TY - THES A1 - Hühne, Tom T1 - Untersuchungen zur selektiven Induktion von Zelltod in CD4+ Foxp3- konventionellen T-Zellen der Maus durch Hemmung der sauren Sphingomyelinase \(in\) \(vitro\) T1 - Analysis of the selective induction of cell death in murine CD4+ Foxp3- conventional T cells by inhibition of acid sphingomyelinase \(in\) \(vitro\) N2 - Die saure Sphingomyelinase (Asm) ist ein lysosomales Enzym, das sezerniert werden kann und die Reaktion von Sphingomyelin zu Ceramid und Phosphocholin katalysiert. Seine Funktion ist bedeutsam für die Aufrechterhaltung des zellulären Lipidstoffwechsels und für die Integrität der Plasmamembran. Enzymdefekte sind an der Pathogenese von Infektionen und zahlreichen Stoffwechselerkrankungen wie z.B. der Niemann-Pick-Krankheit, Diabetes mellitus Typ II und auch an der Entstehung psychischer Erkrankungen beteiligt. Immunologisch bedeutsam ist, dass durch Hemmung der Asm mit trizyklischen Antidepressiva (TZA) oder Serotonin-Wiederaufnahme-Inhibitoren (SSRI) die Frequenz CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatorischer T-Zellen (Treg) der Maus erhöht wird. Grund für die Frequenzerhöhung ist jedoch nicht die Erhöhung der absoluten Treg-Zellzahl, sondern das selektive Sterben CD4+ CD25- Foxp3- konventioneller T-Zellen (Tconv). Erstaunlicherweise führt die Behandlung mit dem kompetitiven Asm-Inhibitor ARC39, einem Bisphosphonat, nicht zu diesem Effekt. Es konnte gezeigt werden, dass IL-2 die regulatorischen T-Zellen vor dem durch Asm-Hemmung induziertem Zelltod schützt. In Abwesenheit von IL-2 gehen auch Treg-Zellen durch die Asm-Inhibition zugrunde. Treg-Zellen exprimieren konstitutiv CD25, den IL-2-Rezeptor, dessen α-Kette die Bindungsstelle von Interleukin-2 bildet. Die β- und γ-Kette des Rezeptors sind an der Bindung des Transkriptionsfaktors STAT5 beteiligt, das wiederum die Gentranskription von antiapoptotischen Proteinen wie bcl-2 und bcl-x sowie CD25 fördert. Dahingehend wurde versucht, den verantwortlichen Faktor für den Schutz von Treg-Zellen vor dem Zelltod in der IL-2-Signaltransduktion zu identifizieren. Der Transkriptionsfaktor STAT5 konnte hierbei ausgeschlossen werden. Weder die genetische Überexpression noch die Defizienz von STAT5 hatten Einfluss auf das T-Zell-Gleichgewicht. Die genauen molekularen Mechanismen der Treg-spezifischen IL-2-Protektion bleiben daher ungeklärt. Zu diskutieren sind der Einfluss von Zn2+-Ionen, Januskinasen und Mitgliedern der FoxO-Familie. Die zugrundeliegende Hypothese, dass das spezifische Sterben konventioneller T-Zellen auf einer Erhöhung der lysosomalen Membranpermeabilität (LMP) besteht, woraufhin proapoptotisch wirksame Cathepsine ins Zytosol freigesetzt werden und Caspasen zur Auslösung von Apoptose führen, konnte nicht abschließend bestätigt werden. Jedoch wurde nachgewiesen, dass durch Inhibition von Cathepsinen das Sterben konventioneller T-Zellen in Abwesenheit von IL-2 verlangsamt wird. Eine Protektion der Tconv-Zellen durch Caspase-Inhibitoren kann nur bei hohen 60 Konzentrationen des Inhibitors ZVAD bei gleichzeitig geringer Asm-Inhibitor-Konzentration erreicht werden. In Zusammenschau der Ergebnisse müssen weitere Formen des Zelltods neben der Apoptose, etwa eine durch Asm-Inhibition induzierte Ferroptose, in Erwägung gezogen werden. Neben dem durch Asm-Inhibition erzeugten Lipidstress begünstigt das Vorliegen von hypoxischen Bedingungen die Induktion von Zelltod. Schon das alleinige Auftreten von Hypoxie ohne den Einfluss von Asm-Inhibitoren führt zu einer Treg-Frequenzerhöhung. Der Hypoxie-induzierte Faktor HIF-1α induziert die Expression von Foxp3, wodurch die Differenzierung und Suppressivität von CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg-Zellen gefördert wird. Der Einfluss von Hypoxie spielt womöglich vor allem in der Tumortherapie eine entscheidende Rolle. HIF-1α regt hypoxische, nicht-vaskularisierte Tumorareale zur Neovaskularisation an und bremst durch die Frequenzerhöhung regulatorischer T-Zellen die eigene Immunabwehr. Ein Abbau des Transkriptionsfaktors HIF-1α stellt somit eine therapeutische Option in der Therapie solider Tumoren dar. Abschließend lässt sich also festhalten, dass die relative Frequenzerhöhung regulatorischer T-Zellen durch Asm-Inhibition nicht durch Apoptose erklärt werden kann, sondern alternative Erklärungsmodelle wie z.B. die Ferroptose in Betracht gezogen werden müssen. Die Protektion CD25+ regulatorischer T-Zellen beruht auf der