TY - THES A1 - Plochmann, Kathrin T1 - Bioassays zur Untersuchung der biologischen Aktivität von Flavonoiden und Ermittlung eines zellulären Rezeptormoleküls von foamyviralen Vektoren T1 - Bioassay to investigate the biological activity of flavonoids and research to discover the foamyviral receptor N2 - Aufgrund ihrer gut dokumentierten, umfangreichen gesundheitsfördernden biologischen Aktivitäten wird den Flavonoiden eine große Bedeutung zugeordnet. Die Ergebnisse von in vitro- und Tierstudien deuten zudem darauf hin, dass diese Verbindungen bei der Prävention und Therapie von Erkrankungen wie Krebs oder Alzheimer Krankheit (AD) positive Effekte zeigen. Zur besseren Charakterisierung der Interaktion von Flavonoiden mit Krebszellen wurden von uns die Cytotoxizität verschiedener Flavonoide auf T-Lymphoblastomzellen untersucht und Strukturelemente identifiziert, welche für einen Flavonoid-induzierten Zelltod relevant sind. Weitere Studien waren der potentiell neuroprotektiven Wirkung von Flavonoiden gewidmet. Die sowohl in neuronalen Zellkulturen als auch in transgenen Alzheimer-Mäusen (TgAPPsw) festgestellte Erhöhung der sAPPα Produktion und Reduktion von Aβ-Bildung wurden mit Aktivitäts- und Expressionssteigerung der α-Sekretase ADAM-10 assoziiert. Um herauszufinden, ob Flavonoide eine neuroprotektive Wirkung zeigen, wurden erste Vorbereitungen für ein Flavonoid-Screening mit einer sowohl hAPP alsauch ADAM-10 stabil transfizierten HT1080 Zellen getroffen. Dies beinhaltete die Suche nach einer potenten siRNA/shRNA und einem effektiven Flavonoid. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Experimente durchgeführt, um die Rolle von Heparansulfat (HS) bei der foamyviralen Anbindung an die Wirtszelle zu untersuchen. Foamyviren (FV) sind Spumaviren und gehören zur Familie der Retroviren. Bei unseren Studien wurde die Bindung von FV an Heparin, die Korrelation der Suszeptibilität verschiedener Zellen mit zellulärem HS und die Reduktion der Infektion durch lösliches Heparin sowie durch enzymatischen HS-Abbau festgestellt. N2 - Flavonoids have well-documented, beneficial biological effects. Furthermore different in vitro- and animal-experiments indicate that these compounds demonstrate positive effects in prevention and therapy of diseases, like cancer or neurodegenerative diseases. In order to characterize the interactionsbetween flavonoids and cancer cells, we examined the cytotoxicity of different flavonoids on a human leukemia cell line and identified structure elements that could be associated to flavonoid-induced cell death. Our further studies were dedicated to the potentially neuroprotective activity of flavonoids. It has been described that in neuronal cells as well as in transgenic AD mice EGCG increases levels of sAPPα- and reduces Aβ-production. This influence of EGCG was associated with enhanced activity and expression of the α-secretase, ADAM-10. To find out, if flavonoids showed neuroprotective activity, preliminary work for a later flavonoid screening on hAPP and ADAM-10 wit stably-transfected HT1080 cells was done. This includes the determination of flavonoid candidates and research of effective siRNAs towards ADAM-10. Furtherrmore we investigated the role of heparansulfat (HS) in attachment of FV to host cell. Foamyviruses (FV) are retroviruses and belong to the subfamily of spumaretroviruses. In our studies we discovered the binding of FV on heparin, the correlation between susceptibility of different cells and cellular HS and the reduction of infectivity through soluble heparin and through enzymatic HS-degradation. KW - Flavonoide KW - Biologische Aktivität KW - Bioassay KW - Virusrezeptor KW - Spumaviren KW - T-Lymphoblastomzellen KW - ADAM-10 KW - alpha-Sekretase KW - Cytotoxizität KW - T-Zell-Leukämie KW - Alzheimer-Krankheit KW - Spumaviren KW - Virusrezeptor KW - Heparansulfat KW - flavonoids KW - cytotoxicity KW - alzheimer's disease KW - foamy virus KW - receptor Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65183 ER - TY - THES A1 - Heinze, Britta T1 - Charakterisierung der angeborenen Immunantwort gegen Pneumoviren in einem in vivo Modell T1 - Characterization of the innate immune response against pneumoviruses in an in vivo model N2 - In dieser Arbeit wurde das PVM-Mausmodell verwendet, um die Bedeutung der Typ I und Typ III Interferonantwort für die Pathogenese einer pneumoviralen Infektion zu analysieren. Hierzu wurden zunächst mit Hilfe der reversen Genetik rekombinante PVM-Mutanten hergestellt, bei denen die Gene für die NS-Proteine, welche vermutlich als Interferonantagonisten fungieren, deletiert sind. Die Charakterisierung der Replikationsfähigkeit der rPVM dNS-Mutanten erfolgte in vitro in Interferon-kompetenten und Interferon-inkompetenten Zelllinien. Ein zentraler Schritt innerhalb dieser Charakterisierung war die Untersuchung der Induktion von Interferonen in vivo und in vitro nach Infektion mit den rPVM dNSMutanten, wobei nachgewiesen wurde, dass die NS-Proteine von PVM als Interferonantagonisten fungieren. In allen Interferon-kompetenten Zellkulturen wurde eine Attenuierung von rPVM dNS1, rPVM dNS2 und rPVM dNS1dNS2 bezogen auf rPVM beobachtet. In allen Interferon-inkompetenten Zellkulturen konnte die Attenuierung der rPVM dNS-Mutanten nahezu vollständig revertiert werden. Nach Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten wurde in verschiedenen Zelllinien eine Induktion von Typ I und Typ III Interferonen betrachtet, wobei Unterschiede in der Stärke der Interferon-Induktion nach Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten vorhanden waren. Zusammenfassend war es möglich, die NS1- und NS2-Proteine von PVM in Analogie zu RSV eindeutig als Antagonisten der Interferonantwort