TY - THES A1 - Rasheed, Huma T1 - Development of simple and cost-effective High Performance Liquid Chromatography methods for quality control of essential beta-lactam antibiotics in low- and middle-income countries T1 - Entwicklung einfacher und kosteneffektiver Hochleistungs-Flüssigchromatographie(HPLC)-Methoden für die Qualitätskontrolle für Betalaktam-Antibiotika in Entwicklungs- und Schwellenländern N2 - Assay and impurity profiling of the pharmaceuticals are the key routine quality control methods employed worldwide for which High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is the most widely used technique. The ability to carry out these routine laboratory procedures in low- and middle- income countries (LMICs) need the methods to be based upon simple instruments manageable with moderate levels of personnel skill and costs involved. Simple, convenient, and cost effective reverse phase HPLC methods were developed using phosphate buffer and methanol as mobile phase with C18 column as stationary phase for the impurity profiling and assay of beta lactam antibiotics. Isocratic elution and UV detection was employed in these methods. Impurity profiling method was developed for coamoxiclav tablets and ceftriaxone bulk drug. The method for ceftriaxone included a supplementary method to quantify one of its known impurity (Impurity D of ceftriaxone). This method involved use of acetonitrile where as the two main methods were achieved on the targeted method design, described above. With the exception of impurity A of ceftriaxone, the methods developed can successfully quantify impurities to the concentration as low as ≤0.05%, which is in accordance with the current guidelines for the impurity profiling of antibiotics issued by European Medicines Agency. As ensuring cost reduction was one of the key objectives of carrying out the method development exercise, in situ methods for the preparation of impurities were also identified and some new methods were introduced. The stability of beta lactam antibiotics and the choice of solvent were given due attention during the process of method development revealing information on the presence of new impurities. Deacetyl cefotaxime and 2-mercaptobenzathiazole were identified in this process as new impurities of ceftriaxone currently not listed under known impurities by United States Pharmacopoeia and European Pharmacopoeia. However, deacetyl cefotaxime is a known impurity of cefotaxime whereas the latter molecule is a degradation product of one of the synthesis impurities of ceftriaxone. This substance is reported to be carcinogenic and is resolved using the supplementary method developed for ceftriaxone, hence making its detection and quantification possible. A known inactive impurity of ceftriaxone (Impurity A, E-isomer of ceftriaxone) was` also shown to be produced by exposure to day light, thus warranting the light protection of the ceftriaxone solution, an information that is of critical importance in the clinical settings. A series of experimentation was carried out on the finished products of beta lactam antibiotics sampled from Pakistan and few other countries, to identify key quality issues in the samples. Though the limited sample size and convenient sampling did not provide results that could yield a decisive figure for the country status for prevalence of substandard and falsified medical products, but the experiments have clearly indicated that the problems in drug quality do exist and beta lactam antibiotics form a class of high-risk medicine with respect to surveillance for poor-quality medicines. Isolation of unknown impurities was also carried out along with the introduction of new and modified methods for preparation of impurities of beta-lactam antibiotics. In addition, detailed literature survey was carried out for understanding the complex problem of the poor-quality medicine, impact of poor quality antimicrobials on health care system and the magnitude of the problem at the global level. The country status of Pakistan regarding quality of medicines was recorded based upon the available documentary evidence. The current technologies and strategic options available for low- and middle-income countries in aiding fight for combating poor quality medicines was also laid down to design recommendations for Pakistan. A comprehensive review of the information technology tools used for identification and control of substandard and falsified medicines was also conducted. N2 - Für die Bestimmung der Reinheit und des Gehaltes von Arzneistoffen wird weltweit maßgeblich die Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) eingesetzt. Damit die entsprechenden Methoden auch in Entwicklungs- und Schwellenländern angewendet werden können, müssen sie zur Verwendung mit sehr einfachen Messgeräten geeignet sein und von auch weniger gut ausgebildetem Personal durchgeführt werden können. Zudem sollten die Kosten möglichst niedrig sein. Für die Reinheitsanalytik sowie die Bestimmung des Gehaltes von Betalaktam-Antibiotika wurden einfache, praktische und kostengünstige chromatographische Methoden unter Verwendung von Umkehrphasen entwickelt, die als mobile Phase Gemische aus Phosphatpuffern und Methanol sowie als stationäre Phase C18-Säulen verwenden. Die Methoden sind isokratisch, die Detektion erfolgt mittels UV/Vis-Spektrometer. Für Coamoxiclav-Tabletten sowie den Arzneistoff Ceftiaxon wurden Methoden zur Reinheitsprüfung entwickelt. Für die Reinheitsprüfung von Ceftriaxon wurde eine zweite Methode benötigt, um eine der bekannten Verunreinigungen (Ceftriaxon-Verunreinigung D) zu quantifizieren. Hierbei musste Acetonitril als Bestandteil der mobilen Phase gewählt werden, wohingegen die beiden Hauptmethoden dem beschriebenen Methodendesign folgten. Außer im Falle der Ceftriaxon-Verunreinigung A können mit den Methoden Verunreinigungen bis zu einem Konzentrationslevel ≤ 0,05 % bestimmt werden, was den Vorgaben aktueller Richtlinien für die Reinheitsanalytik der Europäischen Arzneimittelbehörde entspricht. Da es ein Kernziel während der Methodenentwicklung war, die Kosten für die Analytik möglichst gering zu halten, wurden in situ-Methoden für die Gewinnung von Verunreinigungen entwickelt und einige neue eingeführt. Während des Entwicklungsprozesses wurde besonders auf die Stabilität der Antibiotika und auf die Wahl des Lösungsmittels geachtet, wobei Erkenntnisse über die Anwesenheit neuer Verunreinigungen erlangt werden konnten. Desacetylcefotaxime und 2-Mercaptobenzathiazol wurden als neue Verwandte Substanzen von Ceftriaxon identifiziert und sind derzeit nicht als bekannte Verunreinigen in der United States Pharmacopoeia sowie dem Europäischen Arzneibuch aufgeführt. Desacetylcefotaxime ist eine bekannte Verunreinigung von Cefotaxime, wohingegen das zweite Molekül ein Abbauprodukt einer der Verunreinigungen ist, die während der Synthese von Ceftriaxon entstehen können. Es ist bekannt, dass diese Substanz karzinogen ist, und sie kann mit der erweiterten zweiten Methode für Ceftriaxon erfasst und quantifiziert werden. Unter Lichteinfluss bildete sich zudem eine weitere bekannte, inaktive Verunreinigung von Ceftriaxon (Verunreinigung A, E-Isomeres von Ceftriaxon), weshalb Ceftriaxon-haltige Lösungen vor Licht geschützt aufbewahrt werden sollten. Dieses Wissen ist besonders für den klinischen Bereich relevant. An einer Reihe von Betalaktam-haltigen Fertigarzneimitteln aus Pakistan und einigen anderen Ländern wurden mehrere Qualitätsuntersuchungen angestellt. Obwohl der geringe Probenumfang und die Methoden der Probensammlung kein eindeutiges Bild darüber zeichnen konnte, ob in einem bestimmten Land Arzneimittelfälschungen besonders häufig auftreten, konnte durch die Versuche dennoch festgestellt werden, dass es Probleme bei der Arzneimittelqualität gibt und dass Betalaktam-Antibiotika eine Hochrisikogruppe darstellen, die besonders gut hinsichtlich des Vorkommens minderwertiger Arzneimittel untersucht werden muss. Zudem wurden unbekannte Verunreinigungen aus den Proben isoliert und neue sowie modifizierte Methoden entwickelt, um Verunreinigungen der untersuchten Substanzen zu gewinnen. Zudem wurde eine ausführliche