Wirkung von IL-2 und wird durch Hypoxie positiv beeinflusst. Eine genaue Identifizierung der für den Zelltod relevanten Mechanismen ist erforderlich, um sichere therapeutische Maßnahmen im Rahmen von Infektionen und Autoimmunkrankheiten zu etablieren. N2 - The acid sphingomyelinase (Asm) is a lysosomal enzyme that can be secreted and catalyses the cleavage of sphingomyelin to ceramide and phosphocholine. Its function is important for the maintenance of cellular lipid metabolism and for the integrity of the plasma membrane. Enzyme defects are involved in the pathogenesis of infections and numerous metabolic diseases such as Niemann-Pick disease, diabetes mellitus type II and also in the development of mental illness. It is of immunological importance that the inhibition of the Asm with tricyclic antidepressants (TCA) or serotonin reuptake inhibitors (SSRI) leads to an increase of the frequency of CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells (Treg) in the mouse. The reason for this frequency increase is not an increase in the absolute Treg cell count, but rather due to the selective death of CD4+ CD25- Foxp3- conventional T cells (Tconv) Surprisingly, treatment with the competitive Asm-inhibitor ARC39, a bisphosphonate, does not lead to this effect. It could be demonstrated that IL-2 protects regulatory T cells from cell death induced by Asm inhibition. In the absence of IL-2, Treg cells also die due to Asm inhibition. Treg cells constitutively express CD25, the IL-2 receptor, whose α-chain forms the binding site of interleukin-2. The β- and γ-chain of the receptor are involved in the binding of the transcription factor STAT5, which itself promotes gene transcription of anti-apoptotic proteins such as bcl-2 and bcl-x as well as CD25. Therefore, we tried to identify the responsible factor responsible for protecting Treg cells from cell death in IL-2 signal transduction. The transcription factor STAT5 was excluded. Neither the genetic over-expression nor the deficiency of STAT5 had any influence on the T-cell balance. The exact molecular mechanisms of Treg specific IL-2 protection remain unexplained. The influence of Zn2+ ions, Janus kinases and FoxO-family members will be discussed. The underlying hypothesis that the specific death of conventional T cells is based on an increase in lysosomal membrane permeability (LMP), whereupon proapoptotic cathepsins are released into the cytosol and caspases lead to the induction of apoptosis could not be conclusively confirmed. However, it has been shown that inhibition of cathepsins slows down the death of conventional T cells in the absence of IL-2. A protection of Tconv cells by caspase inhibitors can only be achieved at high concentrations of the inhibitor ZVAD with simultaneously low Asm inhibitor concentrations. In summary, other forms of cell death besides apoptosis, such as ferroptosis induced by Asm inhibition, need to be considered. 62 Besides lipid stress induced by Asm inhibition, the presence of hypoxic conditions favors the induction of cell death. Even the mere occurrence of hypoxia without the influence of Asm inhibitors leads to an increase in Treg frequency. Hypoxia-induced factor HIF-1α induces Foxp3 expression, promoting differentiation and suppressiveness of CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg cells. The influence of hypoxia possibly plays a decisive role especially in tumor therapy. HIF-1α stimulates hypoxic, non-vascularized tumor areas to neovascularize and slows down the own immune defense by increasing the frequency of regulatory T cells. A degradation of the transcription factor HIF-1α is therefore a therapeutic option in the therapy of solid tumors. In conclusion, it can be stated that the relative frequency increase of regulatory T cells by Asm inhibition cannot be explained by apoptosis, but alternative explanation models such as ferroptosis must be considered. The protection of CD25+ regulatory T cells is based on the effect of IL-2 and is positively influenced by hypoxia. A precise identification of the mechanisms relevant for cell death is necessary to establish safe therapeutic measures in the context of infections and autoimmune diseases. KW - Sphingomyelinphosphodiesterase KW - Desipramin KW - Regulatorischer T-Lymphozyt KW - Sphingomyelinase KW - Desipramin KW - T-Zelle KW - Regulatorische T-Lymphozyt Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-248351 ER - TY - THES A1 - Gaal, Chiara Claudia T1 - Cardiac Antigens and T cell Specificity after Experimental Myocardial Infarction in Mice T1 - Kardiale Antigene und T-Zell Spezifität nach experimentellem Myokardinfarkt in Mäusen N2 - Cardiovascular diseases (CVD), subsuming atherosclerosis of the coronary arteries and subsequent myocardial infarction, are the leading cause of death in the European Union (over 4 million deaths annually), with devastating individual and economic consequences. Recent studies revealed that T cells play a crucial role in post-MI inflammation, healing and remodelling processes. Nevertheless, the specificity profile of adaptive immune responses in the infarcted myocardium has not yet been differentiated. The experiments portrayed in this thesis sought to assess whether post-MI CD4+ T cell responses in mice are triggered by heart specific antigens, and eventually identify relevant epitopes. We were able to create a murine antigen atlas including a list of 206 epitopes for I-Ab and 193 epitopes for I-Ad presented on MHC-II in the context of MI. We sought to consecutively test this panel by in vitro T cell proliferation and antigen recall assays ex vivo. The elispot assay was used as a readout for antigen-specific stimulation by measurement of IL-2 and IFN-γ production, currently the most sensitive approach available to detect even small counts of antigen producing cells. Splenocytes as well as lymphocytes from mediastinal lymph nodes were purified from animals 7 days or 56 days after EMI conducted by ligation of the left anterior descending artery. We were able to provide evidence that post-MI T cell responses in Balb/c mice are triggered by heart-specific antigens and that MYHCA, especially MYHCA614-628, is relevant for that response. Moreover, a significant specific T cell response after MI in C57BL/6J mice was observed for α actin, cardiac muscle 1 [ACTC1], myosin-binding protein C3 [MYBPC3] and myosin heavy chain α [MYHCA] derived heart specific antigens. Generally, the epitopes of interest for Balb/c as well as C57BL/6J could be further investigated and may eventually be modulated in the future. N2 - Herz-Kreislauf-Erkrankungen (CVD) sowie der häufig folgende Myokardinfarkt sind die häufigsten Todesursachen in der Europäischen Union (über 4 Millionen Todesfälle pro Jahr) mit verheerenden individuellen und wirtschaftlichen Folgen. Aktuelle Studien haben gezeigt, dass T-Zellen eine entscheidende Rolle bei Entzündungs-, Heilungs- und Umbauprozessen nach einem Myokardinfarkt spielen. Das Spezifitätsprofil adaptiver Immunantworten im infarzierten Myokard konnte bisher jedoch noch nicht differenziert werden. Die in dieser Arbeit dargestellten Experimente gingen der Frage nach, ob CD4+ T-Zellantworten nach einem Myokardinfarkt in Mäusen durch herzspezifische Antigene ausgelöst werden und ob hieraus relevante Epitope identifiziert werden können. Uns gelang es, einen Maus-Antigen-Atlas zu erstellen, der eine Zusammenstellung von 206 Epitopen für I-Ab und 193 Epitope für I-Ad enthält, welche auf MHC-II im Rahmen des Myokardinfarkts präsentiert werden. Dieses Panel wurde nacheinander durch In-vitro-T-Zell-Proliferations- und Antigen-Recall-Assays ex vivo getestet. Der Elispot-Assay wurde als sensitivster verfügbare Ansatz zur Quantifizierung der antigen-spezifischen Stimulation durch Messung der IL-2- und IFN-γ-Produktion verwendet. Splenozyten sowie Lymphozyten aus mediastinalen Lymphknoten der Mäuse wurden 7 Tage bzw. 56 Tage nach einem experimentellen Myokardinfarkt, welcher durch Ligation der RIVA Arterie durchgeführt wurde, aufgereinigt. Wir konnten nachweisen, dass Post-MI-T-Zellantworten in Balb/c Mäusen durch herzspezifische Antigene ausgelöst werden, und dass MYHCA, insbesondere MYHCA614-628, für diese Antwort relevant ist. Darüber hinaus konnte eine signifikante spezifische T-Zell-Antwort nach Myokardinfarkt in C57BL/6J Mäusen auf aus Alpha-Actin des Herzmuskels 1 [ACTC1], Myosin-bindendes Protein C vom Herztyp [MYBPC3] und der schweren Kette des Myosins α [MYHCA] generierten herzspezifischen Antigenen gezeigt werden. KW - Regulatorische T-Lymphozyt KW - Herzinfarkt KW - Immunreaktion KW - Myosin KW - Kardiologie KW - T-Lymphozyten KW - T-Lymphocytes KW - Myocardial infarction KW - T-Cell Specificity KW - Cardiac Antigens KW - Kardinale Antigene KW - T-Zell Spezifität KW - Myocardial Healing KW - Mycardiale Heilung Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-260047 ER -