TY - THES A1 - Arndt, Petra T1 - Klonierung und funktionelle Charakterisierung von organischen Kationentransportern aus der Rattenniere T1 - Cloning and functional characterization of organic cation transporters from rat kidney N2 - Der organische Kationentransport im proximalen Tubulus der Niere spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase der Körperflüssigkeiten und der Ausschleusung von toxischen organischen Kationen. Der Transport von organischen Kationen wird an der Bürstensaummembran durch den H+/organische Kationen-Austauscher vermittelt, während bei dem Transport von organischen Kationen an der basolateralen Membran das nach innen gerichtete negative Membranpotential eine treibende Kraft darstellt. Durch Expressionsklonierung wurde der erste organische Kationentransporter, rOCT1, aus der Rattenniere isoliert. Kurz darauf wurde im Rahmen dieser Arbeit ein zweiter organischer Kationentransporter ebenfalls aus der Ratenniere kloniert. rOCT2 besteht aus 593 Aminosäuren und besitzt 12 putative Transmembrandomänen. Zum funktionellen Vergleich zwischen rOCT1 und rOCT2 wurde das Oozytenexpressionssystem verwendet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein pharmakologisches Profil von rOCT2 erstellt. Das Substratsprektrum von rOCT2 ist dem von rOCT1 sehr ähnlich. Die Affinitäten von rOCT2 gegenüber verschiedenen Substanzen wurden direkt mit denen von rOCT1 verglichen. Einerseits fanden wir bei einigen Substraten Unterschiede in den Km- und Vmax-Werten, aber andererseits auch viele Ähnlichkeiten zwischen beiden Transportern. Anionen (z. B. p-Aminohippurat) wurden als neue Gruppe von Inhibitoren für den durch rOCT1- und rOCT2-vermittelten Transport identifiziert. Die Potentialdifferenz ist die treibende Kraft des rOCT1- und rOCT2-vermittelten Transportes. Wir konnten potentialabhängige Veränderungen der Km-Werte von Cholin-induzierten Einwärtsströmen zeigen. Bei dem Austausch von Na+-Ionen gegen K+-Ionen im Reaktionspuffer wurde die Aufnahme von Cholin und MPP durch rOCT2 erniedrigt. Der bidirektionale Transport von MPP wurde gezeigt und trans-Stimulationsexperimente für MPP-Influx und MPP-Efflux durchgeführt, um die Asymmetrie des Transporters zu studieren. Darüberhinaus wurde in der vorliegenden Arbeit die Interaktion von verschiedenen Substraten mit rOCT1 und rOCT2 untersucht und ein kompetitver und nicht-kompetitiver Hemmtyp bei der TEA-Aufnahme gefunden. N2 - Organic cation transport in the renal tubule is an important physiological function for the maintenance of body fluid homeostasis and detoxification of harmful organic cations. In general, transport of organic cations in brush-border membranes is mediated by the H+/organic cation antiporter, whereas transport of organic cations in basolateral membranes is stimulated by the inside-negative membrane potential. By the expression cloning method, the organic cation transporter rOCT1, which is expressed in rat liver and kidney, was isolated. In 1996 another organic cation transporter from rat kidney, rOCT2, was isolated by homology cloning. rOCT2 was deduced to be a glycoprotein comprised of 593 amino acid residues with 12 putative transmembrane domains. To analyse the functional characteristics of rOCT2 in comparison with rOCT1 we utilized the Xenopus expression system. During this dissertation a pharmacological profile was made for rOCT2. The apparent substrate spectrum of rOCT2 was similar to that of rOCT1. Affinities of rOCT2 against several compounds were directly compared with those of rOCT1. We found differences in Km- and IC50-values for distinct substrates but also a lot of similarities between both transporters. Anions like p-aminohippuric acid were identified as a new group of inhibitors for rOCT1- and rOCT2-mediated transport. The potential difference is the driving force of transport mediated by rOCT1 and rOCT2. We showed the potential-dependent changes of Km-values of choline induced inward currents. Further when extracellular Na+ ions were replaced with K+ ions, the uptake of MPP and choline by rOCT2 was decreased. The bidirectional transport of MPP was shown and trans-sitmulation experiments for MPP influx and efflux were performed to study asymmetry of the transporter. The mechanism of interaction of several substrates with rOCT1 and rOCT2 were investigated and we found competitive and non-competitive inhibition of TEA uptake. KW - Ratte KW - Niere KW - Kation KW - Stofftransport KW - Molekularbiologie KW - rOCT1 KW - rOCT2 KW - proximaler Tubulus KW - Niere KW - Sekretion KW - Xenopus laevis KW - Oozyte KW - Transport KW - Inhibition KW - Homologieklonierung KW - rOCT1 KW - rOCT2 KW - proximal tubule KW - kidney KW - secretion KW - Xenopus laevis KW - oocyte KW - transport KW - inhibition KW - homology cloning Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-793 ER - TY - THES A1 - Gutjahr, Fabian Tobias T1 - Neue Methoden der physiologischen Magnet-Resonanz-Tomographie: Modellbasierte T1-Messungen und Darstellung von chemischem Austausch mit positivem Kontrast T1 - Novell Methods for Physiological MRI: Model based T1-Quantification and Positive Contrast Chemical Exchange Measurements N2 - Ziel dieser Arbeit war es, neue quantitative Messmethoden am Kleintier, insbesondere die Perfusionsmessung am Mäuseherz, zu etablieren. Hierfür wurde eine retrospektiv getriggerte T1-Messmethode entwickelt. Da bei retrospektiven Methoden keine vollständige Abtastung garantiert werden kann, wurde ein Verfahren gefunden, das mit Hilfe von Vorwissen über das gemessene Modell sehr effizient die fehlenden Daten interpolieren kann. Mit Hilfe dieser Technik werden dynamische T1-Messungen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung möglich. Dank der hohen Genauigkeit der T1-Messmethode lässt sich diese für die nichtinvasive Perfusionsmessung am Mäuseherz mittels der FAIR-ASL-Technik nutzen. Da auf Grund der retrospektiven Triggerung Daten an allen Positionen im Herzzyklus akquiriert werden, konnten T1- und Perfusionskarten nach der Messung zu beliebigen Punkten im Herzzyklus rekonstruiert werden. Es bietet sich an, Techniken, die für die myokardiale Perfusion angewandt werden, auch für die Nierenperfusionsmessung zu verwenden, da die Niere in ihrer Rinde (Cortex) eine ähnlich hohe Perfusion aufweist wie das Myokard. Gleichzeitig führen Nierenerkrankungen oftmals zu schlechter Kontrastmittelverträglichkeit, da diese bei Niereninsuffizienz u.U. zu lange im Körper verweilen und die Niere weiter schädigen. Auch deshalb sind die kontrastmittelfreien Spin-Labeling-Methoden hier interessant. Die FAIR-ASL-Technik ist jedoch an Mäusen in koronaler Ansicht für die Niere schlecht geeignet auf Grund des geringen Unterschieds zwischen dem markierten und dem Vergleichsexperiment. Als Lösung für dieses Problem wurde vorgeschlagen, die Markierungsschicht senkrecht zur Messschicht zu orientieren. Hiermit konnte die Sensitivität gesteigert und gleichzeitig die Variabilität der Methode deutlich verringert werden. Mit Hilfe von kontrastmittelgestützten Messungen konnten auch das regionale Blutvolumen und das Extrazellularvolumen bestimmt werden. In den letzten Jahren hat das Interesse an Extrazellularvolumenmessungen zugenommen, da das Extrazellularvolumen stellvertretend für diffuse Fibrose gemessen werden kann, die bis dahin nichtinvasiven Methoden nicht zugänglich war. Die bisher in der Literatur verwendeten Quantifizierungsmethoden missachten den Einfluss, den das Hämatokrit auf den ECV-Wert hat. Es wurde eine neue Korrektur vorgeschlagen, die allerdings zusätzlich zur ECV-Messung auch eine RBV-Messung benötigt. Durch gleichzeitige Messung beider Volumenanteile konnte auch erstmals das Extrazellulare-Extravaskuläre-Volumen bestimmt werden. Eine gänzlich andere kontrastmittelbasierte Methode in der MRT ist die Messung des chemischen Austauschs. Hierbei wirkt das Kontrastmittel nicht direkt beschleunigend auf die Relaxation, sondern der Effekt des Kontrastmittels wird gezielt durch HF-Pulse an- und ausgeschaltet. Durch den chemischen Austausch kann die Auswirkung der HF-Pulse akkumuliert werden. Bislang wurde bei solchen Messungen ein negativer Kontrast erzeugt, der ohne zusätzliche Vergleichsmessungen schwer detektierbar war. Im letzten Teil dieser Arbeit konnte eine neue Methode zur Messung des chemischen Austauschs gezeigt werden, die entgegen der aus der Literatur bekannten Methoden nicht Sättigung, sondern Anregung überträgt. Diese Änderung erlaubt es, einen echten positiven chemischen Austausch-Kontrast zu erzeugen, der nicht zwingend ein Vergleichsbild benötigt. Gleichzeitig ermöglicht die Technik, dadurch dass Anregung übertragen wird, die Phase der Anregung zu kontrollieren und nutzen. Eine mögliche Anwendung ist die Unterscheidung verschiedener Substanzen in einer Messung. In der Summe wurden im Rahmen dieser Arbeit verschiedene robuste Methoden eta- bliert, die die Möglichkeiten der quantitativen physiologischen MRT erweitern. N2 - The objective of this dissertation was to develop new methods for physiological magnetic resonance imaging. A new retrospectively triggered T1-method was developed. Due to the retrospectivity, full sampling of k-space can not be warranted. Therefore a model- based interpolation method was developed to reconstruct missing data efficiently. Using this technique, dynamic T1-measurements with high temporal and spatial resolution could be acquired. Due to the high precision of the developed T1-method, perfusion could be quantified using Arterial Spin Labeling. In comparison to the method established previously in our laboratory, the resolution could be doubled. Retrospective triggering enables reconstruc- tion of parameter maps on arbitrary positions in the heart cycle, as data are acquired continuously over several heart cycles. The perfusion measurement benefits from recon- struction on the end systole, as partial volume effects are decreased, due to the increased myocardial wall thickness. This serves as an effective increase in resolution. Furthermore, the data distributed over the whole heart cycle could be used to accelerate and stabilize the measurement. Cardiac and renal diseases can be directly related, as deficiency in one of the organs affects the other one. Additionally several diseases like hypertension or diabetes affect both organs. Moreover, kidneys are highly perfused, similar to the myocardium. Renal insufficiency can also lead to contrast agent intolerance, as clearance rates can be redu- ced. Therefore the FAIR-ASL technique lends itself to kidney perfusion measurements. It can, however, be problematic in small animals in coronal view, as the control-experiment inadvertently labels much of the same tissue and blood, as the labeling experiment. A modified FAIR-ASL measurement could be shown to increase sensitivity and reduce in- ter-measurement-variability by repositioning the inversion slice of the control experiment orthogonally to the measurement slice. The T1-method was used in combination with contrast agent based measurements to quantify the regional blood volume and the extracellular volume fraction. There has been an increased interest in extracellular volume fraction measurements as the extracel- lular volume is used as a proxy for the detection of diffuse fibrosis, which has previously been inaccessible to non-invasive methods. Several correction factors are used in volume fraction quantification, but the influence of hematocrit in ECV measurements has been neglected so far. In mice and rats, the regional blood volume is a major constituent of the ECV, leading to a significant influence of hematocrit. A new correction is proposed to account for the volume fraction taken up by hematocrit. For this ECV hematocrit correction, the RBV has to be measured as well. Using both measurements, the ex- tracellular volume fraction can be corrected and the extracellular-extravascular-volume- fraction quantified. A fundamentally different contrast-mechanism can be utilized using the measurement of chemical exchange. Instead of shortening relaxation times, the contrast provided by chemical exchange agents can be turned on and off using frequency selective rf-pulses. Due to the chemical exchange the effect of these pulses can be accumulated. Measure- ments exploiting this accumulation effect in general produce a negative contrast requiring a control-experiment for further evaluation. In the last part of this dissertation, a new technique transferring excitation instead of saturation could be demonstrated. By ge- nerating a real positive contrast, no control experiment is required. Other properties unavailable to previously published chemical exchange transfer methods can be exploi- ted. One example demonstrated in this dissertation is the separation of simultaneously excited compounds by their respective phase information imprinted by the