tree-water relation T1 - Strukturelle und Zusammenseztungseffekte auf die Beziehung zwischen Baum und Wasser N2 - Forests are essential sources of tangible and intangible benefits, but global climate change associated with recurrent extreme drought episodes severely affects forest productivity due to extensive tree die-back. On that, it appeals to an urgency for large-scale reforestation efforts to mitigate the impact of climate change worldwide; however, there is a lack of understanding of drought-effect on sapling growth and survival mechanisms. It is also challenging to anticipate how long trees can survive and when they succumb to drought. Hence, to ensure success of reforestation programs and sustainable forest productivity, it is essential to identify drought-resistant saplings. For that, profound knowledge of hydraulic characteristics is needed. To achieve this, the study was split into two phases which seek to address (1) how the hydraulic and anatomical traits influence the sapling’s growth rate under drought stress. (2) how plant water potential regulation and physiological traits are linked to species’ water use strategies and their drought tolerance. The dissertation is assembled of two study campaigns carried out on saplings at the Chair of Botany II, University of Würzburg, Germany. The first study involved three ecologically important temperate broadleaved tree species — saplings of 18-month (Acer pseudoplatanus, Betula pendula, and Sorbus aucuparia) — grown from seeds in contrasting conditions (inside a greenhouse and outside), with the latter being subjected to severe natural heat waves. In the second study, two additional temperate species (Fagus sylvatica and Tilia cordata) were added. The drying-out event was conducted using a randomised blocked design by monitoring plant water status in a climate-controlled chamber and a greenhouse. In campaign I, I present the result based on analysed data of 82 plants of temperate deciduous species and address the juvenile growth rate trade-off with xylem safety-efficiency. Our results indicate biomass production varies considerably due to the contrasted growing environment. High hydraulic efficiency is necessary for increased biomass production, while safety-efficiency traits are decoupled and species-specific. Furthermore, productivity was linked considerably to xylem safety without revealing a well-defined pattern among species. Moreover, plasticity in traits differed between stressed and non-stressed plants. For example, safety-related characteristics were more static than efficiency-related traits, which had higher intra-specific variation. Moreover, we recorded anatomical and leaf traits adjustments in response to a stress condition, but consistency among species is lacking. In campaign II, I combined different ways to estimate the degree of isohydry based on water potential regulation and connected the iso-anisohydric spectrum (i.e., hydroscape area, HSA) to hydraulic traits to elucidate actual plant performance during drought. We analysed plant water potential regulation (Ψpd and Ψmd) and stomatal conductance of 28-29 month saplings of five species. I used a linear mixed modelling approach that allowed to control individual variations to describe the water potential regulation and tested different conceptual definitions of isohydricity. The combined methods allowed us to estimate species' relative degree of isohydry. Further, we examined the traits coordination, including hydraulic safety margin, HSM; embolism resistance, P88; turgor loss, Ψtlp; stomata closure, Ps90; capacitance, C; cuticular conductance, gmin, to determine time to hydraulic failure (Thf). Thf is the cumulative effect of time to stomata closure (Tsc) and time after stomatal closure to catastrophic hydraulic failure (Tcrit). Our results show the species' HSA matches their stomatal stringency, which confirms the relationship between stomatal response and leaf water potential decline. Species that close stomata at lower water potential notably had a larger HSA. Isohydric behaviour was mostly associated with leaf hydraulic traits and poorly to xylem safety traits. Species' degree of isohydry was also unrelated to the species' time to death during drying-out experiments. This supports the notion that isohydry behaviours are linked to water use rather than drought survival strategies. Further, consistent with our assumptions, more isohydric species