TY - THES A1 - Ye, Fang T1 - The role of DNA supercoiling in the coordinated regulation of gene expression in Helicobacter pylori N2 - Summary Mechanisms of global gene regulation in bacteria are not well characterized yet. Changes in global or local supercoiling of chromosomal DNA are thought to play a role in global gene silencing and gene activation. In Helicobacter pylori, a bacterium with few dedicated transcriptional regulators, the structure of some promoters indicates a dependency on DNA topology. For example, the promoter of the major flagellar subunit gene flaA (ó28-dependent) has a shorter spacing of 13 nucleotides (nt) in comparison to the consensus promoter (15 nt). Supercoiling changes might be a mechanism of gene-specific and global transcriptional regulation in this bacterium. The aim of this study was to elucidate, if changes in global supercoiling have an influence on global gene regulation in H. pylori, and on the temporal regulation of the flagellar biosynthesis pathway in this organism. In the present work, global DNA supercoiling in H. pylori was visualized for the first time, by determining the supercoiling state of plasmids under different growth conditions. Using this method, we showed that cellular supercoiling was clearly growth phase-dependent in H. pylori. Coinciding with increased supercoiling during the growth phases, transcription of the flaA gene was increased, while the transcription of a second ó28-dependent gene with regular promoter spacing (HP0472) was reduced, supporting the hypothesis that growth phase-dependency of promoters might be mediated by changes of DNA topology. Supercoiling in H. pylori could be influenced in a reproducible fashion by inhibition of gyrase using novobiocin, which led to DNA relaxation and to a concomitant decrease of flaA transcript levels. Promoter spacer mutagenesis of the flaA promoter was performed. With flaA promoters of increased or reduced length, transcription of flaA was reduced, less susceptible to supercoiling changes, and, under specific conditions, inverted as compared to the wild type promoter. Transcriptional interdependence between the coupled topA-flaB genes and flaA was found by analysis of the flaA promoter mutants. Chromosomally linked gyrA-flgR, and topA-flaB genes were all dependent on supercoiling and coregulated with each other. Comprehensive transcript profiling (DNA microarrays) of wildtype H. pylori with and without novobiocin treatment identified a number of genes (10% of total genes), including flagellin, virulence and housekeeping genes, which were strongly dependent on and appeared to be synchronized by supercoiling changes (transcriptional up- or downregulation). These findings indicate a tightly coupled temporal regulation of flagellar biogenesis and metabolism in H. pylori, dependent on global supercoiling. A specific group of genes was also regulated in H. pylori by overexpression of Topoisomerase I, as detected by genome-wide analysis (DNA microarray). The DNA-bending protein HU is thought to be responsible for influencing the negative supercoiling of DNA, through its ability to wrap DNA. HU is encoded by the hup single gene in H. pylori, and constitutively expressed during the whole growth curve. An H. pylori hup mutant was constructed. H. pylori cells lacking HU protein were viable, but exhibited a severe growth defect. Our data indicate that the lack of HU dramatically changes global DNA supercoiling, indicating an important function of HU in chromosome structuring in H. pylori. Transcriptome analyses were performed and demonstrated that a total of 66 genes were differentially transcribed upon hup deletion, which include virulence genes and many other cell functions. The data indicate that HU might act as further important global regulator in H. pylori. Increased gene expression of heat shock proteins and a decreased transcription of the urease gene cluster may indicate a co-ordinated response of H. pylori to changes of environmental conditions in its specific ecological niche, mediated by HU. After the whole genomic sequences of H. pylori strains 26695 and J99 were published, two ORFs (HP0116 and HP0440) were presumptively annotated as topoisomerase I orthologs. HP0116 is the functional H. pylori topoisomerase I (TopA). HP0440 (topA2) was found in only few (5 of 43) strains. Western blot analysis indicated that TopA2 is antigenically different from TopA. TopA2 is transcribed in H. pylori, but the protein must be functionally different from TopA, since it is lacking one functionally essential zinc finger motif, and was not able to functionally complement a TopA-deficient E. coli. Like topA, topA2 was also transcribed in a growth phase-dependent manner. We did not find a function of TopA2 in DNA structuring or topology, but, in the present study, we were able for the first time to establish a unique function for TopA2 in global gene regulation, by comprehensive transcriptome analysis (DNA microarray). Transcriptome analysis showed that a total of 46 genes were differentially regulated upon topA2 deletion, which included flagellar genes and urease genes. These results suggest that TopA2 might act as a novel important regulator of both flagellar biosynthesis and urease in H. pylori. N2 - Zusammenfassung Die Mechanismen der globalen Kontrolle der Genregulation bei Bakterien sind bisher noch wenig charakterisiert. Unterschiede in der globalen oder lokalen Topologie der chromosomalen DNA spielen wahrscheinlich eine Rolle bei der globalen Kontrolle der Genexpression. Bei Helicobacter pylori, einem Bakterium mit wenigen funktionell definierten Transkriptionsregulatoren, spricht die Struktur einiger Promotoren dafür, daß sie durch die DNA-Topologie kontrolliert werden. Der Promotor des Hauptflagellingens flaA, ein Sigma-28 abhängiger Promotor, hat ein gegenüber dem Konsensuspromotor (15 Nukleotide) verkürztes Spacing von 13 Nukleotiden. Veränderungen der DNA-Superhelizität könnten ein Mechanismus der genspezifischen und globalen transkriptionellen Kontrolle in diesem Bakterium sein. Ziel dieser Untersuchungen war es zu zeigen, ob Veränderungen des globalen Supercoiling-Niveaus einen Einfluß auf die globale Genregulation von H. pylori haben und ob sie sich auf die zeitlich gesteuerte Regulation der Geißelbiosynthese (Beweglichkeitsorganell; essenzieller Virulenz- und Persistenzfaktor von H. pylori) in diesem Organismus auswirkt. In der vorliegenden Arbeit wurde das Niveau der DNA-Superspiralisierung bei H. pylori erstmals durch Visualisierung des Supercoilingzustands von Plasmiden unter unterschiedlichen Wachstumsbedingungen dargestellt. Wir konnten mit dieser Methode zeigen, daß das zelluläre Supercoiling-Niveau bei H. pylori in Abhängigkeit von der Wachstumsphase stark variiert. In Wachstumsphasen mit erhöhtem Supercoiling war auch die Transkription des flaA-Gens erhöht, während die Transkription eines zweiten Sigma-28-abhängigen Gens mit normalem Promotorabstand (HP0472) reduziert war. Dieser Befund stützte die Hypothese, daß die wachstumsphasenabhängige Aktivität dieser Promotoren durch Veränderungen der DNA-Topologie bewirkt wird. Das Supercoiling-Niveau konnte reproduzierbar durch Hemmung der Gyrase mit Novobiocin beeinflusst werden. Die Gegenwart von Novobiocin führte zur DNA-Relaxation und zu einem gleichzeitigen Absinken der Transkription von flaA. Es wurde eine gerichtete Mutagenese der Promotor-Spacer-Region des flaA-Promotors durchgeführt. Die Verlängerung oder Verkürzung des H.pylori flaA-Promotors führte zu einer verminderten Transkription von flaA, sowie zu reduzierter Empfindlichkeit der Promotoraktivität gegenüber Veränderungen des Supercoiling-Niveaus. Unter spezifischen Bedingungen war die Supercoiling-Abhängigkeit umgekehrt im Vergleich zum Wildtyppromotor. Es konnte weiterhin eine inverse transkriptionelle Abhängigkeit zwischen dem gekoppelten Genpaar topA-flaB und flaA durch Analyse der flaA-Promotormutanten nachgewiesen werden. Auch die chromosomal gekoppelten Gene gyrA und flgR sowie topA und flaB waren abhängig vom Supercoiling-Zustand und miteinander koreguliert. Die Analyse des Transkriptoms von H.pylori-Wildtypbakterien mit DNA-Microarrays mit und ohne Novobiocinbehandlung führte zur Identifizierung von zahlreichen Genen (etwa 10% des Gesamttranskriptoms), deren Expression Supercoiling-abhängig war und durch Veränderungen des Supercoilings synchronisiert verändert werden konnte. Unter diesen waren Flagellin-, andere Virulenz-, sowie Grundstoffwechsel-Gene. Diese Befunde weisen auf eine enge Verbindung zwischen der chronologischen Kontrolle der Flagellen-Biogenese und des Metabolismus bei H. pylori, die gemeinsam durch das Supercoiling-Niveau gesteuert werden. Eine definierte Gruppe von Genen konnte bei H.pylori durch Überexpression von Topoisomerase-1 reguliert werden. Das Protein HU beeinflusst ebenfalls das Supercoiling-Niveau von DNA durch seine Fähigkeit, DNA zu biegen. HU wird bei H. pylori durch das Gen hup kodiert und ist während sämtlicher Wachstumsphasen konstitutiv exprimiert. Eine HU-defiziente Mutante wurde konstruiert. Zellen, die kein HU-Protein exprimierten, waren lebensfähig, zeigten aber einen deutlichen Wachstumsdefekt. Unsere Daten weisen daraufhin, daß der Mangel von HU sich dramatisch auf das globale DNA-Supercoiling-Niveau auswirkt, und sprechen für eine wichtige Funktion von HU bei der Kontrolle der DNA-Struktur von H. pylori. Mittels DNA-Microarray-Hybridisierung wurden die Transkriptome von H. pylori-Wildtyp und HU-Mutante miteinander verglichen. Die Ergebnisse zeigen, daß insgesamt 66 Gene in der HU-Mutante differentiell transkribiert werden, darunter Virulenzgene und Gene für viele andere Zellfunktionen. Diese Daten deuten darauf hin, daß auch HU eine wichtige Rolle in der Kontrolle der globalen Genexpression bei H. pylori spielt. Die erhöhte Expression von Hitzestress-Proteinen, verbunden mit einer verminderten Transkription des Ureasegenclusters, könnte auf eine koordinierte Antwort der Bakterien auf Veränderungen der Umweltbedingungen in ihrer spezifischen ökologischen Nische hinweisen. Nach der Publikation der Gesamtgenomsequenzen von H.pylori 26695 und J99 wurden 2 ORFs (HP 0116 und HP 0440) als Topoisomerase-1-Orthologe annotiert. HP 0116 ist das funktionelle H.pylori Topoisomerase-1-Gen. HP 0442 (topA2) wurde nur in wenigen (5 aus 43) Stämmen nachgewiesen. topA2 ist trotz seines seltenen Vorkommens kein Pseudogen und wird in H.pylori transkribiert. Westernblot-Analysen sprechen dafür, daß TopA2 sich antigenetisch von TopA unterscheidet. Das TopA2-Protein unterscheidet sich ebenfalls funktionell von TopA, da ihm ein funktionell essentielles Zinkfingermotiv fehlt. TopA2 konnte außerdem eine TopA-defiziente E.coli-Mutante nicht funktionell komplementieren. Wie bei topA war auch die Transkription von topA2 von der Wachstumsphase abhängig. Eine Funktion von TopA2 bei der Kontrolle der DNA-Topologie konnte bisher nicht nachgewiesen werden, Transkriptomanalysen zeigten aber, dass TopA2 eine klare Regulationsfunktion hat, da die topA2-Mutante gravierende Veränderungen des Transkriptoms gegenüber dem Wildtyp aufwies. Diese Untersuchungen zeigten, daß 46 Gene in der TopA2-Mutante differentiell reguliert wurden, darunter Flagellengene und Ureasegene. Die Ergebnisse sprechen dafür, daß TopA2 ein weiterer wichtiger Regulator von sowohl Flagellenbiosynthese als auch Ureasebildung bei H.pylori sein könnte. KW - Helicobacter pylori KW - Genexpression KW - Flagelline KW - Supercoiling KW - regulation KW - flagella Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9878 ER - TY - THES A1 - Weber [geb. Spalek], Evelyn T1 - Poststationäres Management Helicobacter pylori positiver Patienten im Raum Aschaffenburg T1 - Post-hospital management of helicobacter pylori positive patients in the area of Aschaffenburg N2 - 2009 wurde die deutsche S3-Leitlinie „Helicobacter pylori und gastroduodenale Ulkuskrankheit“ publiziert, in der klare Empfehlungen für die Diagnostik, die Indikationen für eine Eradikation, die Therapie und das Follow-Up beschrieben sind. Das Management der H. pylori Infektion im praktischen Alltag zeigt nach dieser Arbeit indessen ein anderes Bild. Ein Optimierungsbedarf für die Zukunft kann daraus abgeleitet werden. Diese Arbeit beschäftigt sich mit dem poststationären Management von Patienten mit einer H. pylori Infektion im Raum Aschaffenburg. Hierzu wurden 199 Patienten identifiziert, bei denen im Rahmen eines stationären Aufenthaltes im Klinikum Aschaffenburg im Jahr 2011 eine H. pylori Infektion diagnostiziert worden war. Aus den Patientenakten wurden alle relevanten Daten entnommen, wie zum Beispiel Diagnose, Indikation zur H. pylori Eradikation und deren stationäre Initiierung beziehungsweise Empfehlung an den Hausarzt. Nachfolgend wurden die 97 Hausärzte der 199 Patienten angeschrieben und um das ausfüllen eines Fragebogens gebeten. Dieser enthielt sechs Fragen zum poststationären Management der Patienten mit H. pylori Infektion. Während des stationären Aufenthaltes war bei 88/199 Patienten (44,2%) die Eradikationstherapie begonnen und bei 24 von ihnen (12,1%) bereits abgeschlossen worden. Bei den anderen 64 Patienten sollte die Medikation ambulant fortgeführt werden. Bei 77 Patienten (38,7%) wurde dem Hausarzt die Einleitung einer ambulanten Eradikationsbehandlung empfohlen. 34 Patienten verließen das Krankenhaus ohne Therapie und auch ohne entsprechende Therapieempfehlung. Die Rücklaufquote der Fragebögen betrug 46,2% (92 von 199 Patienten). Die nachfolgenden Ergebnisse beziehen sich auf diese 92 Patienten (entspricht 100%). Zwei Drittel der Patienten (n=61) stellten sich direkt im Anschluss an die Entlassung aus stationärer Behandlung ihrem Hausarzt vor. Bei 30 Patienten führte der Hausarzt die stationäre begonnene Eradikationstherapie fort (32,6%) oder initiierte sie bei 28 Patienten selbst (30,4%). 