excitation pulses. In summary, several robust methods could be implemented to further the capabilities of quantitative physiological MRI. KW - Kernspintomografie KW - Physioloische MRT KW - Modellbasierte Rekonstruktion KW - FAIR-ASL KW - Chemischer Austausch KW - Regionales Blutvolumen KW - Extrazellularvolumen KW - T1-Quantifizierung KW - Kernspinresonanz KW - Myokardiale Perfusion KW - Niere KW - Perfusionsmessung Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-161061 ER - TY - THES A1 - Gößmann, Holger T1 - Untersuchungen zur Expression und Lokalisation des Adaptorproteins Kanadaptin T1 - Expression and localization of the adaptorprotein Kanadaption N2 - Kanadaptin ist ein Multidomänenprotein, das in der Ratte in nahezu allen Geweben vorkommt und über kernimport- und kernexport-aktive Sequenzen verfügt. Die kernimport-aktive Sequenz konnte der NLS1 (189RKRK) zugeordnet werden. Die Kernexportaktivität wird möglicherweise durch eine Leucin-reiche Domäne (414LLQEPELELEAAV) vermittelt. Zusätzlich ist Kanadaptin in Mitochondrien nachweisbar. In humanen Zellen wird eine Isoform gebildet, die über eine zusätzliche aminoterminale FHA-Domäne verfügt. Solche Proteine zeichnen sich u.a durch DNA-bindende Eigenschaften aus (Murakami and Okayama, 1995; Allen et al., 1994; Durocher and Jackson, 2002). Dies erklärt auch die nukleäre Retention von Kanadaptin nach Verlust Zellkernmembranintegrität (Hübner et al, 2002) Für eine nukleäre Funktion spricht auch, dass infolge der Expression eines Kanadaptin-cDNA-Fragments eine unter diesen Umständen (d.h. infolge der Expression DNA-bindender/modifizierender Proteine) spezifische SOS-Antwort in E. coli ausgelöst werden kann (Perkins et al., 1999). Die Ergebnisse deuten somit eindeutig daraufhin, dass Kanadaptin an nukleären und/oder nukleinsäureabhängigen Prozessen beteiligt ist. In der Niere wurde mit Hilfe der in-situ-Hybridisierung Kanadaptin hauptsächlich in proximalen Tubuluszellen detektiert. Insgesamt scheint eine Interaktion zwischen Kanadaptin und kAE1 inzwischen immer unwahrscheinlicher. Schließlich ließ sich eine Interaktion zwischen Kanadaptin und kAE1 im Hefe-2-Hybrid-System nicht mehr reproduzieren (Hübner, persönliche Mitteilung) (Wongthida P. et al., 2006). Auch in embryonalen Nierenzellen (HEK293-Zellen) konnte keine Interaktion zwischen humanem Kanadaptin und kAE1 nachgewiesen werden (Kittanakom et al., 2004). Welche Funktionen Kanadaptin intrazellulär ausübt bleibt weiterhin enigmatisch und muss in zukünftigen Untersuchungen herausgefunden werden. N2 - Kanadaptin is a multidomainprotein, which is expressed in almost all tissue of the rat. It has nuclear import - and export sequences. The import-dependent sequence was identified as NLS1 (189RKRK). The exportsequence might be a leucin-rich domain (414LLQEPELELEAAV). Kanadaptin is also detectable in mitochondrias. In human cells an isoform is produced, which has an aminoterminal insertion containing an FHA. Such proteins show dna-binding features (Murakami and Okayama, 1995; Allen et al., 1994; Durocher and Jackson, 2002). This feature might be the reason for nuclear retention, even after the loss of the integrity of the nuclear core membrane(Hübner et al, 2002). It was also shown, that human kanadaptin cDNA fragment is able to elicite an SOS-Response in an SOS detection E.coli strain(Perkins et al., 1999). These results indicate, that Kanadaptin is involved in DNA and/or DNA-dependent processes. In in-situ-hybridisation Kanadaptin was detetcted mainly in the prox. tubule of the rat kidney. An interaction between Kanadaptin and kAE1 seems less likely, especially since an interaction between the two proteins could not be reproduced in yeast two-hybrid experiments(Wongthida P. et al., 2006). Embryonal kidney cells (HEK293-Cells) also showed no Interaction between the two proteins(Kittanakom et al., 2004). The intracellular function(s) of kanadaptin remain enigmatic and are subject for futher research. KW - Niere KW - Zellkern KW - Kernproteine KW - Sammelrohr KW - Kanadaptin KW - Kerntransport KW - NLS KW - Kidney KW - Nuclear Import KW - nuclear localization sequence Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46218 ER - TY - THES A1 - Hesse, Britta Dorothea T1 - Modulation des renalen organischen Anionentransporters hOAT1 durch EGF T1 - Modulatory effects of EGF on renal organic anion transporter hOAT1 N2 - Eine der Hauptaufgaben der Niere besteht in der Ausscheidung körpereigener und körperfremder Abfallstoffe und Stoffwechselmetabolite. Eine Reihe dieser Substanzen gehört zur Gruppe der organischen Anionen, diese werden mit Hilfe eines eigenen Transportsystems aus dem Blut durch die Nierenepithelzelle in den Urin transportiert. Eines der wichtigsten Transportproteine dieses Ausscheidungssystems ist der organische Anionentransporter hOAT1 der basolateralen Zellmembran. Es ist bekannt, dass die an der Stoffausscheidung beteiligten Transportproteine modulatorischen Einflüssen unterliegen können. Kürzlich fanden sich an OK (opossum kidney)-Zellen Hinweise, dass der Wachstumsfaktor EGF das Transportsystem für organische Anionen stimulieren kann, ohne dass die genaue Identität der beteiligten Transportproteine aufgeklärt wurde. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals der akute, modulatorische Einfluß des Wachstumsfaktors EGF auf ein definiertes menschliches Transportprotein für organische Anionen, den hOAT1, untersucht. Die menschliche Nierenepithelzelllinie IHKE1 wurde zu diesem Zweck mit dem hOAT1-Transportprotein stabil transfiziert. Die Versuchsergebnisse zeigten eine hohe basolaterale Transportaktivität der transfizierten Zellen für organische Anionen, und nach einer zehnminütigen Vorinkubation mit EGF eine deutliche Stimulation der basolateralen Aufnahmeaktivität. Durch EGF wird also in menschlichen Nierenepithelien der organische Anionentransport akut über das hOAT1-Protein in der basolateralen Zellmembran stimuliert. Es konnte gezeigt werden, dass die intrazelluläre Signaltransduktion dieses stimulierenden Effektes durch die MAPKinasen ERK1/2 vermittelt wird. In der Absicht, mehr Aufschluss über die Mechanismen der intrazellulären Signaltransduktion vom EGF-Rezeptor an den hOAT1 zu gewinnen, etablierten wir das System aus EGF-Rezeptor HER1 und Anionentransporter hOAT1 für weitere Versuche in der CHO-Zelllinie. In CHO-HER1-Zellen führte eine Vorinkubation mit EGF zu einer Phosphorylierung der MAPKinasen ERK1/2, und CHO-hOAT1-Zellen zeigten im Gegensatz zum CHO-Wildtyp eine deutliche Transportaktivität für Fluorescein. In ko-transfizierten CHO-HER1-hOAT1-Zellen konnte in IHKE1-hOAT1-Zellen ein modulatorischer Effekt des Wachstumsfaktors auf die Aktivität des Anionentransporters nachgewiesen werden. EGF bewirkte jedoch hier keine Stimulation, sondern eine (ebenfalls über die Phosphorylierung der MAPKinasen ERK1/2 vermittelte) Hemmung des hOAT1-Transportproteins. EGF wirkt also in den unpolaren CHO-Zellen genau gegensätzlich auf das hOAT1-Transportprotein wie an der basolateralen Membran der polaren, epithelialen IHKE1-Zellen, in beiden Fällen wird jedoch die Wirkung über die MAPKinasen ERK1/2 vermittelt. Wie reagieren nun in polaren IHKE1-Zellen hOAT1-Proteine, die sich nicht in der basolateralen Membran befinden? Zur Klärung dieser Frage nutzten wir den Umstand, dass der hOAT1 in transfizierten IHKE1-hOAT1-Zellen stark überexprimiert wird, und untersuchten die Wirkung von EGF auf die apikale Fluoresceinaufnahme. Im Transportversuch zeigte sich in IHKE1-hOAT1-Zellen ohne EGF eine gegenüber dem Wildtyp signifikante Fluoresceinaufnahme an der apikalen Membran. Auf eine Vorinkubation mit EGF reagierten IHKE1-hOAT1-Zellen mit einer Hemmung dieser apikalen Fluoresceinaufnahme. Die hOAT1-Transportproteine in der apikalen Membran der IHKE1-hOAT1-Zellen reagierten somit genauso auf EGF wie Transportproteine in unpolaren CHO-Zellen: In beiden Versuchsaufbauen fand sich eine Hemmung der Fluoresceinaufnahme. In CHO-Zellen wurde diese Hemmung vermittelt über eine Phosphorylierung der MAPKinasen ERK1/2, in IHKE1-Zellen jedoch erfolgte die Hemmung unabhängig davon. Ein stimulierender Effekt von EGF auf den hOAT1, den die Ergebnisse an OK-Zellen nahegelegt hatten, fand sich nur an der basolateralen Membran von IHKE1-hOAT1-Zellen. Ob die unterschiedliche Wirkung von EGF auf hOAT1-Transportproteine in der basolateralen und der apikalen Nierenepithelmembran eine physiologische Bedeutung hat, lässt sich nur vermuten. Denkbar wäre jedoch, dass durch gleichzeitige Stimulation der basolateralen Aufnahme und Hemmung des Rücktransportes durch die apikale Membran eine ausreichende Sekretion organischer Anionen über EGF vermittelt auch bei entzündlicher Schädigung des Nierencortex oder im Falle einer Ischämie gewährleistet bleibt. N2 - We recently showed that, in a proximal tubule cell line (opossum kidney cells), epithelial growth factor (EGF) stimulates basolateral organic anion transport (OAT) via ERK1/2, arachidonic acid, phospholipase A2, and generation of prostaglandins. PGE2 binds the prostanoid receptor and, thus, activates adenylate cyclase and PKA, which stimulate basolateral organic anion uptake. In the present study, we investigated whether this regulatory cascade is also true 1) for ex vivo conditions in isolated renal proximal (S2) tubules from rabbit and 2) in a human renal epithelial cell line stably expressing human OAT1 (IHKE-hOAT1). EGF activated ERK1/2 in S2 tubules and IHKE-hOAT1, and, in both cases, inhibition of ERK activation (by U-0126) abolished this stimulation. In S2 tubules and IHKE-hOAT1, EGF led to an increase of organic anion uptake, which again was inhibited by U-0126. PGE2 stimulated basolateral organic anion uptake in rabbit S2 tubules and IHKE-hOAT1. EGF- and PGE2-mediated stimulation of organic anion uptake was abolished by inhibition of PKA in rabbit S2 tubules and IHKE-hOAT1, respectively. We conclude that 1) stimulation of basolateral organic anion uptake by EGF or PGE2 is a widespread (if not general) regulatory mechanism, 2) the signal transduction pathway involved seems to be general, 3) stimulation of basolateral organic anion uptake by EGF or PGE2 is also present under ex vivo conditions and, thus, is not a cell culture artifact, 4) activation of OAT1 is sufficient to explain the stimulatory effects of EGF and PGE2 in opossum kidney cells and rabbit S2 segments, and 5) stimulation of basolateral OAT1 by EGF or PGE2 is also important in humans and, thus, may have clinical implications. Physiologically, OAT1 is located in the basolateral membrane of proximal tubular cells. During renal damage loss of polarity occurs in renal epithelial cells, leading to missorting of proteins or complete loss of polarity. Missorting or loss of polarity generally leads to disturbance of vectorial transport. In the present study, hOAT1 was expressed in human renal epithelial IHKE cells (IHKE-hOAT1) and in non polarized CHO cells (CHO-hOAT1). Because EGF and its receptor is described to play on important role in recovery from renal damage, we compared the regulation of hOAT1 by EGF in the (a) basolateral and (b) apical membrane of epithelial cells, and in (c) non polarized cells, resembling the above mentioned pathophysiological situations. Expression of hOAT1 was verified by determination of the kinetic parameters (using fluorescein as a substrate) and western blot (CHO-hOAT1) or RT-PCR (IHKE-hOAT1). To investigate the EGF effect on hOAT1, CHO-hOAT1 cells were additionally co-transfected with the human EGF receptor HER1. In agreement with previous publications, incubation of IHKE-hOAT1 cells with EGF increased fluorescein uptake via basolateral hOAT1. In opposite, EGF inhibited hOAT1 mediated fluorescein uptake across the apical membrane of IHKE-hOAT1 cells. Additionally EGF inhibited hOAT1 mediated fluorescein uptake into non polarized CHO-hOAT1-HER1 cells, too. In summary, we confirmed that EGF stimulates basolateral uptake of organic anions (a) in proximal tubular cells mediated by hOAT1. However, EGF inhibits hOAT1 located in the apical membrane (b) or in non polarized cells (c). Renal failure is associated with successive loss of epithelial polarity. Therefore, inverted regulation of hOAT1 falsely located in the apical membrane of proximal tubular cells may be part of a mechanism stabilizing organic anion secretion in pathophysiological situations. KW - Niere KW - EGF KW - hOAT1 KW - Transporter KW - kidney KW - EGF KW - hOAT KW - transporter Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18901 ER - TY - THES A1 - Hilbert, Fabian Michael T1 - Neue Methoden und Modelle für die diffusionsgewichtete Magnetresonanztomographie der Niere T1 - New methods and models for diffusion-weighted magnetic resonance imaging of the kidney N2 - Diffusionsgewichtete MR-Bilder sind ein wichtiger Bestandteil für die klinische Diagnostik