TY - THES A1 - Adhikari, Bikash T1 - Targeted degradation of Myc-interacting oncoproteins T1 - Gezielte Degradation von mit Myc interagierenden Onkoproteinen N2 - The hallmark oncoprotein Myc is a major driver of tumorigenesis in various human cancer entities. However, Myc’s structural features make it challenging to develop small molecules against it. A promising strategy to indirectly inhibit the function of Myc is by targeting its interactors. Many Myc-interacting proteins have reported scaffolding functions which are difficult to target using conventional occupancy- driven inhibitors. Thus, in this thesis, the proteolysis targeting chimera (PROTAC) approach was used to target two oncoproteins interacting with Myc which promote the oncogenicity of Myc, Aurora-A and WDR5. PROTACs are bifunctional small molecules that bind to the target protein with one ligand and recruit a cellular E3- ligase with the other ligand to induce target degradation via the ubiquitin- proteasome system. So far, the most widely used E3-ligases for PROTAC development are Cereblon (CRBN) and von Hippel–Lindau tumor suppressor (VHL). Furthermore, there are cases of incompatibility between some E3-ligases and proteins to bring about degradation. Hence there is a need to explore new E3- ligases and a demand for a tool to predict degradative E3-ligases for the target protein in the PROTAC field. In the first part, a highly specific mitotic kinase Aurora-A degrader, JB170, was developed. This compound utilized Aurora-A inhibitor alisertib as the target ligand and thalidomide as the E3-ligase CRBN harness. The specificity of JB170 and the ternary complex formation was supported by the interactions between Aurora-A and CRBN. The PROTAC-mediated degradation of Aurora-A induced a distinct S- phase defect rather than mitotic arrest, shown by its catalytic inhibition. The finding demonstrates that Aurora-A has a non-catalytic role in the S-phase. Furthermore, the degradation of Aurora-A led to apoptosis in various cancer cell lines. In the second part, two different series of WDR5 PROTACs based on two protein- protein inhibitors of WDR5 were evaluated. The most efficient degraders from both series recruited VHL as a E3-ligase and showed partial degradation of WDR5. In addition, the degradation efficiency of the PROTACs was significantly affected by the linker nature and length, highlighting the importance of linker length and composition in PROTAC design. The degraders showed modest proliferation defects at best in cancer cell lines. However, overexpression of VHL increased the degradation efficiency and the antiproliferative effect of the PROTACs. In the last part, a rapamycin-based assay was developed to predict the degradative E3-ligase for a target. The assay was validated using the WDR5/VHL and Aurora- A/CRBN pairs. The result that WDR5 is degraded by VHL but not CRBN and Aurora-A is degraded by CRBN, matches observations made with PROTACs. This technique will be used in the future to find effective tissue-specific and essential E3-ligases for targeted degradation of oncoproteins using PROTACs. Collectively, the work presented here provides a strategy to improve PROTAC development and a starting point for developing Aurora-A and WDR5 PROTACs for cancer therapy. N2 - Das Onkoprotein Myc ist ein wichtiger Faktor bei der Tumorentstehung in verschiedenen menschlichen Krebsarten. Die strukturellen Merkmale von Myc machen es jedoch schwierig, kleine Moleküle gegen dieses Protein zu entwickeln. Eine vielversprechende Strategie zur indirekten Hemmung der Funktion von Myc besteht darin, auf seine Interaktoren abzuzielen. Viele Proteine, die mit Myc interagieren, haben Gerüstfunktionen, die mit herkömmlichen Inhibitoren nur schwer zu hemmen sind. Daher wurde in dieser Arbeit der PROTAC-Ansatz (Proteolysis Targeting Chimera) verwendet, um zwei Onkoproteine, die mit Myc interagieren