zu identifizieren. Die Untersuchung der protektiven Rolle von Typ I und Typ III Interferonen für die Replikation und Pathogenität von PVM bildete den zweiten Teil dieser Arbeit. Hierzu wurde die Replikationsfähigkeit und Pathogenität der rPVM dNS-Mutanten in verschiedenen Interferon-defizienten Mausstämmen getestet. Die Untersuchungen ergaben eine protektive Rolle von Typ I und Typ III Interferonen bei einer Infektion mit PVM, wobei den Typ I Interferonen ein effektiverer Einfluss zugeordnet werden konnte. Ein Vergleich von Replikation und Virulenz zwischen den verschiedenen Typ I oder Typ III oder Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mausstämmen belegte eine erhöhte Suszeptibilität der Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mäuse gegenüber einer Infektion mit den rPVM dNS-Mutanten. Eine vollständige Aufhebung der Attenuierung wurde auch in den Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mäusen nicht erlangt. Eine anti-apoptotische Funktion der NS-Proteine zusätzlich zu ihrer Wirkungsweise als Interferonantagonisten wurde aufgrund der unvollständigen Revertierung der Pathogenität der rPVM dNS-Mutanten in Typ I/Typ III Interferonrezeptor-defizienten Mäusen vermutet. Der abschließende Teil dieser Dissertation befasste sich mit der Frage, welche Zellen bei einer natürlichen pulmonalen Infektion Interferone in vivo produzieren. In vitro wurde beobachtet, dass überraschenderweise nur sehr wenige virusinfizierte oder uninfizierte Zellen Typ I Interferone bilden. Der Nachweis darüber, welche Zellen während einer pulmonalen Infektion hauptsächlich Interferone in vivo produzieren, war aufgrund der fehlenden Eignung der kommerziell erhältlichen Interferon-Antikörper für intrazelluläre Gewebefärbungen nicht möglich. Dennoch gelang es abschließend durch eine neue Nachweismethode erstmals Zellen mit rezeptorgebundenen Interferon zu identifizieren, wobei es sich um ziliierte Epithelzellen, Alveolarmakrophagen und vermutlich Clarazellen sowie Typ I und Typ II Pneumozyten handelte. N2 - In this thesis the PVM mouse model was used to unveil the role of type I and type III interferone response for the pathogenesis of pneumoviral infection. First, recombinant PVM dNS-mutants with single or combined deletions of the NS-genes were generated and replication efficiency characterization was analyzed in interferon-competent cells as well as in interferon-incompetent cells. A major point was to elucidate the NS-proteins of PVM as interferon antagonists. In interferon-competent cells the replication of rPVM dNS-mutants were significantly attenuated. These attenuation of all three rPVM dNS-mutants was almost completely reversed when interferon-incompetent cells were infected. Induction of type I and type III interferons was determined in different cell types after infection with rPVM dNS-mutants with differences in intensity of interferon induction. Thus, NS1- and NS2-proteins were clearly identified as interferon antagonists. To analyze the protective capacity of type I and type III interferons with respect to replication and pathology of PVM, mice lacking functional receptors for either or both interferons were infected with rPVM or the respective dNS-mutants. The results indicated that both type I and type III interferons which one restricted replication and pathology of PVM, with the former playing the greater role. Interestingly, the replication and virulence of wild-type PVM were completely unaffected by the presence or absence of functional receptors to type I and type III interferon, indicating that both systems are strongly suppressed during infection. However, pretreatment of mice with type I interferon were protective against lethal rPVM challenge, whereas pretreatment with type III interferon delayed but did not prevent death. Finally, the PVM-NS-proteins appeared to delay apoptosis independently of its IFN-antagonistic activity that may contribute to the limited pathogenicity of the viruses in type I/type III receptor deficient mice. In the last part type I interferon producing cells in a pneumoviral infection in vivo should be identified. It was documented that type I interferon producing cells are virusinfected cells as well as uninfected cells. Surprisingly, in vitro only few cells produced type I interferon during rPVM-GFP7 dNS1dNS2 infection. Because the commercially available interferon antibodies are not qualified for intracellular tissue staining it was not possible to identify in vivo the interferon producing cells, but by inventing a new method it was possible to verify the binding of type I interferon to the cell surface receptor of ciliated epithelial cells, alveolar macrophages and presumably Clara cells and type I and type II pneumocytes. KW - Interferon KW - RS-Virus KW - Immunreaktion KW - Lungenentzündung KW - Apoptosis KW - Tiermodell KW - Toll-like-Rezeptoren KW - PVM KW - Nichtstrukturproteine KW - IFNAR KW - Interferonrezeptor KW - PVM KW - interferon KW - IFNAR KW - receptor KW - apoptosis Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56454 ER - TY - THES A1 - Wortmann, Sebastian T1 - Das Tuberoinfundibuläre Peptid von 39 Aminosäuren (TIP39): Gen-Struktur und Expressionsmuster im Zebrafisch und Mäusehirn T1 - The tuberoinfundibular peptide of 39 amino acids (TIP39): Gene structure and expression scheme in zebrafish and mouse brain N2 - Das Tuberoinfundibuläre Peptid von 39 Aminosäuren (TIP39), ein kurzes Oligopeptid mit einer N-terminalen und einer C-terminalen alpha-Helix, wurde ursprünglich bei der Suche nach einem Liganden für den neu beschriebenen PTH2-Rezeptor aus einem Hypothalamus-Hypophysen-Extrakt isoliert. Aus der bisherigen Charakterisierung von TIP39 ist am meisten bekannt bezüglich der Expressions-Muster und der Interaktion am PTH2-Rezeptor. TIP39 ist der stärkste bekannte Aktivator des PTH2-Rezeptors und wirkt am PTH1-Rezeptor als funktioneller Antagonist. Inzwischen wurde auch das TIP39 Gen des Menschen und der Maus charakterisiert. Die physiologische Rolle von TIP39 ist dennoch bisher weitgehend ungeklärt, diskutiert werden Einflüsse auf den Kalzium-Phosphat-Haushalt, die Hypothalamus-Hypophysen-Achse oder die Nozizeption. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Untersuchung des TIP39 kodierenden Gens des Zebrafischs danio rerio. Die komplette cDNA konnte amplifiziert werden und wurde unter der Accession No. AF486190 in der GenBank veröffentlicht. Der Genlocus konnte mittels Radiation Hybrid Mapping auf Chromosom 17 lokalisiert werden. Die 3 charakterisierten Exons und 2 Introns umfassen zusammen ca. 3750 bp. Daneben wurde die Prozessierung des Genprodukts aufgeklärt: TIP39 wird beim Zebrafisch als Preprohormon translatiert, am N-terminalen Ende findet sich eine 25 Aminosäuren lange Signalsequenz, die für sezernierte Peptide typisch ist und welche für die Aufnahme in das Endoplasmatische Retikulum verantwortlich ist. In diesem Bereich finden sich eine weitgehende Übereinstimmungen zwischen den analysierten Spezies. Gefolgt wird die Zielsequenz von einem 93 Aminosäuren langen Zwischenpeptid, das sich als wenig konserviert zwischen den Spezies zeigt. Die eigentliche Sequenz von TIP39 beim Zebrafisch zeigte eine Sequenzhomologie von 59% zur humanen Sequenz und wurde mittels Blast Suche als hochkonserviert in allen 12 untersuchten Spezies wiedergefunden. Im genomischen Southern-Blot zeigte sich, dass TIP39 beim Zebrafisch im einfachen Chromosomensatz ein „single-copy“ Gen ist. Mittels RT-PCR konnte eine sehr frühe erste Expression von TIP39 bereits ab 16 Stunden nach Fertilisation gezeigt werden. Im Bereich des supraoptischen Trakts des Zebrafischhirn konnte eine scharf umschriebene Zellpopulation mit starker TIP39-Expression detektiert werden. Durch Knockdown-Experimente konnte beim Zebrafisch gezeigt werden, dass ein Fehlen von TIP39 Expression während der Embryogenese zu einer Fehlentwicklung des Frontalhirns führt und zudem mit einer Funktionsbeeinträchtigung der Schwanzmotorik einhergeht. Hierfür wurden gerade befruchteten Zebrafischeiern im Zwei-Zell-Stadium sogenannte „Morpholinos“ injiiziert, welche als Antisense-Nukleotide spezifisch die Translation von TIP39 hemmen. Ergänzend konnte im Mäusehirn die Expression von TIP39 mittels in-situ Hybridisierung bestimmt werden. Es zeigte sich eine Expression von TIP39 in einer Vielzahl von klar umschriebenen Neuronengruppen, so im Hypothalamus, dem limbischen System und in sensorischen Neuronen, ohne dass sich im Einzelfall jeweils sicher eine Funktion hieraus ableiten lässt. In der vorliegenden Arbeit konnte somit erstmals gezeigt werden, dass TIP39 zur korrekten Neurogenese bei der Entwicklung des Frontalhirns des Zebrafisches unabdingbar ist und auch die frühe Entwicklung der Motoneurone durch TIP39 beeinflusst wird. Die ermittelten Daten unterstützen die Vorstellung von TIP39 als ein sezerniertes Neuropeptid, das als Transmitter in der Sensorik, insbesondere der Nozizeption, wirkt. Auch eine Beeinflussung der zentralnervösen Steuerung der Motorik durch TIP39 wird angenommen. Die gute Lokalisations-Übereinstimmung der Expressionen von TIP39 mit seinem zugeordneten Rezeptor, dem PTH2-Rezeptor, lässt eine systemische endokrine Wirkung von TIP39 wenig wahrscheinlich erscheinen, sondern stärkt die Hypothese von TIP39 als einem para-, bzw. autokrin wirkenden Neurotransmitter. N2 - The tuberoinfundibular peptide of 39 aa (TIP39) is a short oligopeptide containing two alpha-helices. It was first detected in hypothalamic tissue while searching for a ligand of the new-described parathyroid hormone receptor 2 (PTH2R). So far only expression scheme and interaction with the PTH2R is investigated. TIP39 is the most potent activator of the PTH2R and a functional antagonist of the PTH1R. In contrast little is known about the physiological role of TIP39, influences on the calcium phosphate balance or on nociception are discussed. We focused on the analysis of the zebrafish gene encoding the TIP39. The complete cDNA was amplified and publish in PubMed (Accession No. AF486190). The gene locus was detected on chromosome 17 via radiation hybrid mapping. TIP39 consists of 3 exons and 2 introns, in total covering 3750 bp. Zebrafish TIP39 is translated as a preprohormone, containing a typical 25 aa signal sequence, responsible for uptake to the endoplasmatic reticulum. This signal sequence showed broad accordance among all 12 analysed species, but the following 93 aa intercalated peptide is only poorly conserved. The actual TIP39 peptide shows aa accordance of 59% between zebrafish and human. Via southern blotting zebrafish TIP39 was characterized as a single copy gene. The fist expression of TIP39 during embryogenesis was detected before 16 hpf by RT-PCR. Strong TIP39 expression was located in a distinct cell group of the supraoptic tract. Knockdown of TIP39 during embryogenesis showed TIP39 being indispensable for correct forebrain development. Furthermore we described the distribution of TIP39 expression in the mouse brain by in-situ hybridization. In this work the zebrafish TIP39 gene is described. We showed first the influence of TIP39 on correct forebrain development and motoneurone formation. This data confirm TIP39 being most likely a neurotransmitter involved in sensoric especially nociception. Because of the widely concordance of the TIP39 and PTH2R expression we estimate a paracrine or autocrine effect of TIP39. KW - Zebrabärbling KW - Parathormon KW - Rezeptor KW - TIP39 KW - Parathormon KW - Rezeptor KW - Zebrafisch KW - TIP39 KW - parathyroid hormone KW - receptor KW - zebrafish Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-32230 ER - TY - THES A1 - Kotzsch, Alexander T1 - BMP Ligand-Rezeptor-Komplexe: Molekulare Erkennung am Beispiel der Spezifischen Interaktion zwischen GDF-5 und BMPR-IB T1 - BMP ligand receptor complexes: Molecular recognition exemplified by the specific interaction between GDF-5 and BMPR-IB N2 - Knochenwachstumsfaktoren (Bone Morphogenetic Proteins, BMPs) sind ubiquitäre, sekretierte Proteine mit vielfältigen biologischen Funktionen. Die Vielfalt an zellulären Prozessen, die durch BMPs reguliert werden, von der Knochenentwicklung und Organhomöostase bis hin zur Neurogenese, erstaunt – und wirft angesichts von teils redundanten, teils spezifischen Funktionen der BMPs Fragen zu den Mechanismen ihrer Signalübermittlung auf. Die Signaltransduktion von BMPs erfolgt wie bei den strukturell verwandten TGF-βs und Activinen durch die ligandeninduzierte Oligomerisierung von transmembranen Serin/Threonin-Kinaserezeptoren, von denen zwei Typen – Typ I und Typ II – existieren. Einer Vielzahl von mehr als 18 BMP-Liganden stehen nach derzeitigem Erkenntnisstand nur vier Typ I und drei Typ II Rezeptorsubtypen für die Bildung von heteromeren Rezeptorkomplexen zur Verfügung. Ein BMP-Ligand kann hochspezifisch nur einen bestimmten Rezeptorsubtyp oder in einer promisken Art und Weise mehrere Rezeptorsubtypen binden. Trotz dieser Bindungspromiskuität üben BMPs ihre biologische Funktion überwiegend hochspezifisch aus, d.h. abhängig vom Liganden werden spezifische zelluläre Prozesse reguliert. Somit stellt sich die Frage, wie die Bildung von heteromeren Ligand-Rezeptor-Komplexen und die Aktivierung definierter intrazellulärer Signalkaskaden zusammenhängen und wie letztlich ein bestimmtes BMP-Signal durch einen „Flaschenhals“, repräsentiert durch die begrenzte Anzahl an Rezeptorsubtypen, in das Zellinnere übermittelt wird. Die Interaktionen zwischen BMP-2 / GDF-5 und den Typ I Rezeptoren BMPR-IA / BMPR-IB sind ein Paradebeispiel für Bindungspromiskuität und -spezifität. Während BMP-2 beide Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB mit gleicher Bindungsaffinität bindet („promiske Interaktion“), zeigt GDF-5 eine 15-20fach höhere Bindungsaffinität zu BMPR-IB („spezifische“ Interaktion). Dieser Unterschied ist scheinbar gering, aber physiologisch überaus relevant. Um Einblick in die Mechanismen der molekularen Erkennung zwischen den Bindungspartnern zu gewinnen, wurden binäre und ternäre Komplexe aus den Liganden BMP-2 oder GDF-5, den extrazellulären Domänen der Typ I Rezeptoren BMPR-IA oder BMPR-IB sowie der extrazellulären Domäne des Typ II Rezeptors ActR-IIB untersucht. Die hier vorliegende Arbeit beschreibt die strukturelle und funktionelle Analyse dieser Ligand-Rezeptor-Komplexe. Um den Einfluss struktureller Flexibilität auf die BMP Typ I Rezeptor Erkennung näher zu analysieren, wurde zudem die Struktur von BMPRIA in freiem Zustand mittels NMR-Spektroskopie aufgeklärt. Aus Mutagenesedaten und der Kristallstruktur des GDF-5•BMPR-IB-Komplexes lassen sich im Vergleich zu bekannten Kristallstrukturen Merkmale ableiten, mit denen die Ligand-Rezeptor-Bindung und -Erkennung charakterisiert werden kann: (1) Die Hauptbindungsdeterminanten in Komplexen von BMPR-IA und BMPR-IB mit ihren Liganden sind unterschiedlich. Während in Komplexen mit BMPR-IB ein hydrophobes Motiv die Bindungsaffinität bestimmt, trägt in Komplexen mit BMPR-IA eine polare Interaktion signifikant zur Bindungsenergie bei. Ein Vergleich der Strukturen von freien und gebundenen Liganden und Typ I Rezeptoren zeigt, dass interessanterweise diese Hauptbindemotive erst bei der Ligand-Rezeptor-Interaktion entstehen, sodass ein „induced fit“ vorliegt und die Moleküle entsprechend „aufeinander falten“. (2) Die Bindungsspezifität wird durch periphere Schleifen in den Typ I Rezeptoren bestimmt. Wie Untersuchungen von Punktmutationen in BMPR-IA zeigen, die einer krebsartigen Darmerkrankung (Juvenile Polyposis) zugrunde liegen, führt erst die „richtige“ Kombination aus Flexibilität in den Schleifen und Rigidität des Rezeptorgrundgerüsts zu signalaktiven Typ I Rezeptoren mit einer potentiell den Liganden komplementären Oberfläche. Die mangelnde sterische Komplementarität von Ligand- und Rezeptoroberflächen führt zu der niedrigeren Bindungsaffinität von GDF-5 zu BMPR-IA im Vergleich zu BMPR-IB. Interessanterweise zeigen die hier vorgestellten, hochaufgelösten Strukturdaten, dass die Orientierungen/Positionen der Typ I Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB in den Bindeepitopen der Liganden BMP-2 und GDF-5 variieren. Unter der Voraussetzung, dass die extrazelluläre Domäne, das Transmembransegment und die intrazelluläre Domäne der Typ I Rezeptoren ein starres Element bilden, sollte sich die unterschiedliche Orientierung der extrazellulären Domänen der Typ I Rezeptoren in der Anordnung der Kinasedomänen widerspiegeln und sich auf die Signaltransduktion auswirken. Möglicherweise ist eine bestimmte Anordnung der Kinasedomänen der Typ I und Typ II Rezeptoren für eine effiziente Phosphorylierung bzw. Signaltransduktion erforderlich. Der Vergleich mehrerer Ligand-Typ I Rezeptor-Komplexe zeigt, dass die unterschiedliche Orientierung dieser Rezeptoren möglicherweise vom Liganden abhängt. Angesichts der Bindungspromiskuität unter BMP-Liganden und -Rezeptoren könnten so spezifische Signale übermittelt und spezifische biologische Funktionen reguliert werden. Die in dieser Arbeit vorgestellten Erkenntnisse tragen wesentlich zur strukturellen Charakterisierung der Ligand-Rezeptor-Erkennung in der BMP-Familie bei. Die Frage, warum trotz