TY - THES A1 - Cruz, Alexandre Bettencourt da T1 - Molecular and functional characterization of the swiss-cheese and olk mutants in Drosophila melanogaster : two approaches to killing neurons T1 - Molekulare und funktionelle Untersuchung der swiss-cheese und olk Mutanten in Drosophila melanogaster N2 - In this thesis two genes involved in causing neurodegenerative phenotypes in Drosophila are described. olk (omb-like), a futsch allele, is a micotubule associated protein (MAP) which is homologous to MAP1B and sws (swiss cheese) a serine esterase of yet unknown function within the nervous system. The lack of either one of these genes causes progressive neurodegeneration in two different ways. The sws mutant is characterized by general degeneration of the adult nervous system, glial hyperwrapping and neuronal apoptosis. Deletion of NTE (neuropathy target esterase), the SWS homolog in vertebrates, has been shown to cause a similar pattern of progressive neural degeneration in mice. NTE reacts with organophosphates causing axonal degeneration in humans. Inhibition of vertebrate NTE is insufficient to induce paralyzing axonal degeneration, a reaction called "aging reaction" is necessary for the disease to set in. It is hypothesized that a second "non-esterase" function of NTE is responsible for this phenomenon. The biological function of SWS within the nervous system is still unknown. To characterize the function of this protein several transgenic fly lines expressing different mutated forms of SWS were established. The controlled expression of altered SWS protein with the GAL4/UAS system allowed the analysis of isolated parts of the protein that were altered in the respective constructs. The characterization of a possible non-esterase function was of particular interest in these experiments. One previously described aberrant SWS construct lacking the first 80 amino acids (SWSΔ1-80) showed a deleterious, dominant effect when overexpressed and was used as a model for organophosphate (OP) intoxication. This construct retains part of its detrimental effect even without catalytically active serine esterase function. This strongly suggests that there is another characteristic to SWS that is not defined solely by its serine esterase activity. Experiments analyzing the lipid contents of sws mutant, wildtype (wt) and SWS overexpressing flies gave valuable insights into a possible biological function of SWS. Phosphatidylcholine, a major component of cell membranes, accumulates in sws mutants whereas it is depleted in SWS overexpressing flies. This suggests that SWS is involved in phosphatidylcholine regulation. The produced α-SWS antibody made it possible to study the intracellular localization of SWS. Images of double stainings with ER (endoplasmic reticulum) markers show that SWS is in great part localized to the ER. This is consistent with findings of SWS/ NTE localization in yeast and mouse cells. The olk mutant also shows progressive neurodegeneration but it is more localized to the olfactory system and mushroom bodies. Regarding specific cell types it seemed that specifically the projection neurons (PNs) are affected. A behavioral phenotype consisting of poor olfactory memory compared to wt is also observed even before histologically visible neurodegeneration sets in. Considering that the projection neurons connect the antennal lobes to the mushroom bodies, widely regarded as the "learning center", this impairment was expected. Three mutants where identified (olk1-3) by complementation analysis with the previously known futschN94 allele and sequencing of the coding sequence of olk1 revealed a nonsense mutation early in the protein. Consistent with the predicted function of Futsch as a microtubule associated protein (MAP), abnormalities are most likely due to a defective microtubule network and defects in axonal transport. In histological sections a modified cytoskeletal network is observed and western blots confirm a difference in the amount of tubulin present in the olk1 mutant versus the wt. The elaboration of neuronal axons and dendrites is dependent on a functional cytoskeleton. Observation of transport processes in primary neural cultures derived from olk1 mutant flies also showed a reduction of mitochondrial transport. Interaction with the fragile X mental retardation gene (dfmr1) was observed with the olk mutant. A dfmr1/ olk1 double mutant shows an ameliorated phenotype compared to the olk1 single mutant. tau, another MAP gene, was also shown to be able to partially rescue the