und die Onkogenität von Myc fördern, ins Visier zu nehmen: Aurora-A und WDR5. PROTACs sind bifunktionale kleine Moleküle, die mit einem Liganden an das Zielprotein binden und mit dem anderen Liganden eine zelluläre E3-Ligase rekrutieren, um den Abbau des Zielproteins über das Ubiquitin-Proteasom-System einzuleiten. Die bisher am häufigsten verwendeten E3-Ligasen für die Entwicklung von PROTACs sind Cereblon (CRBN) und der von Hippel-Lindau-Tumorsuppressor (VHL). Außerdem gibt es Fälle von Inkompatibilität zwischen einigen E3-Ligasen und Proteinen, die abgebaut werden sollen. Daher besteht die Notwendigkeit, neue E3-Ligasen zu erforschen und Werkzeuge zur Vorhersage abbauender E3-Ligasen für das Zielprotein zu entwickeln. Im ersten Teil wurde ein hochspezifischer Degrader der mitotischen Kinase Aurora-A, JB170, entwickelt. Bei dieser Verbindung wurde der Aurora-A-Inhibitor Alisertib als Zielligand und Thalidomid als Binder für die E3-Ligase CRBN verwendet. Die Spezifität von JB170 und die ternäre Komplexbildung wurden durch die Wechselwirkungen zwischen Aurora-A und CRBN unterstützt. Der durch PROTAC vermittelte Abbau von Aurora-A führte zu einem deutlichen Defekt in der S-Phase und nicht zu einem mitotischen Stillstand, wie es für dessen katalytische Hemmung beobachtet wurde. Dies zeigt, dass Aurora-A eine nicht-katalytische Funktion in der S-Phase hat. Außerdem führte der Abbau von Aurora-A in verschiedenen Krebszelllinien zur Apoptose. Im zweiten Teil wurden zwei verschiedene Serien von WDR5 PROTACs auf der Grundlage von zwei Protein-Protein-Inhibitoren von WDR5 untersucht. Die effizientesten Degrader aus beiden Serien rekrutierten VHL als E3-Ligase und zeigten einen teilweisen Abbau von WDR5. Darüber hinaus wurde die Abbaueffizienz der PROTACs erheblich von der Art und Länge des Linkers beeinflusst, was die Bedeutung der Linkerlänge und -zusammensetzung bei der Entwicklung von PROTACs unterstreicht. Die Abbauprodukte zeigten bestenfalls bescheidene Proliferationsdefekte in Krebszelllinien. Eine Überexpression von VHL erhöhte jedoch die Abbaueffizienz und den antiproliferativen Effekt der PROTACs. Im letzten Teil wurde ein auf Rapamycin basierender Assay entwickelt, um die abbauende E3-Ligase für ein Target vorherzusagen. Der Assay wurde anhand der Paare WDR5/VHL und Aurora-A/CRBN validiert. Das Ergebnis, dass WDR5 von VHL, aber nicht von CRBN abgebaut wird und Aurora-A von CRBN abgebaut wird, stimmt mit den Beobachtungen überein, die mit PROTACs gemacht wurden. Diese Technik wird in Zukunft eingesetzt werden, um wirksame gewebespezifische und essentielle E3-Ligasen für den gezielten Abbau von Onkoproteinen mit Hilfe von PROTACs zu finden. Insgesamt bieten die hier vorgestellten Arbeiten eine Strategie zur Verbesserung der PROTAC-Entwicklung und einen Ausgangspunkt für die Entwicklung von Aurora-A- und WDR5-PROTACs für die Krebstherapie. KW - Degradation KW - PROTACs KW - Oncoprotein KW - Cancer KW - Onkoprotein Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-317326 ER - TY - THES A1 - Christensen, Morten Overby T1 - Dynamics of human DNA Topoisomerases I and II T1 - Dynamic von Human DNA Topoisomerases I and II N2 - The first goal of this study was to develop cell lines with a stable expression of bio-fluorescent topo II and topo I. This was successfully achieved using a bicistronic vector system. Control experiments showed that proteins of expected size were expressed, and that GFP-tagged topos I, IIa, and IIb were active in the cells and fully integrated in the endogenous pools of the enzymes. These cell-lines provided a novel tool for investigating the cell biology of human DNA topoisomerases. Our most important finding was, that both types of mammalian topoisomerases are entirely mobile proteins that are in continuous and rapid flux between all compartments of the nucleus and between the cytososl and the chromosomes of mitotic