17 Patienten erhielten keine Eradikation (18,5%). Die Gründe hierfür waren unterschiedlich, am häufigsten lag ein Informationsdefizit zwischen Klinik und Hausarzt vor. Die französische Triple-Therapie wurde mit 39 mal am häufigsten verordnet, die italienische Triple-Therapie wurde 20 Patienten verschrieben. Andere Behandlungsprotokolle fanden nur vereinzelt Anwendung. Eine Kontrolle des Eradikationserfolges wurde bei 35 Patienten (38%) vorgenommen. Bezieht man die Eradikationskontrolle ausschließlich auf die therapierten Patienten erfolgte diese in der Hälfte der Fälle (49,3%). Von den Patienten mit H. pylori Eradikation und Kontrolle des Eradikationserfolges (n=35) konnten 31 (88,6%) erfolgreich behandelt werden. Die Vorgehensweise nach erfolgloser H. pylori Eradikation umfasste den Versuch einer Zweitlinientherapie, die Überweisung zum Gastroenterologen und den Verzicht auf weitere Maßnahmen. Zusammenfassend zeigt diese Erhebung, dass es einen klaren Optimierungsbedarf in der Anwendung der Empfehlungen aus der Leitlinie bedarf. Dieser Aspekt sollte zukünftig vermehrt Berücksichtigung finden, nicht zuletzt in der Aktualisierung der Leitlinie 2016. N2 - In 2009, the German S3-guideline "Helicobacter pylori and gastroduodenal ulcer disease" was published, in which clear recommendations for diagnosis, the indications for eradication, therapy and follow-up are described. However, the management of H. pylori infection in everyday practice shows a different picture. An optimization requirement for the future can be derived from this. This thesis deals with post-hospital management of patients with H. pylori infection in the area of Aschaffenburg. 199 patients were identified who had been diagnosed with H. pylori infection during their inpatient stay at Aschaffenburg Hospital in 2011. All relevant data were taken from the patient records, such as diagnosis, indication for H. pylori eradication and their inpatient therapy initiation or recommendation to the family doctor. Subsequently, the 97 general practitioners of the 199 patients were contacted and asked to complete a questionnaire. This included six questions about post-hospital management of patients with H. pylori infection. During inpatient treatment, eradication therapy had started in 88/199 patients (44.2%) and had already been completed in 24 of them (12.1%). For the other 64 patients, the medication should be continued on an outpatient basis. In 77 patients (38.7%) the family doctor received a recommended to initiate an eradication therapy. Thirty-four patients left the hospital without therapy and without appropriate therapy recommendation. The response rate of the questionnaires was 46.2% (92 out of 199 patients). The following results refer to these 92 patients (equivalent to 100%). Two-thirds of the patients (n = 61) presented themselves to their family doctor immediately after discharge from hospitalization. In 30 patients, the family doctor continued inpatient eradication therapy (32.6%) or initiated it in 28 patients (30.4%). 17 patients received no eradication (18.5%). The reasons for this varied, with the most common being an information deficit between the clinic and the family doctor. The French triple therapy was prescribed most often in 39 times, the Italian triple therapy was prescribed to 20 patients. Other treatment protocols were used only sporadically. A control of eradication success was made in 35 patients (38%). If the eradication control was exclusively applied to the treated patients, this was done in half of the cases (49.3%). Of the patients with H. pylori eradication and control of eradication success (n = 35), 31 (88.6%) were successfully treated. The procedure after unsuccessful H. pylori eradication included the attempt of a second-line therapy, the referral to the gastroenterologist and the renunciation of further steps. In summary, this scientific work shows that there is a clear need for optimization in the application of the Guideline recommendations. This aspect should be taken more into account in the future, not least in the update of the upcoming guideline update 2016. KW - Ambulante Behandlung KW - Helicobacter KW - Helicobacter pylori KW - Therapie KW - Ärztliche Behandlung KW - Poststationär KW - post-hospital KW - Follow-up KW - leitliniengerecht KW - ambulant KW - Resistenz KW - Adhärenz KW - Compliance KW - Antibiotikatherapie KW - Therapietreue KW - Therapieversagen KW - Patientenversorgung KW - according to guidelines KW - outpatient KW - ambulatory KW - treatment failure KW - resistance KW - adherence KW - compliance KW - antibiotic therapy KW - patient care Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-156634 ER - TY - JOUR A1 - Tegtmeyer, Nicole A1 - Moodley, Yoshan A1 - Yamaoka, Yoshio A1 - Pernitzsch, Sandy Ramona A1 - Schmidt, Vanessa A1 - Traverso, Francisco Rivas A1 - Schmidt, Thomas P. A1 - Rad, Roland A1 - Yeoh, Khay Guan A1 - Bow, Ho A1 - Torres, Javier A1 - Gerhard, Markus A1 - Schneider, Gisbert A1 - Wessler, Silja A1 - Backert, Steffen T1 - Characterisation of worldwide Helicobacter pylori strains reveals genetic conservation and essentiality of serine protease HtrA JF - Molecular Microbiology N2 - HtrA proteases and chaperones exhibit important roles in periplasmic protein quality control and stress responses. The genetic inactivation of htrA has been described for many bacterial pathogens. However, in some cases such as the gastric pathogen Helicobacter pylori, HtrA is secreted where it cleaves the tumour-suppressor E-cadherin interfering with gastric disease development, but the generation of htrA mutants is still lacking. Here, we show that the htrA gene locus is highly conserved in worldwide strains. HtrA presence was confirmed in 992 H.pylori isolates in gastric biopsy material from infected patients. Differential RNA-sequencing (dRNA-seq) indicated that htrA is encoded in an operon with two subsequent genes, HP1020 and HP1021. Genetic mutagenesis and complementation studies revealed that HP1020 and HP1021, but not htrA, can be mutated. In addition, we demonstrate that suppression of HtrA proteolytic activity with a newly developed inhibitor is sufficient to effectively kill H.pylori, but not other bacteria. We show that Helicobacter htrA is an essential bifunctional gene with crucial intracellular and extracellular functions. Thus, we describe here the first microbe in which htrA is an indispensable gene, a situation unique in the bacterial kingdom. HtrA can therefore be considered a promising new target for anti-bacterial therapy. KW - Helicobacter pylori KW - cag pathogenicity island KW - Differential RNA-sequencing KW - epithelial cells KW - campylobacter jejuni infection Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-190774 VL - 99 IS - 5 ER - TY - JOUR A1 - Svensson, Sarah L. A1 - Sharma, Cynthia M. T1 - Small RNAs that target G-rich sequences are generated by diverse biogenesis pathways in Epsilonproteobacteria JF - Molecular Microbiology N2 - Bacterial small RNAs (sRNAs) are widespread post-transcriptional regulators that control bacterial stress responses and virulence. Nevertheless, little is known about how they arise and evolve. Homologs can be difficult to identify beyond the strain level using sequence-based approaches, and similar functionalities can arise by convergent evolution. Here, we found that the virulence-associated CJnc190 sRNA of the foodborne pathogen Campylobacter jejuni resembles the RepG sRNA from the gastric pathogen Helicobacter pylori. However, while both sRNAs bind G-rich sites in their target mRNAs using a C/U-rich loop, they largely differ in their biogenesis. RepG is transcribed from a stand-alone gene and does not require processing, whereas CJnc190 is transcribed from two promoters as precursors that are processed by RNase III and also has a cis-encoded antagonist, CJnc180. By comparing CJnc190 homologs in diverse Campylobacter species, we show that RNase III-dependent processing of CJnc190 appears to be a conserved feature even outside of C. jejuni. We also demonstrate the CJnc180 antisense partner is expressed in C. coli, yet here might be derived from the 3’UTR (untranslated region) of an upstream flagella-related gene. Our analysis of G-tract targeting sRNAs in Epsilonproteobacteria demonstrates that similar sRNAs can have markedly different biogenesis pathways. KW - sRNA biogenesis KW - Campylobacter jejuni KW - Helicobacter pylori KW - pathogenesis KW - RNase III Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-259602 VL - 117 ER - TY - THES A1 - Spohn, Gunther T1 - The transcriptional control of virulence gene expression in Helicobacter pylori T1 - Die transkriptionelle Kontrolle der Virulenzgenexpression in Helicobacter pylori N2 - The Gram-negative, spiral-shaped, microaerophilic bacterium Helicobacter pylori is the causative agent of various disorders of the upper gastrointestinal tract, such as chronic superficial gastritis, chronic active gastritis, peptic ulceration and adenocarcinoma. Although many of the bacterial factors associated with disease development have been analysed in some detail in the recent years, very few studies have focused so far on the mechanisms that regulate expression of these factors at the molecular level. In an attempt to obtain an overview of the basic mechanisms of virulence gene expression in H. pylori, three important virulence factors of this pathogen, representative of different pathogenic mechanisms and different phases of the infectious process, are investigated in detail in the present thesis regarding their transcriptional regulation. As an essential factor for the early phase of infection, including the colonisation of the gastric mucosa, the flagella are analysed; the chaperones including the putative adhesion factors GroEL and DnaK are investigated as representatives of the phase of adherence to the gastric epithelium and persistence in the mucus layer; and finally the cytotoxin associated antigen CagA is analysed as representative of the cag pathogenicity island, which is supposed to account for the phenomena of chronic inflammation and tissue damage observed in the later phases of infection. RNA analyses and in vitro transcription demonstrate that a single promoter regulates expression of cagA, while two promoters are responsible for expression of the upstream divergently transcribed cagB gene. All three promoters are shown to be recognised by RNA polymerase containing the vegetative sigma factor sigma 80. Promoter deletion analyses establish that full activation of the cagA promoter requires sequences up to -70 and binding of the C-terminal portion of the alpha subunit of RNA polymerase to an UP-like element located between -40 and -60, while full activation of the major cagB promoter requires sequences upstream of -96 which overlap with the cagA promoter. These data suggest that the promoters of the pathogenicity island represent a class of minimum promoters, that ensure a basic level of transcription, while full activation requires regulatory elements or structural DNA binding proteins that provide a suitable DNA context. Regarding flagellar biosynthesis, a master transcriptional factor is identified that regulates expression of a series of flagellar basal body and hook genes in concert with the alternative sigma factor sigma 54. Evidence is provided that this regulator, designated FlgR (for flagellar regulatory protein), is necessary for motility and transcription of five promoters for seven basal body and hook genes. In addition, FlgR is shown to act as a repressor of transcription of the sigma 28-regulated promoter of the flaA gene, while changes in DNA topology are shown to affect transcription of the sigma 54-regulated flaB promoter. These data indicate that the regulatory network that governs flagellar gene expression in H. pylori shows similarities to the systems of both Salmonella spp. and Caulobacter crescentus. In contrast to the flagellar genes which are regulated by three different sigma factors, the three operons encoding the major chaperones of H. pylori are shown to be transcribed by RNA polymerase containing the vegetative sigma factor sigma 80. Expression of these operons is shown to be regulated negatively by the transcriptional repressor HspR, a homologue of a repressor protein of Streptomyces spp., known to be involved in negative regulation of heat shock genes. In vitro studies with purified recombinant HspR establish that the protein represses transcription by binding to large DNA regions centered around the transcription initiation site in the case of one promoter, and around -85 and -120 in the case of the the other two promoters. In contrast to the situation in Streptomyces, where transcription of HspR-regulated genes is induced in response to heat shock, transcription of the HspR-dependent genes in H. pylori is not inducible with thermal stimuli. Transcription of two of the three chaperone encoding operons is induced by osmotic shock, while transcription of the third operon, although HspR-dependent, is not affected by salt treatment. Taken together, the analyses carried out indicate that H. pylori has reduced its repertoire of specific regulatory proteins to a basic level that may ensure coordinate regulation of those factors that are necessary during the initial phase of infection including the passage through the gastric lumen and the colonisation of the gastric mucosa. The importance of DNA topology and/or context for transcription of many virulence gene promoters may on the other hand indicate, that a sophisticated global regulatory network is present in H. pylori, which influences transcription of specific subsets of virulence genes in response to changes in the microenvironment. N2 - Das Gram-negative, spiralförmige Bakterium Helicobacter pylori verursacht verschiedene Krankheiten des oberen Verauungstraktes, wie z.B. chronische superfizielle Gastritis, chronische aktive Gastritis, Ulzera und Magenkarzinom. Obwohl viele der bakteriellen Faktoren, die zur Entwicklung dieser Krankheitsformen beitragen, in den letzten Jahren untersucht wurden, sind die molekularen Mechanismen, die die Expression dieser Faktoren regulieren, noch weitgehend unbekannt. Als Ansatz zur Untersuchung der grundlegenden Mechanismen der Virulenzgenexpression in H. pylori wurden in der vorliegenden Arbeit drei wichtige Virulenzfaktoren repräsentativ für die verschiedenen Phasen des Infektionsprozesses ausgewählt und in Bezug auf ihre transkriptionelle Regulation analysiert. Als essentielle Faktoren für die frühe Phase der Infektion, gekennzeichnet durch die Erstbesiedelung der Schleimschicht des Magens durch die Bakterien, wurden die Flagellen untersucht. Die Chaperone-Proteine mit den mutmaßlichen Adhärenzfaktoren GroEL und DnaK wurden stellvertretend für die Phase der Adhäsion an die Magenepithelzellen und die anschließende persistente Besiedelung der Magenschleimhaut analysiert. Als Verteter der cag Pathogenitätsinsel, die mit großer Wahrscheinlichkeit für die chronische Entzündung und Schädigung des Magengewebes in den späteren Phasen der Infektion verantwortlich ist, wurde schließlich das