strukturell hoch homologer Liganden und Rezeptoren und weitgehend konservierten Bindeepitopen eine teils promiske und teils spezifische Interaktion möglich ist, kann nun für die Liganden BMP-2 und GDF-5 sowie den beiden Typ I Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB beantwortet werden. N2 - Bone morphogenetic proteins (BMPs) are ubiquitous, secreted cytokines involved in a manifold of biological functions. The diversity of cellular processes regulated by BMPs, from bone development to tissue homeostasis and neuronal processes, is amazing – and raises questions about the mechanisms of signal transduction in the light of redundant functions on the one hand, and specific functions on the other hand. Similar to structurally related activins and TGF-βs, the signal transduction of BMPs is accomplished by ligand-induced oligomerization of transmembrane BMP type I and type II serine/threonine receptor kinases. According to current knowledge, only four type I and three type II receptor subtypes are available for BMP signal transduction, facing a multitude of more than 18 BMP ligands. Binding of BMP ligands to their receptors can be highly specific meaning that only one specific receptor of either subtype is used for signaling. In contrast, many BMP ligands can recruit more than one receptor subtype, which results in binding promiscuity. However, even though receptor subtypes are bound in a promiscuous manner, only certain biological functions are triggered. Dependent on the BMP ligand, specific cellular processes are activated and regulated. This discrepancy between unspecific binding and specific signaling events and the biological response raises the question how the formation of heteromeric ligand-receptor complexes is linked to the activation of defined intracellular signaling cascades, and finally, how a certain BMP signal is transduced into the interior of the cell through a „bottleneck“ represented by the limited number of receptor subtypes. The interaction between BMP-2 / GDF-5 and the BMP type I receptors BMPR-IA / BMPR-IB is a prime example for binding promiscuity and binding specificity. BMP-2 binds BMPR-IA and BMPRIB with almost equal binding affinity („promiscuous interaction“) while GDF-5 exhibits a 15-20fold higher binding affinity to BMPR-IB („specific interaction“). Although this difference is seemingly small, it is however of considerable relevance for the physiological role of these ligands. To gain insight into the mechanisms of molecular recognition between the binding partners, binary and ternary ligand-receptor complexes consisting of BMP-2 or GDF-5, the extracellular domains of the type I receptors BMPR-IA or BMPR-IB, and the extracellular domain of the type II receptor ActRIIB were investigated. The thesis presented here describes the structural and functional analysis of these ligand-receptor complexes. To analyse the effect of structural flexibility on BMP type I receptor recognition in more detail, the structure of free BMPR-IA was determined using NMR spectroscopy. Based on data from a limited mutagenesis and the crystal structure of the GDF-5•BMPR-IB complex several characteristics concerning ligand-receptor binding and recognition can be deduced: (1) The main binding determinants in complexes of BMPR-IA and BMPR-IB with their ligands BMP-2 and GDF-5 differ. A hydrophobic binding motif determines binding affinity in complexes of BMPR-IB, whereas a polar interaction significantly contributes to binding energy in complexes of BMPR-IA. These main binding motifs are only formed during complex formation as demonstrated by a comparison between structures of free and bound ligands as well as type I receptors. Both ligand and receptor fold „onto each other“ which suggests an induced fit mechanism. (2) Binding specificity is encoded on loops at the periphery of the binding epitope of the type I receptors. Only the „appropriate“ combination between structural flexibility in the receptor loops and structural rigidity of the receptor backbone results in signal active type I receptors, as shown by analysis of single polymorphisms in BMPR-IA causing juvenile polyposis syndrome, a cancerous disease of the intestine. A lack of steric surface complementarity between GDF-5 and BMPR-IA, that cannot be overcome by structural flexibility, leads to the lower binding affinity in comparison to BMPR-IB. Interestingly, the high resolution structure of the GDF-5•BMPR-IB complex shows that the orientations/positions of BMPR-IA in the binding epitope of BMP-2 and of BMPR-IB in the binding epitope of GDF-5 vary. Assuming that the extracellular domain, the transmembrane segment, and the intracellular domain of the type I receptors form a rigid element, the different orientations of the extracellular domains should also reflect the assembly of the kinase domains and therefore, affect signal transduction. One can assume that a defined arrangement of the kinase domains of type I and type II receptors is required to allow for efficient phosphorylation and signal transduction, respectively. The comparison of several BMP ligand-type I receptor complexes suggests that the different orientations of these receptors are likely dependent on the ligand. Considering the binding promiscuity among BMP ligands and receptors such a mechanism would represent a possible way for the transmission of specific signals and regulation of specific biological functions. The insights into molecular structure and function of BMP ligands and receptors presented in this thesis contribute significantly to a more detailed understanding of their binding properties. The question why the interaction of BMP ligands and receptors is promiscuous on the one hand and specific