cells. This was particularly surprising with regard to topo II, which is considered to be a structural component of the nuclear matrix and the chromosome scaffold. We must conclude that if this was the case, then these architectural structures appear to be much more dynamic than believed until now. In this context it should also be mentioned, that the alignment of topo II with the central axes of the chromosome arms, which has until now been considered a hall-mark of the enzyme’s association with the chromosomal scaffold, is not seen in vivo and can be demonstrated to be to some extent an artefact of immunohistochemistry. Furthermore, we show that the two isoforms of topo II (a and b) have a different localisation during mitotic cell division, supporting the general concept that topo II functions at mitosis are exclusively assigned to the a-form, whereas at interphase the two isoenzymes work in concert. Despite unrestricted mobility within the entire nuclear space, topoisomerases I and II impose as mostly nucleolar proteins. We show that this is due to the fact that in the nucleoli they are moving slower than in the nucleoplasm. The decreased nucleolar mobility cannot be due to DNA-interactions, because compounds that fix topoisomerases to the DNA deplete them from the nucleoli. Interestingly, the subnucleolar distribution of topoisomerases I and II was complementary. The type II enzyme filled the entire nucleolar space, but excluded the fibrial centers, whereas topo I accumulated at the fibrial centers, an allocation directed by the enzyme’s N-terminus. During mitosis, it also mediates association with the nucleolar organising regions of the acrocentric chromosomes. Thus, topo I stays associated with the rDNA during the entire cell-cycle and consistently colocalizes there with RNA-polymerase I. Finally, we show that certain cancer drugs believed to act by stabilising covalent catalytic DNA-intermediates of topoisomerases, do indeed immobilize the enzymes in living cells. Interestingly, these drugs do not target topoisomerases in the nucleoli but only in the nucleoplasm. N2 - Diese Arbeit hatte zunächst zum Ziel, humane Zelllinien zu etablieren, in denen GFP-Chimären der humanen DNS-Topoiosmerasen I, IIa und IIb stabil und constitutiv exprimiert werden. Dies wurde mit Hilfe eines bicistronischen Expressionsvektors erreicht, der eine quasi physiologische Expression der GFP-Chimären in humanen Zellen ermöglichte. Wir zeigen, dass die chimärischen Proteine die erwartete Größe haben, aktiv sind, und vollständig in die jeweiligen endogenen Enzympopulationen integriert werden. Damit halten wir ein ideales Werkzeug zur Untersuchung der Zellbiologie der Topoisomerasen in Händen. Sowohl Topoisomerase I, als auch die beiden Typ II-Enzyme innerhalb des Zellkerns vollständig mobil sind und zwischen Nukleoplasma und Nukleolen, sowie zwischen Zytosol und Chromosmen mitotischer Zellen ständig austauschen. Dieser Befund ist insbesondere hinsichtlich der Topoisomerase II erstaunlich, da man bisher davon ausgeht, dass dieses Enzym eine zentrale Rolle bei der Konstituierung der Kernmatrix bzw. des Chromosomengerüstes spielt, was mit einem vollständig und rasch beweglichen Protein unvereinbar scheint. Falls Topoisomerase II tatsächlich eine solche Rolle spielen sollte, müssen die Kernmatrix und das Chromosomengerüst sehr viel dynamischere Strukturen sein, als bisher angenommen. Es sei in diesem Zusammenhang auch darauf hingewiesen, dass wir in der lebenden Zelle keine Konzentrierung der Topoisomerase entlang der zentralen Längsachsen der Chromosmenarme gesehen haben, was bisher als Markenzeichen von deren Gerüstfunktion galt. Vielmehr konnten wir zeigen, dass eine solche axiale Anordnung überwiegend ein Artefakt immunhistologischer Methoden darstellt. Wir zeigen weiterhin, dass die beiden Isoformen der Topoisomerase II (a und b) während der Zellteilung