Literaturrecherche durchgeführt, um das komplexe Problem minderwertiger Arzneimittel, den Einfluss minderwertiger Antibiotika auf das Gesundheitssystem sowie das globale Ausmaß des Problems zu verstehen. Für Pakistan wurde der status quo der Arzneimittelqualität aufgrund vorhandener Dokumentation ermittelt. Außerdem wurde dargelegt, inwiefern die heutigen modernen Technologien und Strategien, die für Entwicklungs- und Schwellenländern zur Verfügung stehen, zur Bekämpfung von qualitativ minderwertigen Arzneimitteln in Pakistan beitragen können. Hierzu wurde eine Übersicht aktueller, moderner digitaler Techniken angefertigt, die für die Aufdeckung und Bekämpfung von minderwertigen und gefälschten Arzneimitteln verwendet werden können. KW - Quality ccontrol KW - antibiotics KW - HPLC KW - LMICS KW - simple KW - HPLC KW - Low-income Countries KW - Qualitätskontrolle KW - Antibiotikum Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-177214 ER - TY - THES A1 - Rachid, Shwan T1 - Molecular investigation of the influence of environmental factors and subinhibitory antibiotic concentrations on the biofilm formation in Staphylococcus epidermidis T1 - Molekulare Untersuchungen zum Einfluß von Umweltfaktoren und subinhibitorischen Antibiotikakonzentrationen auf die Biofilmbildung in Staphylococcus epidermidis N2 - Biofilm production is an important step in the pathogenesis of S. epidermidis polymer-associated infections and depends on the expression of the icaADBC operon leading to the synthesis of a polysaccharide intercellular adhesin (PIA). The PIA represents a sugar polymer consisting of ß-1,6 linked N-acetyl glucosaminoglycans and mediates the intercellular adherence of the bacteria to each other and the accumulation of a multilayered biofilm. Epidemiological and experimental studies strongly suggest that PIA-production and subsequently biofilm formation contributes significantly to the virulence of specific S. epidermidis strains. This work aimed on the investigation of external factors regulating the ica expression in S. epidermidis. For this purpose, a reporter gene fusion between the ica promoter and the beta-galactosidase gene lacZ from E. coli was constructed and integrated into the chromosome of an ica positive S. epidermidis clinical isolate. The reporter gene fusion was used to investigate the influence of external factors and of sub-MICs of different antibiotics on the ica expression. It was shown that the S. epidermidis biofilm formation is growth phase dependent with a maximum expression in the late logarithmic and early stationary growth phase. The optimal expression was recorded at 42 °C at a neutral pH ranging from 7.0 to 7.5. The glucose content of the medium was found to be essential for biofilm formation, since concentrations of 1.5 to 2 per cent glucose induced the ica expression. In addition, external stress factors as high osmolarity (mediated by 3 to 5 per cent sodium chloride), and sub-lethal concentrations of detergents, ethanol, hydrogene peroxide, and urea significantly enhanced the biofilm production. Subinhibitory concentrations of tetracyline, the semisynthetic streptogramin quinupristin/dalfopristin and the streptogramin growth promoter virginiamycin were found to enhance the ica expression 8 to 11-fold, respectively, whereas penicillin, oxacillin, gentamicin, clindamycin, vancomycin, teicoplanin, ofloxacin, and chloramphenicol had no effects. A weak induction was recorded for sub-MICs of erythromycin. Both quinupristin/ dalfopristin and tetracyline exhibited a strong postexposure effect on the S. epidermidis ica expression, respectively, even when the substances were immediately removed from the growth medium. The results were confirmed by Northern blot analysis of the ica transcription and quantitative analysis of biofilm formation in a colorimetric assay. Expression of the icaprom::lacZ reporter gene plasmid in Bacillus subtilis and S. epidermidis revealed that the ica induction by sub-MICs of streptogramins and tetracycline might depend on unidentified regulatory elements which are specific for the staphylococcal cell. In contrast, the activation by external stress signals seems to be mediated by factors which are present both in Staphylococci and in Bacillus subtilis. Construction and analysis of an agr-mutant in a biofilm-forming S. epidermidis strain excluded the possibility that the Agr-quorum-sensing system significantly contributes to the ica expression in the stationary growth phase. However, clear evidence was provided that in S. aureus the ica transcription depends on the expression of the alternative transcription factor sigmaB, which represents a global regulator of the stress response in S. aureus as well as in B. subtilis. For this purpose, a sigB knockout mutant had been constructed in a biofilm-forming S. aureus. This mutant showed a markedly decrease of the ica transcription and biofilm-production, whereas a complement strain carrying the sigB gene on an expression vector completely restored the biofilm-forming phenotype of the S. aureus wild type. Southern blot analysis indicated that the the sigB gene is also present in S. epidermidis and Northern analyses of the sigB and the ica transcription revealed that both genes are activated under identical conditions (i. e. in the stationary growth phase and by external stress factors) suggesting a similar regulatory pathway as in S. aureus. However, since neither in S. aureus nor in S. epidermidis the ica promoter has obvious similiarities to known SigB-dependent promotoer sequences it is tempting to speculate that the ica activation is not directely mediated by SigB, but might be indirectely controlled by other SigB-dependent regulatory elements which remain to be elucidated. N2 - Die Ausbildung von Biofilmen ist ein wichtiger Schritt in der Pathogenense von Polymer-assoziierten Infektionen durch S. epidermidis. Sie hängt von der Expression des icaADBC-Operons ab, das die Syntheseenzyme für die Produktion eines extrazellulären Polysaccharids (PIA) kodiert. PIA steht für Polysaccharid-Interzelluläres-Adhäsin. Diese Substanz stellt ein beta-1,6 verknüpftes N-Acetyl-Glukosaminoglycan dar, das den Bakterien extrazellulär aufliegt, die Adhärenz der Zellen untereinander vermittelt und so die Akkumulation eines Biofilms wesentlich fördert. Epidemiologische und experimentelle Studien haben gezeigt, daß die PIA-Produktion und damit die Biofilmbildung wesentlich zur Virulenz bestimmter S. epidermidis Stämme beiträgt. Die vorliegende Arbeit zielte auf die Untersuchung äußerer Faktoren ab, die die PIA-Expression in S. epidermidis regulieren. Dazu wurde eine Genfusion zwischen dem ica-Promotor und dem beta-Galaktosidasegen aus E. coli hergestellt und stabil in das Chromosom eines ica-positiven S. epidermidis Klinikisolates integriert. Das Reportergenkonstrukt wurde benutzt, um den Einfluß verschiedener Umweltfaktoren und die Wirkung subinhibitorischer Antibiotikadosen auf die Expression des ica-Operons zu bestimmen. Es konnte gezeigt werden, daß die ica-Expression wachstumsphasenabhängig ist und ihr Maximum in der späten logarhitmischen und frühen stationären Phase erreicht. Die optimale Expressionstemperatur liegt bei 42 °C und einem neutralen pH-Wert in einem Bereich zwischen 7,0 und 7,5. Die Biofilmbildung hängt stark vom Glukosegehalt des Wachstumsmediums ab. So wurde gezeigt, daß 1,5 bis 2 Prozent im Kulturmedium die ica-Expression in der logarhitmischen Phase induzieren. Externe Stressfaktoren wie erhöhte Osmolarität durch 3 bis 5 Prozent NaCl oder sublethale Dosen von Detergenzien, Äthanol, Wasserstoffperoxid und Harnstoff begünstigen ebenfalls die ica-Expression und damit die Biofilmbildung. Subinhibitorische Dosen von Tetrazyklin, des Streptogramingemisches Quinupristin/Dalfopristin (Synercid?) sowie des Streptogramin-Leistungsförderers Virginiamycin führten zu einer Erhöhung der ica-Expression um das 8 bis 11-fache. Eine kurzzeitige Exposition der Bakterien zu hohen Konzentrationen dieser Antibiotika führte ebenfalls zu einer langanhaltenden Induktion der Biofilmexpression, auch wenn die Stoffe aus dem Wachstumsmedium sofort wieder entfernt worden waren. Andere