sogenannte Cytotoxin-assoziierte Antigen CagA untersucht. RNA-Analysen und in vitro-Transkriptionsstudien konnten zeigen, daß die Transkription des cagA-Gens von einem einzigen Promotor aus gesteuert wird, während die Expression des stromaufwärts gelegenen divergenten cagB-Gens von zwei Promotoren reguliert wird. Alle drei Promotoren werden von der vegetativen, sigma 80-enthaltenden RNA-Polymerase erkannt. Durch die Einführung spezifischer Deletionen zwischen cagA und cagB konnte weiterhin gezeigt werden, daß zur vollständigen Aktivierung des cagA-Promoters Sequenzen bis -70 sowie die Bindung der alpha-Untereinheit der RNA-Polymerase an ein UP-ähnliches Element zwischen -40 und -60 erforderlich sind, während die vollständige Aktivierung des wichtigsten cagB-Promotors Sequenzen oberhalb von -96 erfordert, die mit denjenigen des cagA Promoters überlappen. Diese Daten lassen darauf schließen, daß die Promotoren der Pathogenitätsinsel eine Klasse von Minimalpromotoren darstellen, die ein geringes Niveau an Transkription garantieren, für ihre volle Aktivierung aber regulatorische Elemente oder strukturelle DNA-bindende Proteine benötigen, die ein spezielles topologisches Umfeld produzieren. Bezüglich der Flagellen konnte ein zentraler Transkriptionsfaktor identifiziert werden, der in Kooperation mit dem alternativen Sigma-Faktor sigma 54 die Expression einer Serie von Genen kontrolliert, die für strukturelle Komponenten des Flagellenkörpers kodieren. Es konnte gezeigt werden, daß dieser Faktor (genannt FlgR für Flagellen-Regulator) für die Motilität der Bakterien notwendig ist und die Transkription von fünf Operonen reguliert, die für sieben strukturelle Gene des Flagellen-Basalkörpers und -Hakens kodieren. Darüberhinaus reprimiert FlgR die Transkription des sigma 28-regulierten flaA-Gens, während Änderungen der DNA-Topologie die Transkription des sigma 54-regulierten flaB-Promotors beeinflussen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß das regulatorische Netzwerk, welches die Expression der strukturellen Komponenten der Flagellen in H. pylori kontrolliert, Ähnlichkeiten zu den in Caulobacter crescentus und Salmonella spp. beschriebenen Systemen aufweist. Im Gegensatz zu den Flagellengenen, die von drei verschiedenen Sigma-Faktoren reguliert werden, konnte im Fall der drei Operone, die für die Haupt-Chaperone von H. pylori kodieren, eine sigma 80-abhängige Transkription nachgewiesen werden. Die Expression dieser Operone wird darüberhinaus negativ reguliert durch den transkriptionellen Repressor HspR, ein Homolog des gleichnamigen Hitzeschockrepressors von Streptomyces spp. In vitro-Experimente mit gereinigtem rekombinantem HspR konnten zeigen, daß das Protein die Transkription durch die Bindung an große DNA Regionen reprimiert, die in einem Fall mit dem Transkriptionsstart überlappen, und in den anderen beiden Fällen um -85 bzw. -120 lokalisiert sind. Im Gegensatz zur Situation in Streptomyces, wo die Transkription HspR-abhängiger Gene durch Hitzeschock induziert werden kann, ist die Transkription der HspR-regulierten Gene in H. pylori nicht mit Temperaturerhöhungen induzierbar. Die Expression zweier der drei Chaperone-kodierenden Operone kann dagegen durch osmotischen Schock induziert werden, während die Transkription des dritten Operons, trotz seiner HspR-Abhängigkeit, nicht durch osmotische Reize beeinflußbar ist. In ihrer Gesamtheit lassen die transkriptionellen Analysen der verschiedenen Virulenzfaktoren darauf schließen, daß H. pylori sein Repertoire an spezifischen regulatorischen Genen auf ein minimales Niveau reduziert hat, das die koordinierte Regulation derjenigen Faktoren sicherstellt, die für die Anfangsphase der Infektion, namentlich die Durchquerung des Magenlumens und die Erstbesiedelung des Magenepithels, notwendig sind. Die Bedeutung von DNA-Topologie und -Kontext für die Transkription vieler Virulenzgene könnte andererseits auf die Anwesenheit eines hochentwickelten globalen regulatorischen Netzwerkes hinweisen, welches die Transkription spezifischer Untergruppen von Virulenzgenen in Reaktion auf bestimmte Umweltfaktoren beeinflußt. KW - Helicobacter-pylori-Infektion KW - Virulenz KW - Genexpression KW - Helicobacter pylori KW - Transkription KW - Virulenzfaktoren KW - Flagellen KW - Pathogenitätsinsel KW - Chaperone KW - Helicobacter pylori KW - transcription KW - virulence factors KW - flagella KW - pathogenicity island KW - chaperones Y1 - 1999 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2334 ER - TY - THES A1 - Schär, Jennifer T1 - Molekulare Charakterisierung der Response-Regulatoren ArsR (HP0166), HP1043 und HP1021 von Helicobacter pylori T1 - Molecular characterisation of the response regulators ArsR, HP1043, HP1021 of Helicobacter pylori N2 - Bakterien müssen ständig in der Lage sein auf Veränderungen in ihrer Umwelt reagieren zu können. Zur Wahrnehmung dieser Veränderungen haben sich unterschiedliche Signaltransduktionssysteme entwickelt. Ein weit verbreiteter und gut charakterisierter Mechanismus zur Signaltransduktion sind die so genannten Zwei-Komponentensysteme. Im Genom von H. pylori konnten nur wenige Bestandteile von Zwei-Komponentensystemen identifiziert werden. Dazu zählen neben dem Chemotaxis-System lediglich drei Histidin-Kinasen, ArsS, CrdS und FlgS, und fünf Response-Regulatoren HP1021, HP1043, ArsR, CrdR und FlgR, die vermutlich Transkriptions-regulatorische Funktionen haben. Zwei der Response-Regulatoren, HP1043 und ArsR als essentiell für das Überleben von H. pylori, während HP1021 einen deutlichen Einfluss auf das Zellwachstum hat, da ein Wachstums-Defekt zu erkennen ist, wenn das entsprechende Gen hp1021 deletiert wird. Eine Deletion von arsS, dem Gen der zugehörigen Histidin-Kinase von ArsR, hat unter Standard-Wachstumsbedingungen keine Auswirkung auf das Zellwachstum von H. pylori. Diese Beobachtung spricht für die Hypothese, dass der Response-Regulator ArsR die Transkription zweier unterschiedlicher Sets von Zielgenen kontrolliert. Demzufolge reguliert der Response-Regulator ArsR nach Säure-induzierter Phosphorylierung durch ArsS die Transkription von Genen, die zur Säureresistenz beitragen, während ArsR im nicht-phosphorylierten Zustand die Transkription von weiteren Zielgenen kontrolliert, von denen mindestens eines für das Zellwachstum essentiell sein sollte. Das durch ArsR~P kontrollierte Regulon konnte bereits weitgehend charakterisiert werden allerdings sind die Zielgene des unphosphorylierten Regulators bislang unbekannt. In der vorliegenden Arbeit konnte die zuvor beschriebene Hypothese bestätigt werden, da gezeigt wurde, dass ein Derivat von ArsR, mit einer Mutation der Phosphorylierungsstelle D52 zu N52, das wildtypische Protein bezüglich des Zellwachstums unter Standardbedingungen funktionell ersetzen kann. Für die Response-Regulatoren HP1021 und HP1043 konnte bislang keine zugehörige Histidin-Kinase identifiziert werden und interessanterweise findet man in der Receiver-Domäne dieser Response-Regulatoren atypische Abweichungen von der Konsensus-Sequenz. Um die Bedeutung dieser atypischen Primärsequenzen für die Funktion dieser Response-Regulatoren zu untersuchen wurden mutierte H. pylori-Stämme konstruiert, die ausschließlich Derivate von HP1021 bzw. HP1043 exprimieren, die in ihrer Receiver-Sequenz der Konsensus-Sequenz entsprachen. Da diese Mutanten sich bezüglich ihres Zellwachstums nicht vom Wildtyp unterscheiden, konnte nachgewiesen werden, dass die atypischen Receiver-Sequenzen der beiden Response-Regulatoren nicht entscheidend für die Funktionen der Response-Regulatoren sind. Weiterhin konnten Indizien dafür gesammelt werden, dass HP1021 und HP1043 hinsichtlich ihrer Aktivierung vermutlich vom üblichen Zwei-Komponentenparadigma abweichen. Derivate von HP1021 und HP1043 mit Mutationen ihrer putativen atypischen Phosphorylierungsstelle sind in der Lage ihre wildtypischen Pendants hinsichtlich der bekannten Phänotypen funktionell zu ersetzen. Somit ist eine Phosphorylierung der Receiver-Domäne dieser Response-Regulatoren keine Voraussetzung für ein normales Zellwachstum von H. pylori. Diese Hypothese wird gestützt durch die Beobachtung, dass ein Ortholog von HP1043 aus C. jejuni CJ0355, das natürlicherweise an der potentiellen Phosphorylierungsstelle einen nicht phosphorylierbaren Aminosäurerest trägt, HP1043 in seiner Funktion ersetzen kann. Es konnte gezeigt werden, dass in vitro keine Phosphorylierung durch radioaktiv markiertes Acetylphosphat stattfindet und dass ein H. pylori-Stamm mit einer Deletion der Gene pta und ackA, welche Proteine kodieren, die bei der Synthese von zellulärem Acetylphosphat benötigt werden, einen normalen Wachstums-Phänotyp zeigt. Zusätzlich konnten in einer massenspektrometrischen Analyse des Proteins HP1021, welches nach Zweidimensionaler Gelelektrophorese von Gesamtzellproteinlysaten aus H. pylori isoliert wurde, keine Hinweise auf eine Serinphosphorylierung entdeckt werden. Es ist daher fraglich ob in vivo eine funktionell relevante Phosphorylierung stattfindet. Die Mechanismen zur Modulation der Regulator-Aktivität von HP1043 und HP1021 bleiben unklar. In der vorliegenden Arbeit konnte demonstriert werden, dass eine strikte Transkriptionskontrolle nicht für die Zellwachstums-assoziierten Funktionen von HP1021 von Bedeutung ist. Dagegen wurden Hinweise darauf erzielt, dass die Expression von HP1043 auf einem posttranskriptionellen und/oder auf einem posttranslationellen Level reguliert wird. Es waren bislang keine Zielgene von HP1021 bekannt. Durch vergleichende Zweidimensionale Gelelektrophorese der H. pylori Stämme 26695 und 26695 1021Δ konnten einige potentielle Zielgene des Response-Regulators HP1021 identifiziert werden. N2 - Bacteria need to react instantaneously on changes in their environment. For the sensing of environmental changes many different signaltransduction-systems have been evolved and the most widespread and well-characterised mechanism for signal transduction among the bacteria are the so called two-component systems. The genome of Helicobacter pylori encodes only a few proteins which are part of a two-component system. In addition to the chemotaxis-system there are just three histidine kinases, ArsS (HP0165), CrdS (HP1364) and HP0244, and five response regulators HP1021, HP1043, ArsR (HP0166), CrdR (HP1365) and HP0703, which are probably involved in transcriptional regulation (Alm et al., 1999; Tomb et al., 1997). Interestingly two of the response regulators, HP1043 and ArsR (HP0166) proved to be essential for the survival of H. pylori, while the response regulator HP1021 has a distinct influence on the cell-growth, as indicated by a severe growth defect when hp1021 is deleted (Beier & Frank, 2000; McDaniel et al., 2001; Schär, 2001). Under standard growth-conditions, the deletion of arsS (hp0165), encoding the cognate histidine kinase of ArsR (HP0166), has no effect on the cell-growth of H. pylori. This observation argues for the hypothesis that the response regulator ArsR (HP0166) controls the transcription of two different sets of target-genes. Upon acid-induced phosphorylation via ArsS (HP0165), the response regulator ArsR (HP0166) regulates the transcription of genes which are involved in acid resistance mechanisms, while in an unphosphorylated state ArsR (HP0166) controls other target genes, of which at least one is essential for cell-growth. The regulon controlled by ArsR~P (HP0166~P) has been extensively studied (Dietz, 2002; Forsyth et al., 2002; Pflock et al., 2004; Pflock et al., 2006; Pflock et al., 2005), while target genes of the unphosphorylated response regulator are so far unknown. In this work this hypothesis could be proven. It was shown that a derivative of ArsR (HP0166), with a mutation of the phosphorylation site D52 to N52, is able to substitute the wildtype protein functionally with respect to cell-growth. In the case of the response regulators HP1021 and HP1043 no cognate histidine kinases have been identified so far (Beier & Frank, 2000). Interestingly the receiver domains of the response regulators differ from the consensus sequence at highly conserved aminoacid residues. To investigate the importance of the atypical primary sequences for the function of HP1021 and HP1043, mutated H. pylori strains expressing exclusively derivatives of HP1021 or HP1043 with receiver sequences matching the consensus sequence were constructed. As these mutants did not show differences in cell-growth in comparison to the wildtype strain, it was proven that the atypical receiver sequences are not crucial for cell growth. Furthermore, indications could be found that HP1021 and HP1043 presumably differ from the common two component paradigm regarding their activation. Derivatives of HP1021 and HP1043 with mutations in their putative phosphorylation sites could functionally complement their wildtype counterparts with regards to cell growth. Therefore the phosphorylation of the receiver domain of these response regulators is not a pre-requisite for normal cell growth of H. pylori. In line with this hypothesis it could be demonstrated that there is no in vitro phosphorylation of the receiver domain of HP1021 and HP1043 with radioactive labelled acetylphosphate and that a H. pylori strain which a deletion of the genes pta and ackA, encoding proteins involved in the synthesis of acetylphosphate in the cell, showed a normal growth-phenotype. Moreover, when the protein HP1021, which was isolated by two-dimensional gelelectrophoreses, was analysed by mass spectrometry no evidence of a serine phosphorylation was obtained. Aditionally the observation that deletion of hp1043 can be complemented by the C. jejuni ortholog cj0355 encoding a response regulator protein with an asparagine residue replacing the consensus phosphate-accepting aspatic acid residue supports this hypothesis. Therefore it is questionable whether in vivo there is a phosphorylation which is functional relevant at all at the receiver domain. The mechanisms by which the activity of the Response-Regulators HP1021 and HP1043 is modulated still remain unclear. Here it could be demonstrated that strict transcriptional control of its expression is not relevant for the cell-growth associated function of HP1021. In contrast there are hints that the expression of HP1043 is controlled on a post-transcriptional and/or a post-translational level. Up to now no target genes of HP1021 were known. Using comperative two-dimensional gelelectrophoresis some potential target genes have been identified, among others