verschiedener Pathologien, wie z.B. bei Schlaganfall oder Tumoren. Meistens wird ein mono-exponentielles Diffusionsmodell verwendet und über verschiedene Raumrichtungen gemittelt. Der Einfluss von Fluss auf das diffusionsgewichtete Signal und eine mögliche Richtungsabhängigkeit werden dabei vernachlässigt. Dabei machen Diffusionsmodelle, die mehr Eigenschaften des Signals abbilden, unter Umständen eine genauere Diagnostik möglich. Mit DTI wird die Richtungsabhängigkeit der Diffusion erfasst und bei IVIM wird der Beitrag von Fluss zum Signal berücksichtigt. Die Niere ist ein stark strukturiertes Organ und weist Anisotropie in der Diffusion auf. Außerdem ist die Niere ein sehr gut durchblutetes Organ. DTI und IVIM beschreiben also unabhängig voneinander zwei wichtige Aspekte des diffusionsgewichteten Signals in der Niere, ohne dass der Vorteil des jeweils anderen Modells Beachtung findet. In dieser Arbeit wurde das Modell IVOF zur umfassenden Beschreibung von Diffusionssignal vorgestellt, bei dem sowohl die Richtungsabhängigkeit der Diffusion, als auch das Signal der fließenden Spins und deren Richtungsabhängigkeit abgebildet wird. Die Vorteile von DTI und IVIM werden also in IVOF vereint und darüber hinaus auch die mögliche Anisotropie die Flusssignals berücksichtigt. Es konnte gezeigt werden, dass dieses Modell das diffusionsgewichtete Signal in der menschlichen Niere besser beschreibt als die herkömmlichen Modelle (DTI und IVIM) und auch besser als eine Kombination von DTI und IVIM, bei der ein isotroper Flussanteil des Signals angenommen wird. Es wurde weiterhin gezeigt, dass selbst wenn der Flussanteil im verwendeten Diffusionsmodell berücksichtigt wird, der tatsächlich gemessene Flussanteil in der Niere von der Art der Messung, d.h. Bewegungsempfindlichkeit des Gradientenschemas abhängt. Das bedeutet, dass der mikroskopische Fluss in der Niere nicht, wie häufig angenommen, komplett zeitlich inkohärent ist. Bei Vergleichen von IVIM Studien an der Niere ist es deshalb notwendig, die Bewegungsempfindlichkeit der jeweiligen Gradientenschemata zu berücksichtigen. Wie groß das absolute Verhältnis von kohärent zu inkohärent fließendem Signal ist, konnte nicht festgestellt werden. Ebenso wenig konnte die absolute Flussgeschwindigkeit bzw. die Art des Flusses (Laminare Strömung, Pfropfenströmung, oder andere) ermittelt werden. TSE hat sich als vielversprechendes, artefaktfreies Verfahren für die Aufnahme diffusionsgewichteter Bilder der Niere gezeigt. Im Vergleich mit dem Standardverfahren EPI wurden ähnliche Werte der Parameter von DTI und IVIM gefunden. Abweichungen zwischen EPI und TSE sind vor allem durch die Unschärfe der TSE Bilder aufgrund von T2-Zerfall zu erklären. Bis zur klinischen Anwendbarkeit diffusionsgewichteter TSE Bilder bzw. Parameterkarten sind noch einige Weiterentwicklungen der Methode nötig. Vor allem sind schärfere TSE Bilder erstrebenswert und es sollten mehrere Schichten in einer klinisch vertretbaren Zeitspanne aufgenommen werden, ohne dass dabei die zulässigen SAR Grenzwerte überschritten werden. Bei allen Untersuchungen in dieser Arbeit handelt es sich um Machbarkeitsstudien. Daher wurden alle Messungen nur an erwachsenen, gesunden Probanden durchgeführt, um zu zeigen, dass das jeweilige vorgeschlagene Modell zu den Daten passt bzw. dass die vorgeschlagene Methode prinzipiell funktioniert. Bei welchen Pathologien die hier vorgeschlagenen Methoden und Modelle einen diagnostischen Nutzen haben, muss in zukünftigen Studien erforscht werden. Außerdem wurden keine b- Werte zwischen 0 und 200 s/mm2 aufgenommen, bei denen fließende Spins noch signifikant zum Signal beitragen. Betrachtet man die Ergebnisse der Diffusionsbildgebung mit verschiedenen m1 in dieser Arbeit, dann ist neben dem b-Wert auch die Bewegungsempfindlichkeit m1 nötig, um das Signal in diesem Bereich korrekt zu beschreiben. Alles in allem sollte der Beitrag von Fluss zum diffusionsgewichteten MR-Signal in der Niere immer berücksichtigt werden. Die vielfältigen Einflüsse, die unterschiedliche Parameter auf das Signal von Mikrofluss haben, wurden in dieser Arbeit untersucht und präsentieren weiterhin ein spannendes Feld für kommende Studien. Diffusionsgewichtete TSE Sequenzen sind auch für die klinische Diagnostik eine potentielle Alternative zu Artefakt-anfälligen EPI Sequenzen. Bis dahin sollten jedoch die Bildschärfe und Abdeckung der diffusionsgewichteten TSE Sequenz weiter verbessert werden. N2 - Diffusion-weighted magnetic resonance (MR) imaging plays an important role in clinical diagnosis of various pathologies, such as stroke or tumors. Oftentimes a mono-exponential diffusion model is used and multiple diffusion directions are averaged. The potential influence of flow and a possible anisotropy of the signal are then neglected. Diffusion models that take these properties of the signal into account may allow a more accurate diagnosis. Diffusion tensor imaging (DTI) captures the directional dependence of diffusion, while the Intravoxel Incoherent Motion (IVIM) model accounts for the contribution of flow to the signal. Kidneys are strongly structured organs and exhibit anisotropic diffusion. Furthermore, kidneys are well perfused organs. DTI and IVIM both describe independently two important features of the diffusion-weighted signal in the kidneys, but neglect the advantages of the other model. The here presented work introduces a comprehensive diffusion model named Intravoxel Oriented Flow (IVOF). IVOF includes the possibilities of anisotropic diffusion and of flow. This way IVOF combines the advantages of DTI and IVIM and furthermore, accredits the possibility of anisotropic flow signal. It was shown that this model fits diffusion-weighted signal in the human kidney better than the standard diffusion models DTI and IVIM. IVOF even performs better than a combination of DTI and IVIM with an isotropic flow fraction. Moreover, it was shown that the actually measured flow fraction of the diffusionweighted signal in the kidneys depends on the imaging protocol, i.e. on the first gradient moment m1 of the diffusion gradient scheme. This means that the microscopic flow in the kidneys is not completely temporally incoherent, in contrast to what is often assumed. Therefore, a comparison of renal IVIM studies needs to pay attention to the used gradient schemes and their respective m1. The absolute ratio of coherent to incoherent flow signal could not be determined in this work and is subject to future work. The flow profile (whether laminar flow, plug flow or other) and the mean flow velocity should also be investigated in further studies. Turbo-Spin-Echo (TSE) proofed to be an artifact-free and promising tool for acquiring diffusion-weighted images of the kidney. Similar DTI and IVIM parameters were found when images where acquired with TSE compared to Echo-Planar Imaging (EPI). Differences between parameters acquired with EPI and TSE may be explained by blurring in the TSE images, which is caused by T2 -decay. Before diffusion-weighted TSE images and parameter maps can be used for clinical diagnosis, some further improvements of the method are necessary. Sharper TSE images are preferable and multiple slices need to be acquired within a clinically reasonable scan time without exceeding specific absorption rate limits. All studies described in this work are feasibility studies. For this reason, all measurements were performed on healthy, adult volunteers to show that the proposed diffusion model fits the data or that the proposed acquisition method works in principle. The diagnostic value of the here proposed methods and models should be investigated in future studies. No b-values between 0 and 200 s/mm2 were acquired. In this range, the signal of flowing spins contributes significantly to the total signal. With regard to the results in this work concerning diffusion-weighted imaging with multiple first gradient moments it is likely that the b-value is not sufficient to describe the signal in this regime. The first gradient moment of the diffusion-weighting gradients may be crucial to describe the signal correctly. All in all it is important to always consider the contribution of flow to the diffusionweighted MR signal in the kidneys. Manifold influences of acquisition parameters to the signal of micro flow were presented in this work and provide an interesting field for further research. Diffusion-weighted TSE sequences are a potential alternative to artifact-prone EPI sequences. However, for clinical application of diffusion-weighted TSE blurring needs to be reduced and 3-dimensional coverage should be increased. KW - Diffusionsgewichtete Magnetresonanztomografie KW - Niere KW - Diffusion Tensor Imaging KW - Intravoxel Incoherent Motion KW - Kidney KW - Turbo Spin Echo Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-141149 ER - TY - THES A1 - Hoffmann, Dana T1 - Neue Biomarker zum Nachweis von Nierentoxizität T1 - Novel Biomarker of Nephrotoxicity N2 - Der Prozess von der Entdeckung und Entwicklung eines potentiellen Arzneistoffs bis zu dessen Zulassung ist extrem kosten‐ und zeitintensiv und eine Vielzahl dieser Stoffe kann aufgrund toxischer Nebenwirkungen in präklinischen Studien nicht weiterentwickelt werden. Dabei ist die Niere eines der Hauptziele von Xenobiotika‐induzierter Organtoxizität, jedoch ist eine frühe Detektion von Nierenschäden schwierig. Den derzeitig verwendeten klinischen Parameter, wie Blutharnstoff (BUN) und Serumkreatinin fehlt es an Sensitivität und Spezifität, da sie Fremdstoff‐induzierte Toxizität meist erst aufzeigen, wenn schon ein erheblicher Teil der Nierenfunktion beeinträchtigt ist. Daher ist es notwendig, empfindlichere und zuverlässigere Biomarker zu identifizieren und zu validieren, welche kleinste Nierenschädigungen früher als traditionelle Parameter erkennen. In den letzten Jahren wurden in der Literatur aber auch von verschiedenen Projekten eine Reihe neuer gen‐basierender und Urinbiomarker (Kim‐1, Clusterin, Lipocalin‐2, Timp‐1) identifiziert. Ziel dieser Dissertation war es die Aussagekraft dieser Marker im Vergleich zu traditionellen Endpunkten, einschließlich klinische Chemie und Histopathologie an Gewebe‐, Urin‐ und Serumproben von männlichen Ratten, welche mit Modellsubstanzen für Nephrotoxizität (Aristolochiasäure und Gentamicin) oder nephrotoxischen Arzneistoffkandidaten (PredTox Projekt) behandelt wurden, mittels qRT‐PCR, Immunhistochemie und ELISA zu untersuchen. Zusammenfassend kann man sagen, dass die Effekte auf Ebene der Gen‐ und Proteinexpression generell sehr gut mit den histopathologischen Veränderungen korrelieren. Sie konnten meist früher oder in niedrigeren Dosierungen als die traditionellen Nierenmarker BUN und Serumkreatinin detektiert werden. Eine erhöhte Expression und Exkretion von Kim‐1 zeigte sich in allen Studien als eine der frühesten Antworten auf Schädigung der proximalen Tubuli und stellt somit den empfindlichsten Biomarker dar. Die erhöhte Ausscheidung von Clusterin konnte teilweise vor einer veränderten Gen‐ und Proteinexpression im Gewebe detektiert werden und unterstützen die Verwendung von Clusterin als nicht‐invasiven Biomarker. Obwohl eine gesteigerte Exkretion von Lipocalin‐2 sehr früh nach Schädigung des proximalen Tubulus detektiert werden konnte, ist diese nicht spezifisch für einen Nierenschaden. Dennoch könnte die vermehrte Expression/Ausscheidung von Lipocalin‐2 als frühe Antwort auf eine Entzündung oder einen Gewebeschaden eine sinnvolle Ergänzung der routinemäßigen Testung auf Toxizität darstellen. Ebenfalls konnte ein dosis‐ und zeitabhängiger Konzentrationsanstieg von einem Großteil der potentiellen Biomarker des „WideScreen™ Rat Kidney Toxicity Panels 1 and 2“ im Urin beobachtet werden. Da jedoch die potentiellen Biomarker unterschiedliche Empfindlichkeiten besitzen und unter Umständen auch vom Mechanismus der Toxizität von Verbindungen abhängen, erscheint eine Kombination von verschiedenen Biomarkern zur frühzeitigen Erkennung von proximalen Nierenschäden sowie zur Verlaufskontrolle von Nierenerkrankungen sinnvoll. Durch die einfache Probenahme und leichte Bestimmung ist die Messung der neuen potentiellen Nierenbiomarker im Urin neben der Bestimmung der traditionellen Parameter der klinischen Chemie sowie der Histopathologie sinnvoll für die Identifizierung von Nierenschädigungen in präklinischen Studien. N2 - The discovery and development of new drugs is very costly and time‐consuming and the rate of drug failure due to late‐breaking findings in preclinical toxicity studies is high. The kidney is a major target of xenobiotic induced organ toxicity but early detection of renal damage or minor effects on renal function is challenging due to the functional reserve of the kidney. Current clinical pathology parameters of nephrotoxicity such as blood urea nitrogen (BUN) and serum creatinine