Antibiotika wie Penicillin, Oxacillin, Gentamicin, Clindamycin, Vancomycin, Teicoplanin und Chloramphenicol zeigten keinerlei Effekt auf die ica-Expression. Eine schwache Induktion wurde dagegen für Erythromycin verzeichnet. Die Daten wurden durch Northernblotanalysen der ica–Transkription und durch einen quantitativen Biofilmassay in Polystyrol-Mikrotiterplatten bestätigt. Die Propagierung des Reportergenkonstruktes als Plasmid sowohl in einem B. subtili- Hintergrund als auch in einem ica-negativen S. epidermidis-Stamm ergab, daß die Induktion des ica-Operons durch niedrige Tetrazyklin- oder Streptograminkonzentrationen möglicherweise von spezifischen Regulatoren abhängt, die nur in Staphylokokken vorkommen. Im Gegensatz dazu ist die Induktion durch externe Sressfaktoren sowohl in B. subtilis als auch in S. epidermidis möglich. Durch die Herstellung und Untersuchung einer agr-Mutante in einem Biofilm-bildenden S. epidermidis-Stamm konnte ausgeschlossen werden, daß das Agr-Quorum-Sensing-System einen wesentlichen Einfluß auf die ica-Expression in der stationären Phase ausübt. Dagegen wurde klar gezeigt, daß die ica-Transkription in S. aureus von der Expression des alternativen Transkriptionsfaktors SigmaB abhängt, der einen globalen Regulator für die Stressantwort in Staphylokokken und in B. subtilis darstellt. Zu diesem Zweck war eine sigB-Deletionsmutante in einem Biofilm-bildenden S. aureus-Stamm hergestellt worden. Diese Mutante zeigte eine deutlich verminderte ica Transkription und Biofilmbildung. Dagegen wies die Komplementante, die das sigB-Gen auf einem Expressionsvektor trug, wieder alle Merkmale des Biofilm-bildenden S. aureus Wildtyps auf. Southernblot-Analysen zeigten, daß das sigB-Gen auch in S. epidermidis nachweisbar ist und unter denselben Bedingungen (d. h. in der stationären Phase und durch externen Stress) wie das ica Gen transkribiert wird. Das läßt vermuten, daß die Regulation des ica-Operons in S. epidermidis ähnlich abläuft wie in S. aureus und durch SigB beeinflußt wird. Da jedoch weder in S. aureus noch in S. epidermidis der ica-Promotor Ähnlichkeiten zu den bekannten SigB-abhängigen Promotor-Strukturen aufweist, ist anzunehemen, daß dieses Operon nicht direkt durch diesen alternativen Transkriptionsfaktor kontrolliert wird. Wahrscheinlich existieren noch weitere regulatorische Elemente, die hieran beteiligt sind und die noch zu identifizieren sind. KW - Staphylococcus epidermidis KW - Biofilm KW - Umweltfaktor KW - Antibiotikum KW - Staphylococcus KW - epidermidis KW - Biofilm KW - Staphylococcus KW - epidermidis KW - Biofilm Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1882 ER - TY - THES A1 - Saedtler, Marco T1 - Pharmaceutical formulation strategies for novel antibiotic substances utilizing salt formation and two- and three-dimensional printing techniques T1 - Pharmazeutische Formulierungsstrategien für neuartige, antibiotische Substanzen unter Verwendung von Salzbildung sowie zwei- und dreidimensionalen Drucktechniken N2 - Salt formation is a routinely used strategy for poorly water-soluble drugs and traditionally performed with small inorganic counterions. High energy crystal lattices as well as effects on the local pH within the aqueous boundary layer during dissolution drive the increased dissolution rate and apparent solubility. Ionic liquids however, by definition low melting ionic salts with often large organic counterions, combine an increased dissolution rate with solubilization of the drug by the counterion itself. Long lasting supersaturation profiles of increased kinetic solubility were reported for several drugs formulated as ionic liquids increasing their overall bioavailability. Furthermore, aggregation and micellization between highly lipophilic compounds and amphiphilic bile acids was described before, demonstrating the capabilities of the human body itself to utilize solubilization of poorly water-soluble compounds. Development of novel counterions not only tailoring the desired physicochemical properties e.g. dissolution rate of the parent drug but adding – in a best-case scenario synergistic – pharmacological activity has been driven forward in the last years. However, salt formation can only be applied for ionizable i.e. acidic or basic compounds. While co-crystals can be used as a nonionized alternative, their formation is not always successful leading to an urgent need for other formulation strategies. In these lines, development of 2D and 3D printing techniques has been ongoing for the last decades and their pharmaceutical application has been demonstrated. The versatile nature and commercial availability allow a decentralized production further elaborating this technique for a highly flexible and patient-oriented supply with medication. This thesis focuses on the theoretical background and potential application of salt formation in the pharmaceutical development of a drug candidate. The first section presents the current knowledge and state of the art in preparation of low melting ionic liquids i.e. salts and is translated to the in vitro investigation of molecular interaction between the poorly water-soluble drug imatinib and components of the human intestinal fluid in the second section. Development of novel antibiotic counterions and assessment of their potential use in pharmaceutical formulations with fluoroquinolones is described in the last two sections. Chapter I describes the application of low melting ionic liquids in pharmaceutical formulation and details their development in the last two decades from versatile organic solvents in chemical synthesis towards amorphous strategies for drug delivery. The chapter gives a general overview on molecular structure and physicochemical properties of several drug containing ionic liquids and details the mechanisms which attribute to a typically fast dissolution, increased aqueous solubility as well as enhanced permeation which was reported in several publications. Chapter II translates the increased aqueous solubility of drugs by an organic counterion to the human gastrointestinal tract with taurocholate and lecithin as main drivers for the solubilization of highly lipophilic and poorly water-soluble drugs. Investigation of the interaction of imatinib – a poorly water-soluble weak base – with fasted- and fed state simulated intestinal fluids revealed a complex interplay between the components of the intestinal fluid and the drug. Mixed vesicles and micelles were observed in concentration dependent aggregation assays and revealed differences in their size, molecular arrangement as well as composition, depending on the tested drug concentration. Overall, the study outlines the effective interaction of weakly basic drugs with taurocholate and lecithin to minimize recrystallization during intestine passage finally leading to favorable supersaturation profiles. Chapter III focuses on the development of novel antibiotic counterions which potentially move the evolution of ionic liquids from a pharmaceutical salt with tailored physicochemical properties to a synergistic combination of two active pharmaceutical ingredients. The natural occurring anacardic acid derived from the cashew nut shell inspired a series of antibacterial active acidic compounds with increasing alkyl chain length. Their physicochemical properties, antibacterial activity, bacterial biofilm inhibition and cytotoxicity were detailed and in vivo activity in a Galleria mellonella model was assessed. This group of anacardic acid derivatives is synthetically accessible, easily modifiable and yielded two compounds with favorable activity and physicochemical profile for further drug development. Chapter IV outlines the potential application of anacardic acid derivatives in pharmaceutical formulations by salt formation with fluoroquinolone antibiotics as well as novel techniques such as 2D/3D printing for preparation of drug imprinted products. Despite anacardic acid derivatives demonstrated promising physicochemical properties, salt formation with fluoroquinolone antibiotics was not feasible. However, 2D/3D printed samples with anacardic acid derivative alone or in combination