olk1 mutant. N2 - In dieser Arbeit werden zwei neurodegenerative Mutanten in Drosophila beschrieben. Zum einen drei Allele des futsch Gens namens olk (omb-like). futsch wurde bereits als Mikrotubuli assoziertes Protein (MAP) beschrieben und ist als MAP1B Ortholog identifiziert worden. Zum anderen sws (swiss cheese), eine Serinesterase, deren Funktion im Nervensystem noch unbekannt ist. In sws mutanten Fliegen ist Vakuolisierung im gesamten Gehirn sichtbar, es handelt sich um einen generellen, progressiven, neurodegenerativen Phänotyp. Neuronale Apoptose wie auch multiple Membranhüllen um Gliazellen sind für die sws Mutanten charakteristisch. Die biologische Funktion von SWS innerhalb des Nervensystems ist bisher noch nicht geklärt. Vertebraten, die für das sws Ortholog NTE (neuropathy target esterase) mutant sind, zeigen einen ähnlichen Phänotyp wie sws mutante Fliegen. Auch Vergiftung von NTE mit Organophosphaten kann zu axonaler Degeneration führen. Dabei ist jedoch die Inhibition von NTE nicht ausreichend um die Axondegeneration hervorzurufen. Eine weitere Reaktion, die sogenannte "Aging reaction" is notwendig um die paralysierende Wirkung auszulösen. Eine These besagt, dass NTE eine zweite, von der Esterasefunktion unabhängige Funktion ("Nicht-Esterase" Funktion) besitzt, die diese Wirkung auslöst. Zur Aufklärung der physiologischen Funktion von SWS wurden verschiedene transgene Fliegenlinien etabliert. Diese produzieren verschiedene, mutierte Formen des SWS Proteins, dessen Expression mit Hilfe des GAL4/ UAS Systems genau gesteuert werden kann. Diese Methode erlaubt eine eingehende Untersuchung einzelner Proteindomänen, die in den jeweiligen Konstrukten verändert waren. Insbesondere die Charakterisierung der möglichen "Nicht-Esterase" Funktion war von Interesse. Eine bereits beschriebene mutante Form des SWS Proteins, dem die ersten 80 Aminosäuren fehlen (SWSΔ1-80), zeigte einen dominanten degenerativen Effekt. Die Überexpression von SWSΔ1-80 führt, wie auch die Vergiftung mit bestimmten Organophosphaten, zur Degeneration der betroffenen Zellen und wurde deshalb als Modell für Organophosphatvergiftung herangezogen. Es konnte gezeigt werden, dass dieses Konstrukt auch dann einen schädlichen Effekt zeigt, wenn die katalytische Serinesterasefähigkeit durch Mutation entfernt wurde. Dies deutet die Möglichkeit an, dass SWS eine, von der Esteraseaktivität unhabhängige, Funktion ausüben kann. Ein Vergleich des Lipidgehalts von sws Mutanten mit wt und SWS überexprimierenden Fliegen gab wertvolle Hinweise auf eine mögliche biologische Funktion von SWS. Der Gehalt an Phosphatidylcholin, ein Hauptbestandteil von Zellmembranen, scheint in sws Mutanten erhöht zu sein, während es in SWS überexprimierenden Fliegen in geringeren Mengen zu finden ist. Dies weist darauf hin, dass SWS an der Phosphatidylcholinregulation beteiligt sein könnte. Der in dieser Arbeit hergestellte α-SWS Antikörper ermöglichte eine genauere intrazelluläre Lokalisation des SWS Proteins. Doppelfärbungen mit einem ER (Endoplasmatisches Retikulum) Marker zeigen, dass ein grosser Anteil von SWS im ER zu finden ist. Dies stimmt mit den kürzlich veröffentlichten Ergebnisse zur Lokalisation von SWS/ NTE in Hefe- und Mauszellen überein. Die olk Mutante zeigt ebenfalls progressive Neurodegeneration, die Effekte sind jedoch lokaler, insbesondere das olfaktorische System und die Pilzkörper sind betroffen. Die Projektionsneurone (PN) degenerieren in dieser Mutante innerhalb von etwa 20 Tagen. Noch vor der histologisch sichtbaren Degeneration ist bereits ein Verhaltensphänotyp erkennbar, der sich in schlechter, olfaktorischen Lernleistung äussert. Projektionsneurone verbinden die Antennalloben und die Pilzkörper, die als "Lernzentren" gelten, daher entspricht ein Lerndefekt den Erwartungen. Die drei olk Mutanten (olk1-3) wurden durch Komplementationstests mit dem publizierten futschN94 Allel als weitere futsch Allele identifiziert. In olk1 zeigte die Sequenzierung der kodierenden Sequenz eine Mutation, die frühzeitig zu einem Stopcodon im Protein führt. Die Degenerationserscheinungen in der Mutanten sind vermutlich auf Defekte im Mikrotubulinetzwek und axonalen Transport zurück zu führen. In histologischen Gehirnschnitten sind Veränderungen im Zytoskelett zu beobachten und Western Blots deuten auf einen erhöhten Tubulingehalt in der olk1 Mutante hin. Für die Entwicklung von Axonen und Dendriten ist ein intaktes Zytoskelett unentbehrlich. Transportprozesse sind in olk1 Mutanten ebenso betroffen, insbesondere ist der mitochondriale