are relatively insensitive and non specific, revealing kidney damage not until 70‐80 % of the renal epithelial mass has been lost. There is a clear need for the identification and validation of more sensitive and reliable biomarkers, which are indicators of minimal kidney damage rather than impaired kidney function. Recently a range of novel gene‐based and urinary kidney biomarker (Kim‐1, clusterin, lipocalin‐2 and Timp‐1) was identified from literature and various colloraborative projects. The aim of this work was to investigate the performance of these markers compared to traditional endpoints, such as clinical chemistry and histopathology in tissue, urine and serum samples collected from studies, in which male Wistar rats were treated either with model compounds of nephrotoxicity (aristolochic acid and gentamicin) or drug candidates (PredTox) using qRT‐PCR, immunohistochemistry and ELISA. In summary, effects on marker gene and protein expression generally correlated well with the renal histopathology alterations and were frequently detected at earlier time‐points or lower doses than the traditional clinical parameters BUN and serum creatinine. Overexpression and enhanced urinary excretion of Kim‐1 was one of the earliest responses to proximal tubule damage and might be seen as the most sensitive marker of nephrotoxicity. Furthermore, urinary Clusterin was increased before changes in gene and protein expression or even histopathological alterations were evident, confirming urinary clusterin as a sensitive, non‐invasive marker for renal injury. Although changes in urinary lipocalin‐2 occurred very early after proximal tubule damage, lipocalin‐2 may not specific for kidney injury. However, its rapid response to inflammation and tissue damage in general may reinforce its use in routine toxicity testing. A dose‐ and time‐dependent increase in most of the novel urinary biomarkers was evident using the “WideScreen™ Rat Kidney Toxicity Panels 1 and 2”. Due to the the variable sensitivity of a single biomarker, a combination of many different biomarkers to detect kidney injury appears to be useful. Concerning of the easy sampling and measurement, the additional determination of potential urinary biomarkers of nephrotoxcity next to the traditional clinical chemistry parameters and histopathological changes is helpful to identify kidney damage at early time‐points. KW - Biomarker KW - Nephrotoxizität KW - Niere KW - biomarker KW - nephrotoxicity KW - kidney Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48562 ER - TY - THES A1 - Hoppensack, Anke T1 - Entwicklung eines humanen In-vitro-Modells des renalen proximalen Tubulus T1 - Development of a human in vitro model of the renal proximal tubule N2 - Die Epithelzellen des renalen proximalen Tubulus resorbieren große Mengen an Wasser, Glucose und weiteren wertvollen Substanzen aus dem Primärharn, um deren Ausscheidung zu verhindern. Weiterhin sekretieren sie harnpflichtige Substanzen in den Primärharn und sind in der Lage, in die Zelle aufgenommene Substanzen enzymatisch umzusetzen. Diese Funktionen machen den renalen proximalen Tubulus zu einer wichtigen Einheit für die Nie-renfunktion. Sie führen aber auch zu einer hohen Empfindlichkeit gegenüber toxischen Effek-ten von Fremdstoffen. Daher ist ein In-vitro-Modell des renalen proximalen Tubulusepithels sowohl für die Erforschung physiologischer und pathologischer Mechanismen als auch zur Testung der Toxizität von Substanzen, insbesondere neuen Arzneimitteln, bedeutend. Ein weiteres Forschungsfeld, für das ein In-vitro-Gewebe von großem Nutzen wäre, ist die Ent-wicklung von bioartifiziellen Nierenersatzsystemen. Aufgrund Spezies-spezifischer Unterschiede, z.B. in der Expression von Transportproteinen und Enzymen, ist ein Modell mit humanen Zellen anzustreben. Bisher besteht jedoch ein Mangel an Modellen, die das renale proximale Tubulusepithel für die oben genannten An-wendungsbereiche adäquat abbilden. Das Ziel dieser Arbeit war deshalb der Aufbau eines humanen In-vitro-Modells des renalen proximalen Tubulus unter Verwendung von humanen Nierenzellen (human kidney-derived cells, hKDCs), die Eigenschaften renaler Vorläuferzellen aufweisen. In Kombination mit die-sen Zellen wurden verschiedene Kultursubstrate getestet. Dabei zeigte sich, dass die Zellen sowohl in Zellkulturplatten als auch auf Kollagen-Typ-I-beschichteten Insertmembranen mehrschichtig wachsen, ohne die typische Morphologie renaler proximaler Tubuluszellen auszubilden. In einem dreidimensionalen Kollagen-Typ-I-Hydrogel bildeten die hKDCs hin-gegen tubuläre bzw. zystäre Strukturen mit einer kubischen bis hochprismatischen Morpho-logie. Da für die oben erwähnten Anwendungsbereiche jedoch eine planare Zellschicht benö-tigt wird, erfolgte die Testung weiterer biologischer Matrices. Diese waren die Small intestinal submucosa (SIS) und das Biological vascularized scaffold (BioVaSc). Beide ließen sich aus porcinem Dünndarm herstellen, wobei bei der SIS die Mucosa sowie das Mesenterium ent-fernt wurden. Bei der BioVaSc handelt es sich um ein Darmsegment mit erhaltenem Ge-fäßsystem, dass zur Perfusion genutzt wird. Nach ihrer Kultur auf der SIS wiesen die hKDCs das typische Wachstum und die charakteris-tische Morphologie des renalen proximalen Tubulusepithels auf. Dazu gehören die Kontakt-hemmung, die das einschichtige Wachstum ermöglicht, die kubisch bis hochprismatische Morphologie sowie die Bildung eines Bürstensaums an der apikalen Zellmembran. Anhand einer Kollagen-Typ-IV- und einer Alcianblau-Färbung ließ sich die Bildung einer Basalmemb-ran an der Grenze zur SIS nachweisen. Bürstensaum- und Basalmembranbildung zeigten die zelluläre Polarisierung. Weiterhin waren typische Markerproteine renaler proximaler Tu-buluszellen wie N-Cadherin und Aquaporin-1 immunhistochemisch, zum Teil deutlich stärker als bei den Ausgangszellen, nachweisbar. Dies belegt einen positiven Einfluss der extrazellu-lären Matrixkomponenten der SIS auf die Ausbildung von Charakteristika des renalen proxi-malen Tubulusepithels. Die Albuminaufnahme als spezifische Funktion war ebenfalls nach-weisbar. Die molekularen Veränderungen der hKDCs während der Kultivierung auf der SIS ließen sich weiterhin mittels Raman-Spektroskopie bestätigen. Aufgrund der starken Interak-tion zwischen Tubulusepithel und umgebenden Kapillarnetzwerk wurde weiterhin die Co-Kultur mit Endothelzellen etabliert. Für den Vergleich der hKDCs mit einer etablierten humanen Zelllinie renaler proximaler Tu-buluszellen wurde die HK-2-Zelllinie verwendet. Mit dieser Zelllinie ließen sich die Ergebnisse der hKDCs jedoch nicht reproduzieren, was auf die fehlende Sensitivität der transformierten Zelllinie auf die Substrateigenschaften zurückzuführen ist. In der dynamischen Kultur mit der BioVaSc als Matrix waren ein inhomogenes Wachstum sowie eine variierende Markerexpression zu beobachten. Die ließ sich vor allem auf den starken Einfluss der Aussaatdichte sowie die Festigkeit der Matrix zurückführen. Bei einer erfolgreichen Optimierung der Kultur kann dieses Modell jedoch für komplexere Studien in der pharmakologischen Entwicklung nützlich sein. Mit der Kombination aus hKDCs und SIS ist es gelungen, eine einzelne, durchgängige Zell-schicht zu generieren, die wichtige Charakteristika des renalen proximalen Tubulusepithels aufweist. Weitere Untersuchungen sind nun nötig, um die Funktionalität des Modells weiter-gehend zu charakterisieren (z.B. der Transport von Substanzen und Sensitivität gegenüber toxischen Substanzen). Anschließend kann es für die spezifischen Anwendungen weiterentwickelt werden. N2 - The epithelial cells of the renal proximal tubule resorb high amounts of water, glucose and other valuable substances from the primary urine to prevent their excretion. Furthermore, they secrete metabolic waste products into the primary urine and are able to enzymatically alter absorbed substances. These functions make the renal proximal tubule an important unit for kidney function, but also lead to a high sensitivity towards toxicity of xenobiotics. There-fore, an in vitro model of the renal proximal tubular epithelium is important not only for the investigation of physiological and pathological processes, but also for toxicity testing of sub-stances, in particular, new pharmaceuticals. A further research area, for which an in vitro tis-sue would be of great value, is the development of bioartificial kidney assist devices. Due to species-specific differences, e.g. regarding the expression of transport proteins and enzymes, a model with human cells should be aimed. Until recently, there has been a lack of models that adequately simulate the renal proximal tubular epithelium for the above men-tioned fields. Therefore, the aim of this work was to develop a human in vitro model of the renal proximal tubule using human kidney-derived cells (hKDCs), which exhibit renal progenitor cell charac-teristics. Different culture substrates were tested in combination with these cells. hKDCs in cell culture plates as well as on collagen type I-coated insert membranes grew in multilayers without developing the typical morphology of renal proximal tubular cells. In contrast, in a three-dimensional collagen type I hydrogel, hKDCs formed tubular and cystic structures with a cubic to high-prismatic morphology. However, since a planar cell layer is required for the above mentioned research fields, small intestinal submucosa (SIS) and the biological vascu-larized scaffold (BioVaSc) were tested, which are both made of porcine small intestine. For SIS production, the mucosa and the mesenterium were removed, whereas the BioVaSc is a segment of the small intestine with a preserved vascular system, which can be used for per-fusion. Following their culture on the SIS, hKDCs featured the typical growth and characteristic mor-phology of the renal proximal tubule epithelium. hKDCs were contact-inhibited, which allows monolayered growth; they had a cubic to high-prismatic morphology and developed a brush border at their apical cell membrane. By collagen type IV and alcian blue staining, the for-mation of a basement membrane at the cell-matrix border was detectable. Brush border and basement membrane formation showed cellular polarization. Furthermore, marker proteins of renal proximal tubular cells such as aquaporin-1 and N-cadherin were shown by immuno-histochemistry, which were partially stronger than before SIS culture. This demonstrates a positive influence of the extracellular matrix components of the SIS on the development of characteristics of the renal proximal tubular epithelium by hKDCs. Albumin uptake as a spe-cific function was likewise detectable. The molecular changes of hKDCs during their culture on the SIS were also identified by Raman spectroscopy. Due to the strong interaction of the tubule epithelium with the peritubular capillaries, the co-culture of hKDCs with endothelial was established as well. For comparison of hKDCs with a well-established human cell line of renal proximal tubular origin, the HK-2 cell line was used. With this cell line, the results of hKDCs were not repro-ducible, which can be explained by the lacking sensitivity of the transformed cell line towards the substrate properties. In the dynamic culture with the BioVaSc scaffold, an inhomogeneous growth and a varying marker expression were observed. This was ascribed to the strong influence of the cell seed-ing density and the low matrix stiffness. If successfully optimized, this culture model can be useful for more complex studies in the pharmacological development. In summary, with the combination of hKDCs and the SIS, a single, continuous cell layer could be generated that exhibits essential characteristics of the renal proximal tubular epithelium. More studies are required to further characterize the functionality of the model (e.g. transport of substances and sensitivity towards toxic substances). Subsequently, it can be further de-veloped for specific applications. KW - Niere KW - In vitro KW - Tissue Engineering KW - Gewebekultur KW - Zellkultur KW - Tissue Engineering KW - Kidney KW - in vitro Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-81562 ER - TY - THES A1 - Islinger, Florian T1 - Untersuchungen zum Wirkmechanismus des klinisch angewandten Schwermetallchelators 2,3-Dimercapto-1-Propansulfonsäure (DMPS) T1 - Investigation of the renal handling of the heavy metal chelator DMPS (2,3-dimercapto-1-propanesulfonic acid) N2 - Die Niere stellt das wichtigste Zielorgan für die Akkumulation von anorganischem Quecksilber dar. Versuche an Ratten ergaben, dass bereits wenige Stunden nach Injektion einer geringen Menge Quecksilberchlorid 50% dieser Dosis in den Nieren akkumuliert war. Durch verschiedene Untersuchungen wurden die proximale Tubuli (Pars convoluta et recta) als Ort der Quecksilber-Anreicherung identifiziert. Der Schwermetallchelator DMPS (2,3-Dimercapto-1-Propansulfonsäure) ist heutzutage das Mittel der Wahl für die Behandlung von Vergiftungen mit anorganischem Quecksilber. DMPS hat sich gegenüber dem früher verwendeten BAL aus mehreren Gründen als überlegen erwiesen: in klinischen Tests bezüglich der Quecksilberentgiftung zeigt DMPS die größere Wirksamkeit, kann oral angewendet werden und ist zudem weitaus weniger toxisch als sein Vorgänger BAL. Jedoch war der Wirkmechanismus von DMPS nicht genau bekannt. Allerdings existieren zahlreiche in-vivo- und in-vitro-Studien, die zeigen, dass das organische Anion DMPS ein Substrat des „klassischen Organische-Anionen-Transportsystems“ bzw. des 1997 klonierten, tertiär aktiven Anionenaustauschers OAT1 sein könnte. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob eine direkte Interaktion zwischen DMPS und OAT1 stattfindet und DMPS ein Substrat von OAT1 ist. Von entscheidendem Interesse war dabei die Frage, ob der Redoxzustand von DMPS (reduziert-monomer, oxidiert-dimer) einen Einfluß auf einen möglichen Transport durch OAT1 hat. Darüber hinaus sollte die Rolle von Albumin, welches unter physiologischen Bedingungen im Blutkreislauf des Menschen in hoher Konzentration vorhanden ist, bei diesem Vorgang geklärt werden. In einem zweiten Teil lag das Interesse auf den Mechanismen, die DMPS und v.a. den intrazellulär gebildeten Quecksilber-DMPS-Komplex (Hg-DMPS-Chelat) aus der Tubuluszelle sezernieren und damit aus dem Organismus eliminieren. Dabei sollte insbesondere die Rolle des apikal lokalisierten, passiven Transporters OAT-K2 („kidney-specific“ Organische-Anionen-Transporter 2) geklärt werden. Die Untersuchung der Transportvorgänge an hOAT1 (menschliches Ortholog von OAT1) und OAT-K2 wurden an Xenopus laevis Ooztyen, HeLa-Zellen sowie OK-Zellen durchgeführt Das organische Anion DMPS war sowohl in reduzierter als auch in oxidierter Form in der Lage, den Transport von PAH kompetitiv zu hemmen: Ki (reduziertes DMPS) = 22.4 mM bzw. Ki (oxidiertes DMPS) = 66.0 mM DMPS-Äquivalente. Bei Anwesenheit von 0.1mM Albumin erlosch die Hemmung des PAH-Transports durch reduziertes und oxidiertes DMPS vollständig. Albumin alleine hatte hingegen keinen Einfluß auf den PAH-Transport durch hOAT1. Die Transstimulations-Experimente an hOAT1-transfizierten HeLa-Zellen zeigten, dass reduziertes und oxidiertes DMPS den Efflux von PAH stimulieren konnten: innerhalb von drei Minuten wurden so 10 bzw. 8% des PAH-Zellgehaltes aktiv über hOAT1 aus der Zelle sezerniert. Das Hg-DMPS-Chelat hatte im Gegensatz zu den beiden Einzelkomponenten Quecksilber und DMPS keinen hemmenden Einfluß auf den PAH-Transport in Oozyten. Damit hat der Komplex auch keine Affinität zu hOAT1, womit der basolaterale Weg für die Elimination des gebundenen Quecksilbers aus der Zelle keine Rolle spielt. Untersuchungen an OAT-K2 konnten aufgrund eines zu niedrigen Expressionsniveaus des Transporters in Oozyten und MDCK-Zellen nicht durchgeführt werden. OK-Zellen, die OAT1 aufgrund ihres Ursprungs aus dem proximalen Tubulus des Opossums endogen exprimieren, waren in der Lage, reduziertes DMPS transzellulär zu sezernieren. Ein Teil dieses Transports konnte durch PAH inhibiert werden. Damit zeigte sich nicht nur, dass hOAT1 DMPS als Substrat für den Transport über die basolaterale Membran akzeptiert, sondern darüber hinaus auch, dass in der apikalen Membran der Tubuluszelle Transporter lokalisiert sind, die DMPS in das Tubuluslumen sezernieren können. Die vorliegenden Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass hOAT1 eine tragende Rolle im Wirkmechanismus des Quecksilberantidots DMPS spielt: hOAT1 ist entscheidend am Transport von DMPS an den Ort der Vergiftung, die proximale Tubuluszelle, beteiligt. Dabei spielt es keine Rolle, ob die reduzierte oder oxidierte Form am Transporter vorliegt, da beide nachweislich Substrate von hOAT1 sind. Von wesentlicher Bedeutung ist die lockere Bindung von DMPS an Albumin, die DMPS einerseits vor einer raschen glomerulären Filtration bewahrt, andererseits aber durch einfaches Abdiffundieren eine rasche Gleichgewichtseinstellung mit dem perivaskulären Intersitium der Niere und anschließenden Transport in die Tubuluszelle erlaubt. Das intrazellulär gebildete Hg-DMPS-Chelat hat im Gegensatz zu DMPS keine Affinität zu hOAT1, wodurch eine Rückkehr des mobilisierten Quecksilbers in den Körperkreislauf auf diesem Weg verhindert wird. N2 - The kidney is the primary target organ in which inorganic mercury (Hg2+) accumulates and expresses its toxic effects. It has been shown that the chelating agent DMPS can rapidly reduce the renal burden of mercury and increase the urinary excretion of mercury. However, the cellular and molecular basis of its efficacy is still unknown. A number of previous studies implicated that the "classical organic anion secretory pathway" is involved in the secretion of DMPS and its chelating products. In this study we used the human isoform of the Organic Anion Transporter (hOAT1) expressed in the Xenopus oocytes expression system to study the interaction of DMPS and its mercury chelates with hOAT1. [3H]PAH was used to show the transport activity of hOAT1 (Km=3.9 mM ±1.3). Uptake of [3H]PAH was inhibited by DMPS (Ki=22.4 mM ± 8.4). We also investigated the interaction of oxidized DMPS with hOAT1 since it has been shown that at least 80% of DMPS in the blood is oxidized within 30min. Oxidized DMPS also inhibited uptake of [3H]PAH (Ki=66 ±13.6mM). In contrast, we found no interaction of the DMPS-Hg-Chelate with hOAT1. To determine whether reduced and oxidized DMPS are transported by hOAT1 we examined the effect of inwardly directed anion gradients on [3H]PAH-loaded HeLa-cells transiently transfected with hOAT1: PAH, DMPS and oxidized DMPS significantly transstimulated efflux of [3H]PAH. These data suggest that hOAT1 can transport reduced and oxidized DMPS, whereas the DMPS-Hg-Chelate does not seem to have any affinity for the transporter. Therefore hOAT1 seems to play a fundamental role in the antidotal action of DMPS by giving the antidote access to the cells of the proximal tubule, the primary site of mercury accumulation. Moreover, the formation of the DMPS-Hg chelate in the blood plasma prevents more mercury from accumulating in the kidney and, once the DMPS-Hg-Chelate has formed inside the tubule cell, no back leak to the blood via hOAT1 is possible because the DMPS-Hg-Chelate has no affinity to hOAT1. The importance of other mechanisms, particularly transport of DMPS and its chelates across the apical membrane of proximal tubule cells, are at present not known. KW - Quecksilber KW - DMPS KW - OAT1 KW - Niere KW - mercury KW - DMPS KW - OAT1 KW - kidney Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6358 ER - TY - THES A1 - Kerl, Hans Ulrich T1 - Charakterisierung interagierender Proteine des renalen ATP-abhängigen Kaliumkanals ROMK T1 - Characterisation of interacting proteins of the renal ATP- dependent potassium channel ROMK N2 - ROMK ist ein einwärts-gleichrichtender Kaliumkanal, der hauptsächlich in der Niere exprimiert wird. Er wird dabei vor allem in der apikalen Membran des aufsteigenden Astes der Henleschen Schleife, dem distalen Tubulus und dem Sammelrohr exprimiert. Die Hauptaufgaben von ROMK bestehen in der Rezirkulation von Kalium im dicken aufsteigenden Ast der Henleschen Schleife und der Kaliumsekretion im kortikalen Sammelrohr. ROMK wurde kloniert und in Oozyten exprimiert. Die Expression sowie Struktur- und Funktionsstudien haben viele Informationen über die Biophysik und die Regulation dieses Kanals gebracht. Dennoch ist bisher wenig über die für den Transport zur apikalen Membran von Epithelzellen verantwortlichen Mechanismen des Kanals bekannt. Der C- Terminus von ROMK ist aufgrund einer sehr hohen Homologie zu einem PDZ-Motiv ein möglicher Teilnehmer an Protein- Protein Interaktionen. In einem Hefe-zwei-Hybrid Screen wurden verschiedene mögliche Interaktionspartner gefunden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde versucht, die Interaktion zwischen einigen im Hefe-System gefundenen Proteinen und dem Kanalprotein zu identifizieren, verifizieren und charakterisieren. In dem in vitro HIS- Pulldown Assay konnten die im Hefe-zwei-Hybrid System gefundenen Interaktionen zwischen ROMK und HEF1, Antiquitin1 sowie Calponin2 bestätigt werden. Ebenso war es möglich, durch Kolokalisationsstudien mittels indirekter Immunfluoreszenz weitere Anhaltspunkte für eine mögliche Interaktion von ROMK und Antiquitin1, Calponin2, Shank und ArgBP2 zu liefern. Diese Ergebnisse legen die Vermutung nahe, dass die gefundenen Interaktionspartner zum einen für den Einbau und die Stabilität von ROMK in der Membran zuständig sein und zum anderen durch Verbindung zu möglichen Signalkomplexen, z.B. durch ArgBP2, ein Rolle in der Aktivitätssteuerung von ROMK spielen könnten. KW - Kaliumkanal KW - Niere KW - Protein-Protein-Interaktion KW - PDZ-Domäne KW - GST KW - HIS KW - Immunfluoreszenz KW - Potassium Channel KW - Kidney KW - Protein-Protein Interaction KW - PDZ-Domain KW - GST KW - HIS KW - Immunfluorescence Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13506 ER - TY - THES A1 - Kroiß, Matthias T1 - Die subzelluläre Verteilung des Regulatorproteins RS1 in Nierenepithelzellen T1 - The sucbcellular distribution of the regulatory protein RS1 in renal epithelial cells N2 - Diese Arbeit bedient sich der Immunfluoreszenzmikroskopie, um die intrazelluläre Lokalisation des mit der Plasmamembran assoziierten Regulatorproteins RS1 und eines seiner Zielproteine, des Natrium-D-Glucose-Kotransporters SGLT1, in Zellkulturmodellen des Nierenepithels (LLC-PK1- und HEK293-Zellen) zu untersuchen. Zwei polyklonale Antikörper gegen das RS1-Protein des Schweins (pRS1) wurden dafür erzeugt. In Untersuchungen am konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop fand sich pRS1 an der Plasmamembran, im Zellkern, intrazellulär an Vesikeln sowie an einem perinukleären Kompartiment. Die Lokalisation des Proteins im Kern von LLC-PK1-Zellen nahm mit zunehmender Differenzierung der Zellen ab, pRS1 wurde in differenzierten Zellen lediglich im perinukleären Kompartiment gefunden. Dieses wurde in Kolokalisationsstudien als trans-Golgi-Netzwerk (TGN) identifiziert und dort eine Kolokalisation von pRS1 mit Clathrin und Dynamin nachgewiesen. Durch Behandlung der Zellen mit Brefeldin A wurde der Verlust von pRS1 vom TGN induziert. SGLT1 wurde überwiegend in Endosomen nachgewiesen, die entlang von Microtubuli organisiert waren. Auch im trans-Golgi-Netzwerk wurde die Anwesenheit von SGLT1 gezeigt. pSGLT1 kolokalisierte dort mit Dynamin aber nicht mit Clathrin. Es wurde demonstriert, dass experimentelle Hemmung der Proteasoms die Menge an pRS1 drastisch erhöht und gegenläufig die des Natrium-D-Glucose-Kotransporter (pSGLT1) abnimmt. Die gewonnenen Daten wurden in einem hypothetischen Modell zusammengefasst, das die gezeigten Ergebnisse mit früher gewonnenen funktionellen Experimente zu einem schlüssigen Konzept zusammenführt. N2 - RS1 is a negative regulator of solute transporters such as the Na+-D-glucose cotransporter SGLT1 on the transcriptional and posttranscriptional level. RS1 has been shown to reduce SGLT1-mediated substrate uptake upon coexpression in Xenopus oocytes. This effect is paralleled by decreased membrane surface area and can be counteracted by coexpressed dominant negative dynamin. In this study, I used immunofluorescence microscopy to determine the subcellular distribution of RS1 and SGLT1 in two renal epithelial cell lines (HEK293, LLC-PK1) that express RS1 and SGLT1 endogenously. I found that RS1 was present i) at the plasma membrane, ii) within the nucleus, iii) in small vesicles and iv) at the trans-Golgi network (TGN). At the TGN, RS1 was colocalized with clathrin and dynamin. Incubation of cells with brefeldin A abolished the association of RS1 with the TGN. SGLT1 was likewise present at the TGN although the majority of SGLT1 resided in elongated endosomes. The presence of both RS1 and SGLT1 at the TGN suggests that their functional interaction may involve adaptor proteins such as the Golgi localized, gamma-ear-containing, Arf binding (GGA) proteins. Indeed, RS1 contains a unique acidic cluster dileucine motif on its ubiquitin binding associated (UBA) domain, which we found by 3D modeling to be exposed to the surface of RS1. Taken together with previous data, this study leads to a testable model of RS1 function on the posttranscriptional level. KW - Glucose KW - Transporter KW - Regulation KW - Niere KW - Zellkultur KW - glucose KW - transporter KW - regulation KW - kidney KW - cell culture Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-20712 ER - TY - JOUR A1 - Krzymanski, M. A1 - Waaga, A. M. A1 - Ulrichs, Karin A1 - Müller-Ruchholtz, Wolfgang T1 - Long-standing rat kidney graft survival