unterschiedlich lokalisiert sind, was mit dem generellen Konzept zusammenpasst, dass nur die a-Form mitotische Funktionen wahrnimmt, während die beiden Isoenzyme in der Interphase konzertiert arbeiten. Ungeachtet ihrer unbegrenzten Mobilität innerhalb des gesamten Zellkerns, imponieren Topoiosmerase I und II in der lebende Zelle als überwiegend nukleoläre Proteine, was damit zusammenhängt, dass sie sich hier etwas langsamer bewegen, als im Nukleoplasma. Diese relative Abbremsung kann nicht auf DNS-Interaktionen beruhen, weil chemische Susbtanzen, die Topoisomerasen an der DNS fixieren, eine Entleerung der Nukleolen bewirken. Interessanterweise ist die subnukleoläre Verteilung von Topoisomerase I und II komplementär. Die Typ II- Enzyme füllen den gesamten nukleolären Raum aus, sparen aber die fibrillären Zentren aus, während das Typ I- Enzym fast ausschließlich an den fibrillären Zentren zu finden ist. Diese Assoziation wird durch den N-Terminus des Enzyms vermittelt, der darüber hinaus während der Mitose auch die Bindung an die nukelolären Organisationszentren der akrozentrischen Chromosomen bewirkt. So bleibt Topoisomerase I über den gesamten Zellzyklus hinweg mit der rDNS physisch verbunden und kolokalisiert hier mit der RNS-Polymerase I. Schließlich konnten wir zeigen, das bestimmte Tumnortherapeutika, von denen man annimt, dass sie über eine Stabilisierung der kovalenten katalytischen DNS-Intermediate der Topoiosmerasen wirken, diese Enzyme in der lebenden Zelle tatsächlich immobil machen. Interssanterweise treffen diese Substanzen überwiegend im Nukleolplasma und nicht in den Nukleolen. KW - Mensch KW - DNS-Topoisomerasen KW - Molekulargenetik KW - Topoisomerase I KW - Topoisomerase II KW - Mobilitet KW - Drogen KW - Krebs KW - Topoisomerases I KW - Topoisomerase II KW - Mobility KW - Drugs KW - Cancer Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4927 ER - TY - JOUR A1 - Otto, C. A1 - Schmidt, S. A1 - Kastner, C. A1 - Denk, S. A1 - Kettler, J. A1 - Müller, N. A1 - Germer, C.T. A1 - Wolf, E. A1 - Gallant, P. A1 - Wiegering, A. T1 - Targeting bromodomain-containing protein 4 (BRD4) inhibits MYC expression in colorectal cancer cells JF - Neoplasia N2 - The transcriptional regulator BRD4 has been shown to be important for the expression of several oncogenes including MYC. Inhibiting of BRD4 has broad antiproliferative activity in different cancer cell types. The small molecule JQ1 blocks the interaction of BRD4 with acetylated histones leading to transcriptional modulation. Depleting BRD4 via engineered bifunctional small molecules named PROTACs (proteolysis targeting chimeras) represents the next-generation approach to JQ1-mediated BRD4 inhibition. PROTACs trigger BRD4 for proteasomale degradation by recruiting E3 ligases. The aim of this study was therefore to validate the importance of BRD4 as a relevant target in colorectal cancer (CRC) cells and to compare the efficacy of BRD4 inhibition with BRD4 degradation on downregulating MYC expression. JQ1 induced a downregulation of both MYC mRNA and MYC protein associated with an antiproliferative phenotype in CRC cells. dBET1 and MZ1 induced degradation of BRD4 followed by a reduction in MYC expression and CRC cell proliferation. In SW480 cells, where dBET1 failed, we found significantly lower levels of the E3 ligase cereblon, which is essential for dBET1-induced BRD4 degradation. To gain mechanistic insight into the unresponsiveness to dBET1, we generated dBET1-resistant LS174t cells and found a strong downregulation of cereblon protein. These findings suggest that inhibition of BRD4 by JQ1 and degradation of BRD4 by dBET1 and MZ1 are powerful tools for reducing MYC expression and CRC cell proliferation. In addition, downregulation of cereblon may be an important mechanism for developing dBET1 resistance, which can be evaded by incubating dBET1-resistant cells with JQ1 or MZ1. KW - Cancer Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-202451 VL - 21 IS - 11 ER - TY - THES A1 - Petrov, Ivan T1 - Combinational therapy of tumors in syngeneic mouse tumor models with oncolytic Vaccinia virus strains expressing IL-2 and INF-g. Human adipose tissue-derived stem cell mediated delivery of oncolytic Vaccinia virus T1 - Kombinationstherapie von Tumoren in syngenen Maus-Tumormodellen mit onkolytischen Vaccinia-Virenstämmen, die IL-2 und INF-g exprimieren. Übertragung von onkolytischen Vaccinia-Viren durch menschliche Fettstammzellen N2 - Cancer is one of the leading causes of death worldwide, with currently assessed chances to develop at least one cancer in a lifetime for about 20%. High cases rates and mortality require the development of new anticancer therapies and treatment strategies. Another important concern is toxicity normally associated with conventional therapy methods, such as chemo- and radiotherapy. Among many proposed antitumoral agents, oncolytic viruses are still one of the promising and fast-developing fields of research with almost a hundred studies published data on over 3000 patients since the beginning of the new millennia. Among all oncolytic viruses, the Vaccinia virus is arguably one of the safest, with an extremely long and prominent history of use, since it was the one and only vaccine used in the Smallpox Eradication Program in the 1970s. Interestingly enough, it was the first oncolytic virus proven to have tumor tropism in vitro and in vivo in laboratory settings, and this year we can celebrate an unofficial 100th anniversary since the publication of the fact. While being highly immunogenic, Vaccinia virus DNA replication takes place in the cytoplasm of the infected cell, and virus genes never integrate into the host genome. Another advantage of using Vaccinia as an oncolytic agent is its high genome capacity, which allows inserting up to 25 kbps of exogenous genes, thus allowing to additionally arm the virus against the tumor. Oncolytic virus action consists of two major parts: direct oncolysis and immune activation against the tumor, with the latter being the key to successful treatment. To this moment, preclinical research data are mostly generated in immunocompromised xenograft models, which have hurdles to be properly translated for clinical use. In the first part of the current study, fourteen different recombinant Vaccinia virus strains were tested in two different murine tumor cell lines and corresponding immunocompetent animal models. We found, that Copenhagen backbone Vaccinia viruses while being extremely effective in cell culture, do not show significant oncolytic efficacy in animals. In contrast, several of the LIVP backbone viruses tested (specifically, IL-2 expressing ones) have little replication ability when compared to the Copenhagen strain, but are able to significantly delay tumor growth and prolong survival of the treated animals. We have also noted cytokine related toxicity of the animals to be mouse strain specific. We have also tested the virus with the highest therapeutic benefit in combination with romidepsin and cyclophosphamide. While the combination with histone deacetylase inhibitor romidepsin did not result in therapeutic benefit in our settings, the addition of cyclophosphamide significantly improved the efficacy of the treatment, at the same time reducing cytokine-associated toxicity of the IL-2 expressing virus. In the second part of the work, we analyzed the ability of adipose-derived mesenchymal stem cells to serve as a carrier for the oncolytic Vaccinia virus. We showed for the first time that the cells can be infected with the virus and can generate virus progeny. They are also able to survive for a substantially long time and, when injected into the bloodstream of tumor-bearing animals, produce the virus that is colonizing the tumor. Analysis of the systemic