on the other hand in spite of structurally highly homologous molecules can now be answered for BMP-2 and GDF-5 as well as BMPR-IA and BMPR-IB. KW - Cytokine KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Ligand KW - Proteinfaltung KW - Molekulare Erkennung KW - Rezeptor KW - Transforming Growth Factor beta KW - Wachstumsfaktor KW - Strukturaufklärung KW - Dreidimensionale NMR-Spektroskopie KW - Protein-Serin-Threonin-Ki KW - Proteinkristallographie KW - GDF-5 KW - BMPR-IB KW - Signaltransduktion KW - protein crystallography KW - molecular recognition KW - signal transduction KW - ligand KW - receptor Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-31040 ER - TY - THES A1 - Herzog, Anna Laura T1 - Migräne und das serotonerge System T1 - Migraine and the serotonergic system N2 - Untersuchung zu single-nucleotid-polymorphismen (SNPs) der Serotoninrezeptoren 5-HT2A, 5-HT3A, des Neurotrophins BDNF und des Enzyms Tryptophanhydroxlase auf deren Korrelation mit Migräne mit und ohne Aura. N2 - Correlation between single nucleotide polymorphisms in genes of serotonergic 5-HT2A and 5-HT3A-receptors, brain derived neurotropic factor and Tryptophanhydroxylase with migraine with and without aura phenomenon. KW - Migräne KW - Serotonin KW - 5-HT2A KW - 5-HT3A KW - BDNF KW - TPH KW - Rezeptor KW - Migraine KW - serotonin KW - 5-HT2A KW - 5-HT3A KW - BDNF KW - TPH KW - receptor Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29380 ER - TY - THES A1 - Erlenhöfer, Christian T1 - Identifizierung von SLAM (CD150) als zellulären Rezeptor für Masernviren T1 - Identification of SLAM (CD150) as a cellular receptor for measles virus N2 - Das Masernvirus (MV) interagiert mit zellulären Rezeptoren auf der Oberfläche von peripheren Blut-Lymphozyten (PBL), die Virus -Bindung und -Aufnahme vermitteln. Wir konnten einen monoklonalen Antikörper mAK 5C6 selektieren, der gegen die Zelloberfläche von B95a Zellen gerichtet ist, die mit MV gut infizierbar sind. Der Antikörper 5C6 inhibiert sowohl die Bindung, als auch die Infektion mit MV Wildtyp- und Vakzine-Stämmen. Ich verwendete eine retrovirale Genbank als Quelle für humane Milz mRNA und Proteine, um ein Screening nach Rezeptoren mit Antikörpern durchzuführen. Mit Hilfe des Antikörpers 5C6 wurde, unter Verwendung von Magnetbeats und FACS-Sortierung, ein erfolgreiches Screening Rezeptor-exprimierender Zellen durchgeführt. Das von mAK 5C6 erkannte Molekül konnte kloniert und als signaling lymphocytic activation molecule (SLAM; CD150) identifiziert werden. Zur Untersuchung der Rezeptorbenutzung verschiedener MV-Stämme wurden CHO-Zellen, die entwe-der rekombinantes CD46 oder SLAM exprimierten, mit 28 Masernvirusstämmen infiziert. Unter den getesteten Viren befanden sich sowohl Vakzine-Stämme, Wildtyp-Stämme mit verschiedener Pass-agierung und rekombinante Viren. Dabei konnte gezeigt werden, dass SLAM ein Rezeptor für MV ist, der sowohl Virusaufnahme und Synzytienbildung für alle getesteten Masernvirusstämme vermittelt. Vor allem Vakzine- und laboradaptierte-Stämme, aber auch eine kleine Fraktion der getesteten Wild-typstämme, konnten sowohl CD46 als auch SLAM verwenden. Durch Verwendung rekombinanter Viren konnte ich zeigen, dass der einzelne Aminosäureaustausch im Hämagglutinin (H) Protein an Position 481 Asn/Tyr (H481NY) determiniert, ob das Virus CD46 verwendet. Der Aminosäureaus-tausch hat keinen Effekt auf die Verwendung von SLAM als Rezeptor was andeutet, dass die Bin-dungsstelle von SLAM und CD46 unterschiedlich ist. Wie bereits für CD46 beschrieben, konnte eine schnelle Rezeptormodulation sowohl auf infizierten als auch uninfizierten Zellen nach Kontakt der MV-Glykoproteine mit SLAM, festgestellt werden. Dabei zeigte sich eine kontaktvermittelte Downregulation nach Vermischung SLAM-positiver Zellen mit per-sistent infizierten BJAB Zellen oder UV-inaktiviertem Virus. SLAM wird schnell von der Zelloberfläche SLAM exprimierender Zelllinien, wie CHO-SLAM, B95a, BJAB, sowie von peripheren Blutlymphozyten (PBL) herunterreguliert. Zusammgefasst: mit SLAM (CD150) wurde ein neuer zellulärer Rezeptor für alle Masernvirusstämme identifiziert. N2 - Measles virus (MV) interacts with cellular receptors on the surface of peripheral blood lymphocytes (PBL) which mediate virus binding and uptake. We selected a monoclonal antibody (Mab 5C6) direc-ted to the surface of highly MV-susceptible B cells (B95a), which inhibits binding to and infection of cells with MV wild-type and vaccine-strains. I used a retroviral gene bank as a source for human splenic mRNAs and proteins, which made it pos-sible to screen with antibodies and to screen for receptor positiv cells. By using the suitable antibody 5C6 I successfully screened for receptor expressing cells using magnetic beads and FACS sorting. I cloned and identified the Mab 5C6 recognized molecule as Signaling Lymphocytic Activation Molecu-le (SLAM; CD150). In order to investigate which measles virus strains may use CD46 and /or CD150 as receptors, CHO cells expressing either recombinant CD46 or SLAM were infected with a panel of 28 MV-strains inclu-ding vaccine strains, wild-type strains with various passage histories and recombinant viruses. I found that SLAM served as a receptor conferring virus uptake and syncytium formation for all MV-strains tested. Predominantly vaccine and laboratory adapted strains, but also a minor fraction of wild-type strains tested, could utilize both CD46 and SLAM. Using recombinant viruses it was demonstrated that the single amino acid exchange in the haemagglutinin (H) protein at position 481 Asn/Tyr (H481NY) determines whether the virus can utilize CD46. The amino acid alteration has no affect on the usage of SLAM as receptor, and as such