by a combination of organ perfusion with MHC class II monoclonal antibody and immunosuppression with reduced doses of 15-deoxyspergualin. N2 - No abstract available KW - Niere KW - Ratte KW - MHC Klasse II KW - kidney KW - rat Y1 - 1991 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-64442 ER - TY - THES A1 - Leimeister, Cornelia T1 - Identifizierung und Charakterisierung von Genen für die Entwicklung der Nieren und des Urogenitalsystems T1 - Identification and characterization of genes involved in development of the kidney and the urogenital system N2 - Das Studium der Nierenentwicklung gibt Einblicke in generelle entwicklungsbiologische Prozesse wie induktive Wechselwirkungen, mesenchymale Kondensation, mesenchymale-epitheliale Umformung, Determinierung von Zellschicksal sowie Differenzierung und damit auch in die Entstehung congenitaler Fehlbildungen. Nach Induktion durch die Ureterknospe entstehen aus dem metanephrogenen Mesenchym die funktionellen Einheiten der Niere - die Nephrone - und das Nierenstroma. Diesen morphogenetischen Prozessen liegen komplexe regulatorische Veränderungen in der Genexpression zugrunde, die bislang nicht im Detail aufgeklärt sind. Ziel dieser Arbeit war deshalb die Identifizierung bekannter und insbesondere neuer Gene, die durch Induktion im metanephrogenen Mesenchym reguliert werden. Mit Hilfe der ddPCR und Transfilter-Organkulturen wurde die Genexpression von induziertem versus nicht-induziertem Mesenchym aus Mäuse-Nierenanlagen untersucht. Einzelne Kandidaten wurden auf differenzielle Expression durch Northern Blot Analyse überprüft und für die weitere Charakterisierung ausgewählt. Als eines der bekannten Gene wurde sFRP2 als im metanephrogenen Mesenchym induziert bestätigt und durch in situ Hybridisierung ganzer Mäuseembryonen und Paraffinschnitte näher untersucht. Es zeigt eine spezifische und dynamische Expression während der Entwicklung der Niere und anderer Gewebe, die mit den Expressionsmustern von sFRP1 und sFRP4 verglichen wurde. Die detailierte Genexpressionsanalyse der sFRP-Familie in der murinen Embryonalentwicklung sollte als Grundlage für funktionelle Studien dieser erst kürzlich entdeckten neuen Genfamilie dienen. Erste Untersuchungen der ddPCR-Produkte C0-5, J6-3 und M2-4 zeigten, daß es sich um neue Gene handelt, die unterschiedliche Expressionsmuster in der Niere zeigen. Während C0-5 dynamisch in Epithelzellen von Ureter und Nephronvorläufern exprimiert ist, markiert J6-3 Stromazellen und M2-4 ist bereits im kondensierenden Mesenchym, später aber auch in den epithelialen Derivaten nachweisbar. Die Isolierung und Analyse der dem C0-5-ddPCR-Fragment entsprechenden cDNA zeigte, daß sie für ein kollagenartiges Protein codiert, welches beim Menschen in der Nähe des EWS-Gens auf Chromosom 22q12 liegt. Darüber hinaus wurde eine neue zu hairy und dem E(spl)-Komplex verwandte Genfamile identifiziert. Aufgrund ihrer Verwandtschaft und einem charakteristischen YRPW-Tetrapeptid wurden sie als Hey-Gene bezeichnet für: "hairy- und E(spl)-verwandt mit YRPW-Motiv". Sie zeigen gegenüber hairy/E(spl) oder den entsprechenden Vertebraten-Homologen der Hes-Genfamilie veränderte DNA- und Protein-Bindungseigenschaften. Darüber hinaus korrelieren ihre Expressionsmuster häufig mit Genen des Delta-Notch-Signaltransduktionsweg, was auf eine Beteiligung der Hey-Gene an Zelldeterminierung und Bildung von Zellgrenzen hinweist. Diese Vermutung konnte durch die Analyse von Dll1-Knockout-Mäusen für die Somitogenese ansatzweise bestätigt werden. Die Kombination von Transfilter-Organkultur mit ddPCR erwies sich als geeignet, um transkriptionell regulierte Gene des metanephrogenen Mesenchyms zu identifizieren. Expressions- und Sequenzanalyse vor allem der neuen Gene deutet auf ihre Beteiligung an der Entwicklung der Niere und anderer Gewebe hin, die nun im Einzelnen untersucht werden muß. Mehr als 50 weitere Kandidaten für neue Gene bilden eine breite Basis zur weiteren Erforschung molekularer Grundlagen der Nierenentwicklung. N2 - Studies on kidney development provide insights into general processes of embryogenesis like inductive interactions, mesenchymal condensation, mesenchymal-epithelial interactions, cell fate determination as well as differentiation and thereby into the basis of congenital malformations. Once induced by the ureteric bud, the metanephrogenic mesenchyme gives rise to the functional units of the kidney - the nephrons - and the renal stroma. These morphogenetic processes rely on complex regulatory changes in gene expression, which to date are not understood in detail. The present thesis aimed to identify known and primarily novel genes regulated within the metanephrogenic mesenchyme upon induction. Gene expression of induced versus uninduced mesenchyme from murine kidney anlagen was compared using ddPCR together with transfilter organ culture. Several candidates were assayed for differential expression by northern blot hybridization and selected for further characterization. As one of the known genes, sFRP2 was verified to be induced within the metanephrogenic mesenchyme. In situ hybridization of whole-mount mouse embryos and paraffin sections revealed specific and dynamic expression patterns for sFRP2 as well as for the related genes sFRP1 and sFRP4 in the developing kidney and other tissues. The detailed sFRP gene expression analysis was performed to guide functional studies for this recently identified novel gene family. Preliminary investigations of the ddPCR products C0-5, J6-3 and M2-4 revealed that they are all derived from novel genes with distinct expression patterns during kidney development. While C0-5 expression dynamically switches from the ureteric bud to the nephron precursors and the collecting system, J6-3 specifies the stromal cell lineage and M2-4 is already detectable in the condensing mesenchyme with subsequent expression in epithelial derivatives. Isolation and analysis of the C0-5 cDNA resulted in the identification of a collagen-like protein in mice and humans that is located upstream of the EWS gene of the human chromosome 22q12. Additionally, a novel gene family related to hairy and the E(spl)-complex genes has been identified. Because of this relationship and a characteristic YRPW tetrapeptide they were designated as Hey genes for "hairy and E(spl) related with YRPW motif". Compared to hairy/E(spl) or the mammalian Hes proteins they show novel features of DNA-binding and protein interaction. Moreover, their expression patterns frequently correlate with those of members of the Delta-Notch signaling pathway suggesting that Hey genes may participate in this pathway in cell fate decisions and boundary formation. Analysis of Dll1 knockout mice partly confirmed this assumption for Hey1 and Hey2 during somitogenesis. This screen has shown that transfilter organ culture in combination with ddPCR is a powerful tool to identify genes regulated within the metanephrogenic mesenchyme upon induction. Expression and sequence analysis of the novel genes implies a function during development of the kidney and other tissues that can now be studied in further detail. The collection of more than 50 additional candidates for novel genes regulated during nephrogenesis provides a rich resource for future analysis of the networks governing kidney development KW - Niere KW - Entwicklung KW - Molekulargenetik KW - Niere KW - Urogenitalsystem KW - Differential Display PCR KW - Entwicklung KW - In situ Hybridisierung KW - Somitogenese KW - Neurogenese KW - Mesenchym KW - Maus KW - Delta KW - kidney KW - urogenital system KW - differential display PCR KW - development KW - in situ hybridization KW - somitogenesis KW - neurogenesis KW - mesenchyme KW - mouse Y1 - 1999 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1690 ER - TY - THES A1 - Rached, Eva Katharina T1 - Neue Ansätze zur Entwicklung von Alternativmethoden zur Prüfung auf chronische Nierentoxizität N2 - Die Niere ist eines der wichtigsten Zielorgane für Toxizität, allerdings stellt die frühzeitige Erkennung einer Nierenschädigung und/oder kanzerogenen Wirkung infolge einer wiederholten Exposition gegenüber toxischen Verbindungen ein großes Problem dar, da traditionelle Marker für Nierenfunktionsstörungen wenig empfindlich sind. Daher ist es notwendig, verbesserte Testmethoden (Alternativmethoden) zur Prüfung auf chronische Nierentoxizität zu entwickeln. Ziel dieser Arbeit war es daher, mögliche Alternativmethoden zur Prüfung auf Nephrotoxizität nach wiederholter Exposition zu untersuchen. Zum einen wurden dazu in einem in vivo-Modell für chronische Nierentoxizität neue Biomarker für Stress und Gewebeschädigung untersucht, deren erhöhte Genexpression in mehreren Modellen für akute Schädigung des Nierengewebes gezeigt wurde, einschließlich kidney injury molecule-1 (KIM-1), Lipocalin-2 (LCN2), Clusterin (CLU), Osteopontin (OPN), tissue inhibitor of metalloproteinases-1 (TIMP-1), Vimentin (VIM) und Hämoxygenase-1 (HO-1). Diese Marker wurden nachfolgend auch in einem zellkulturbasierten in vitro-Modell untersucht. Ein weiterer Teil der Arbeit befasste sich mit Veränderungen der Zellteilung als möglicher Marker für die Früherkennung kanzerogener Effekte. Das in vivo-Modell bestand in einer Studie in männlichen F344/N-Ratten, die 14, 28 oder 90 Tage oral mit 0, 21, 70 oder 210 µg/kg Körpergewicht (KG) Ochratoxin A (OTA) behandelt wurden. OTA ist ein Mykotoxin, das in Ratten bei wiederholter Gabe eine Nierenschädigung und Nierenkrebs verursacht. Die Analyse der mRNA-Expression der neuen Biomarker in Nierengewebe zeigte bei Tieren, die mit 70 oder 210 µg/kg KG behandelt wurden, eine frühzeitige, zeit- und dosisabhängige Induktion von KIM-1, LCN2, TIMP-1, OPN und CLU, die mit histopathologischen Veränderungen in Form von Zelldegeneration und Regeneration einherging und das Fortschreiten der Schädigung gut widerspiegelte. Auch die mRNA-Expression von HO 1 und VIM wurde durch OTA moduliert, allerdings war eine Erhöhung nicht zu allen Zeitpunkten zu messen bzw. trat nicht so früh auf wie bei den anderen Markern. Effekte auf traditionelle Marker für Nephrotoxizität (Serum-Kreatinin, N-Acetyl-β-D-glucosaminidase und γ-Glutamyltransferase im Urin) wurden im Vergleich zu den neuen Markern zu einem späteren Zeitpunkt und zumeist nur in der Hochdosisgruppe festgestellt. Zusätzlich zu den Effekten auf die Genexpression konnte in den Zielzellen von OTA im proximalen Tubulusepithel eine erhöhte Proteinexpression von KIM-1, CLU, OPN und VIM gezeigt werden; nur für KIM-1 wurde allerdings auch im Urin eine erhöhte Konzentration nachgewiesen, die mit den Effekten auf die mRNA- und Proteinkonzentration im Gewebe korrelierte. Damit stellt KIM-1 in dieser Studie hinsichtlich Empfindlichkeit und Messbarkeit den empfindlichsten Biomarker für Nephrotoxizität dar. Die Untersuchung der Zellteilung nach wiederholter Gabe von OTA zeigte einen dramatischen, zeit- und dosisabhängigen Anstieg der Proliferation von proximalen Tubulusepithelzellen in Nieren von Tieren, die mit 70 oder 210 µg/kg KG behandelt wurden. Dagegen wurden nach wiederholter Exposition gegenüber 21 µg/kg KG über 90 Tage keine OTA-abhängigen Effekte auf die renale Zellproliferation festgestellt. Somit korrelieren die Veränderungen der Zellteilung in der Niere in der 90-Tages-Studie sehr gut mit dem Ergebnis der 2-Jahres-Kanzerogenitätsstudie mit OTA, in der Nierentumoren nur nach Behandlung mit 70 oder 210 µg/kg KG auftraten. Ausgehend von den verschiedenen Endpunkten für Toxizität, die in der Studie untersucht wurden, liegt der no-observed-adverse-effect-level (NOAEL) bei 21 µg/kg KG OTA. Dies entspricht dem NOAEL der 2-Jahres-Kanzerogenitätsstudie. In einem weiteren Teil der Arbeit wurden die neuen in vivo-Biomarker für Nephrotoxizität in NRK 52E-Zellen als in vitro-Modell ausgetestet. Allerdings konnte eine erhöhte mRNA-Expression von KIM-1, einem sensitiven Marker in vivo, nach 24 oder 48 Stunden Behandlung mit verschiedenen nephrotoxischen Modellverbindungen (OTA, Kaliumbromat (KBrO3), Cisplatin oder Cadmiumchlorid (CdCl2)) in den Zellen nicht nachgewiesen werden. Die mRNA-Expression anderer Marker (VIM, CLU, TIMP-1, LCN2, OPN) war dagegen in unbehandelten Zellen bereits so hoch, dass die Behandlung mit Nephrotoxinen zu keiner weiteren Induktion führte. Allein die Gen- und Proteinexpression von HO-1 wurde durch CdCl2, KBrO3 und OTA induziert und könnte daher einen potentiellen Marker für screening-Studien in vitro darstellen. Insgesamt war der Nachweis zytotoxischer Wirkungen jedoch der empfindlichste Endpunkt in der Zellkultur. Die Ergebnisse stützen somit die Verwendung der neuen in vivo-Biomarker als gewebespezifische Marker für Nephrotoxizität in vitro nicht. N2 - The kidney is a main target organ of toxicity, but early detection of kidney damage and/or carcinogenic effects following the repeated exposure to