HP0695, FadA and the Catalase. KW - Helicobacter pylori KW - Signaltransduktion KW - Genregulation KW - Response-Regulator KW - Helicobacter pylori KW - Zwei-Komponentensystem KW - essentiell KW - orphan KW - response regulator KW - Helicobacter pylori KW - two component system KW - essential KW - orphan Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21855 ER - TY - THES A1 - Pernitzsch, Sandy Ramona T1 - Functional Characterization of the abundant and conserved small regulatory RNA RepG in Helicobacter pylori T1 - Funktionelle Charakterisierung der abundanten und konservierten kleinen regulatorischen RNA RepG in Helicobacter pylori N2 - Bacterial small non-coding RNAs (sRNAs) play fundamental roles in controlling and finetuning gene expression in a wide variety of cellular processes, including stress responses, environmental signaling and virulence in pathogens. Despite the identification of hundreds of sRNA candidates in diverse bacteria by genomics approaches, the mechanisms and regulatory capabilities of these posttranscriptional regulators have most intensively been studied in Gram-negative Gammaproteobacteria such as Escherichia coli and Salmonella. So far, almost nothing is known about sRNA-mediated regulation (riboregulation) in Epsilonproteobacteria, including the major human pathogen Helicobacter pylori. H. pylori was even thought to be deficient for riboregulation as none of the sRNAs known from enterobacteria are conserved in Helicobacter and since it lacks the major RNA chaperone Hfq, which is crucial for sRNA function as well as stability in many bacteria. Nonetheless, more than 60 cis- and trans-acting sRNA candidates were recently identified in H. pylori by a global RNA sequencing approach, indicating that this pathogen, in principle, has the capability to use riboregulation for its gene expression control. However, the functions and underlying mechanisms of H. pylori sRNAs remained unclear. This thesis focused on the first functional characterization and target gene identification of a trans-acting sRNA, RepG (Regulator of polymeric G-repeats), in H. pylori. Using in-vitro and in-vivo approaches, RepG was shown to directly base-pair with its C/Urich terminator loop to a variable homopolymeric G-repeat in the 5’ untranslated region (UTR) of the tlpB mRNA, thereby regulating expression of the chemotaxis receptor TlpB. While the RepG sRNA is highly conserved, the length of the G-repeat in the tlpB mRNA leader varies among different H. pylori isolates, resulting in a strain-specific tlpB regulation. The modification of the number of guanines within the G-stretch in H. pylori strain 26695 demonstrated that the length of the homopolymeric G-repeat determines the outcome of posttranscriptional control (repression or activation) of tlpB by RepG. This lengthdependent targeting of a simple sequence repeat by a trans-acting sRNA represents a new twist in sRNA-mediated regulation and a novel mechanism of gene expression control, since it uniquely links phase variation by simple sequence repeats to posttranscriptional regulation. In almost all sequenced H. pylori strains, tlpB is encoded in a two gene operon upstream of HP0102, a gene of previously unknown function. This study provided evidence that HP0102 encodes a glycosyltransferase involved in LPS O-chain and Lewis x antigen production. Accordingly, this glycosyltransferase was shown to be essential for mice colonization by H. pylori. The coordinated posttranscriptional regulation of the tlpB-HP0102 operon by antisense base-pairing of RepG to the phase-variable G-repeat in the 5’ UTR of the tlpB mRNA allows for a gradual, rather than ON/OFF, control of HP0102 expression, thereby affecting LPS biosynthesis in H. pylori. This fine-tuning of O-chain and Lewis x antigen expression modulates H. pylori antibiotics sensitivity and thus, might be advantageous for Helicobacter colonization and persistence. Whole transcriptome analysis based on microarray and RNA sequencing was used to identify additional RepG target mRNAs and uncover the physiological role of this riboregulator in H. pylori. Altogether, repG deletion affected expression of more than 40 target gene candidates involved various cellular processes, including membrane transport and adhesion, LPS modification, amino acid metabolism, oxidative and nitrosative stress, and nucleic acid modification. The presence of homopolymeric G-repeats/G-rich sequences in almost all target mRNA candidates indicated that RepG hijacks a conserved motif to recognize and regulate multiple target mRNAs in H. pylori. Overall, this study demonstrates that H. pylori employs riboregulation in stress response and virulence control. In addition, this thesis has successfully established Helicobacter as a new model organism for investigating general concepts of gene expression control by Hfq-independent sRNAs and sRNAs in bacterial pathogens. N2 - Bakterielle kleine, nicht-kodierende RNAs (sRNAs, engl. für small RNAs) spielen eine fundamentale Rolle in der Kontrolle und Feinabstimmung der Genexpression in Bakterien. Sie sind an einer Vielzahl von zellulären Prozessen, einschließlich der Adaption an unterschiedliche Stress- sowie Umweltbedingungen und der Virulenz von bakteriellen Pathogenen, beteiligt. Trotz der Identifizierung von Hunderten von sRNA-Kandidaten in diversen Bakterien durch genomweite Untersuchungsmethoden, wurden die regulatorischen Eigenschaften und Mechanismen dieser posttranskriptionellen Regulatoren bisher hauptsächlich in Gram-negativen Gammaproteobakterien wie Escherichia coli und Salmonella untersucht. Bislang ist nur wenig über sRNA-basierte Regulation (Riboregulation) in Epsilonproteobakterien, einschließlich dem weitverbreiteten Humanpathogen Helicobacter pylori, bekannt. Es wurde sogar angenommen, dass H. pylori über keine Art der Riboregulation verfügt, da keine der enterobakteriellen sRNAs in Helicobacter konserviert sind. Zudem konnte in diesem Erreger kein Homolog für das RNAChaperon Hfq, welches in vielen Bakterien essentiell für die Funktion und Stabilität von sRNAs ist, identifiziert werden. Nichtsdestotrotz wurden mit Hilfe einer globalen RNASequenzierungsstudie,die auf der Sequenzierung primärer Transkripte in einem Hochdurchsatzverfahren basiert, kürzlich mehr als 60 in cis- und in trans-agierende sRNAKandidaten in H. pylori identifiziert. Diese Transkriptomanalyse deutet darauf hin, dass H. pylori prinzipiell die Fähigkeit hat Riboregulation zur Kontrolle seiner Genexression zu nutzen. Die Funktionen und Mechanismen von sRNAs in H. pylori sind jedoch immer noch unklar. In der vorgelegten Arbeit wurde erstmals eine in trans-agierende sRNA, RepG (Regulator of polymeric G-repeats), in Helicobacter charakterisiert sowie dessen zelluläre Zielgene identifiziert. Mit Hilfe diverser in-vitro und in-vivo Analysen konnte gezeigt werden, dass der C/U-reiche Transkriptionsterminatorloop von RepG direkt an eine variable, repetitive G-Sequenz in der 5‘ untranslatierten Region (UTR) der tlpB mRNA bindet. Durch diese direkte sRNA-mRNA Interaktion wird die Expression des Chemotaxis Rezeptors TlpB reguliert. Im Gegensatz zu einer hohen Konservierung der Sequenz der RepG sRNA, variiert die Länge des G-Stretches im 5‘ UTR der tlpB mRNA zwischen unterschiedlichen H. pylori Isolaten. Diese Längenvariation resultiert in einer Stamm-spezifischen Regulation der TlpB Expression. Die Modifikation der Anzahl der Guanin-Basen im G-Stretch des H. pylori Stammes 26695 demonstrierte, dass die Länge der repetitiven G-Sequenz das Ergebnis der posttranskriptionellen Regulation (Repression oder Aktivierung) von tlpB durch RepG beeinflusst. Die hier beschriebene Längen-abhängige Interaktion zwischen einer in transagierenden sRNA und einer einfachen, repetitiven Sequenz repräsentiert nicht nur ein neues Konzept für die Genregulation durch sRNAs, sondern stellt auch einen neuen Mechanismus der Genexpressionskontrolle dar. Darüber hinaus, veranschaulicht die hier beschriebene sRNA-mRNA Interaktion eine bislang einzigartige Verknüpfung von Phasenvariation durch hochvariabel, repetitive Sequenzen mit Genregulation durch sRNAs. In nahezu allen sequenzierten H. pylori Stämmen ist das tlpB Gen in einem Operon zusammen mit einem Gen mit bisher unbekannter Funktion, HP0102, kodiert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass HP0102 für eine Glykosyltransferase kodiert, die an der Synthese der O-Seitenketten des LPS und des Lewis x Antigens in H. pylori beteiligt ist. Darüber hinaus konnte demonstriert werden, dass diese Glykosyltransferase für die Kolonisierung des murinen Magens durch H. pylori essentiell ist. Die koordinierte, posttranskriptionelle Regulation des tlpB-HP0102 Operons, welche durch antisense Basenpaarung zwischen RepG und der phasen-variablen, repetitiven G-Sequenz im 5‘ UTR der tlpB mRNA vermittelt wird, ermöglicht eine graduelle Kontrolle der Genexpression von HP0102, und somit Einflussnahme auf die LPS Biosynthese in H. pylori. Diese Feinabstimmung der LPS O-Seitenketten und Lewis x Antigen Expression beeinflusst die Resistenz von H. pylori gegen diverse Antibiotika und könnte somit sowohl für die Kolonisierung als auch für die persistente Infektion des Wirts durch H. pylori vorteilhaft sein. Um Einblicke in die physiologische Funktion von RepG zu gewinnen, wurden in einer genom-weiten Transkriptomanalyse mittels Microarray und RNA-Sequenzierung weitere Zielgene von RepG bestimmt. Insgesamt beeinflusste die Deletion von repG die Expression von mehr als 40 potentiellen Zielgenen, welche an diversen zellulären Prozessen beteiligt sind, wie z.B. Membrantransport und Adhäsion, Aminosäure- und Nukleinsäure-Metabolismus, oxidative und nitrosative Stressantwort sowie LPS Modifizierung. Die Identifizierung von homopolymeren G-Stretchen bzw. G-reichen Sequenzen in allen ZielmRNAs deutet darauf hin, dass RepG ein konserviertes Motiv bindet, um mehrere Zielgene in H. pylori zu erkennen und zu regulieren. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass H. pylori Riboregulation basierend auf sRNAs nutzt, um seine Genexpression in unterschiedlichen Stress- und Virulenzbedingungen zu regulieren. Darüber hinaus hat diese Studie Helicobacter als neuen Modelorganismus für die Untersuchung genereller Wirkungsweisen Hfq-unabhängiger sRNAs und sRNAs in bakteriellen Pathogenen etabliert. KW - Small RNA KW - Helicobacter pylori KW - Genregulation KW - Riboregulation KW - Chemotaxis KW - LPS Biosynthese KW - Sequenzwiederholung KW - Phasenvariation Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-122686 ER - TY - THES A1 - Niehus, Eike T1 - Untersuchungen zur Regulation Motilitäts-assoziierter Gene in Helicobacter pylori T1 - Regulation of Motility-Associated Genes in Helicobacter pylori N2 - Helicobacter pylori ist ein an seine ökologische Nische hochgradig angepasstes Bakterium, das den Magen von mehr als 50% der Weltbevölkerung chronisch besiedelt. Bei 10 bis 20% der Infizierten können schwerere Krankheitsverläufe von Magengeschwüren bis hin zu Karzinomen auftreten. Die Chemotaxis-gesteuerte Motilität von H. pylori, vermittelt durch ein Bündel von 2-8 polaren Flagellen, ist für die Besiedelung und persistente Infektion des Wirtes essenziell. Mehr als 40 Komponenten des Flagellen- und Chemotaxissystems konnten mit Hilfe der beiden sequenzierten H. pylori-Genome identifiziert werden, wobei die Gene einzeln oder in kleinen transkriptionellen Einheiten über das gesamte Genom verteilt angeordnet sind. Mit der vorliegenden Arbeit sollte die Organisation und Vernetzung der transkriptionellen Regulation der Flagellenbiogenese und mögliche Querverbindungen zu anderen zellulären Funktionen in H. pylori umfassend charakterisiert werden. H. pylori verfügt über zwei unterschiedliche Flagellingene, flaA und flaB, deren Transkription von den beiden alternativen Sigma-Faktoren Sigma28 und Sigma54 kontrolliert wird. Um die transkriptionelle Regulation der beiden Gene in zwei unterschiedlichen Flagellenregulons zu untersuchen, wurde die Genexpression von flaA und flaB abhängig von der Wachstumsphase analysiert. Mit flaA- und flaB-Promotorfusionen wurde hier erstmalig ein sensitives, Biolumineszenz-basiertes Reportersystem für Expressionsstudien in H. pylori etabliert und genutzt. Die Transkriptmengen der beiden Flagellingene wurden weiterhin direkt mittels Northern Blot-Hybridisierungen und RT-PCR bestätigt. Es ergab sich eine Wachstumsphasen-abhängige, differentielle Regulation, bei der in Übereinstimmung mit der strukturellen Anordnung der Flagelline im Filament und der Zugehörigkeit der Gene zu zwei Regulationsklassen, das Verhältnis der flaA- zur flaB-Expression im Verlauf der Wachstumskurve stark anstieg. Um genomweite Analysen durchführen zu können, wurde in dieser Arbeit zunächst eine Plattform zur Untersuchung von H. pylori mit DNA-Microarrays etabliert. Hierzu wurde in Kooperation mit dem Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie in Berlin ein PCR-Produkt-Microarray mit 1590 H. pylori-spezifischen Sonden produziert. Zusätzlich wurde ein industriell gefertigter, Oligonukleotid-basierter, H. pylori-Microarray erstmalig verwendet und validiert. Mit Hilfe der Microarray- Technologie wurden verschiedene zentrale Regulatoren der H. pylori-Flagellenbiogenese zum ersten Mal auf genomweiter Ebene untersucht. Hierzu zählten die beiden alternativen Sigma-Faktoren FliA und RpoN, der Anti-Sigma28-Faktor FlgM, das RpoN-spezifische Zwei-Komponenten System FlgS/FlgR und die Flagellen-Basalkörperkomponenten FlhA und FlhF. Bis auf die fliA- und flgM-Mutanten, die, in Übereinstimmung mit ihrer antagonistischen Funktion, Stummelflagellen bzw. eine leicht erhöhte Flagellenzahl aufwiesen, bewirkten die Mutationen in allen anderen untersuchten Genen einen flagellenlosen unbeweglichen Phänotyp. Die Klassen 2 und 3 des H. pylori-Flagellenregulons konnten durch die Analysen des FliA- und des RpoNRegulons neu definiert und um zehn neue Gene ergänzt werden. Für FlhA und FlhF konnte eine Funktion als übergeordnete Regulatoren der Klassen 2 und 3 des Flagellenregulons gezeigt werden. Des Weiteren wurden 24 Gene einer neuen regulatorischen Zwischenklasse zugeordnet. Diese Gene werden von mehr als einem Promotor kontrolliert und umfassen Flagellen- sowie Nicht-Flagellengene. Durch globale Untersuchungen von Doppelmutanten wurde die komplexe Einbindung des Anti-Sigma-Faktors FlgM in die FlhA- und FlhF-vermittelte transkriptionelle Rückkopplung nachgewiesen. Basierend auf den Ergebnissen der Arbeit konnte ein neues Modell