with ciprofloxacin demonstrated physical compatibility between drug and matrix as well as antibacterial activity against three S. aureus strains in an agar diffusion assay. Conclusively, drug printing can be applied for the herein tested compounds, but further process development is necessary. In summary, preparation of low melting ionic liquids, salts or co-crystals is an appropriate strategy to increase the aqueous solubility of poorly water-soluble drugs and tailor physicochemical properties. The counterion itself solubilizes the drug and furthermore potentially interferes with the complex micellar environment in the human intestine. However, salt formation as routinely used formulation strategy is not feasible in every case and development of alternative techniques is crucial to hurdle challenges related to unfavorable physicochemical properties. The outlined techniques for 2D/3D drug printing provide versatile production of drug products while extending the design space for novel drug development. N2 - Die Salzbildung mit pharmazeutischen Wirkstoffen – als routinemäßig durchgeführte Strategie für schlecht wasserlösliche Substanzen – wird traditionell mit kleinen, anorganischen Gegenionen durchgeführt. Eine tragende Rolle spielen hierbei ein hochenergetisches Kristallgitter sowie die Beeinflussung des pH-Wertes in der ruhenden Grenzschicht während des Auflösungsprozesses. Diese treiben eine beschleunigte Auflösungsrate sowie eine Erhöhung der scheinbaren Löslichkeit an. Ionische Flüssigkeiten stellen per Definition niederschmelzende ionische Salze mit oftmals großen, organischen Gegenionen dar. Sie kombinieren, aufgrund ihrer hohen Gitterenergie, eine beschleunigte Auflösungsratemit der Solubilisierung des Wirkstoffs durch das Gegenion. Langanhaltende Übersättigungen mit erhöhter kinetischer Löslichkeit und eine damit einhergehende, verbesserte Bioverfügbarkeit, wurden bereits bei verschiedenen Wirkstoffen beobachtet, die als ionische Flüssigkeiten formuliert wurden. Auch der menschliche Körper nutzt diesen Effekt und solubilisiert schlecht wasserlösliche Substanzen durch Aggregation und Mizellisierung lipophiler Substanzen mit amphiphilen Gallensäuren. Die Entwicklung neuartiger – meist kationischer – Gegenionen wurde in den letzten Jahren vorangetrieben. Vor allem Gegenionen, die nicht nur die gewünschten physikochemischen Eigenschaften (z.B. Auflösungsrate) hervorbringen, sondern einen eigenen – im besten Fall synergistischen – pharmakologischen Effekt aufweisen. Jedoch kommt eine Salzbildung nur für ionisierbare Substanzen respektive Säuren und Basen in Frage. Während Co-Kristalle als Alternative für nicht-ionisierbare Substanzen dienen können, ist deren Herstellung nicht immer erfolgreich und neue Formulierungsstrategien werden notwendig. Deshalb wurde unter anderem die Entwicklung von 2D- und 3D-Druckverfahren in den letzten Jahrzehnten vorangetrieben und deren Relevanz für pharmazeutische Fragestellungen aufgezeigt. Die vielseitige Natur und kommerzielle Verfügbarkeit des 2D/3D-Drucks erlaubt eine dezentrale Produktion und ermöglicht eine flexible und patientenorienterte Medikamentenversorgung. Diese Dissertation beschäftigt sich vorrangig mit den theoretischen Hintergründen und den praktischen Anwendungsmöglichkeiten der Salzbildung in der pharmazeutischen Entwicklung eines potenziellen Wirkstoffes. Das erste Kapitel präsentiert den gegenwärtigen Stand der Technik zur Verwendung von niederschmelzenden ionischen Flüssigkeiten. Diese Erkenntnisse werden im Anschluss auf eine Untersuchung der Interaktionen des schlecht wasserlöslichen Wirkstoffs Imatinib und den Bestandteilen der menschlichen Verdauungssäfte übertragen. Die Entwicklung neuartiger, antibiotisch wirksamer Gegenionen und deren potenzielle Verwendung in pharmazeutischen Formulierungen mit Fluorchinolonen ist Gegenstand der letzten zwei Kapitel. Kapitel I beschreibt niederschmelzende ionische Flüssigkeiten in pharmazeutischen Formulierungen und führt deren Entwicklung in den letzten drei Jahrzehnten aus: Vom vielfältig anwendbaren, organischen Lösemittel für die chemische Synthese hin zur amorphen Darreichungsform. Das Kapitel gibt einen Überblick über die molekularen Strukturen und physikochemischen Eigenschaften verschiedener wirkstoffbeinhaltender, ionischer Flüssigkeiten. Hierbei werden die zugrundeliegenden Mechanismen dargelegt, was im Besonderen die rasche Auflösung, eine erhöhte Löslichkeit in wässrigen Medien sowie eine Beeinflussung der Permeation meint. Kapitel II überträgt die Beobachtung einer erhöhten Löslichkeit in Gegenwart eines organischen Gegenions auf den menschlichen Verdauungstrakt, in dem Taurocholat und Lecithin hauptverantworlich für die Solubilisierung von liphilen und schlecht wasserlöslichen Substanzen sind. Untersuchungen der Interaktion von Imatinib, einer schlecht wasserlöslichen, schwachen Base, mit simulierten, intestinalen Flüssigkeiten zeigten ein komplexes System aus Bestandteilen der intestinalen Flüssigkeit und dem Wirkstoff. Gemische aus Vesikel und Mizellen, die mithilfeeines Aggregationsassays untersucht wurden, zeigten, in Abhängigkeit von momentanen Wirkstoffkonzentrationen, Unterschiede in ihrer Größe sowie der molekularen Anordnung und Zusammensetzung. Zusammenfassend beschreibt dieses Kapitel die effektive Interaktion von schwachen Basen mit Taurocholat und Lecithin sowie eine Möglichkeit zur Minimierung von Rekristallisation und damit der Aufrechterhaltung von übersättigten Zuständen während der Wirkstoff den Verdauungstrakt passiert. Kapitel III befasst sich mit der Entwicklung neuartiger antibiotischer Gegenionen. Diese treiben möglicherweise die Weiterentwicklung von ionischen Flüssigkeiten mit optimierten physikochemischen Eigenschaften zu synergistischen Kombinationen aus zwei pharmakologisch aktiven Substanzen voran. Die natürlich vorkommende Anacardsäure, welche sich aus der Schale der Cashewnuss gewinnen lässt, hat eine Reihe von antibakteriellen, sauren Substanzen inspiriert, die sich allein in der Länge ihrer Alkylkette unterschieden. Physikochemische Eigenschaften, antibakterielle Aktivität, Inhibition des bakteriellen Biofilms sowie Zytotoxizität wurden untersucht und anschließend in vivo mittels Galleria mellonella-Modell beleuchtet. Diese Gruppe aus Anacardsäurederivaten ist synthetisch zugänglich, einfach chemisch modifizierbar und brachte zwei Substanzen mit vorteilhafter Aktivität und physikochemischen Eigenschaften zur weiteren Entwicklung hervor. Kapitel IV beschreibt die potenzielle Anwendung der Anacardsäurederivate in pharmazeutischen Formulierungen. Durch Salzbildung mit Fluorchinolon-Antibiotika sowie Nutzung neuerer Techniken, wie dem 2D/3D-Druck, wurden wirkstoffbedruckte Darreichungsformen hergestellt. Obwohl die Anacardsäurederivate vielversprechende physikochemische Eigenschaften zeigten, eigneten sie sich nicht für eine Salzbildung mit Fluorchinolonen. Trotzdem war es möglich Anacardsäurederivate allein oder in Kombination mit Ciprofloxacin auf Oberflächen zu drucken, wobei keine physische Inkompatibilität zwischen Wirkstoff und Matrix erkennbar war jedoch eine antibakterielle Wirkung gegen drei S. aureus Stämme gezeigt werden konnte. Abschließend stellte sich der Druck von Wirkstoffen, mit den untersuchten Techniken, als machbar heraus, wobei eine Weiterentwicklung des Prozesses sicherlich notwendig ist. Zusammenfassend stellt die Herstellung von niederschmelzenden, ionischen Flüssigkeiten, Salzen oder Co-Kristallen eine geeignete Strategie dar, die Löslichkeit schlecht wasserlöslicher Substanzen zu verbessern und deren physikochemische Eigenschaften zu optimieren. Das Gegenion kann dabei dazu beitragen den Wirkstoff zu solubilisieren, wobei es sehr wahrscheinlich ist, dass er auch mit dem komplexen mizellaren System des menschlichen Verdauungstrakts interagiert. Trotzdem ist eine routinemäßige Salzbildung nicht in allen Fällen zielführend und alternative Technologien müssen entwickelt werden, um die Herrausforderungen mit unvorteilhaften physikochemischen Eigenschaften zu meistern. Die beschriebenen 2D/3D-Druckverfahren bieten hierbei eine Produktion variabler und vielfältiger Darreichungsformen und