distribution of the cells after injection revealed that infected and uninfected cells are not distributed in the same manner, possibly suggesting that infected cells are getting recognized and cleared by an impaired immune system of athymic mice faster than non-infected cells. Despite this, injection of virus-loaded adipose-derived mesenchymal stem cells to human A549 tumor-bearing xenograft mice resulted in rapid tumor regression and reduced virus-related side effects of the treatment when compared to injection of the naked virus. In conclusion, we have tested two different approaches to augmenting oncolytic Vaccinia virus therapy. First, the combination of recombinant Vaccinia virus expressing IL-2 and cyclophosphamide showed promising results in a syngeneic mouse model, despite the low permissivity of murine cells to the virus. Second, we loaded the oncolytic Vaccinia virus into mesenchymal stem cells and have proven that they can potentially serve as a vehicle for the virus. N2 - Krebs ist eine der häufigsten Todesursachen weltweit, wobei die Wahrscheinlichkeit, im Laufe des Lebens an mindestens einer Krebsart zu erkranken, derzeit auf etwa 20 % geschätzt wird. Die hohen Fallzahlen und die hohe Sterblichkeit erfordern die Entwicklung neuer Krebstherapien und Behandlungsstrategien. Ein weiteres wichtiges Problem ist die Toxizität, die normalerweise mit konventionellen Behandlungsmethoden, wie Chemo- und Strahlentherapie, einhergeht. Unter den vielen vorgeschlagenen antitumoralen Wirkstoffen sind onkolytische Viren nach wie vor eines der vielversprechendsten und sich schnell entwickelnden Forschungsgebiete mit fast hundert veröffentlichten Studien an über 3000 Patienten seit Beginn des neuen Jahrtausends. Unter allen onkolytischen Viren ist das Vaccinia Virus wohl eines der Sichersten und hat eine extrem lange und prominente Anwendungsgeschichte, da es der einzige Impfstoff war, der im Pockenausrottungsprogramm in den 1970er Jahren verwendet wurde. Interessanterweise war es das erste onkolytische Virus, dessen Tumortropismus in vitro und in vivo im Labor nachgewiesen wurde. In diesem Jahr (2022) können wir das inoffizielle 100-jährige Jubiläum seit der Veröffentlichung dieser Tatsache feiern. Obwohl Vaccinia hoch immunogen ist, findet die Replikation im Zytoplasma der infizierten Zelle statt, und die Virusgene werden niemals in das menschliche Genom integriert. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von Vaccinia als onkolytisches Agens ist seine hohe Genomkapazität, die es ermöglicht, bis zu 25 kbit/s an exogenen Genen einzufügen, wodurch das Virus zusätzlich gegen den Tumor aufgerüstet werden kann. Die Wirkung des onkolytischen Virus besteht aus zwei Hauptbestandteilen: der direkten Onkolyse und die Aktivierung des Immunsystems gegen den Tumor, wobei letztere der Schlüssel zum Behandlungserfolg ist. Bislang wurden präklinische Forschungsdaten meist in immungeschwächten Xenotransplantationsmodellen gewonnen, die sich nur schwer für den klinischen Einsatz eignen. Im ersten Teil der aktuellen Studie wurden vierzehn verschiedene rekombinante Vaccinia-Virusstämme in zwei verschiedenen murinen Tumorzelllinien und in entsprechenden immunkompetenten Tiermodellen getestet. Wir fanden heraus, dass Kopenhagener Backbone-Vaccinia-Viren zwar in der Zellkultur äußerst wirksam sind, im Tiermodell jedoch keine signifikante onkolytische Wirksamkeit zeigen. Im Gegensatz dazu haben mehrere der getesteten LIVP-Backbone-Viren (insbesondere die IL-2 exprimierenden) im Vergleich zum Kopenhagener Stamm nur eine geringe Replikationsfähigkeit, sind aber in der Lage, das Tumorwachstum deutlich zu verzögern und das Überleben der behandelten Tiere zu verlängern. Wir haben auch festgestellt, dass die Zytokin-bedingte Toxizität der Tiere mausstammspezifisch ist. Wir haben auch das Virus mit dem höchsten therapeutischen Nutzen in Kombination mit Romidepsin