had larger internal water storage and lost their leaf turgor at less negative water potentials. Counter to our expectations, neither embolism resistance nor the associated hydraulic safety margins were related to metrics of isohydry. Instead, our results indicate traits associated with plant drought response to cluster along two largely independent axes of variation (i.e., stomatal stringency and xylem safety). Furthermore, on the temporal progression of plant drought responses, stomatal closure is critical in coordinating various traits to determine species' hydraulic strategies. Desiccation avoidance strategy was linked to Tsc and coordinated traits response of Ps90, Ψtlp, and HSA, whereas desiccation tolerance was related to Tcrit and traits such as lower P88 value, high HSM, and lower gmin. Notably, the shoot capacitance (C) is crucial in Thf and exhibits dichotomous behaviour linked to both Tsc and Tcrit. In conclusion, knowledge of growth rate trade-offs with xylem safety-efficiency combined with traits linked to species’ hydraulic strategies along the isohydry could substantially enhance our ability to identify drought-resistant saplings to ensure the success of reforestation programs and predicting sensitivity to drought for achieving sustainable forest ecosystems. N2 - Wälder sind wichtige Quellen materieller und immaterieller Vorteile, aber der globale Klimawandel, der mit wiederkehrenden extremen Dürreperioden einhergeht, beeinträchtigt die Produktivität der Wälder aufgrund des starken Absterbens von Bäumen erheblich. Deshalb werden dringend groß angelegte Aufforstungsmaßnahmen gefordert, um die Auswirkungen des Klimawandels weltweit abzumildern. Allerdings fehlt es an Kenntnissen über die Auswirkungen von Dürre auf das Wachstum und die Überlebensmechanismen von Jungbäumen. Es ist auch schwierig, vorherzusehen, wie lange Bäume überleben können und wann sie der Trockenheit erliegen. Um den Erfolg von Wiederaufforstungsprogrammen und die nachhaltige Produktivität der Wälder zu gewährleisten, ist es daher unerlässlich, trockenheitsresistente Setzlinge zu identifizieren. Dazu ist eine profunde Kenntnis der hydraulischen Eigenschaften erforderlich. Um dies zu erreichen, wurde die Studie in zwei Phasen aufgeteilt, in denen untersucht werden soll, (1) wie die hydraulischen und anatomischen Merkmale die Wachstumsrate der Setzlinge unter Trockenstress beeinflussen. (2) wie die Regulierung des pflanzlichen Wasserpotenzials und die physiologischen Merkmale mit den Wassernutzungsstrategien der Arten und ihrer Trockentoleranz zusammenhängen. Die Dissertation setzt sich aus zwei Studienkampagnen zusammen, die am Lehrstuhl für Botanik II der Universität Würzburg an Setzlingen durchgeführt wurden. In der ersten Studie wurden drei ökologisch wichtige Laubbaumarten der gemäßigten Zonen - 18-monatige Setzlinge (Acer pseudoplatanus, Betula pendula und Sorbus aucuparia) - aus Samen unter unterschiedlichen Bedingungen (in einem Gewächshaus und im Freien) aufgezogen, wobei letztere schweren natürlichen Hitzewellen ausgesetzt waren. In der zweiten Studie wurden zwei weitere gemäßigte Arten (Fagus sylvatica und Tilia cordata) hinzugefügt. Der Austrocknungsversuch wurde in einem randomisierten Blockdesign durchgeführt, bei dem der Wasserhaushalt der Pflanzen in einer klimatisierten Kammer und einem Gewächshaus überwacht wurde. In Kampagne I präsentiere ich die Ergebnisse, die auf den analysierten Daten von 82 Pflanzen gemäßigter Laubbaumarten basieren, und gehe auf den Kompromiss zwischen der Wachstumsrate von Jungpflanzen und der Sicherheitseffizienz des Xylems ein. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Biomasseproduktion aufgrund der unterschiedlichen Wachstumsbedingungen stark variiert. Eine hohe hydraulische Effizienz ist für eine erhöhte Biomasseproduktion notwendig, während die Sicherheitseffizienz entkoppelt und artspezifisch ist. Darüber hinaus war die Produktivität in erheblichem Maße mit der Xylemsicherheit verknüpft, ohne dass sich ein klar definiertes Muster zwischen den Arten ergab. Darüber hinaus war die Plastizität der Merkmale zwischen gestressten und nicht gestressten Pflanzen unterschiedlich. So waren beispielsweise sicherheitsbezogene Merkmale statischer als effizienzbezogene Merkmale, die eine stärkere intra-spezifische Variation aufwiesen. Darüber hinaus haben wir Anpassungen der anatomischen Merkmale und der Blatteigenschaften als Reaktion auf eine