der Regulation der Flagellenbiogenese für H. pylori entwickelt werden. Es beinhaltet drei regulatorische Genklassen mit einer intermediären Klasse, die von den drei H. pylori-Sigma-Faktoren Sigma80, Sigma54 und Sigma28 zusammen mit den assoziierten Regulatoren FlgS/FlgR und FlgM kontrolliert werden. FlgM vermittelt als Anti-Sigma28-Faktor die transkriptionelle Rückkopplung auf die Klasse 3- und, im Zusammenspiel mit FlhA, auch auf die Klasse 2-Flagellengene. FlhF kontrolliert die Expression der Klasse 2-Flagellengene durch einen FlgM-unabhängigen, bislang ungeklärten Mechanismus. Die Sigma80-abhängigen Klasse 1-Flagellengene werden, anders als bei vielen anderen Bakterien, mit Stoffwechselgenen koreguliert und beinhalten auch die Flagellenmotor- und Chemotaxisgene. Dies spiegelt die Anpassung von H. pylori an seine spezifische ökologische Nische wieder, mit der Notwendigkeit, während der gesamten Infektion die Motilität aufrecht zu erhalten. N2 - The gastric human pathogen Helicobacter pylori is a fastidious bacterium, chronically colonizing the stomach of more than half of the world population, leading to severe diseases in some individuals such as ulcers or gastric cancer. H. pylori flagella-driven motility has been shown to be essential for the initial colonization of the human gastric mucosa and for the long-term persistence of the infection. The 2-8 flagella are arranged at one pole of the bacterium and covered by a membranous sheath. The flagella and chemotaxis system comprises more than forty genes. In contrast to the highly ordered gene organization in other organisms, they are scattered along the genome. The aim of this study was to comprehensively characterize the network of transcriptional regulation of flagellar biogenesis with possible links to other cell functions in H. pylori. H. pylori possesses two different flagellin genes, flaA and flaB, the transcription of the corresponding genes is controlled by sigma28 and sigma54 promoters respectively. To characterize the specific transcriptional regulation of these flagellar genes, which belong to two different regulons, transcript levels were monitored throughout the growth curve of H. pylori. A bioluminescence-based reporter gene system was successfully established in H. pylori for the first time. It was utilized to measure the activity of the newly constructed flaA- and flaB-promoter fusions. Furthermore growth-phase dependent transcript levels of the two flagellin genes were confirmed by Northern blot hybridizations and RT-PCR analysis. The results revealed a growthphase dependent differential transcriptional control of flaA and flaB in H. pylori. In agreement with the structural succession of FlaB and FlaA in the filament, as well as the affiliation of the genes to different flagellar regulons, flaA to flaB expression ratio was strongly increasing with the progression of the growth curve. An H. pylori microarray working platform was established to be able to perform genome-wide analyses on this organism. A custom made PCR-product microarray with 1590 H. pylori specific probes was constructed in cooperation with the Max-Planck-Institute for Infection Biology in Berlin. In addition, a commercially available H. pylori-specific oligonucleotide based microarray system was utilized for the first time and validated. By using the microarray technology, a set of different key regulators of the H. pylori flagellar system was analysed on a genome-wide scale for the first time. They are comprising the alternative sigma factors FliA and RpoN, the anti-sigma-factor FlgM, the RpoN specific two component system FlgS/R and the components of the flagellar basal body, FlhA and FlhF. While the fliA mutant revealed a phenotype with truncated flagella, the flgM mutant had a slightly enhanced number of flagella, correlating with their antagonistic function. Mutations in all other regulators lead to loss of flagella and motility. Based on the microarray analyses of the FliA and RpoN regulons, the flagellar regulatory classes 2 and 3 could be newly defined and enlarged by ten additional genes. The microarray studies on early flagellar components revealed a role for FlhA and FlhF as functional equivalents to master regulators. They are governing the transcription of flagellar regulatory classes 2 and 3 and a newly defined intermediate regulon. The latter comprised 24 flagellar and non-flagellar genes controlled by more than one promoter. Furthermore, studies on double mutants of the early regulators with the flagellar antisigma factor FlgM provided evidence for the complex regulatory interconnection of this factor with the determined flagellar feedback regulation of FlhA and FlhF. Based on the results of this study, a revised model of regulation pathways of flagellar biogenesis in H. pylori could be constructed. It is composed of three regulatory classes of flagellar genes and one intermediate class, governed by the three H. Pylori specific sigma factors sigma80, sigma54 and sigma28 and the associated regulators FlgS/R and FlgM. The transcriptional feedback regulation on class 3 genes is mediated by the anti-sigma factor FlgM, which is also involved in FlhA-dependent transcriptional control of class 2 flagellar genes. FlhF-dependent transcriptional control on class 2 genes is independent from FlgM. In contrast to other organisms, flagellar class 1 genes in H. pylori include flagellar motor and chemotaxis components and are coregulated with housekeeping genes. This coincides with the specific ecological adaptation of H. pylori to its niche and the necessity for the pathogen to be continuously motile to maintain a persistent infection. KW - Helicobacter pylori KW - Geißel KW - Genregulation KW - Helicobacter pylori KW - Flagellen KW - Genregulation KW - Motilität KW - Microarray KW - Helicobacter pylori KW - regulation KW - flagella KW - motility KW - microarray Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11141 ER - TY - THES A1 - Müller, Stefanie T1 - Funktionale und molekulare Charakterisierung des ArsRS Zweikomponenten-Systems sowie der Response-Regulatoren HP1021 und HP1043 von Helicobacter pylori T1 - Functional and molecular characterization of the ArsRS two-component-system and of the response-regulators HP1021 and HP1043 of Helicobacter pylori N2 - Bakterien sind in der Lage, sich schnell an wechselnde Umweltbedingungen anzupassen. Eine wichtige Rolle bei der Wahrnehmung von verschiedensten Umweltreizen und der zellulären Antwort spielt die Genregulation durch Zweikomponenten-Systeme. Gut charakterisiert ist das ArsRS Zweikomomponenten-System in H. pylori, welches an der Ausbildung der Säureresistenz beteiligt ist und dem Bakterium so die Kolonisierung der Magenschleimhaut ermöglicht. Die Histidin-Kinase ArsS wird in Gegenwart von Säure aktiviert und phosphoryliert den Response-Regulator ArsR, der die Transkription von Target-Genen reguliert. In der periplasmatischen Sensordomäne der Histidin-Kinase ArsS sind sieben Histidinreste vorhanden, die aufgrund ihres pKa-Wertes von 6,0 bei Absenken des pH Wertes von pH 7 auf pH 5, was eine Aktivierung der Histidin-Kinase zur Folge hat, protoniert werden könnten. Es konnte gezeigt werden, dass der Histidinrest H94 der periplasmatischen Sensordomäne einen wesentliche Rolle bei der Säurewahrnehmung durch die Histidin-Kinase ArsS spielt. Die Einführung einer positiv geladenen AS an dieser Position allein reicht jedoch nicht aus, um die Kinase zu aktivieren, weshalb unklar bleibt, ob eine Protonierung des Histidinrestes H94 in vivo die Säurewahrnehmung vermittelt. Weiterhin konnten Indizien darauf erhalten werden, dass neben dem Histidinrest H94 noch weitere Aminosäuren an der Säurewahrnehmung durch die Histidin-Kinase beteiligt sind. Der Aspartatrest D124 leistet unter den negativ geladenen AS vermutlich den größten Beitrag zur Säurewahrnehmung. In den mit H. pylori nahe verwandten Arten Helicobacter hepaticus, Wolinella succinogenes und Campylobacter jejuni sind Orthologe zu dem ArsRS Zweikomponenten-System vorhanden. Um zu untersuchen, ob es sich bei der Säurewahrnehmung durch die Histidin-Kinase ArsS um eine spezifische Anpassung von H. pylori an sein Habitat handelt oder ob Säure einen allgemeinen Stimulus der ArsS-orthologen Kinasen darstellt, wurden Mutanten im genetischen Hintergrund von H. pylori G27 konstruiert, in welchen die Histidin-Kinase ArsS durch die orthologen Kinasen HH1608, CJ1262 und WS1818 substituiert wurde. Durch Transkriptionsstudien konnte gezeigt werden, dass die Kinase WS1818 eine gesteigerte Aktivität bei saurem pH-Wert aufweist. Auch die Kinase HH1607 kann Säure als einen Umweltreiz wahrnehmen, jedoch deutlich weniger effektiv als die Kinasen ArsS und WS1818. Ob die Zweikomponenten-Systeme HH1608/HH1607 und WS1817/WS1818 in vivo in H. hepaticus und W. succinogenes an der Wahrnehmung von Säure und evtl. an der Ausbildung einer Säureresistenz beteiligt sind, ist unklar, da über die Funktion dieser Zweikomponenten-Systeme bisher nichts bekannt ist. Die Kinase CJ1262 ist nicht in der Lage, Säure als einen Umweltreiz wahrzunehmen. Die beiden Response-Regulatoren HP1043 und HP1021 spielen vermutlich eine Rolle bei der Regulation von Genen, deren Produkte eine wichtige Funktion für das vegetative Zellwachstum haben. Die Aktivität der beiden RR wird entgegen dem gängigen Zweikomponenten-System-Paradigma nicht über eine Phosphorylierung moduliert. In der vorliegenden Arbeit wurde analysiert, ob eine strikte Expressionskontrolle für die wachstumsassoziierten Funktion dieser Response-Regulatoren von Bedeutung ist. Zu diesem Zweck wurden verschieden Mutanten konstruiert, in welchen die Transkription der Gene hp1021 und hp1043 unter der Kontrolle von unterschiedlich regulierten Promotoren stattfindet. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression des Gens hp1043 sowohl transkriptionell als auch posttranskriptionell und/oder posttranslational strikt reguliert wird. Es kann deshalb postuliert werden, dass die Aktivität des RR HP1043 über die vorhandene Konzentration an Regulator in der Bakterienzelle beeinflusst wird. Die Expression des Gens hp1021 wird nicht strikt reguliert. Auf welche Weise die Aktivität des RR HP1021 moduliert wird, bleibt unklar. N2 - Bacteria are able to adapt rapidly to alternating environmental conditions. Two component systems play a predominant role in sensing environmental stimuli and triggering a proper cellular response. The genome of Helicobacter pylori harbours only a few genes encoding for two component system proteins. The ArsRS two component system of H. pylori which controls the acid response and therefore is required for colonization of the mucus is well characterized. The kinase ArsS is activated under acidic conditions and phosphorylates the response regulator ArsR resulting in activation or repression of transcription of ArsRS-dependent target genes. The acid response of H. pylori is triggered when the pH drops from 7 to 5. Therefore, due to their side chain pKa-value of 6 seven histidine residues in the periplasmic sensor domain of the kinase ArsS were hypothesized to be involved in acid sensing. It was shown that the histidine residiue H94 is involved in the acid sensing by the histidine kinase ArsS. Substitution of H94 by the positively charged amino acid arginine did not result in a constitutively active ArsS protein. Therefore it remains unclear whether H94 contributes to the acid-sensing via protonation. Furthermore it was speculated that apart from histidine H94 other other amino acids contribute to the acid sensing of ArsS. Amongst them the aspartic acid residue D126 seems to play a predominant role. The closely related epsilon-proteobacteria Helicobacter hepaticus, Wolinella succinogenes and Campylobacter jejuni express ArsRS orthologs. Mutants of H. pylori G27 expressing the orthologous hisitine kinases WS1818, HH1607, and CJ1262 instead of the ArsS protein where constructed to investigate whether acidic pH is a common stimulus sensed by ArsS orthologs. Transcriptional analysis of the mutants revealed that the kinase WS1818 is activated under acidic conditions. The histidine kinase HH1607 also responds to acid as an environmental signal though less efficient than ArsS and WS1818. Since nothing is known about the function of the kinases HH1607 and WS1818 it remains unclear whether these proteins contribute to acid sensing and mounte an acid response in vivo in W. succinogenes and H. hepaticus. The kinase CJ1262 is not activated under acidic conditions. The response regulators HP1021 and HP1043 presumably play a role in the regulation of genes whose protein products have a fundamental function in vegetative cell growth. In contrast to the well established two component system paradigm their activity is not modulated via phosphorylation. In this work it was analyzed whether a strict control of their expression is required for the growth associated function of the respective response regulators. For this purpose several mutants were constructed in which the transcription of the genes hp1021 and hp1043 was placed under the control of different promoters. It was demonstrated that the expression of the gene hp1043 is controlled both on the transcriptional and posttranscriptional and/or posttranslational level and that this expression control is important for response regulator function. In contrast, strict expression control is not a prerequisite for the function of response regulator HP1021. KW - Helicobacter pylori KW - Säure KW - Genregulation KW - Zweikomponenten-System KW - ArsRS KW - Response-Regulator KW - HP1021 KW - HP1043 KW - two-cpmponent-system KW - ArsRS KW - response-regulator KW - HP1021 KW - HP1043 Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36263 ER - TY - THES A1 - Lee, Sae Kyung T1 - Interaction of Helicobacter pylori flagellins with the host innate immune system T1 - Interaktion von Helicobacter pylori Flagellin mit dem angeborenen Immunsystem des Wirtes N2 - Helicobacter pylori (H. pylori) is a gram-negative, microaerophilic, spiral-shaped bacterium. It resides in the gastric mucous layer and epithelial lining of the stomach, often clustering at the junction of epithelial cells. H. pylori colonization usually occurs during childhood, and, when left untreated, generally persists for the host’s lifetime. Persistent H. pylori infection can cause chronic superficial gastritis and gastric duodenal ulcers, which is possibly linked to the development of gastric carcinoma and primary gastric lymphoma, especially