Transport reduziert. Das fragile X mental retardation Gen (dfmr1) interagiert mit der olk Mutante, so dass eine dfmr1/ olk1 Doppelmutante einen weniger starken Phänotyp zeigt als die olk1 Mutante. tau, ein weiteres MAP Gen, besitzt ebenso die Fähigkeit den olk1 Phänotyp partiell zu suprimieren. KW - Taufliege KW - Nervendegeneration KW - Molekulargenetik KW - Drosophila KW - Neurodegeneration KW - futsch KW - MAP KW - swiss-cheese KW - Drosophila KW - neurodegeneration KW - futsch KW - MAP KW - swiss-cheese Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17734 ER - TY - THES A1 - Schober, Tilmann T1 - Erhöhte Calcium-Empfindlichkeit der kardialen Myofilamente - ein Mechanismus bei der Entstehung von Herzrhythmusstörungen T1 - Increased myofilament calcium sensitivity - a mechanism in the development of cardiac arrhythmias N2 - Die vorliegende Studie zeigt erstmals, dass eine erhöhte Ca2+-Empfindlichkeit der kardialen Myofilamente im Tiermodell einen selbstständigen Risikofaktor bei der Entstehung von Herzrhythmusstörungen darstellt. Dies konnte sowohl für chronische Erhöhung der Ca2+-Empfindlichkeit im Rahmen einer Familiären Hypertrophen Kardiomyopathie (FHK) als auch für eine akute Erhöhung mit Hilfe eines Ca2+-Sensitizers gezeigt werden. Die Ergebnisse der Arbeit bieten so eine mögliche Erklärung für plötzlichen Herztod bei bestimmten Patienten mit FHK. Sie schränken weiterhin den Einsatz von Ca2+-Sensitizern ein. Schließlich beleuchten sie einen bisher kaum untersuchten Aspekt in der Arrhythmogenese von Herzinsuffizienz und nach einem Myokard-Infarkt. Auf zellulärer Ebene findet sich ein veränderter Ca2+-Zyklus mit erniedrigten und verlangsamten Transienten. Diese Veränderungen sind wahrscheinlich eine direkte Konsequenz der erhöhten Bindungsaffinität für Ca2+. Die Myofilamente sind „klebriger“ für Ca2+, während der Systole wird mehr Ca2+ gebunden, während der Diastole hingegen dissoziiert es langsamer. Bei adrenerger Stimulation und schnellen Herzfrequenzen mit entsprechender Verkürzung der Diastole kommt es zu erhöhtem diastolischem [Ca2+]i und zu erhöhten Ca2+-Inhalt des Sarkoplasmatischen Retikulums. Der so veränderte Ca2+-Zyklus führt wahrscheinlich mit Hilfe des Na+/Ca2+-Austauschers zu Veränderungen der Repolarisation des Aktionspotentials. Bei schnellen Herzfrequenzen treten Aktionspotential-Verlängerung, Ca2+-abhängige Nachdepolarisationen und getriggerte Schläge auf. Auf Organ-Ebene findet sich eine verkürzte Refraktärzeit. Damit sind sowohl ein Trigger als auch ein arrhythmogenes Substrat für die beobachteten ventrikulären Arrhythmien gegeben. N2 - The present study shows for the first time that increased Ca2+-sensitity of the cardiac myofilaments is an indepent mechanism in the development of cardiac arrhythmias. This could be shown both for chronically increased Ca2+-sensitity in Familial Hypertrophic Cardiomyopathy (FHC) and for acute drug-induced Ca2+-sensitization. The results provide an explanation for sudden cardiac death in certain patients with FHC. Moreover they limit the use of Ca2+-sensitizers. Furthermore they elucidate new aspects in the arrhythmogenesis of important aquired hearts diseases such as heart failure and myocardial infarction. On the cellular level the Ca2+-cycle is altered, Ca2+-transients show a smaller amplitude and slower rate of decay. These changes are probably a direct consequence of the increased Ca2+-puffering capacity. The myofilaments are “sticky” for Ca2+, durig systole more Ca2+ is bound while the dissociation during diastole is decelerated. With adrenergic stimulation and faster frequencies there is an increased diastolic [Ca2+]i and subsequently an Ca2+-overloading of the Sarcoplasmatic Reticulum. These changes in the Ca2+-cycle cause remodelling of the action potential repolarisation via the Na+-Ca2+-exchanger. At fast frequencies one finds action potential prolongation, Ca2+-dependent afterdepolarisations and triggered activity. On the organ level Ca+-sensitized hearts show a shortened refractory period. Thus there is both trigger and substrate for the observed ventricular arrhytrhmia. KW - Herzrhythmusstörung KW - Calcium KW - Troponin KW - Aktionspotenzial KW - EAD KW - Alternans KW - Hypertrophische Herzmuskelkrankheit KW - Natrium-Calcium-Austauscher KW - Calcium-bindende Proteine KW - MAP KW - Refraktärzeit KW - Elektrokardiogramm KW - Frank-Starling-Gesetz KW - Sekunde KW - Myofilament KW - FHK KW - plötzlicher Herztod KW - Sudden Cardiac Death Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-33298 ER -