Stressbedingung festgestellt, aber es fehlt die Konsistenz zwischen den Arten. In Kampagne II kombinierte ich verschiedene Methoden zur Schätzung des Isohydrierungsgrads auf der Grundlage der Wasserpotenzialregulierung und verknüpfte das iso-anisohydrische Spektrum (d. h. die Hydroscape-Fläche, HSA) mit hydraulischen Merkmalen, um die tatsächliche Leistung der Pflanzen bei Trockenheit zu ermitteln. Wir analysierten die Regulierung des pflanzlichen Wasserpotenzials (Ψpd und Ψmd) und die stomatäre Leitfähigkeit von 28-29 Monate alten Setzlingen von fünf Arten. Ich verwendete einen linearen gemischten Modellierungsansatz, der die Kontrolle individueller Variationen zur Beschreibung der Wasserpotenzialregulierung ermöglichte, und testete verschiedene konzeptionelle Definitionen der Isohydrizität. Die kombinierten Methoden ermöglichten es uns, den relativen Grad der Isohydrizität der Arten zu schätzen. Darüber hinaus untersuchten wir die Koordination der Merkmale, einschließlich der hydraulischen Sicherheitsspanne (HSM), des Embolieresistenz (P88), des Turgorverlustes (Ψtlp), des Spaltöffnungsgrades (Ps90), der Kapazität (C) und des kutikulären Leitwertes (gmin), um die Zeit bis zum hydraulischen Versagen (Thf) zu bestimmen. Thf ist der kumulative Effekt der Zeit bis zum Schließen der Spaltöffnungen (Tsc) und der Zeit nach dem Schließen der Spaltöffnungen bis zum katastrophalen hydraulischen Versagen (Tcrit). Unsere Ergebnisse zeigen, dass die HSA der Arten mit ihrer Spaltöffnungsintensität übereinstimmt, was die Beziehung zwischen der Spaltöffnungsreaktion und dem Rückgang des Wasserpotenzials der Blätter bestätigt. Arten, die ihre Spaltöffnungen bei einem niedrigeren Wasserpotenzial schließen, hatten einen deutlich größeren HSA. Das isohydrische Verhalten stand hauptsächlich mit den hydraulischen Eigenschaften der Blätter in Verbindung und kaum mit den Sicherheitsmerkmalen des Xylems. Der Grad der Isohydrierung der Arten stand auch in keinem Zusammenhang mit der Zeit bis zum Absterben der Arten während der Austrocknungsversuche. Dies unterstützt die Annahme, dass das Isohydrie-Verhalten eher mit der Wassernutzung als mit Überlebensstrategien bei Trockenheit zusammenhängt. Darüber hinaus wiesen isohydrische Arten, wie von uns angenommen, einen größeren internen Wasserspeicher auf und verloren ihren Blattturgor bei weniger negativen Wasserpotentialen. Entgegen unseren Erwartungen standen weder die Embolieresistenz noch die damit verbundenen hydraulischen Sicherheitsspannen in Zusammenhang mit Isohydratisierungsmerkmalen. Stattdessen deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass sich die Merkmale, die mit der Reaktion der Pflanzen auf Trockenheit in Verbindung stehen, entlang zweier weitgehend unabhängiger Variationsachsen (d. h. stomatäre Strenge und Xylem-Sicherheit) gruppieren. Was den zeitlichen Verlauf der pflanzlichen Reaktionen auf Trockenheit betrifft, so ist der Stomataverschluss für die Koordinierung der verschiedenen Merkmale entscheidend, um die hydraulischen Strategien der Arten zu bestimmen. Die Strategie zur Vermeidung von Austrocknung war mit Tsc und koordinierten Merkmalen wie Ps90, Ψtlp und HSA verbunden, während die Austrocknungstoleranz mit Tcrit und Merkmalen wie einem niedrigeren P88-Wert, einem hohen HSM und einem niedrigeren gmin zusammenhing. Insbesondere die Sprosskapazität (C) ist für Thf entscheidend und zeigt ein dichotomes Verhalten, das sowohl mit Tsc als auch mit Tcrit zusammenhängt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Wissen um die Wechselwirkungen zwischen der Wachstumsrate und der Sicherheitseffizienz des Xylems in Verbindung mit Merkmalen, die mit den hydraulischen Strategien der Arten entlang der Isohydrie zusammenhängen, unsere Fähigkeit, trockenheitsresistente Setzlinge zu identifizieren, erheblich verbessern könnte, um den Erfolg von Aufforstungsprogrammen zu gewährleisten und die Empfindlichkeit gegenüber Trockenheit vorherzusagen, um nachhaltige Waldökosysteme zu erreichen. KW - Wachstumsrate KW - hydraulic efficiency KW - phenotypic plasticity KW - growth rate KW - safety-efficiency trade-off KW - vulnerability curve KW - stomatal closure KW - desiccation time KW - hydroscape KW - cuticular conductance KW - shoot capacitance KW - Baum KW - Wasser KW - hydraulische Effizienz KW - Verwundbarkeitskurve KW - Stomatenverschluss KW - Hydroscape-Gebiet Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-326245 ER -