demonstrates that the binding sites for SLAM and CD46 are distinct. As described for CD46 a rapid receptor modulation was induced by contact of MV glycoproteins with SLAM on infected and uninfected cells. A contact-mediated downregulation was measured by mixing persistently infected BJAB cells or UV-inactivated viruses with uninfected SLAM-positive cells. SLAM is rapidly modulated from the cell surface of all SLAM expressing cell-lines including CHO-SLAM, B95a, BJAB as well as peripheral blood lymphocytes (PBL). In conclusion, I identified SLAM (CD150) as a new cellular receptor for all measles virus strains. KW - Masernvirus KW - Zelloberfläche KW - Rezeptor KW - Masern KW - SLAM KW - CD150 KW - Virus KW - Rezeptor KW - measles KW - SLAM KW - CD150 KW - virus KW - receptor Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6225 ER - TY - THES A1 - Kumar, Andreas T1 - Expression und Aufreinigung von intrazellulären Anteilen des Interleukin-4-Rezeptors als GST-Fusionsproteine und Messung von Protein-Protein-Wechselwirkungen T1 - Expression and Purification of Intracellular Parts of the Interleukin-4-Receptor as GST-Fusion-Proteins and Detection of Protein-Protein-Interactions N2 - In dieser Doktorarbeit wurden zwei intrazelluläre Anteile des IL-4 Rezeptors als GST-Fusionsproteine exprimiert. GST-E1, in dem das cytoplasmatische membranproximale 1/3 von IL-4Ralpha (173 AS) einschließlich des Box 1 Motivs an GST fusioniert ist, konnte nach differenzierter De- und Renaturierung und Bindung an Glutathion-Sepharose Matrix in elektrophoretisch reiner Form aufgereinigt werden. GST-gammainP5D4, in dem die intrazelluläre Domäne von gamma c an GST gebunden vorliegt, konnte nur als heterogenes Gemisch mit 4 C-terminal verkürzten Fraktionen erhalten werden. Mit diesen rekombinanten Fusionsproteinen wurden Immunpräzipitationsversuche in Lysaten IL-4R-transfizierter Ba/F3 Zellen vor und nach Stimulation mit IL-4 durchgeführt. Für GST-E1 wurde eine Wechselwirkung mit Jak1 nachgewiesen, die dem bisherigen Kenntnisstand entspricht; für GST-ginP5D4 hingegen konnte eine Wechselwirkung mit Jak3 nicht gezeigt werden. Beide Proteine sind in der Lage, STAT5 zu präzipitieren; diese Bindung erscheint unabhängig von der IL-4 Stimulation der Zellen und läßt neue Spekulationen über den Mechanismus der Signaltransduktion durch STAT5 zu. Danach könnten nach den hier gewonnenen Informationen beide IL-4-Rezeptorketten jeweils ein STAT5 Molekül zur STAT5-Dimerisirerung nach Rezeptoraktivierung beitragen. Es ist somit gelungen, ein in-vitro-Modell zur Messung von Protein-Protein-Wechselwirkungen am IL-4 Rezeptor zu etablieren, welches für weitere Untersuchungen eingesetzt werden kann. N2 - Two intracellular parts of the interleukin-4-receptor were expressed as GST-fusion-proteins. GST-E1, which comprises the cytoplasmic membrane-proximal 1/3 of IL-4Ralpha (173 AS) including the box1-motif fused to GST, could be purified electrophoretically clean after differential denaturation and renaturation and specific binding to Glutathion-Sepharose Matrix. GSTgammainP5D4, which comprises the intracellular domain of gamma c fused to GST, could only be purified as a heterogenous mixture with 4 C-terminally truncated proteins. Immunoprecipitation experiments were performed in lysates of IL-4R transfected Ba/F3 cells before and after stimulation with IL-4. For GST-E1, an interaction with Jak1 was shown, reflecting the current state of knowledge; however, an interaction with Jak3 could not be shown for GSTgamma in P5D4. Both proteins are able tp precipitate STAT5; this binding appears independet of IL-4 stimulation of the cells and allows for new speculations on the signal transduction mechanism by STAT5. According to the information gained in this work, both IL-4-receptor chains could contribute one STAT5 molecule to STAT5 dimerisation after receptor activation. Therefore, the goal was achieved to establish an in-vitro-model for the detection of protein-protein interactions on the interleukin-4-receptor, which can be used for further investigations. KW - Interleukin-4 KW - Rezeptor KW - Signaltransduktion KW - GST-Fusionsprotein KW - Jak/ STAT KW - Interleukin-4 KW - receptor KW - signal transduction KW - GST fusion protein KW - Jak/ STAT Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5338 ER - TY - THES A1 - Brede, Marc T1 - Kardiovaskuläre Phänotypisierung von Angiotensin II AT2-Rezeptor- und adrenergen Rezeptor-"Knockout"-Mäusen T1 - Cardiovascular characterization of Angiotensin II AT2-receptor- and adrenergic receptor-knockout-mice N2 - Die Deletion des AT2-Rezeptors (AT2-KO) führt zu erhöhter Blutdruckempfindlichkeit und vaskulärer Hypertrophie durch Aktivitätszunahhme der P70S6-Kinase. Die Vasodilatation von Blutgefäßen wird maßgeblich durch beta1-adrenerge Rezeptoren vermittelt. Die Deletion von alpha2-adrenergen Rezeptoren (alpha2-KO) führt zur Entwicklung einer Herzinsuffizienz nach Aortenstenose. Der Mortalitätanstieg ist mit erhöhten Plasmanoradrenalin-Spiegeln (a2A-KO), bzw. Plasmaadrenalin-Spiegeln (a2C-KO) assoziiert. N2 - The deletion of AT2-receptors causes increased blood-pressure sensitivity and vascular hypertrophy by increased P70S6-Kinase activity. Vasodilation is mainly mediated by beta1-adrenoceptors. The deletion of alpha2-adrenoceptors leads to heart failure after aortic banding. The increased mortality is associated with elevated plasma levels of norepinephrine (a2A-KO) or epinephrine (a2C-KO). KW - transgen KW - Maus KW - Angiotensin KW - Rezeptor KW - adrenerg KW - Katecholamine KW - Blutgefäß KW - Hypertrophie KW - Herzinsuffizienz KW - Nebenniere KW - Angiotensin KW - receptor KW - adrenergic KW - catecholamines KW - vessel KW - hypertrophy KW - heart failure