und Cyclophosphamid getestet. Während die Kombination mit dem Histon-Deacetylase-Inhibitor Romidepsin in unseren Versuchsreihen keinen therapeutischen Nutzen erbrachte, verbesserte die Zugabe von Cyclophosphamid die Wirksamkeit der Behandlung erheblich und verringerte gleichzeitig die zytokinbedingte Toxizität des IL-2-exprimierenden Virus. Im zweiten Teil der Arbeit analysierten wir die Fähigkeit von aus Fettgewebe gewonnenen mesenchymalen Stammzellen, als Träger für das onkolytische Vaccinia-Virus zu dienen. Wir konnten zum ersten Mal zeigen, dass die Zellen mit dem Virus infiziert werden können und Virusnachkommen erzeugen können. Sie sind auch in der Lage, sehr lange zu überleben und, wenn sie in den Blutkreislauf von Tieren mit Tumoren injiziert werden, das Virus zu produzieren, das den Tumor besiedelt. Die Analyse der systemischen Verteilung der Zellen nach der Injektion ergab, dass infizierte und nicht infizierte Zellen nicht auf die gleiche Weise verteilt werden, was möglicherweise darauf hindeutet, dass infizierte Zellen von einem beeinträchtigten Immunsystem der athymischen Mäuse schneller erkannt und beseitigt werden, als nicht infizierte Zellen. Trotzdem führte die Injektion von virusbeladenen mesenchymalen Stammzellen aus Fettgewebe in A549-Tumor-tragende Xenograft-Mäuse zu einer schnellen Tumorregression und zu geringeren virusbedingten Nebenwirkungen der Behandlung, als bei der Injektion des nackten Virus. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir zwei verschiedene Ansätze zur Verstärkung der onkolytischen Vaccinia-Virus-Therapie getestet haben. Erstens zeigte die Kombination aus rekombinantem Vaccinia-Virus, das IL-2 exprimiert, und Cyclophosphamid in einem syngenen Mausmodell vielversprechende Ergebnisse, trotz der geringen Permissivität der Mäusezellen für das Virus. Zweitens haben wir onkolytische Vaccinia-Viren in mesenchymale Stammzellen eingebracht und nachgewiesen, dass diese als Vehikel für das Virus dienen können. KW - Vaccinia-virus KW - Vaccinia KW - ADSCs KW - Cancer Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-273550 ER - TY - THES A1 - Schneider, Matthias T1 - Characterisation of Metalloprotease-mediated EGFR Signal Transactivation after GPCR Stimulation T1 - Charakterisierung der EGFR Signaltransaktivierung nach GPCR Stimulation N2 - In the context of metalloprotease-mediated transactivation of the epidermal growth factor receptor, different monoclonal antibodies against ADAM17 / TACE were characterized for their ability to block the sheddase. Activity of some of them was observed at doses between 2µg/mL and 10µg/mL. Kinetic analyses showed their activity starting at around 30 minutes. In cellular assays performed with the antibodies, especially upon treatment of cells with sphingosine-1-phosphate a reduction in proliferation was observed with some candidates. Moreover this study provides potential new roles for ß-Arrestins. Their involvement in the triple membrane-passing signal pathway of EGFR transactivation was shown. Furthermore, in overexpressing cellular model systems, an interaction between ADAM17 and ß-Arrestin1 could be observed. Detailed analysis discovered that phosphorylation of ß-Arrestin1 is crucial for this interaction. Additionally, the novel mechanism of UV-induced EGFR transactivation was extended to squamous cell carcinoma. The mechanism happens in a dose dependent manner and requires a metalloprotease to shed the proligand Amphiregulin. The involvement of both ADAM9 and ADAM17, being the metalloproteases responsible for this cleavage, was shown for SCC9 cells. N2 - Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene monoklonale Antikörper gegen ADAM17 / TACE im Kontext der Metalloprotease-vermittelten Transaktivierung des Epidermalen Wachstumsfaktors auf ihre Fähigkeit hin untersucht, die Proteaseaktivität zu unterdrücken. Einige von Ihnen zeigten inhibitorische