erweitern den Gestaltungsraum für neuartige Wirkstoffentwicklungen. KW - Löslichkeit KW - Solubilisation KW - Antibiotikum KW - Formulierung KW - Anacardic acid derivatives KW - Formulation development KW - Anacardsäurederivate KW - Formulierungsentwicklung Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-219784 ER - TY - THES A1 - Scheuplein, Nicolas Julian T1 - Synthesis and Characterization of Antimicrobial Inhibitors of the "Macrophage Infectivity Potentiator" Protein and Fluorescent Probes T1 - Synthese und Charakterisierung von antimikrobiellen Inhibitoren des "Macrophage Infectivity Potentiator"-Proteins und fluoreszierenden Sonden N2 - This dissertation focuses on Mip (macrophage infectivity potentiator protein) inhibitors in response to increasing antibiotic resistance. The study follows an antivirulence approach, which aims to inhibit the non-essential Mip protein without exerting too much selective pressure. Three focus areas were (1) development and synthesis of a fluorescent probe for screening Mip inhibitors via fluorescence polarization; (2) design and synthesis of broad spectrum Mip inhibitors bearing a side chain; and (3) understanding the metabolism of Mip inhibitors and identification of active metabolites. A sub-study addressed the biotinylation of anti-leishmanial compounds from Valeriana wallichii rhizomes, with three tracer molecules synthesized for future pull-down experiments. N2 - Diese Dissertation befasst sich mit Mip-Inhibitoren (macrophage infectivity potentiator protein) als Reaktion auf zunehmende Antibiotikaresistenzen. Die Studie verfolgt einen Antivirulenz-Ansatz, der darauf abzielt, das nicht-essentielle Mip-Protein zu hemmen, ohne einen zu großen Selektionsdruck auszuüben. Drei Schwerpunkte waren (1) die Entwicklung und Synthese einer Fluoreszenzsonde für das Screening von Mip-Inhibitoren mittels Fluoreszenzpolarisation; (2) die Entwicklung und Synthese von Mip-Inhibitoren mit breitem Spektrum, welche eine Seitenkette tragen; und (3) das Verständnis des Metabolismus von Mip-Inhibitoren und die Identifizierung von aktiven Metaboliten. Eine Teilstudie befasste sich mit der Biotinylierung von Anti-Leishmanien-Verbindungen aus den Rhizomen von Valeriana wallichii, wobei drei Tracermoleküle für künftige Pull-down-Experimente synthetisiert wurden. KW - Antibiotikum KW - Antimikrobieller Wirkstoff KW - Struktur-Aktivitäts-Beziehung KW - Mip KW - Mip Inhibitoren KW - Fluoreszenzpolarisation Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-321892 ER - TY - THES A1 - von Rüden, Martin Frederik T1 - The Venus flytrap - Role of oxylipins in trap performance of Dionaea muscipula T1 - Die Venus Fliegenfalle – Die Rolle von Oxilipinen im Fallenverhalten von Dionaea muscipula N2 - A part of the plant kingdom consists of a variety of carnivorous plants. Some trap their prey using sticky leaves, others have pitfall traps where prey cannot escape once it has fallen inside. A rare trap type is the snap-trap: it appears only twice in the plant kingdom, in the genera Aldrovanda and Dionaea. Even Charles Darwin himself described Dionaea muscipula, the Venus flytrap, with the following words “This plant, commonly called Venus' fly-trap, from the rapidity and force of its movements, is one of the most wonderful in the world”. For a long time now, the mechanisms of Dionaea’s prey recognition, capture and utilization are of interest for scientists and have been studied intensively. Dionaea presents itself with traps wide-open, ready to catch insects upon contact. For this, the insect has to touch the trigger hairs of the opened trap twice within about 20-30 seconds. Once the prey is trapped, the trap lobes close tight, forming a hermetically sealed “green stomach”. Until lately, there was only limited knowledge about the molecular and hormonal mechanisms which lead to prey capture and excretion of digestive fluids. It is known that the digestion process is very water-consuming; therefore, the interplay of digestion-inducing and digestion inhibiting substances was to be analyzed in this work, to elucidate the fine-tuning of the digestive pathway. Special attention was given to the impact of phytohormones on mRNA transcript levels of digestion-related proteins after various stimuli as well as their effect on Dionaea’s physiological responses. Jasmonic acid (JA) and its isoleucine-conjugated form, JA-Ile, are an important signal in the jasmonate pathway. In the majority of non-carnivorous plants, jasmonates are critical for the defense against herbivory and pathogens. In Dionaea, this defense mechanism has been restructured towards offensive prey catching. One question in this work was how the frequency of trigger hair bendings is related to the formation of jasmonates and the induction of the digestion process. Upon contact of a prey with the trigger hairs in the inside of the trap, the trap closes and jasmonates are produced biosynthetically. JA-Ile interacts with the COI1- receptor, thereby activating the digestion pathway which leads to the secretion of digestive fluid and production of transporters needed to take up prey-derived nutrients. In this work it could be shown that the number of trigger hair bendings is positively correlated with the level and duration of transcriptional induction of several digestive enzymes/hydrolases. Abscisic acid (ABA) acts, along with many other functions, as the plant “drought stress hormone”. It is synthesized either by roots as the primary sensor for water shortage or by guard cells in the leaves. ABA affects a network of several thousand genes whose regulation prepares the plant for drought and initiates protective measurements. It was known from previous work that the application of ABA for 48 hours increased the required amount of trigger hair bendings to achieve trap closure. As the digestion process is very water-intensive, the question arose how exactly the interplay between the jasmonate- and the ABA-pathway is organized, and if ABA could stop the running digestion process once it had been activated. In the present work it could be shown that the application of ABA on intact traps prior to mechanically stimulating the trigger hairs (mechanostimulation) already significantly reduced the transcription of digestive enzymes for an incubation time as short as 4 h, showing that already short-term exposure to ABA counteracts the effects of jasmonates when it comes to initiating the digestion process, but does not inhibit trap closure. Incubation for 24 and 48 hours with 100 μM active ABA had no effect on trap reopening, only very high levels of 200 μM of active ABA inhibited trap reopening but also led to tissue necrosis. As the application of ABA could reduce the transcription of digestive hydrolases, it is likely that Dionaea can stop the digestion process, if corresponding external stimuli are received. Another factor, which only emerged later, was the effect of the wounding-induced systemic jasmonate burst. As efficient as ABA was in inhibiting marker hydrolase expression after mechanostimulation in intact plants, the application of ABA on truncated traps was not able to inhibit mechanostimulation-induced marker hydrolase expression. One reason might be that the ABA-signal is perceived in the roots, and therefore truncated traps were not able to react to it. Another reason might be that the wounding desensitized the tissue for the ABAsignal. Further research is required at this point. Inhibitors of the jasmonate pathway were also used to assess their effect on the regulation of Dionaea´s hunting cycle. Coronatine-O-methyloxime proved to be a potent inhibitor of mechanostimulation-induced expression of digestive enzymes, thus confirming the key regulatory role of jasmonates for Dionaea´s prey consumption mechanism. In a parallel project, the generation of in vitro cultures from sterilized seeds and single plant parts proved successful, which may be important for stock-keeping of future transgenic lines. Protoplasts were generated from leaf blade tissue and transiently transformed, expressing the reporter protein YFP after 24 h of incubation. In the future this might be the starting point for