KW - adrenal gland Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1179726 ER - TY - THES A1 - Große-Wilde, Anne T1 - Klonierung, molekulare Charakterisierung und konditionale Inaktivierung eines murinen Todesrezeptors für TRAIL (mTRAIL-R) T1 - Cloning, molecular characterization and konditional inactivation of a murine death receptor for TRAIL (mTRAIL-R) N2 - TRAIL/APO-2L (Tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand) ist ein Apoptose-induzierendes Mitglied der TNF-Superfamilie (TNF-SF). Bislang sind zwei humane TRAIL-Todesrezeptoren, TRAIL-R1 und TRAIL-R2, bekannt, die zur TNF-Rezeptor-Superfamilie gehören. TRAIL induziert Apoptose in einer Vielzahl von Tumorzelllinien, wohingegen die meisten primären Zellen resistent gegenüber TRAIL sind. In präklinischen Studien mit Mäusen und nichthumanen Primaten wurde keine systemische Toxizität von TRAIL nachgewiesen. Diese Beobachtungen haben beträchtliches Interesse an dem Einsatz von TRAIL zur Tumortherapie geweckt. Über die physiologische Rolle von TRAIL ist jedoch noch wenig bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war, Werkzeuge zum Studium des Apoptose-induzierenden TRAIL-Systems in Mäusen zu etablieren. Zunächst mussten das oder die murinen Homologe der beiden Apoptose-induzierenden TRAIL-Rezeptoren identifiziert werden. Dazu wurden murine TRAIL-bindende Proteine biochemisch über 2D-Gelanalysen identifiziert. Anhand einer Sequenzinformation aus einer Datenbank wurde ein muriner TRAIL-Rezeptor kloniert, der aufgrund seines biochemisch bestimmten Molekulargewichts p54_mTRAIL-R genannt wurde. Der Sequenzvergleich sowie die Funktionsanalyse von p54_mTRAIL-R ergab, dass dieser Rezeptor das funktionelle murine Homolog zu den humanen TRAIL-Todesrezeptoren TRAIL-R1 und TRAIL-R2 ist. So war p54_mTRAIL-R ebenfalls in der Lage, nach Überexpression Caspase-abhängig Apoptose zu induzieren. Wie die Transkripte der humanen TRAIL-Todesrezeptoren wurden die Transkripte von p54_mTRAIL-R in allen untersuchten Geweben detektiert. Es wurde ein lösliches p54_mTRAIL-R:Fc-Fusionsprotein hergestellt, welches zur TRAIL-Inaktivierung in vivo und in vitro verwendet werden kann. Um die physiologische Rolle des p54_mTRAIL-Rs in vivo studieren zu können, sollten mTRAIL-R-defiziente Mäuse generiert werden. Zur Modifikation des für p54_mTRAIL-R kodierenden tar-Locus wurde das Gen kloniert und charakterisiert. Um eine durch die Gendefizienz hervorgerufene eventuelle Letalität oder sekundäre kompensierende Effekte zu vermeiden, wurden mit Hilfe des Cre/loxP-Systems und des Flp/FRT-Systems konditionale p54_mTRAIL-R defiziente Mäuse hergestellt. Die Werkzeuge, die in dieser Arbeit generiert wurden, wie lösliches p54_mTRAIL-R:Fc Fusionsprotein und konditionale p54_mTRAIL-R defiziente Mäuse, können nun in vivo für die Erforschung der physiologischen Rolle des TRAIL-Systems sowie seines Potentials und dessen Grenzen bei der Tumortherapie benutzt werden. N2 - TRAIL/APO-2L (Tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand) is an apoptosis-inducing member of the tumor necrosis factor superfamily (TNF-SF). Currently two human death receptors, namely TRAIL-R1 and TRAIL-2, belonging to the TNF receptor superfamily (TNFR-SF) are known to bind TRAIL. Interestingly, TRAIL has been shown to induce apoptosis in a variety of tumor cell lines whereas most primary cells were resistant. In addition, preclinical studies with mice and nonhuman primates have indicated that TRAIL does not induce substantial systemic toxicity. These observations have raised considerable interest in the use of TRAIL in tumor therapy. Yet little is known about the physiological function of TRAIL. In order to examine the physiological function of TRAIL in vivo, the aim of this work was to establish tools to study the apoptosis-inducing TRAIL system in mice. First the murine homologue/s of the two death-inducing TRAIL receptors needed to be identified. Therefore the first aim was to biochemically identify murine TRAIL-binding proteins via 2D-gel analysis. With the help of the information from an EST sequence contained in a public database a murine TRAIL receptor was cloned, which was termed p54_mTRAIL-R due to its molecular weight as determined by biochemical analysis. Sequence comparison and functional analysis of p54_mTRAIL-R revealed that mTRAIL-R is homologous to both human TRAIL death receptors. Like its human counterparts p54_mTRAIL-R was capable of inducing apoptosis in a caspase-dependent fashion upon overexpression. As transcripts of the human TRAIL death receptors, also transcripts of p54_mTRAIL-R could be detected in all tissues examined. A soluble p54_mTRAIL-R:Fc-protein was generated, which could be used to block TRAIL-induced apoptosis in vitro and in vivo. To be able to study the physiological role of the p54_mTRAIL-R in vivo TRAIL-R deficient mice were generated. For modification of the tar-locus coding for p54_mTRAIL the gene was cloned and characterized. In order to avoid lethality or secondary complementing effects the Cre/loxP system and Flp/FRT system was used to generate conditional p54_mTRAIL-R deficient mice. The tools generated in this work as soluble p54_mTRAIL-R:Fc fusion protein and conditional p54_mTRAIL-R deficient mice can now be used in vivo to deduce the physiological role of the TRAIL system and to determine its potential and limitations for cancer therapy. KW - Maus KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Apoptosis KW - TRAIL KW - Rezeptor KW - Apoptose KW - Klonierung KW - 2D-Gel-Analyse KW - konditionale Knockout-Maus KW - TRAIL KW - receptor KW - apoptosis KW - cloning KW - 2D gel analysis KW - conditional knockout mouse Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-559 ER -