toxic substances presents a major problem, since traditional markers of renal malfunction suffer from lack of sensitivity. Therefore, nephrotoxic effects are often detected only in long-term experiments in animals. Ethical reasons as well as the immense time and costs required for these animal studies have prompted the search for alternative methods by which animal numbers and duration of studies can be reduced. A further, albeit challenging, attempt is to replace experiments in animals by studies in vitro. The aim of this work was to test possible alternative methods for the detection of nephrotoxicity after repeated exposure. One the one hand, the expression of new biomarkers of stress and tissue damage was studied in an in vivo-model of chronic nephrotoxicity; enhanced gene expression of these biomarkers, including kidney injury molecule-1 (KIM-1), lipocalin-2 (LCN2), clusterin (CLU), osteopontin (OPN), tissue inhibitor of metalloproteinases-1 (TIMP-1), vimentin (VIM), and heme oxygenase-1 (HO-1), had been demonstrated before in several models of acute kidney damage. In addition to the experiments in vivo, the markers were also studied in a cell culture-based in vitro-model to assess their use as sensitive endpoints of toxicity in vitro. A further part of this work included the determination of cell proliferation as potential early marker of toxin-induced carcinogenic effects. As an in vivo-model, a toxicity study in male F344/N rats was performed. Rats were treated 14, 28 or 90 days with 0, 21, 70 or 210 µg/kg body weight (bw) ochratoxin A (OTA) by oral administration. OTA is a mycotoxin that is known to cause kidney damage and renal tumors in rats after repeated exposure. Analysis of mRNA expression of the new biomarkers showed early, time- and dose-dependent induction of KIM-1, LCN2, TIMP-1, OPN and CLU in kidney tissue of animals treated with 70 or 210 µg/kg bw. The induction of these biomarkers accompanied histopathological changes like cell degeneration and regeneration and mirrored well the progression of tissue damage. mRNA expression of HO-1 and VIM was also modulated by OTA, but overexpression was not evident at all time points or occurred later than for the other markers. Compared with the new biomarkers, effects on traditional markers of nephrotoxicity (serum creatinine, urinary N-acetyl-β-D-glucosaminidase and γ-glutamyltransferase) were restricted to later time points and the high dose group. In addition to the effects on gene expression, enhanced protein expression of KIM-1, CLU, OPN and VIM was observed in target cells of OTA in the proximal tubule epithelium; however, only for KIM-1, increased protein levels were also measured in urine, which correlated with the effects on the gene and protein expression in kidney tissue. Therefore, KIM-1 appeared to be the most sensitive biomarker of nephrotoxicity in this study. The study of the renal cell division after repeated administration of OTA demonstrated a dramatic, time- and dose-dependent increase in the proliferation of proximal tubule epithelial cells in kidneys of rats exposed to 70 or 210 µg/kg bw. In contrast, no OTA-dependent effects on renal cell proliferation were observed after repeated administration of 21 µg/kg bw. Thus, changes of renal cell proliferation in this 90-day-study correlate well with the results of the 2-year-carcinogenicity study with OTA, where renal tumors were only detected at 70 or 210 µg/kg bw. Based upon the different endpoints of toxicity determined in this study, the no-observed-adverse-effect-level (NOAEL) is 21 µg/kg KG OTA. This is consistent with the result of the 2-year-carcinogenicity study. In another part of this work, the new in vivo biomarkers of nephrotoxicity were studied in NRK-52E cells as in vitro-model. However, mRNA expression of KIM-1, one of the best biomarkers in vivo, was not detected in the cells after treatment for 24 or 48 hours with several nephrotoxic model substances (OTA, potassium bromate (KBrO3), cisplatin or cadmium chloride (CdCl2)). In contrast, high basal mRNA expression of other markers (VIM, CLU, TIMP-1, LCN2, OPN) was evident even in untreated cells and treatment with nephrotoxins did not further enhance marker gene expression. Only in the case of HO-1, both gene and protein expression were induced by CdCl2, KBrO3 and OTA, and could therefore represent potential markers in screening studies in vitro. In summary, measurement of cytotoxicity was still the most sensitive endpoint of toxicity in vitro. Thus, results from this study do not support the use of the new in vivo-biomarkers as tissue-specific markers of nephrotoxicity in vitro. KW - Niere KW - Toxizität KW - Biomarker KW - Carcinogenese KW - Niere KW - Toxizität KW - Biomarker KW - Carcinogenese KW - nephrotoxicity KW - biomarker KW - carcinogenesis Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47812 ER - TY - THES A1 - Roos, Marcel Philipp T1 - Suche nach Interaktionspartnern mit dem ATP-abhängigen Kaliumkanal der Niere, ROMK, durch "Yeast-Two-Hybrid-Screening" T1 - Finding proteins that interact with a Renal ATP-dependent Potassium Channel by "Yeast-Two-Hybrid-Screening" N2 - Protein-Protein-Interaktionen haben eine wesentliche Bedeutung bei der Regulierung verschiedenster Zellfunktionen. Sie spielen u.a. bei der Funktionssteuerung von Kanälen, Transportern und Ionenpumpen eine wesentliche Rolle. Ein PDZ-Motiv am C- terminalen Ende des ATP-abhängigen Kaliumkanals ROMK ließ mögliche Inter-aktionen mit zellulären und membran-assoziierten Proteinen erhoffen. Nach Durch-führung dreier „Yeast-Two-Hybrid“-Screens zur Identifizierung möglicher Interakt-ionspartner von ROMK kamen 17, von ihrer Funktion schon bekannte, aussichtsreiche Proteine, in die enge Auswahl. Nach weiterer Charakterisierung und Autoaktivierungs-tests blieben 13 Proteine zur weiteren Abklärung übrig. GST-Pulldown-Experimente und Immunfluoreszenz brachten weitere Aufschlüsse und Erkenntnisse zur Interaktion zwischen ROMK und seinen Partnern. Folgende Erkenntnisse konnten aus den Versuchen gewonnen werden: *) 174 positive Klone interagierten bei drei „Yeast-Two-Hybrid“-Screens mit dem zytoplasmatischen Teil von ROMK. *) der zytoplasmatische Teil des ATP-abhängigen Kaliumkanals der Niere, ROMK, ist an Protein- Protein- Interaktionen beteiligt. *) Proteine des Aktin-Zytoskeletts und Tyrosinkinase-assoziierte Proteine binden an den zytoplasmatisch Teil von ROMK. Daher könnten beide in Punkt 1.5.4. erwähnten Theorien der Aktivitätsänderung ROMKs durch a) Stimulierung ruhender Kanäle bzw. b) Einbau von in Vesikel gespeicherten Kanälen in die Membran vertreten werden. *) Shank3a, Calponin2, NHERF2, NUMB2 und Antiquitin1 binden an den C-terminalen Teil von ROMK in den GST-Pull-Down-Experimenten. *) Shank3a und ArgBP2 verändern das Verteilungsmuster von ROMK in der Zelle. *) Shank3a scheint für eine Interaktion mit ROMK am bedeutungsvollsten zu sein. Hypothetische Modelle und Gedankenspiele über den möglichen Einfluss der Interaktionspartner auf ROMK wurden in der Diskussion erstellt und näher erläutert. Es ist davon auszugehen, dass einige dieser Proteine, speziell diese, die mit Tyrosinkinase und dem Aktin-Zytokeletts assoziiert sind, auf ROMK Einfluss nehmen. Weitere Studien werden hoffentlich bald Aufschlüsse über Aktivitätsänderungen des ATP-ab-hängigen K+-Kanal, ROMK, offenbaren. KW - Kaliumkanal KW - Niere KW - Protein-Protein-Interaktionen KW - PDZ-Domäne KW - Yeast-Two-Hybrid-Screening KW - Potassium Channel KW - Kidney KW - Protein-protein-interaction KW - PDZ-Domain KW - Yeast-Two-Hybrid-Screening Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11424 ER - TY - THES A1 - Schwab, Christoph T1 - Vergleich der Mikrofonrichtcharakteristik Kugel und Niere anhand moderner digitaler Hörgerätetechnik am ReSound BZ 5000 HdO (Hinter-dem-Ohr), unter Mithilfe des Kunstkopfes von B&K T1 - Blind study with two different hearing aid microphone characteristics – omni and cardioid directivity patterns tested with speech in noise on a head and torso simulator with 41 normal hearing subjects. N2 - Die Aufgabe der vorliegenden Arbeit war die Beantwortung der Frage, ob die Verständlichkeit von Sprache, unter experimentellen Bedingungen, mit digitalen Hörhilfen, mit und ohne Mikrofonrichtcharakteristik, differiert. Um möglichst realistische Testbedingungen zu schaffen wurden bei der Untersuchung Umweltgeräusche durch einen Störlärm-Rauschpegel imitiert. Messungen bei 60 und 80 dB wurden miteinander verglichen. Als Nutzsignal diente der HSM-Test, bei dem einfache kurze Sätze zum Einsatz kommen. Nach den Kriterien der Realitätsnähe, Validität und Standartisierbarkeit erschien dieser Test besonders geeignet. Die Messungen fanden in einer schalldichten Kabine der HNO-Klinik Würzburg statt. Den Probanden wurden DAT-Cassetten über Kopfhörer vorgespielt, die vorher in der Camera Silens, im Freifeld, unter Mithilfe des Kunstkopfes von B&K aufgenommen wurden. Dieser Kunstkopf ermöglichte die Aufnahme mit dem Dazwischenschalten unterschiedlicher Hörgeräte und Hörgeräteinstellungen, die das normalhörende Probandenkollektiv in die Situation eines Hörbehinderten versetzten. Nach der Prüfung auf Normalverteilung wurden in der Auswertung die Sprachverständlichkeitsschwellen verglichen, zeichnerisch gegenübergestellt und entsprechend diskutiert. Diese Schwelle entspricht dem Signal-Störlärmabstand bei dem genau 50 % aller Testworte verstanden wurden. Schließlich zeigte sich von der Einstellung „Niere“ zur Einstellung „Kugel“ eine geringe Verbesserung der Wortverständlichkeit. Die Resultate der leichten Verständlichkeitsverbesserung mit Richtmikrofon fielen bei 80 dB deutlicher aus als bei 60 dB. Diese Verbesserungen sind rechnerisch nicht signifikant. N2 - In this experiment the dummy head and torso simulator (HATS) was placed in an anechoic chamber and at 0° position a loudspeaker with speech signals was placed. At position 180° a second loudspeaker was placed to generate interferring noise with a level of 60 or 80 dB. CCITT noise was used and the speakers were on a circle with 2m diameter, the HATS was placed in the center. The speech material was a German sentence test (HSM). Normal hearing subjects listened to the tape recordings with different S/N of speech material. The positions 0° and 180° were used to see if carioid or omni had a significant influence on the speech scores. It was a blind study, not a doubble blind one, the experimenters new the typ of recording. The hearing aid used was a modern digital signal processing hearing aid with two microphones. In the omni situation only one microphone was used. 41 normal hearing subject listened to the tape recordings, 20 female and 21 male students KW - Kugel KW - Niere KW - Cardioid KW - Bidirektional KW - Hörgerät KW - Cardioid KW - Bidirektional KW - Resound KW - Hearing Aid Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4545 ER - TY - THES A1 - Sieber, Maximilian T1 - Evaluation of 1H-NMR and GC/MS-based metabonomics for the assessment of liver and kidney toxicity T1 - Bewertung von 1H-NMR und GC/MS-Metabonomics zur Erkennung von Leber- und Nierentoxizität N2 - For the assessment of metabonomics techniques for the early, non-invasive detection of toxicity, the nephrotoxins gentamicin (s.c. administration of 0, 60 and 120 mg/kg bw 2x daily for 8 days), ochratoxin A (p.o. administration of 0, 21, 70 and 210 µg/kg bw 5 days/week for 90 days) and aristolochic acid (p.o. administration of 0, 0.1, 1.0 and 10 mg/kg bw for 12 days) were administered to rats and urine samples were analyzed with 1H-NMR and GC/MS. Urine samples from the InnoMed PredTox project were analyzed as well, thereby focusing on 1H-NMR analysis and bile duct necrosis as histopathological endpoint. 