the generation of transgenic lines or the functional testing of DNA constructs. N2 - Ein Teil des Pflanzenreiches besteht aus einer Vielfalt fleischfressender Pflanzen. Einige fangen ihre Beute mit klebrigen Blättern, andere haben Grubenfallen, aus denen die Beute nicht mehr entkommen kann, wenn sie erst einmal hineingefallen ist. Ein seltener Fallentyp ist die Klappfalle: Sie kommt im Pflanzenreich nur zweimal vor, in den Gattungen Aldrovanda und Dionaea. Charles Darwin selbst beschrieb Dionaea muscipula, die Venusfliegenfalle, als "eine der schönsten Pflanzen der Welt". Die Mechanismen der Erkennung, des Fangs und der Nutzbarmachung von Beutetieren durch Dionaea sind seit langem von Interesse für die Wissenschaft und wurden intensiv untersucht. Dionaea hat weit geöffnete Fallen, die bei Kontakt Insekten fangen können. Dazu muss das Insekt innerhalb von ca. 20-30 Sekunden zweimal die Triggerhaare der geöffneten Falle berühren. Sobald die Beute gefangen ist, schließen sich die Fallenhälften fest und bilden einen hermetisch verschlossenen sogenannten „grünen Magen“. Bis vor einigen Jahren gab es nur wenige Informationen über die molekularen und hormonellen Mechanismen, die zu Beutefang und Sekretion von Verdauungsflüssigkeiten führen. Es ist bekannt, dass der Verdauungsprozess sehr viel Wasser verbraucht; daher sollte in dieser Arbeit das Zusammenspiel von verdauungsauslösenden und verdauungshemmenden Substanzen untersucht werden, um die Feinabstimmung des Verdauungsweges aufzuklären. Ein besonderes Augenmerk wurde auf den Einfluss von Phytohormonen auf die mRNATranskriptzahlen von Verdauungsproteinen nach verschiedenen Stimuli sowie auf deren Auswirkungen auf die physiologischen Reaktionen von Dionaea gelegt. Jasmonsäure (JA) und ihre mit Isoleucin konjugierte Form, JA-Ile, sind ein wichtiges Signal in pflanzlichen Signaltransduktionsprozessen. In der Mehrzahl der nicht-karnivoren Pflanzen sind Jasmonate entscheidend für die Abwehr von Herbivoren und Pathogenen. In Dionaea wurde dieser Abwehrmechanismus für den offensiven Beutefang umstrukturiert. Eine Frage in dieser Arbeit war also, wie die Häufigkeit der Triggerhaarberührungen mit der Bildung von Jasmonaten und dem Verdauungsvorgang miteinander in Verbindung steht. Beim Kontakt von Beute mit den Triggerhaaren im Inneren der Falle schließt sich diese, und es werden durch Biosynthese Jasmonate gebildet. JA-Ile interagiert mit dem COI1-Rezeptor und aktiviert so den Verdauungsweg, der zur Sekretion von Verdauungsflüssigkeit und zur Produktion von Transportern führt, welche zur Aufnahme von aus Beute gewonnenen Nährstoffen benötigt werden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Anzahl der Triggerhaarberührungen positiv mit der Höhe und der Dauer der Transkriptionsinduktion mehrerer Verdauungsenzyme bzw. Verdauungshydrolasen korreliert. Abscisinsäure (ABA) fungiert neben vielen anderen Funktionen als pflanzliches „Trockenstresshormon“. Es wird entweder von Wurzeln als primärem Sensor für Wassermangel oder von Schließzellen in den Blättern synthetisiert. ABA beeinflusst ein Netzwerk von mehreren tausend Genen, deren Regulation die Pflanze auf Dürre vorbereitet und entsprechende Schutzmaßnahmen einleitet. Aus früheren Arbeiten war bekannt, dass die 48-stündige Inkubation einer Dionaea-Falle mit ABA die erforderliche Anzahl an Triggerhaarberührungen erhöhte, die für einen Fallenschluss notwendig sind. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass das Aufbringen von ABA auf intakte Fallen vor der mechanischen Stimulierung der Triggerhaare (Mechanostimulation) die Expression von Verdauungsenzymen bereits bei einer Inkubationszeit von nur 4 Stunden signifikant reduzierte. Das zeigte eindeutig, dass die kurzzeitige Einwirkung von ABA bereits die Effekte von Jasmonaten blockiert, wenn es um den Beginn des Verdauungsprozesses geht, aber keinen Einfluss auf den Fallenschluss hat. Eine Inkubation für 24 und 48 Stunden mit 100 μM aktiver ABA hatte keine Auswirkung auf das Wiederöffnen der Falle, nur sehr hohe Konzentrationen von 200 μM aktiver ABA hemmten das Wiederöffnen der Falle, führten aber auch zu Gewebenekrose. Da ABA die Transkription der Verdauungsenzyme reduzieren konnte, ist es wahrscheinlich, dass Dionaea den Verdauungsvorgang stoppen kann, wenn entsprechende externe Signale empfangen werden. Ein weiterer Einflussfaktor, welcher erst später erkannt wurde, war die Auswirkung des verwundungsbedingten, sprunghaften systemischen Anstiegs der Jasmonatkonzentration auf die Wirkung von extern aufgegebenen Phytohormonen. So wirksam ABA bei der Hemmung der Markerhydrolasen-Expression nach Mechanostimulation in intakten Pflanzen war, so konnte diese Inhibition nach Anwendung von ABA auf abgeschnittenen Fallen nicht mehr beobachtet werden. Ein Grund könnte sein, dass das ABA-Signal in den Wurzeln wahrgenommen wird und daher abgeschnittene Fallen nicht darauf reagieren konnten. Ein anderer Grund könnte sein, dass die Verwundung das Gewebe für das ABA-Signal desensibilisiert hat. An dieser Stelle besteht weiterer Forschungsbedarf. Ebenfalls wurden Inhibitoren des Jasmonat-Weges verwendet, um ihre Wirkung auf die Regulation des Beutefangzyklus von Dionaea zu untersuchen. Coronatine-O-methyloxim erwies sich als wirksamer Inhibitor der durch Mechanostimulation induzierten Expression von Verdauungsenzymen und bestätigte damit die zentrale regulatorische Rolle von Jasmonaten für den Beutefangmechanismus von Dionaea. Ein parallel laufendes Projekt war die Erzeugung von in vitro-Kulturen aus sterilisiertem Saatgut und einzelnen Pflanzenteilen, das sich als sehr erfolgreich erwies, was für die Erzeugung zukünftiger transgener Linien wichtig sein kann. Ebenfalls wurden Protoplasten aus Blattgewebe erzeugt, diese wurden transient transformiert und exprimierten YFP nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden. In Zukunft könnte dies der Ausgangspunkt für die Generierung transgener Linien sein und der Funktionsüberprüfung von DNA-Konstrukten sein. KW - Venusfliegenfalle KW - Protoplast KW - Abscisinsäure KW - Jasmonsäure KW - Antibiotikum KW - Dionaea KW - Herbicid KW - Celaflor Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-273854 ER - TY - THES A1 - Hertlein, Tobias T1 - Visualization of Staphylococcus aureus infections and antibiotic therapy by bioluminescence and 19F magnetic resonance imaging with perfluorocarbon emulsions T1 - Darstellung von Staphylococcus aureus Infektionen und Antibiotikatherapie durch Biolumineszenzbildgebung und 19F-Kernspintomografie mit Perfluorcarbon-Emulsionen N2 - Staphylococcus aureus is a major threat to public health systems all over the globe. This second most cause of nosocomial infections is able to provoke a wide variety of different types of infection in humans and animals, ranging from superficial skin and skin structure infections to invasive disease like sepsis or pneumonia. But not enough, this pathogen is also notorious in acquiring and/or developing resistance to antimicrobial compounds, thus limiting available treatment options severely. Therefore, development of new compounds and strategies to fight S. aureus is of paramount importance. But since only 1 out of 5 compounds, which entered clinical trials, becomes a drug, the preclinical evaluation of promising compounds has to be reconsidered, too. The aim of this thesis was to address both sides of this problem: first, to improve preclinical testing by incorporating in vivo imaging technologies to the preclinical testing procedure in order to acquire additional and clearer data about efficacy of promising compounds and second, by evaluating lysostaphin, which is a promising, new option to fight S. aureus infections. The first aim of this thesis focused on the establishment of a dual modality in vivo imaging platform, consisting of Bioluminescence Imaging (BLI) and Magnetic Resonance Imaging (MRI), to offer detailed insights into the course and gravity of S. aureus infection in the murine thigh infection model. Since luciferase-expressing S. aureus strains were generated in former studies and enabled thus bioluminescence imaging of bacterial infection, this technology should be implemented