Aktivität bei Konzentrationen zwischen 2µg/ml und 10µg/ml. Die Untersuchung der Zeitabhängigkeit ihrer Wirkungsweise ergab eine Aktivität ab 30 Minuten Vorinkubation. In zellulären Versuchen konnte eine Verminderung der Proliferation besonders nach Stimulation mit Sphingosin-1-Phosphat gezeigt werden. Darüber hinaus konnten möglich neue Funktionen von ß-Arrestinen gezeigt werden. Eine Beteiligung am „triple membrane-passing“ Signalwegs der Transaktivierung des Epidermalen Wachstumsfaktors wurde dargestellt. Zudem wurde eine Interaktion von ß-Arrestin1 und ADAM17 in überexprimierenden Zellsystemen gezeigt. Detaillierte Analysen belegten, dass die Phosphorylierung von ß-Arrestin1 eine notwendige Voraussetzung dafür ist. Weiterhin wurde der neue Mechanismus der UV-vermittelten Aktivierung des epidermalen Wachstumsfaktors auf Plattenephithelkarzinom-Zellen ausgeweitet. Er findet in einer dosisabhängigen Form statt und bedarf einer Metalloprotease zum Aktivieren des Liganden Amphiregulin. Sowohl ADAM9 als auch ADAM17 wurden als die verantwortlichen Metalloproteasen in den untersuchten SCC9 Zellen ermittelt. KW - Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor KW - G-Protein gekoppelte Rezeptoren KW - Metalloprotease KW - Krebs KW - EGF Rezeptor KW - Transaktivierung KW - GPCR KW - UV KW - EGFR Transactivation KW - Metalloprotease KW - GPCR KW - Cancer KW - UV Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65105 ER - TY - JOUR A1 - Seher, Axel A1 - Nickel, Joachim A1 - Mueller, Thomas D. A1 - Kneitz, Susanne A1 - Gebhardt, Susanne A1 - Meyer ter Vehn, Tobias A1 - Schlunck, Guenther A1 - Sebald, Walter T1 - Gene expression profiling of connective tissue growth factor (CTGF) stimulated primary human tenon fibroblasts reveals an inflammatory and wound healing response in vitro JF - Molecular Vision N2 - Purpose: The biologic relevance of human connective tissue growth factor (hCTGF) for primary human tenon fibroblasts (HTFs) was investigated by RNA expression profiling using affymetrix (TM) oligonucleotide array technology to identify genes that are regulated by hCTGF. Methods: Recombinant hCTGF was expressed in HEK293T cells and purified by affinity and gel chromatography. Specificity and biologic activity of hCTGF was confirmed by biosensor interaction analysis and proliferation assays. For RNA expression profiling HTFs were stimulated with hCTGF for 48h and analyzed using affymetrix (TM) oligonucleotide array technology. Results were validated by real time RT-PCR. Results: hCTGF induces various groups of genes responsible for a wound healing and inflammatory response in HTFs. A new subset of CTGF inducible inflammatory genes was discovered (e.g., chemokine [C-X-C motif] ligand 1 [CXCL1], chemokine [C-X-C motif] ligand 6 [CXCL6], interleukin 6 [IL6], and interleukin 8 [IL8]). We also identified genes that can transmit the known biologic functions initiated by CTGF such as proliferation and extracellular matrix remodelling. Of special interest is a group of genes, e.g., osteoglycin (OGN) and osteomodulin (OMD), which are known to play a key role in osteoblast biology. Conclusions: This study specifies the important role of hCTGF for primary tenon fibroblast function. The RNA expression profile yields new insights into the relevance of hCTGF in influencing biologic processes like wound healing, inflammation, proliferation, and extracellular matrix remodelling in vitro via transcriptional regulation of specific genes. The results suggest that CTGF potentially acts as a modulating factor in inflammatory and wound healing response in fibroblasts of the human eye. KW - Bone morphogenetic protein-2 KW - Smooth-muscle-cells KW - Myofibroblast differentiation KW - TGF-beta KW - CYR61 KW - Proliferation KW - Mechanisms KW - Apoptosis KW - Receptor KW - Cancer Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-140189 VL - 17 IS - 08. Okt ER -