1H-NMR analysis used water supression with the following protocol: 1 M phosphate buffer, D2O as shift lock reagent, D4-trimethylsilyl­propionic acid as chemical shift reference, noesygppr1d pulse sequence (Bruker). For multivariate data analysis, spectral intensity was binned into 0.04 ppm wide bins. GC/MS analysis of urine was carried out after protein precipitation with methanol, drying, derivatization with methoxyamine hydrochloride in pyridine and with methyl(trimethylsilyl)­trifluoroacetamide on a DB5-MS column using EI ionization. The chromatograms were prepared for multivariate data analysis using the R-program based peak picking and alignment software XCMS version 2.4.0. Principal component analysis (PCA) to detect and visualize time-point and dose-dependent differences between treated animals and controls and orthogonal projection to latent structures discriminant analysis (OPLS-DA) for identification of potential molecular markers of toxicity was carried out using SIMCA P+ 11.5 1H-NMR-based markers were identified and quantified with the Chenomx NMR Suite, GC/MS based markers were identified using the NIST Mass Spectral Database and by co-elution with authentic reference standards. PCA of urinary metabolite profiles was able to differentiate treated animals from controls at the same time as histopathology. An advantage over classical clinical chemistry parameters regarding sensitivity could be observed in some cases. Metabonomic analysis with GC/MS and 1H-NMR revealed alterations in the urinary profile of treated animals 1 day after start of treatment with gentamicin, correlating with changes in clinical chemistry parameters and histopathology. Decreased urinary excretion of citrate, 2-oxoglutarate, hippurate, trigonelline and 3-indoxylsulfate increased excretion of 5-oxoproline, lactate, alanine and glucose were observed. Ochratoxin A treatment caused decreased excretion of citrate, 2-oxoglutarate and hippurate and and increased excretion of glucose, myo-inositol, N,N-dimethylglycine, glycine, alanine and lactate as early as 2 weeks after start of treatment with 210µg OTA/kg bw, correlating with changes in clinical chemistry parameters and histopathology. Integration of histopathology scores increased confidence in the molecular markers discovered. Aristolochic acid treatment resulted in decreased urinary excretion of citrate, 2-oxoglutarate, hippurate and creatinine as well as increased excretion of 5-oxoproline, N,N-dimethylglycine, pseudouridine and uric acid. No alterations in clinical chemistry parameters or histopathology were noted.Decreased excretion of hippurate indicates alterations in the gut microflora, an effect that is expected as pharmacological action of the aminoglycoside antibiotic gentamicin and that can also be explained by the p.o. administration of xenobiotica. Decreased Krebs cycle intermediates (citrate and 2-oxoglutarate) and increased lactate is associated with altered energy metabolism. Increased pseudouridine excretion is associated with cell proliferation and was observed with aristolochic acid and ochratoxin A, for which proliferative processes were observed with histopathology. 5-oxoproline and N,N-dimethylglycine can be associated with oxidative stress. Glucose, a marker of renal damage in clinical chemistry, was observed for all three nephrotoxins studied. Single study analysis with PCA of GC/MS chromatograms and 1H-NMR spectra of urine from 3 studies conducted within the InnoMed PredTox project showing bile duct necrosis revealed alterations in urinary profiles with the onset of changes in clinical chemistry and histopathology. Alterations were mainly decreased Krebs cycle intermediates and changes in the aromatic gut flora metabolites, an effect that may result as a secondary effect from altered bile flow. In conclusion, metabonomics techniques are able to detect toxic lesions at the same time as histopathology and clinical chemistry. The metabolites found to be altered are common to most toxicities and are not organ-specific. A mechanistic link to the observed toxicity has to be established in order to avoid confounders such as body weight loss, pharmacological effects etc. For pattern recognition purposes, large databases are necessary. N2 - Zur Bewertung von Metabonomics-Techniken zur frühen, nicht-invasiven Erkennung von Toxizität wurde Rattenurin nach wiederholter Gabe von Nephrotoxinen mit 1H-NMR und GC/MS analysiert. Untersucht wurden Gentamicin (s.c.-Gabe von 0, 60 und 120 mg/kg Körpergewicht (KG) 2x tägl. über 8 Tage), Ochratoxin A (p.o.-Gabe von 0, 21, 70 und 210 µg/kg KG 5xl wöchentlich für 90 Tage) und Aristolochiasäure (p.o.-Gabe von 0, 0.1, 1.0 und 10 mg/kg KG über 12 Tage). Proben von 16 Studien des InnoMed PredTox Projekts wurden mit 1H-NMR auf den histopathologischen Endpunkt Gallengangnekrose (BDN) untersucht. Folgende Parameter wurden zur 1H-NMR-Analyse mit Wasserunterdrückung verwendet: 1 M Phosphatpuffer, shift lock Reagenz D2O und Referenzierung der chemischen Verschiebung auf D4-Trimethylsilyl­propionsäure, noesygppr1d-Pulssequenz (Bruker). Zur multivariaten Datenanalyse wurden die Spektren in 0.04 ppm große „bins“ unterteilt. Zur GC/MS-Analyse wurden nach Proteinfällung mit Methanol die Urinproben getrocknet und mit Methoxyaminhydrochlorid in Pyridin und Methyl(trimethylsilyl)trifluoracetamid derivatisiert und auf einer DB5-MS -Säule getrennt. Die GC/MS-Chromatogramme wurden mit dem R-Programm-basierten XCMS-Softwarepaket Version 2.4.0 zur multivariaten Datenanalyse vorbereitet. Hauptkomponentenanalyse (PCA) zur Visualisierung von zeit- und dosisabhängigen Unterschieden zwischen Kontrollen und behandelten Tieren und „orthogonal projection to latent structures“-Diskriminantenanalyse (OPLS-DA) zur Identifizierung von Toxizitätsmarkern erfolgte mit SIMCA P+11.5 Die Chenomx-NMR-Suite wurde zur Identifizierung und Quantifizierung von 1H NMR-basierten Markern verwendet; GC/MS-basierte Marker wurden mit der „NIST Mass Spectral Database“ und durch Koelution mit Referenzstandards identifiziert. PCA unterschied Kontroll- von behandelten Tieren zum gleichen Zeitpunkt wie Histopathologie. Gegenüber klinisch-chemischen Parametern war Metabonomics in einigen Fällen empfindlicher. Gentamicin induzierte nach Tag 1 erniedrigte Ausscheidung von Citrat, 2-Oxoglutarat, Hippurat, Trigonellin und 3-Indoxylsulfat Urin, sowie erhöhte Ausscheidung von Lactat, Alanin, 5-Oxoprolin und Glucose, begleitet von geringfügigen Änderungen in klinisch-chemischen Parametern. Ochratoxin A verursachte nach zwei Wochen in einzelnen Tieren eine erniedrigte Ausscheidung von Citrat, 2-Oxoglutarat und Hippurat sowie eine erhöhte Ausscheidung von Glucose, myo-Inositol, N,N-Dimethylglycin, 5-Oxoprolin, Glycin, Alanin und Lactat, korrelierend mit Veränderungen in klinisch-chemischen Parametern und in der Histopathologie. Verwendung von Histopathologiedaten in multivariaten Modellen zur Markeridentifizierung erhöhte die Konfidenz der Marker. Aristolochiasäure induzierte eine erniedrigte Ausscheidung von Citrat, 2-Oxoglutarat, Hippurat und Creatinin und eine erhöhte Ausscheidung von 5-Oxoprolin, N,N-Dimethylglycin und Pseudouridin, ohne Veränderung der klinisch-chemischen Parameter oder der Histopathologie. Erniedrigte Ausscheidung von Hippurat weist auf eine veränderte Darmmikroflora hin; für das Aminoglykosid-Antibiotikum Gentamicin ist dies ein pharmakologischer Effekt, der für die perorale Gabe von Xenobiotica zu erwarten ist. Erniedrigte Ausscheidung von Citrat und 2-Oxoglutarat und erhöhte Ausscheidung von Lactat zeigt einen veränderten Energiestoffwechsel. Erhöhte Ausscheidung von Pseudouridin ist mit Zell­proliferation assoziiert und wurde nach Gabe der Kanzerogene Ochratoxin A und Aristolochiasäure beobachtet, bei denen proliferative Prozesse in der Histopathologie gefunden wurden. 5-Oxoprolin und N,N-Dimethyl­glycin deuten auf erhöhten oxidativen Stress hin. Erhöhte Glucose im Urin, ein Parameter zur Diagnose von Nierenschäden in der klinischen Chemie, wurde in allen drei Studien mit Nephrotoxinen beobachtet. GC/MS- und 1H-NMR-Daten von InnoMed-Studien mit Gallengang­nekrosen als histopathologischen Endpunkt zeigten Veränderung im Urin zeitgleich mit klinisch-chemischen Parametern und Histopathologie; hauptsächlich erniedrigte Ausscheidung von Citratzyklusintermediaten und Veränderungen bei Darmflora-assoziierten Metaboliten, – ein Effekt, der wahrscheinlich veränderten Gallenfluss zurückzuführen ist. Metabonomics ist prinzipiell zum gleichen Zeitpunkt wie klinisch-chemische Parameter und Histopathologie zur Erkennung von toxischen Veränderungen geeignet. Die veränderten Metaboliten sind jedoch zumeist nicht organspezifisch und können mit allgemeinen Toxizitätsmechanismen, wie oxidativem Stress oder Zellproliferation, in Verbindung gebracht werden. Für die Bewertung der Ergebnisse von Metabonomics-Studien ist ein mechanistisches Verständnis der Veränderungen im Urinprofil notwendig, um eine Trennung von toxischen Effekten und solchen, die auf pharmakologische Wirkung, Körpergewichtsverlust etc. zurückzuführen sind, zu erreichen. Für eine Vorhersage von toxischen Mechanismen aufgrund der Urinprofile ist eine größere Datengrundlage notwendig. KW - Toxikologie KW - Protonen-NMR-Spektroskopie KW - GC-MS KW - Multivariate Analyse KW - Niere KW - Leber KW - Metabonomics KW - Toxicology KW - Metabonomics KW - GC/MS KW - 1H-NMR-Spectroscopy KW - multivariate analysis KW - kidney KW - liver Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-43052 ER - TY - CHAP A1 - Spielmann, W.-S. A1 - Arend, L. J. A1 - Klotz, Karl-Norbert A1 - Schwabe, U. T1 - Adenosine receptors and singnaling in the kidney N2 - No abstract available. KW - Adenosinrezeptor KW - Niere Y1 - 1990 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86114 ER - TY - THES A1 - Weinhold, Dietmar Thomas T1 - Transfektion migrierender Nierenepithelzellen mit dem Kalium-Kanal ROMK2 T1 - Transfection of migrating renal epithelial cells with the potassium channel ROMK2 N2 - Epithelzellen sind entlang einer apico-basolateralen Achse polarisiert. Die korrekte Insertion von Ionenkanälen und Transportproteinen ist für die normale Epithelfunktion unerlässlich. Im Gegensatz dazu sind migrierende Zellen in ihrer Bewegungsebene polarisiert, mit einem Lamellipodium und Zellkörper, die als Vorder- und Hinterende der Zell zu verstehen sind. In vorhergehenden Un- tersuchungen konnte gezeigt werden, dass Ionenkanäle und Transporter in be- stimmten Regionen von migrierenden Nierenepithelzellen (MDCK-F-Zellen) zu fin- den sind (z. B.: NHE1, Cl/HCO -Austauscher AE2). Diese reichern sich am Vor- derende der MDCK-F-Zellen an. Es war nicht bekannt, wo sich Markerproteine der apikalen Membran wiederfinden. Um dieser Frage nachzugehen, transfizierte ich MDCK-F-Zellen stabil mit dem Kalium-Kanal ROMK2. Dieser wird in der apikalen Membran im Nierensammelbecken expressioniert. Transfizierte Zellklone konnten durch Subcloning und RT-PCR-Experimente mit spezifischen ROMK2-Primern gefun- den werden. Desweiteren wurden Patch-Clamp-Experimente im Ganzzellmodus durch- geführt, um die Insertion von funktionellen ROMK2-Kanälen in die Zellmembran von transfizierten MDCK-F-Zellen nachzuweisen. Die mit dem Kalium-Kanal trans- fizierten Zellen produzieren einen Barium-hemmbaren Kalium-Strom, der in Mock- transfizierten Zellen nicht nachzuweisen war. Mock-transfizierte MDCK-F-Zellen migrieren mit einer Geschwindigkeit von ca 1,1 µm/min. Im Gegensatz dazu re- duziert die Insertion von ROMK2-Kanälen die Migrationsgeschwindigkeit auf 0,7 µm/min.In immunhistochemischen Experimenten konnte eine diffuse Verteilung des ROMK2 in MDCk-F-Zellen gezeigt werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß es für 'apikale' und basolaterale' Proteine verschiedene intrazelluläre Transportwege in die Plasmamembran von migrierenden Zellen gibt. N2 - Differentiated epithelial cells are polarized along an apico-basolateral axis and the insertion of ion channels and transporters into apical and basolateral membranes is a prerequisite for normal epithelial function. In contrast, migrating cells are polarized within the plane of movement with lamellipodium and cell body representing fromt and rear end of the cell. Previously, it was shown that ion channels and transporters are distributed unevenly in migrating renal epithelial MDCK-F cells. Proteins which are found in the basolateral membrane of differented epithelial cells (e. g. Cl/HCO exchanger AE2) are concentrated at the front of MDCK-F cells. It was unknown whether marker pro- teins of the apical membrane are also distributed unevenly in MDCK-F cells. To adress this question and gain more insight into the sorting mechanisms in mig- rating cells, I stably transfected the potassium channel ROMK2 into MDCK-F cells. ROMK2 is found in the apical membrane of the renal collecting duct. Transfected cell clones were identified by subcloning and sequencing RT-PCR products amplified with specific ROMK2 primers. I performed patch clamp ex- periments in the whole cell configuration in order to demonstrate the inser- tion of functional ROMK2 channels into the membrane of transfected MDCK-F cells. ROMK2 transfected MDCK-F cells express a Barium-sensitive potassium current which is absent in mock-transfected cells. While mock-transfected cells migrate at a rate of 1.1 µm/min ROMK2 channel expression reduces the rate of migration to 0.7 µm/min. The immunocytochemical analysis revealed a diffuse distribution of the ROMK2 protein in MDCK-F cells. These results pro- vide evidence that 'apical' and 'basolateral' proteins are delivered to the plasma membrane of migrating cells via distinct intracellular transport ways. KW - Zellmigration KW - Niere KW - Epithelzelle KW - Polarisation KW - Migration KW - ROMK2 KW - MDCK-F-Zellen KW - Polarisation KW - Sorting KW - Migration KW - ROMK2 KW - MDCK-F cells KW - Polarisation KW - Sorting Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-339 ER -