into the compound evaluation platform in order to non-invasively track the bacterial burden over time. MRI, in contrast, was only rarely used in earlier studies to visualize and measure the course of infection or efficacy of anti-bacterial therapy. Thus, the first set of experiments was performed to identify benefits and drawbacks of visualizing S. aureus infections in the mouse model by different MR methods. Native, proton-based MR imaging showed in this regard increased T2 relaxation times in the infected thigh muscles, but it was not possible to define a clear border between infected and uninfected tissue. Iron oxide nanoparticles and perfluorocarbon emulsions, two MR contrast agents or tracer, in contrast, offered this distinction. Iron oxide particles were detected in this regard by their distortion of 1H signal in proton-based MRI, while perfluorocarbon emulsion was identified by 19F MRI. Mammals do not harbor sufficient intrinsic amounts of 19F to deliver specific signal and therefore, 19F MR imaging visualizes only the signal of administered perfluorocarbon emulsion. The in vivo accumulation of perfluorocarbon emulsion can be imaged by 19F MRI and overlayed on a simultaneously acquired 1H MR image, which shows the anatomical context in clear detail. Since this is advantageous compared to contrast agent based MR methods like iron oxide particle-based MRI, further experiments were performed with perfluorocarbon emulsions and 19F MRI. Experimental studies to elucidate the accumulation of perfluorocarbon emulsion at the site of infection showed robust 19F MR signals after administration between day 2 and at least day 8 p.i.. Perfluorocarbon emulsion accumulated in all investigated mice in the shape of a ‘hollow sphere’ at the rim of the abscess area and the signal remained stable as long as the infection prevailed. In order to identify the mechanism of accumulation, flow cytometry, cell sorting and histology studies were performed. Flow cytometry and cell sorting analysis of immune cells at the site of infection showed that neutrophils, monocytes, macrophages and dendritic cells carried contrast media at the site of infection with neutrophils accounting for the overwhelming portion of perfluorocarbon signal. In general, most of the signal was associated with immune cells, thus indicating specific immune cell dependent accumulation. Histology supported this observation since perfluorocarbon emulsion related fluorescence could only be visualized in close proximity to immune cell nuclei. After establishing and testing of 19F MRI with perfluorocarbon emulsions as infection imaging modality, the effects of antibiotic therapy upon MR signal was investigated in order to evaluate the capability of this modality for preclinical testing procedure. Thus, the efficacy of vancomycin and linezolid, two clinically highly relevant anti - S. aureus compounds, were tested in the murine thigh infection model. Both of them showed reduction of the colony forming units and bioluminescence signal, but also of perfluorocarbon emulsion accumulation strength and volume at the site of infection, which was visualized and quantified by 19F MRI. The efficacy pattern with linezolid being more efficient in clearing bacterial infection was shown similarly by all three methods. In consequence, 19F MRI with perfluorocarbon emulsion as MR tracer proved to be capable to visualize antibacterial therapy in preclinical testing models. The next step was consequently to evaluate a promising new compound against S. aureus infections. Thus, lysostaphin, an endo-peptidase that cleaves the cell wall of S. aureus, was tested in different concentrations alone or in combination with oxacillin for efficacy in murine thigh and catheter associated infection models. Lysostaphin only in the concentration of 5 mg/kg body weight or combined with oxacillin in the concentration of 2 mg/kg showed strong reduction of bacterial burden by colony forming unit determination and bioluminescence imaging in both models. The perfluorocarbon accumulation was investigated in the thigh infection model by 19F MRI and was strongly reduced in terms of volume and signal strength in both above-mentioned groups. In general, lysostaphin showed comparable or superior efficacy than vancomycin or oxacillin alone. Therefore, further development of lysostaphin for the treatment of S. aureus infections is recommended by these experiments. Overall, the antibiotic efficacy pattern of all applied antibiotic regimens was similar with all three applied methods, demonstrating the usefulness of MRI for antibiotic efficacy testing. Importantly, treatment with oxacillin either alone or in combination with lysostaphin resulted in stronger perfluorocarbon emulsion accumulation at the site of infection than expected compared to the results from bioluminescence imaging and colony forming unit determination. This might be an indication for immunomodulatory properties of oxacillin. Further murine infection experiments demonstrated in this context a differential release of cytokine and chemokines in the infected thigh muscle in dependence of the applied antibacterial therapy. Especially treatment with oxacillin, but to a less degree with minocycline or linezolid, too, exhibited high levels of various cytokines and chemokines, although they reduced the bacterial burden efficiently. In consequence, possible immunomodulatory effects of antibacterial compounds have to be taken into account for future applications of imaging platforms relying on the visualization of the immune response. However, this observation opens a new field for these imaging modalities since it might be extraordinary interesting to study the immunomodulatory effects of compounds or even bacterial factors in vivo. And finally, a two modality imaging platform which combines methods to visualize on the one hand the bacterial burden and on the other hand the immune response offers an innovative, new platform to study host-pathogen interaction in vivo in a non-invasive fashion. In summary, it could be shown that perfluorocarbon emulsions accumulate in immune cells at the site of infection in the murine S. aureus thigh infection model. The accumulation pattern shapes a ‘hollow sphere’ at the rim of the abscess area and its size and perfluorocarbon content is dependent on the severity of disease and/or efficacy of antibiotic therapy. Thus, 19F MRI with perfluorocarbon emulsions is a useful imaging modality to visualize sites and course of infection as well as to evaluate promising antibacterial drug candidates. Furthermore, since the accumulation of tracer depends on immune cells, it might be additionally interesting for studies regarding the immune response to infections, auto-immune diseases or cancer, but also to investigate the efficacy of immunomodulatory compounds and immunization. N2 - Staphylococcus aureus ist als zweithäufigste Ursache nosokomialer Infektionen eine ernste Bedrohung für Gesundheitssysteme weltweit. Dieses Pathogen ist in der Lage eine Vielzahl verschiedener Krankheitsformen, von oberflächlichen Wund- und Gewebsinfektionen bis hin zu invasiven Erkrankungen wie Bakteriämie oder Pneumonie, in Mensch und Tier zu verursachen. Zudem erwies sich dieser Krankheitserreger in der Vergangenheit als höchst anpassungsfähig durch den Erwerb oder die Entwicklung von Resistenzen gegenüber antibakterieller Substanzen, wodurch die Verfügbarkeit wirksamer Therapiemöglichkeiten drastisch eingeschränkt wurde. Aus diesem Grund ist die Entwicklung neuer Antibiotika und Behandlungsstrategien gegen S. aureus Infektionen von enormem gesellschaftlichem Interesse. Da aber lediglich eine von fünf Substanzen, die in klinische Studien eintreten, später als Medikament zugelassen wird, sollte die präklinische Evaluierung neuer, vielversprechender Therapeutika ebenso verbessert und überdacht werden. Diese Doktorarbeit addressiert in diesem Zusammenhang beide Facetten: zum einen wurde durch Einbeziehung von in vivo Bildgebungstechnologien ein deutlicheres Bild von der Effizienz neuer Substanzen während der präklinischen Evaluierung ermöglicht, zum anderen wurde mit Lysostaphin eine neuartige Substanzklasse zur Behandlung von S. aureus Infektionen getestet. Primärziel dieser Arbeit war deshalb die Entwicklung und Etablierung einer dualen Bildgebungsplattform bestehend aus Biolumineszenz- (BLI) und Kernspintomografischer (MRI) Bildgebung, um detaillierte Einblicke in Verlauf und Schwere von S. aureus Infektionen im Muskelinfektionsmodell der Maus zu ermöglichen. Die Biolumineszenzbildgebung bakterieller Infektionen wurde durch die Entwicklung von Luziferase-exprimierenden S. aureus Stämmen bereits in früheren Arbeiten ermöglicht und wurde in die Bildgebungsplatform integriert, um die Entwicklung der Bakterienlast nicht-invasiv verfolgen zu können. Kernspintomografie wurde in früheren Arbeiten hingegen kaum zur Darstellung der Effizienz anti-bakterieller Therapien während der Präklinik verwendet. Aus diesem Grund dienten die ersten Experimente zur Erkennung von Vor- und Nachteilen der Darstellung von S. aureus Infektionen im Tiermodell durch verschiedene Kernspintomografische Bildgebungsmethoden. Native, Protonen-basierte Kernspintomografie wies verlängerte T2 Relaxationszeiten im infizierten Muskelgewebe nach, doch eine klare Eingrenzung des infizierten Bereiches war nicht möglich. Die Anwendung von Eisenoxid und Perfluorcarbon Nanopartikeln, zwei Kontrastmittel zur Kernspintomografie, ermöglichte ebendiese. Eisenoxid Nanopartikel wurden durch ihren Signalstöreffekt auf das MR Protonensignal detektiert, während Perfluorcarbon Emulsionen durch 19F basierte Kernspintomografie nachgewiesen wurden. Säugetiere verfügen nicht über ausreichende Mengen von 19F Atomen, um ein spezifisches Signal zu liefern, weshalb 19F Kernspintomografie lediglich applizierte Perfluorcarbon Emulsion in vivo abbilden kann. Dieses Bild kann dann über ein zugleich aufgenommenes Protonen MR Bild gelegt werden, wodurch die Akkumulation des Kontrastmittels im Detail in anatomischer Umgebung dargestellt werden kann. Da es sich hierbei um einen Vorteil gegenüber anderen Kontrastmittel-basierten MR Bildgebungsmethoden wie Eisenoxid Nanopartikel gestützter Kernspintomografie handelt, wurden nachfolgende Experimente mit Perfluorcarbon Emulsionen durchgeführt. Studien zur Bildgebung der Perfluorcarbon Akkumulation am Infektionsherd des Muskelabszessmodels von S. aureus in der Maus zeigten deutliches 19F MR Signal nach Gabe zwischen Tag 2 und Tag 8 p.i.. In allen untersuchten Tieren zeigte sich eine Ansammlung des Kontrastmittels in Form einer Hohlkugel um den Abszessbereich, wobei das Signal während der gesamten Infektion stabil war. Um den Akkumulationsmechanismus zu identifizieren, wurden Durchflusszytometrie-, Zellseparations- und histologische Experimente durchgeführt. In diesem Zusammenhang erwiesen sich Neutrophile, Makrophagen, Monozyten und Dendritische Zellen als Perfluorcarbon-tragende Immunzelltypen, wobei das Gros an Kontrastmittel in Neutrophilen nachgewiesen werden konnte. Im Allgemeinen war der Großteil des Perfluorcarbonsignals mit Immunzellen assoziert, weshalb eine spezifische Immunzell-abhängige Akkumulation wahrscheinlich erscheint. Die histologischen Untersuchungen stützten diese Beobachtung, da die Kontrastmittel assoziierten Fluoreszenzmarker nur in der Nähe von Immunzellnuclei gefunden werden konnten. Die Etablierung von 19F Kernspintomografie mit Perfluorcarbon Emulsionen als Infektionsbildgebungsmethode ermöglichte im nächsten Schritt die Untersuchung von antibakterieller Therapie auf das MR Signal, um die Eignung dieser Methode für die Präklinik zu evaluieren. Deshalb wurden die Wirksamkeit von Vancomycin und Linezolid, zweier klinisch höchst relevanter Antibiotika zur Behandlung von S. aureus Infektionen, im Muskelabszessmodel der Maus untersucht. Beide erwiesen sich als effizient in der Verringerung der bakteriellen Last im infizierten Muskel und des Bakterien-Biolumineszenzsignals, aber auch bei der Reduktion der Stärke und des Volumens der Perfluorcarbon Akkumulation am Infektionsherd, die durch 19F Kernspintomografie dargestellt und vermessen wurde. Alle drei Methoden zeigten dabei das gleiche Effizienzmuster nach dem Linezolid wirksamer bei der Bekämpfung der Infektion war. Folglich erwies sich 19F Kernspintomografie mit Perfluorcarbon Emulsionen als effektiv um den antibakteriellen Effekt von Antibiotika in präklinischen Modellen zu untersuchen. Konsequenterweise wurde im nächsten Schritt eine neuartige Substanz zur Behandlung von S. aureus Infektionen mit Hilfe der Bildgebungsplattform untersucht: Lyostaphin. Diese Endopeptidase schneidet spezifisch die Zellwand von S. aureus und wurde in verschiedenen Konzentrationen oder in Kombination mit Oxacillin im Muskelabszess- oder Katheterinfektionsmodell der Maus gestestet. Lysostaphin in der Konzentration von 5 mg/kg Körpergewicht (Maus) oder Lysostaphin in der Konzentration von 2 mg/kg in Kombination mit Oxacillin führten zu einer starken Verringerung der Bakterienlast und des Biolumineszenzsignals in beiden Modellen. Die Ansammlung von Perfluorcarbon Kontrastmittel war zudem in diesen beiden Gruppen stark reduziert im Vergleich zur Negativkontrolle und den mit Vancomycin und Oxacillin behandelten Tieren. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass Lysostaphin eine vergleichbare oder bessere Wirksamkeit als Vancomycin oder Oxacillin alleine lieferte. Aus diesem Grund scheint eine Weiterentwicklung dieser Substanz zur Behandlung von S. aureus empfohlen. Der Nutzen der Bildgebungsplattform wurde in diesen Experimenten zudem dadurch deutlich, dass alle drei Methoden zur Bestimmung der Schwere der Erkrankung ähnliche Wirksamkeiten der Antibiotika anzeigten. Dennoch muss festgestellt werden, dass die Gruppen, die Oxacillin entweder alleine oder in Kombination mit Lysostaphin erhielten, stärkere Perfluorocarbon Akkumulation am Infektionsherd aufwiesen als von den Bakterienlast- oder Biolumineszenz-Ergebnissen zu erwarten gewesen wäre. Ein Grund hierfür könnten mögliche immunomodulatorischen Effekte von Oxacillin sein. Tatsächlich zeigten weitere Experimente Variationen in den Konzentrationen von Cytokinen und Chemokinen im infizierten Muskel in Abhängigkeit der verwendeten Antibiotikatherapie. Besonders die Behandlung mit Oxacillin, in geringerem Maße aber auch mit Minocyclin oder Linezolid, führte zu erhöhten Konzentrationen, wenngleich die Bakterienlast deutlich reduziert werden konnte. Folglich sollten mögliche immuno-modulatorischen Effekte antibakterieller Substanzen bei zukünftiger Anwendung von Bildgebungsplattform, die auf dem Markieren von Immunzellen basieren, mit ins Kalkül gezogen werden. Auf der anderen Seite eröffnet diese Beobachtung ein neues Anwendungsfeld für diese Bildgebungsmethoden, da es außerordentlich interessant erscheint, damit immuno-modulatorische Substanzen oder bakterielle Faktoren in vivo zu untersuchen. Zu guter Letzt, ermöglicht diese Bildgebungsplattform, die Methoden zur Darstellung der bakteriellen Last auf der einen und des Immunsystems auf der anderen Seite verknüpft, eine innovative, neue Möglichkeit Wirt-Pathogen Interaktionen nicht-invasiv und in vivo studieren zu können. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass Perfluorcarbon Emulsionen in Immunzellen am Infektionsherd des S. aureus Muskelabszessmodells der Maus akkumulieren. Die Ansammlung formt eine Hohlkugel am Rand des Abszessbereiches, deren Größe und Fluorgehalt von der Schwere der Erkrankung und/oder der Wirksamkeit der angewandten Antibiotikatherapie abhängt. Aus diesem Grund erwies sich 19F Kernspintomografie mit Perfluorcarbon Emulsionen als Kontrastmittel als nützliche Platform zur präklinischen Evaluierung antibakterieller Substanzen. Weiterhin erscheint diese Methode wegen der Akkumulation des Kontrastmittels in Immunzellen, als interessant zum Studium der Immunantwort gegenüber Infektionen, aber auch Krebs oder Autoimmunerkrankungen sowie zur Erforschung von immuno-modulatorischen Substanzen und Impfansätzen. KW - Staphylococcus aureus KW - Kernspintomographie KW - Infektion KW - In vivo Imaging KW - Infection imaging KW - Infektionsbildgebung KW - Antibiotikum KW - Bilderzeugung KW - Molekulare Bildgebung Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-105349 ER -