of the mucosa-associated lymphoid tissue (MALT) type. It was recently defined as a class 1 carcinogen. The gastric inflammatory response to H. pylori infection is characterized by infiltration of the mucosa by neutrophils, T and B cells, plasma cells and macrophages. This reaction is initially induced by H. pylori attachment, followed by cytokine release by gastric epithelial cells. Epidemiological studies revealed that more than 50% of adults are infected with H. pylori all over the world. However, interestingly, only a subset of individuals develops serious H. pylori-related disease, while most infected individuals show no clinical symptoms. Gastric epithelial cells, like intestinal epithelial cells, express a subset of Toll-like receptors (TLRs) and similar pattern recognition receptors, which are important for the activation of the innate immune system. Bacterial components such as lipopeptides, peptidoglycan, LPS, flagellin, and CpG DNA are the ligands of TLRs. Thus, TLRs in gastric epithelial cells might be able to contribute to innate immune responses to H. pylori infection. However, there is scant knowledge about the mechanisms of innate immune response to acute and chronic H. pylori infection. This study is focused on host cell interaction with H. pylori flagellins, which are major components of the flagellar apparatus, and innate immune responses against them. The flagellins, which are essential for bacterial motility, are important for H. pylori to survive in the stomach mucus during the whole infectious cycle. Flagellins are known to act as the main determinant of many mucosal pathogenic bacteria that mediates proinflammatory signaling, including transcriptional factor NF-B activation via TLR5. In the first part of the study, we investigated the effects of H. pylori flagellins on TLR5 expression, NF-B activation and IL-8 production in various human intestinal and gastric epithelial cell lines by using Western blotting, semi-quantitative RT-PCR and ELISA. IL-8 is a potent neutrophil-activating chemokine expressed by gastric epithelial cells. When we stimulated the cells with the native form of or E. coli-expressed recombinant H. pylori flagellins, FlaA and FlaB, IL-8 was not induced in any case, while S. typhimurium flagellin (FliC) induced it significantly. H. pylori was able to modulate TLR5 protein expression and NF-B activation in epithelial cells regardless of the presence of flagellins. Having established the finding that H. pylori flagellins have unusually low immune-stimulatory properties, we further investigated to find out possible reasons why H. pylori flagellins are distinct from other flagellins of pathogenic bacteria in terms of immune-stimulatory activity. From amino acid sequence comparisons, we found that some regions in the terminal D0D1 protein domains of H. pylori flagellins are different from flagellins of other pathogenic bacteria. D0D1 is the domain which is known to interact with TLR5 in Salmonella FliC. To examine whether the differences endow H. pylori flagellins with low immune-stimulatory properties, we created several mutated H. pylori flagellins (FlaA and FlaB) by site-directed mutagenesis that contain one to four epitopes of Salmonella flagellin D0D1 domain amino acid sequences. The mutant flagellins expressed both in H. pylori and E. coli were used to determine their influence on TLR5-signaling mediators and cytokines, such as MAPkinases, (ERK, p38), NF-B, IL-8, and MIP-3. Salmonella FliC expressed in E. coli induced activation of p38, IB and NF-B leading to IL-8 and MIP-3 production in gastric epithelial cells. However, none of the H. pylori flagellin mutants activated MAP kinases or induced those cytokines. In a co-immunoprecipitation assay none of the recombinant wild type or mutated H. pylori flagellins showed any direct physical interaction with TLR5, while Salmonella FliC significantly co-precipitated with TLR5. Interestingly, we found H. pylori flagellins bind to the surface of gastric epithelial cells like FliC, although they do not bind to or stimulate TLR5. Based on the physical interaction of H. pylori flagellins and FliC with human gastric epithelial cells, we further analyzed transcriptional regulation by H. pylori flagellin in these host cells using microarray analysis. The result showed that H. pylori flagellins modulate host cell gene expression, and many of the identified regulation events overlap with the genes regulated by FliC. These findings imply that H. pylori flagellins do play a role in gene regulation of host cells probably through still unknown factors or receptors, although they do not trigger TLR5-related signaling pathways. The results of our study suggest that, in addition to the low immune-stimulatory activity of H. pylori LPS, the evolutionary reduction in stimulating activity of H. pylori flagellins on the local innate immune responses in the stomach in vivo might be a further strategy of this chronic mucosal pathogen to evade and minimize deleterious host responses, thereby promoting life-long persistence in the host, and possibly contributing to cancerogenesis. N2 - Helicobacter pylori (H. pylori) ist ein gram-negatives, mikroaerophiles, spiralförmiges Bakterium. Es besiedelt die Schleimschicht und die Epitheloberfläche des Magens, wobei es sich besonders an den Kontaktstellen der Epithelzellen anlagert. Die Kolonisation mit H. pylori erfolgt normalerweise während der Kindheit und bleibt, wenn sie nicht behandelt wird, im allgemeinen während der gesamten Lebenszeit des Wirtes bestehen. Die persistierende H. pylori-Infektion kann chronische oberflächliche Gastritis und Zwöffingerdarmgeschwüre verursachen. Die Infektion kann auch zur Entwicklung von Magenkrebs und Lymphomen des Mukosa-assoziierten Lymphgewebes (MALT-Lymphom) führen. H. pylori ist seit 1994 als Typ I-Karzinogen klassifiziert. Die durch eine H. pylori-Infektion induzierte Entzündungsreaktion der Magenschleimhaut ist charakterisiert durch eine Infiltration der Schleimhaut mit neutrophilen Granulozyten, T- und B-Zellen, Plasmazellen und Makrophagen. Diese Reaktion wird ausgelöst durch die Anheftung von H. pylori gefolgt von der Freisetzung von Cytokinen durch die Magenepithelzellen. Epidemiologische Studien haben ergeben, dass weltweit mehr als 50% aller Erwachsenen mit H. pylori infiziert sind. Jedoch entwickelt interessanterweise nur eine Teilgruppe der infizierten Individuen eine ernsthafte H. pylori-assoziierte Krankheit, während die meisten Infizierten keine klinischen Symptome zeigen. Magenepithelzellen exprimieren, genauso wie Darmepithelzellen, eine Reihe von TOLL-like Rezeptoren (TLRs) und ähnliche Musterekennungsrezeptoren, die wichtig für die Aktivierung des angeborenen Immunsystems sind. Bakterielle Komponenten, wie z. B. Lipopeptide, Peptidoglycan, LPS, Flagellin und CpG-DNA sind die Liganden der TLRs. Auf diese Weise könnten die TLRs in den Magenepithelzellen in der Lage sein, zu der angeborenen Immunreaktion auf eine H. pylori-Infektion beizutragen. Jedoch ist bisher nur wenig über die Mechanismen der angeborenen Immunreaktion auf eine akute und chronische H. pylori-Infektion bekannt. Diese Studie befasst sich mit den Zellinteraktionen mit und den Antworten des Wirtsimmunsystems auf H. pylori-Flagelline, stark exprimierte Proteine des Flagellenapparats. Der Flagellenapparat ist essentiell für die Fähigkeit der Bakterien, im Magenschleim (Mukus) beweglich zu sein, und befähigt die Bakterien dazu, während des gesamten Infektionszyklus im Mukus und an der Magenmukosa zu überleben. Flagellin ist für viele pathogene Bakterien im Intestinaltrakt oder auch in der Lunge des Säuger-Wirts ein sehr wichtiger Faktor, der durch Bindung an TLR5 proinflammatorische Signalvorgänge, einschließlich der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-B, herbeiführt. Im ersten Teil der vorliegenden Studie haben wir die Wirkungen von H. pylori-Flagellinen (FlaA, FlaB) auf TLR5-Expression, NF-B-Aktivierung und IL-8-Produktion in verschiedenen menschlichen Darm- und Magenepithelzelllinien mittels Western Blot, semi-quantitativer RT-PCR und ELISA untersucht. IL-8 ist ein hochwirksames Neutrophilen-aktivierendes Chemokin, welches von den Magenepithelzellen sezerniert wird und als ein Marker für die Zellaktivierung durch H. pylori, seine löslichen Produkte und Kontrollen diente. Nach Stimulation verschiedener Epithelzellen und humaner Makrophagen mit nativen oder in E. coli rekombinant hergestellten H. pylori-Flagellinen FlaA und FlaB wurde in keinem Fall IL-8 gebildet, während S. typhimurium-Flagellin (FliC) IL-8-Bildung und -Sekretion in signifikanter Menge induzierte. H. pylori war in der Lage, TLR5-Protein-Expression und die NF-B-Aktivierung in Epithelzellen zu modulieren, unabhängig von dem Vorhandensein von Flagellinen. Nachdem wir gezeigt hatten, dass H. pylori-Flagelline ungewöhnlich geringe immunstimulierende Eigenschaften besitzen, setzten wir unsere Untersuchungen fort, um mögliche Gründe herauszufinden, warum H. pylori-Flagelline sich von anderen Flagellinen pathogener Bakterien hinsichtlich der das Immunsystem stimulierenden Aktivitäten unterscheiden. Bei Vergleichen von Aminosäuresequenzen fanden wir heraus, dass einige Regionen in den terminalen D0D1-Domänen der H. pylori-Flagelline sich von Flagellinen anderer pathogener Bakterien unterscheiden. D0D1 ist der Funktionsbereich des Flagellins, von dem bekannt ist, dass er bei Salmonellen-FliC mit TLR5 interagiert. Um zu untersuchen, ob diese Unterschiede für die geringe immunstimulierende Wirkung von H. pylori-Flagellinen verantwortlich sind, generierten wir durch eine zielgerichtete Mutagenese mehrere mutierte H. pylori-Flagelline (FlaA und FlaB), die ein bis vier Epitope der Aminosäuresequenzen der D0D1-Domäne des Salmonella-Flagellins enthielten. Die mutierten Flagelline, die sowohl in H. pylori als auch in E. coli exprimiert wurden, wurden genutzt, um ihren Einfluss auf TLR5-Signal-Mediatoren und Cytokine, wie z. B. MAP-Kinasen (ERK, p38), NF-B, IL-8 und MIP-3α herauszufinden. In E. coli exprimiertes Salmonella-FliC bewirkte die Aktivierung von p38, IB, NF-B und ERK und führte zur Produktion von IL-8 und MIP-3α in den Magenepithelzellen. Im Gegensatz dazu aktivierte keine der H. pylori-Flagellinmutanten MAP-Kinasen oder induzierte diese Cytokine. Wir konnten durch Koimmunpräzipitationstechniken zeigen, dass wildtypische oder mutierte H. pylori-Flagelline nicht physisch mit TLR5 interagieren, während Salmonella-FliC spezifisch an TLR5 bindet. Interessanterweise fanden wir heraus, dass H. pylori-Flagelline wie FliC an die Oberfläche verschiedener humaner Epithelzellen binden, obwohl sie nicht TLR5 stimulieren oder an TLR5 binden. Basierend auf der physischen Interaktion von H. pylori-Flagellinen und FliC mit menschlichen Magenepithelzellen haben wir weiterhin die Transkriptionsregulation durch H. pylori-Flagellin in den Wirtszellen mit Hilfe der Microarray-Analyse untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass H. pylori-Flagelline die Gene der Wirtszelle modulieren, und viele der identifizierten Regulationsereignisse überschnitten sich mit den durch FliC regulierten Genen. Diese Ergebnisse implizieren, dass H. pylori-Flagelline doch eine Rolle bei der Genregulierung von Wirtszellen spielen, wahrscheinlich durch noch unbekannte Faktoren und Rezeptoren, obwohl sie keine mit TLR5 in Zusammenhang stehenden Signaltransduktionsketten auslösen. Die Resultate unserer Studien lassen darauf schließen, dass zusätzlich zu der das Immunsystem nur gering stimulierenden Aktivität von H. pylori-LPS die evolutionäre Reduzierung der stimulierenden Aktivität von H. pylori-Flagellinen auf lokale angeborene Immunreaktionen im Magen in vivo eine weitere Strategie dieses chronischen Schleimhautpathogens sein könnte, um schädliche Wirtsreaktionen zu verhindern und zu minimieren und hierdurch seine lebenslange Persistenz, jedoch auch die Krebsentstehung im Wirt zu fördern. KW - Helicobacter pylori KW - TLR5 KW - Helicobacter KW - Flagellin KW - angeborene Immunität KW - TLR5 KW - Helicobacter KW - Flagellin KW - Innate immunity Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19917 ER - TY - THES A1 - Kraft, Christian T1 - Die Rolle von Mutation und Rekombination in der Mikroevolution von Helicobacter pylori T1 - The role of mutation and recombination in the microevolution of Helicobacter pylori N2 - Helicobacter pylori ist ein pathogenes Bakterium, das verantwortlich gemacht wird für verschiedene Erkrankungen des Magens und Duodenums, wie beispielsweise chronische Gastritis, peptische Ulzera und maligne Lymphome. Das Bakterium zeichnet sich durch eine hohe Rekombinationsrate aus und besitzt ein hohes Maß an genetischer Allelvielfalt. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Rekombinationsrate und die Länge der rekombinerten DNA-Importe anhand von sequentiellen Isolaten, die zu definierten Zeitpunkten aus dem selben Patienten isoliert wurden, untersucht. Es wurden zehn Gene, darunter sieben 'housekeeping' Gene und drei virulenzassoziierte Gene, amplifiziert und sequenziert. Die Ergebnisse zeigten eine bis dahin noch nicht für Bakterien beschriebene Fragmentlänge der DNA-Importe von durchschnittlich lediglich 417 Basenpaaren. Die Rekombinationsrate war außergewöhnlich hoch. DNA-Microarray-Analysen konnten zeigen, dass es trotz dieser hohen Rekombinationsrate nur wenige Veränderungen in der genomischen Genausstattung gab. Jedoch hing das Auftreten von Rekombinationsereignissen direkt mit Veränderungen der Genausstattung zusammen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein neues in vitro-Transformationsmodell entwickelt, das die in vivo ermittelten Resultate nachvollziehen sollte. Das Modell konnte sowohl die in vivo gefundene Rekombinationsrate als auch den Import von kurzen DNA-Fragmenten bestätigen, die zu einem Allelmosaik zwischen DNA-Rezipient und Donor führten. Auffällig war eine stark verminderte Transformierbarkeit mit Donor-DNA aus asiatischen H. pylori-Stämmen. Um eine mögliche Beteiligung des Nukleotid-Excisions-Reparatur (NER) Mechanismus an der Rekombination zu ermitteln, wurden zwei Gene des Mechanismus ausgeschaltet. Die Ergebnisse der NER--Mutanten (uvrA-, uvrD-) zeigten eine starke Verminderung der Transformierbarkeit. Diese Verminderung hatte jedoch keinen Einfluss auf die Länge der rekombinierten DNA-Importe. Das Ausschalten des uvrA-Gens führte zudem zu einer erhöhten Sensibilität gegenüber UV-Licht. Der NER-Mechanismus ist bei H. pylori in einer noch nicht aufgeklärten Weise an der Rekombination beteiligt. In einem Rhesusaffen-Tiermodell wurde die initiale Besiedlung mit H. pylori untersucht. Die Tiere stellen einen natürlichen Wirt dar und zeigen ähnliche Krankheitssymptome wie menschliche Patienten. Die Rhesusaffen wurden experimentell mit zwei klinischen H. pylori-Isolaten infiziert. Die Reisolation zu bestimmten Zeitpunkten zeigte, dass sich nur einer der beiden Stämme im Affenmagen etablieren konnte und der zweite Stamm verdrängt worden war. In einem zweiten Versuchsansatz wurden die persistent infizierten Affen mit vier weiteren H. pylori-Stämmen infiziert, um eine transiente Koinfektion zu simulieren. Diese Stämme verdrängten jedoch den bereits etablierten Stamm, und es konnte keine in vivo-Rekombination festgestellt werden. Dennoch ist dieses Modell das Erste, in dem eine persistierende experimentelle H. pylori-Infektion in Rhesusaffen über einen Zeitraum von mehr als vier Jahren nachgewiesen werden konnte. Die Ergebnisse liefern wichtige Hinweise auf den beim Menschen meist unentdeckten Anfang der H. pylori-Infektion. Die Untersuchungen an weiteren Spezies des Genus Helicobacter zeigten, dass die beschriebene Spezies Heelicobacter nemestrinae keine eigene Spezies darstellt, sondern der Spezies H. pylori zugeordnet werden konnte. Den damit nächsten 'Verwandten' stellt die Spezies H. acinonychis dar, deren Stämme sich untereinander wesentlich weniger stark unterscheiden als H. pylori-Stämme. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern wichtige Daten zum Verständnis der Evolution und Mikroevolution innerhalb eines Wirtes von H. pylori, die zu besseren Strategien in der Bekämpfung dieses pathogenen Bakteriums führen können. N2 - The human pathogen Helicobacter pylori colonizes the gastrointestinal tract and causes a long-term infection leading to several diseases such as gastritis, peptic ulcers and cancer. H. pylori is the most genetically diverse bacterial species known. Population genetic analysis has shown that the diversity is largely due to recombination between different H. pylori strains during mixed infection. To analyse the recombination rate in vivo, sequential isolates, taken from the same patient at different timepoints, were used. Fragments of seven housekeeping genes, the two flagellin genes and the vacuolating cytotoxin gene vacA, were sequenced and pairwisely compared to detect genetic changes that had occurred during chronic colonization. The recombination rate was unexpectedly high and the size of the imported DNA-fragments had an average of only 417 basepairs. DNA-imports of this extraordinarily short length were never found before in other bacterial species so far. A Microarray analysis showed a high stability of the genetic content in the paired isolates. The very few differences in this genetic content were mainly driven by recombination events. A new developed in vitro transformation model was able to measure the recombination frequency and the length of the imported DNA. The model confirmed the unusually high recombination frequency and the very short imported DNA fragments found in vivo in the sequential isolates. Interestingly, by using Asian strains as DNA donor, the recombination frequency was much lower compared to European and African strains. To answer the question whether the nucleotide-excision-repair (NER) mechanism was involved in the recombination process, knock out mutants of two key genes of the mechanism were used (uvrA-, uvrD-). The NER mutants showed a notable decrease in their transformation ability, but the length of the imported fragments was not affected. The NER mechanism seems to be involved in the recombination process, but it is still unknown in how far and in which way. A rhesus monkey model was developed to establish an experimentally persistent H. pylori infection and to investigate the initial infection steps. Macaques are natural hosts of H. pylori and develop similar disease. Two clinical isolates were chosen for infection, but only one strain survived in the stomach of the macaques. The second strain was outcompeted by the first one. In a second trial the macaques were infected with four new strains of H. pylori to simulate a transient co-colonisation. Only two of the new strains survived and the formerly established strain was outcompeted by the two new strains. No recombination events could be detected. Nevertheless, this is the first time that rhesus monkeys were experimentally persistently infected for more than four years with H. pylori. In this model the first steps of an new H. pylori infection can be investigated, which is not possible in humans. Investigations of other members of the genus Helicobacter showed, that the species Helicobacter nemestrinae was not an independent species, but represented a strain of H. pylori. The closest related species then was represented by Helicobacter acinonychis. Genetic analyses revealed a much more clonal genome between different H. acinonychis strains compared to H. pylori. KW - Helicobacter pylori KW - Evolution KW - Molekulargenetik KW - Helicobacter KW - Evolution KW - Helicobacter KW - evolution Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9757 ER - TY - THES A1 - Jiménez-Pearson, María-Antonieta T1 - Characterization of the mechanisms of two-component signal transduction involved in motility and chemotaxis of Helicobacter pylori T1 - Untersuchungen zur Zweikomponenten- Signaltransduktion bei der Motilität und Chemotaxis von Helicobacter pylori N2 - Flagellen-basierte Motilität und Chemotaxis stellen essentielle Pathogenitätsfaktoren dar, die für die erfolgreiche Kolonisierung der Magenschleimhaut durch H. pylori notwendig sind. Die Mechanismen der Regulation der Flagellensynthese und das Chemotaxis-System von H. pylori weisen trotz einiger Ähnlichkeiten fundamentale Unterschiede zu den Systemen anderer Bakterien auf. In H. pylori ist die Flagellensynthese durch eine komplex regulierte Kaskade kontrolliert, die Regulatorkomponenten wie das Zweikomponentensystem HP244/FlgR, die Sigma Faktoren 54 und 28 und den Sigma Faktor28-Antagonisten FlgM enthält. Das Signal, welches über die Histidinkinase des Zweikomponentensystems HP244/FlgR die Expression der Sigma Faktor54-abhängigen Klasse 2 Flagellengene reguliert, ist bisher noch nicht bekannt. Allerdings konnte mit HP137 ein Protein identifiziert werden, das im „yeast two-hybrid“ System sowohl mit der korrespondierenden Kinase HP244 des Flagellenregulators FlgR, als auch mit der Flagellenkomponente FlgE´ interagiert (Rain et al., 2001). In dieser Arbeit wurde eine mögliche Rolle von HP137 in einem Rückkopplungsmechanismus untersucht, welcher die Aktivität der Histidinkinase in der Flagellenregulation kontrollieren könnte. Obwohl die Deletion des ORF hp137 zu einer unbeweglichen Mutante führte, legen die erfolglosen Komplementations Experimente, sowie die Beobachtung, dass HP137 in vitro keinen bedeutenden Effekt auf die Aktivität der Histidinkinase HP244 hat nahe, dass HP137 weder in H. pylori noch im nahe verwandten C. jejuni direkt an der Flagellenregulation beteiligt ist. Das Chemotaxis-System von H. pylori unterscheidet sich vom gutuntersuchten Chemotaxis-System der Enterobakterien in einigen Aspekten. Zusätzlich zu dem CheY Response Regulator Protein (CheY1) besitzt H. pylori eine weitere CheY-artige Receiver-Domäne (CheY2) welche C-terminal an die Histidinkinase CheA fusioniert ist. Zusätzlich finden sich im Genom von H. pylori Gene, die für drei CheV Proteine kodieren die aus einer N-terminalen Domäne ähnlich CheW und einer C-terminalen Receiver Domäne bestehen, während man keine Orthologen zu den Genen cheB, cheR, and cheZ findet. Um einen Einblick in den Mechanismus zu erhalten, welcher die chemotaktische Reaktion von H. pylori kontrolliert, wurden Phosphotransferreaktionen zwischen den gereinigten Signalmodulen des Zweikomponentensystems in vitro untersucht. Durch in vitro-Phosphorylierungsexperimente wurde eine ATP-abhängige Autophosphorylierung der bifunktionellen Histidinkinase CheAY2 und von CheA´, welches ein verkürztes Derivat von ChAY2 ohne Receiver-Domäne darstellt, nachgewiesen. CheA´ zeigt eine für an der Chemotaxis beteiligte Histidinkinasen typische Phosphorylierungskinetik mit einer ausgeprägten exponentiellen Phase, während die Phosphorylierungskinetik von CheAY2 nur eine kurze exponentielle Phase aufweist, gefolgt von einer Phase in der die Hydrolyse von CheAY2~P überwiegt. Es wurde gezeigt, dass die Anwesenheit einer der CheY2 Domäne die Stabilität der phosphorylierten P1 Domäne im CheA Teil des bifunktionellen Proteins beeinflusst. Außerdem wurde gezeigt, dass sowohl CheY1 als auch CheY2 durch CheAY2 phosphoryliert werden und dass die drei CheV Proteine die Histidinkinase CheA´~P dephosphorylieren, wenn auch mit einer im Vergleich zu CheY1 und CheY2 geringeren Affinität. Außerdem ist CheA´ in der Lage seine Phosphatgruppen auf CheY1 aus C. jejuni und CheY aus E. coli zu übertragen. Retrophosphorylierungsexperimente weisen darauf hin, dass CheY1~P die Phosphatgruppe zurück auf die Histidinkinase CheAY2 übertragen kann und dass die CheY2-Domäne in dem bifunktionellen Protein CheAY2 als „Phosphat Sink“ agiert der den Phosphorylierungszustand und damit die Aktivität des frei diffundierbaren Proteins CheY1 reguliert, das vermutlich es mit dem Flagellenmotor interagiert. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass die unabhängige Funktion der beiden Domänen CheA´ und CheY2 für eine normale chemotaktische Signalgebung in vivo nicht ausreicht. In dieser Arbeit wurden also Hinweise auf eine komplexe Kaskade Phosphatübertragungsreaktionen im chemotaktischen System von H. pylori gefunden, welches Ähnlichkeiten zu dem Syteme-Chemotaxis von S. meliloti aufweist an denen multiple CheY Proteine beteiligt sind. Die Rolle der CheV Proteine bleibt im Moment unklar, jedoch könnte es sein, dass sie an einer weiteren Feinregulierung der Phosphatgruppenübertragungsreaktionen in diesem komplexen chemotaktischen System beteiligt sind N2 - Flagellar motility and chemotaxis are essential virulence traits required for the ability of Helicobacter pylori to colonize the gastric mucosa. The flagellar regulatory network and the complex chemotaxis system of H. pylori are fundamentally different from other bacteria, despite many similarities. In H. pylori expression of the flagella is controlled by a complex regulatory cascade involving the two-component system FlgR-HP244, the sigma factors 54 and 28 and the anti-sigma 28 factor FlgM. Thus far, the input signal for histidine kinase HP244, which activates the transcriptional regulator FlgR, which triggers sigma factor 54-dependent transcription of the flagellar class 2 genes, is not known. Based on a yeast two-hybrid screen a highly significant protein-protein interaction between the H. pylori protein HP137 and both the histidine kinase HP244 and the flagellar hook protein HP908 (FlgE´) has been reported recently (Rain et al., 2001). So far, no function could be assigned to HP137. Interestingly, the interaction between HP137 and histidine kinase HP244 was observed in the characteristic block N sequence motif of the C-terminal ATP-binding kinase domain. In this work a potential role of HP137 in a feedback regulatory mechanism controlling the activity of histidine kinase HP244 in the flagellar regulation of H. pylori was investigated. Although the substitution of the gene encoding HP137 by a kanamycin cassette resulted in non-motile bacteria, the failure to restore motility by the reintroduction of hp137 in cis into the mutant strain, and the observation that HP137 has no significant effect on the activity of histidine kinase HP244 in vitro indicated that HP137 is not directly involved in flagellar regulation. Therefore, it was demonstrated that HP137 does not participate in the regulation of flagellar gene expression, neither in H. pylori nor in the closely related bacterium C. jejuni. Chemotactic signal transduction in H. pylori differs from the enterobacterial paradigm in several respects. In addition to a CheY response regulator protein (CheY1) H. pylori contains a CheY-like receiver domain (CheY2) which is C-terminally fused to the histidine kinase CheA. Furthermore, the genome of H. pylori encodes three CheV proteins consisting of an N-terminal CheW-like domain and a C-terminal receiver domain, while there are no orthologues of the chemotaxis genes cheB, cheR, and cheZ. To obtain insight into the mechanism controlling the chemotactic response of H. pylori the phosphotransfer reactions between the purified two-component signalling modules were investigated in vitro. Using in vitro phosphorylation assays it was shown that both H. pylori histidine kinases CheAY2 and CheA´ lacking the CheY-like domain (CheY2) act as ATP-dependent autokinases. Similar to other CheA proteins CheA´ shows a kinetic of phosphorylation represented by an exponential time course, while the kinetics of phosphorylation of CheAY2 is characterized by a short exponential time course followed by the hydrolysis of CheAY2~P. Therefore, it was demonstrated that the presence of the CheY2-like receiver domain influences the stability of the phosphorylated P1 domain of the CheA part of the bifunctional protein. Furthermore, it was proven that both CheY1 and CheY2 are phosphorylated by CheAY2 and CheA´~P and that the three CheV proteins mediate the dephosphorylation of CheA´~P, although with a clearly reduced efficiency as compared to CheY1 and CheY2. Moreover, CheA´ is capable of donating its phospho group to the CheY1 protein from C. jejuni and to CheY protein from E. coli. Retrophosphorylation experiments indicated that CheY1~P is able to transfer the phosphate group back to the HK CheAY2 and the receiver domain present in the bifunctional CheAY2 protein acts as a phosphate sink fine tuning the activity of the freely diffusible CheY1 protein, which is thought to interact with the flagellar motor. Hence, in this work evidence of a complex phosphorelay in the chemotaxis system was obtained which has similarities to other systems with multiple CheY proteins. The role of the CheV proteins remain unclear at the moment, but they might be engaged in a further fine regulation of the phosphate flow in this complex chemotaxis system and the independent function of the two domains CheA´ and CheY2 is not sufficient for normal chemotactic signalling in vivo. KW - Helicobacter pylori KW - Chemotaxis KW - Motilität KW - Signaltransduktion KW - Helicobacter pylori KW - Flagellensynthese KW - Chemotaxis KW - Phosphotransferreaktionen KW - Helicobacter pylori KW - Flagella KW - Chemotaxis KW - Phosphotransfer reactions Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15698 ER - TY - THES A1 - Hock Siew, Tan T1 - Functional characterization of an acid-regulated sRNA in \(Helicobacter\) \(pylori\) T1 - Funktionelle Charakterisierung einer durch Säure regulierten SRNA in \(Helicobacter\) \(pylori\) N2 - Low pH is the main environmental stress encountered by Helicobacter pylori in the human stomach. To ensure its survival under acidic conditions, this bacterium utilizes urease (encoded by the ureAB operon), a nickel-activated metalloenzyme, which cleaves urea into ammonia to buffer the periplasmic space. Expression of the ureAB operon is tightly regulated at the transcriptional level. Moreover, the urease activity is modulated post translationally via the activity of nickel-binding proteins such as HP1432 that act as nickel sponges to either sequester or release nickel depending on the pH. However, little is known how the levels of these nickel-binding proteins are regulated at the post-transcriptional level. Interestingly, more than 60 candidate small regulatory RNAs (sRNAs) have been identified in a differential RNA-seq approach in H. pylori strain 26695, suggesting an uncharacterized layer of post-transcriptional riboregulation in this pathogen. sRNAs control their trans- or cis- encoded targets by direct binding. Many of the characterized sRNAs are expressed in response to specific environmental cues and are ideal candidates to confer post-transcriptional regulation under different growth conditions. This study demonstrates that a small RNA termed ArsZ (Acid Responsive sRNA Z) and its target HP1432 constitute yet another level of urease regulation. In-vitro and in-vivo experiments show that ArsZ interacts with the ribosome binding site (RBS) of HP1432 mRNA, effectively repressing translation of HP1432. During acid adaptation, the acid-responsive ArsRS two-component system represses expression of ArsZ. ArsRS and ArsZ work in tandem to regulate expression of HP1432 via a coherent feedforward loop (FFL). ArsZ acts as a delay mechanism in this feedforward loop to ensure that HP1432 protein levels do not abruptly change upon transient pH drops encountered by the bacteria. ArsZ “fine-tunes” the dynamics of urease activity after pH shift presumably by altering nickel availability through post transcriptional control of HP1432 expression. Interestingly, after adaptation to acid stress, ArsZ indirectly activates the transcription of HP1432 and forms an incoherent FFL with ArsRS to regulate HP1432. This study identified a non-standard FFL in which ArsZ can participate directly or indirectly in two different network configurations depending on the state of acid stress adaptation. The importance of ArsZ in the acid response of H. pylori is further supported by bioinformatics analysis showing that the evolution of ArsZ is closely related to the emergence of modern H. pylori strains that globally infect humans. No homologs of arsZ were found in the non-pylori species of Helicobacter. Moreover, this study also demonstrates that the physiological role of a sRNA can be elucidated without the artificial overexpression of the respective sRNA, a method commonly used to characterize sRNAs. Coupled with time-course experiments, this approach allows the kinetics of ArsZ regulation to be studied under more native conditions. ArsZ is the first example of a trans-acting sRNA that regulates a nickel storage protein to modulate apo-urease maturation. These findings may have important implications in understanding the details of urease activation and hence the colonization capability of H. pylori, the only bacterial class I carcinogen to date (WHO, 1994). N2 - In der natürlichen Umgebung des menschlichen Magens ist Helicobacter pylori insbesondere niedrigen pH-Werten ausgesetzt. Um diese Bedingungen zu überleben, setzt das Bakterium das Enzym Urease ein (kodiert durch das ureAB Operon), ein Nickel-aktiviertes Metalloenzym, welches Urea zu Ammonium umsetzt um den pH-Wert des periplasmatischen Raums abzupuffern. Die Expression dieses Operons ist auf transkriptioneller Ebene streng reguliert. Zudem ist die Aktivität des Urease Enzyms auf post-translationaler Ebene moduliert. Dies geschieht durch die Aktivität von Nickel-Bindeproteinen wie HP1432, die in Abhängigkeit vom pH-Wert Nickelionen abfangen oder wieder freigeben. Allerdings ist nur sehr wenig darüber bekannt, wie diese Nickel-Bindeproteine auf post-transkriptioneller Ebene reguliert werden. Interessanterweise wurden mehr als 60 sRNA-Kandidaten (engl. small RNA für dt. kleine RNA) durch eine differentielle RNA-seq Methode im H. pylori Stamm 26695 identifiziert. Dies legt eine nicht charakterisierte Ebene post-transkriptioneller Riboregulierung in diesem Pathogen nahe. sRNAs kontrollieren ihre trans- oder cis-kodierten Zielgene durch direkte Interaktion. Viele der charakterisierten sRNAs werden als Antwort auf spezifische Umweltsignale exprimiert und stellen ideale Kandidaten für post-transkriptionelle Regulatoren unter verschiedenen Wachstumsbedingungen dar. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die kleine RNA ArsZ (engl. acid responsive sRNA Z für dt. säureabhängige sRNA Z) und ihr Zielgen HP1432 ein zusätzliches Level der Urease-Regulierung darstellen. In-vitro und in-vivo Experimente zeigen, dass ArsZ mit der Ribosomenbindestelle (RBS) der HP1432 mRNA interagiert, wodurch dessen Translation verhindert wird. Während der Säureanpassung verhindert das säureabhängige ArsRS Zweikomponentensystem die Expression von ArsZ. Zusammen regulieren ArsRS und ArsZ das Zielgen HP1432 in Form eines kohärenten Feed-forward-loops (FFL). ArsZ agiert hier als Verzögerungsmechanismus, um sicherzustellen, dass sich bei einem transienten Abfall des pH-Wertes das Proteinlevel von HP1432 nicht abrupt verändert. Nach pH-Änderungen vermittelt ArsZ eine Feinregulierung der Ureaseaktivität, vermutlich indem es durch die post-transkriptionelle Kontrolle der HP1432 Expression die Verfügbarkeit von Nickel verändert. Interessanterweise aktiviert ArsZ nach der Säureanpassung indirekt die Transkription von HP1432 und schließt dadurch einen inkohärenten FFL mit ArsRS zur Regulierung von HP1432. Diese Studie identifizierte einen Nicht-Standard-FFL, in dem ArsZ abhängig von dem Status der Säureadaptation in zwei verschiedenen Netzwerkkonfigurationen direkt oder indirekt agieren kann. Bioinformatorische Analysen unterstützen die Relevanz von ArsZ in der Säureantwort von H. pylori zusätzlich. Hierbei kann gezeigt werden, dass die Evolution von ArsZ mit dem Aufkommen moderner H. pylori Stämme einhergeht, die weltweit Menschen infizieren. In nicht-pylori Helicobacter Spezies konnten keine Homologe von arsZ gefunden werden. Zudem zeigt diese Studie, dass die physiologische Rolle einer sRNA ohne ihre artifizielle Überexpression aufgeklärt werden kann, eine standard-mäßige Herangehensweise zur Charakterisierung kleiner RNAs. In Kombination mit Zeitverlaufsexperimenten konnte die zeitabhängige Regulierung von Zielgenen durch ArsZ unter natürlicheren Bedingungen untersucht werden. ArsZ ist das erste Beispiel einer trans-agierenden sRNA die ein Nickel-Speicherprotein reguliert, um die Reifung der Apo-Urease zu modulieren. Diese Ergebnisse können wichtige Informationen liefern, um die Aktivierung des Urease Enzyms besser zu verstehen und um damit detailliertere Einblicke in die Kolonisierungsfähigkeit von H. pylori zu gewinnen, dem bislang einzigen bakteriellen Klasse-I-Karzinogen (WHO, 1994). KW - Small RNA KW - Helicobacter pylori KW - Feedforward loop KW - Acid adaptation KW - HP1432, Hpn2 KW - ArsZ Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-150671 ER - TY - THES A1 - Herold, Johannes Helmut T1 - Nachsorge bei gastralen MALT-Lymphomen nach alleiniger Helicobacter pylori-Eradikation unter besonderer Berücksichtigung der Patientencompliance T1 - Adherence to follow-up of patients with Gastric-MALT-Lymphoma treated by Helicobacter pylori eradication only N2 - Hintergrund: Der EGILS (European Gastro-Intestinal Lymphoma Study) Consensus Report von 2011 enthält als zentralen Therapiebaustein die H.p.-Eradikationsbehandlung mit nachfolgendem „Watch-and-Wait“ bzw. die Nachsorge nach Vollremission. Voraussetzung für eine strukturierte Nachsorge ist eine gute Patientencompliance. Eine Studie über Dauer und praktische Umsetzbarkeit der Nachsorge, insbesondere nach Vollremission, gibt es bisher nicht. Ziel: Ziel dieser retrospektiven Arbeit war es zu überprüfen, ob die von der EGILS empfohlenen Nachsorgeintervalle von den Patienten nach einer alleinigen H.p.-Eradikation eingehalten werden. Ferner sollte auf dieser Grundlage und unter Berücksichtigung des Therapieerfolgs eine Empfehlung für optimale Nachsorgeintervalle nach klinischer Vollremission erarbeitet werden. Methode: 106 Patienten (50 weiblich; 56 männlich); Alter 59 (33 – 85) Jahre mit beliebigem H.p.Status, histologisch gesichertem gastralem MALT-Lymphom und alleiniger H.p.-Eradikationsbehandlung wurden eingeschlossen. Grundlage zur Beurteilung war, bis zur Vollremission, das Nachsorgeschema gemäß EGILS (alle 4-6 Monate); danach erfolgte die Nachsorge alle 6 bis 12 Monate. Die Compliance wurde bei jedem Patienten als das Verhältnis aus erfüllter Nachsorgepflicht zu individueller Gesamtdauer der Nachsorge berechnet und über alle Patienten gemittelt. Ergebnisse: Die meisten Patienten erreichen nach alleiniger H.p.-Eradikation unabhängig vom H.p.-Status eine Vollremission (ca. 71%). Die Nachsorgen wurden über den gesamten Beobachtungszeitraum zu ca. 55% eingehalten. Patienten mit Interesse an einer Nachsorge nehmen diese über Jahre hinweg sehr zuverlässig war. In dieser Patientengruppe liegt die Compliance bei ca. 95%. Schlussfolgerung: Die exzellente Prognose gastraler MALT-Lymphome, unabhängig vom H.p.-Status, und die hohe Bereitschaft der Patienten für Nachsorgeuntersuchungen auch nach Vollremission erhöht die Attraktivität einer „Watch-and-Wait“-Strategie. Nach klinischer Vollremission sind jährliche endoskopische Nachsorgeuntersuchungen praktisch umsetzbar. N2 - Background: The European gastrointestinal lymphoma study (EGILS) consensus report from 2011 included as a central therapy basis the H pylori eradication treatment with subsequent “watch and wait” as well as follow-up care after full remission. The main requirement for a structured follow up care is good patient compliance. A study about the duration and the practical feasibility of follow up care, especially after full remission has not been carried out to date. Aims: The aim of this retrospective work was to review whether patients were complying with the EGILS recommended follow-up intervals after a single H pylori eradication treatment. Furthermore, on this basis and in consideration of treatment success, a recommendation for the optimal follow-up interval after a full clinical remission should be developed. Methods: 106 patients (50 females, 56 males) with an average age of 59 years (33-85) with a variable H pylori status, histologically confirmed gastric MALT-lymphoma and a single H pylori eradication treatment, were included. The basis of assessment was, up to full remission, the follow-up scheme in accordance with EGILS (4-6 months) thereafter follow up in 6-12 months. The compliance for every patient was calculated as the ratio of fulfilled follow-up care obligations to individual duration of follow-up care and averaged out over all Patients. Results: The majority of patients reached a full remission after a single H pylori eradication independent of H pylori status (ca. 71%). Ca 55% of the follow-up care was adhered to the whole observation period. Patients with an interest continued to take part reliably in follow-up care for many years. The compliance in this patient group was ca 95%. Conclusion: The excellent prognosis of gastric MALT-lymphoma, independent of H pylori status and the willingness of the patients to have aftercare-check-ups even after a full remission, increases the attraction of a “watch and wait” strategy. After a full clinical remission, yearly endoscopic check-ups can be easily implemented. KW - Lymphom KW - Non-Hodgkin-Lymphom KW - B-Zell-Lymphom KW - Helicobacter pylori KW - Compliance KW - MALT-Lymphom KW - Magenlymphom KW - Helicobacter-pylori-Eradikation KW - Nachsorge KW - Patientencompliance KW - MALT-Lymphoma KW - gastric MALT lymphoma KW - Helicobacter pylori eradication KW - follow-up KW - adherence Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-249846 ER - TY - THES A1 - Fiore, Elisabetta T1 - Global mapping of pseudouridine in the transcriptomes of \(Campylobacter\) \(jejuni\) and \(Helicobacter\) \(pylori\) and functional characterization of pseudouridine synthases T1 - Globale Kartierung von Pseudouridin in den Transkriptomen von \(Campylobacter\) \(jejuni\) und \(Helicobacter\) \(pylori\) und funktionelle Charakterisierung von Pseudouridin-Synthasen N2 - More than 150 different RNA modifications have been detected in all kingdoms of life and 60 are known to decorate bacterial RNA. Among them, pseudouridine is universally conserved and one of the most abundant modifications present in bacterial stable RNAs such as tRNAs and rRNAs. In bacteria, the nucleotide is posttranscriptionally generated by dedicated enzymes called pseudouridine synthases (PUSs). With the advent of sophisticated deep-sequencing technologies, this modification has been identified in different types of RNA classes (tRNAs, rRNAs, mRNAs, snRNAs, and lncRNAs) in diverse eukaryotic organisms. However, these techniques have never been applied to bacteria, generating a knowledge gap about the location of the modified nucleotide in prokaryotic RNAs. Mutations or deletions of specific eukaryotic PUS enzymes are linked to human diseases and therefore their absence is deleterious for the correct function of the cell. However, deletion of tRNA or rRNA PUS enzymes in the bacterial model organism E. coli have not revealed any such drastic phenotypes, suggesting a different role and function of the modification itself and of the enzymes in different kingdoms of life. Since the roles of tRNA PUS enzymes in bacteria is still poorly understood, a functional characterization of these proteins is pursued in the Epsilonproteobacteria Campylobacter jejuni and Helicobacter pylori. While C. jejuni is the leading cause of bacterial foodborne gastroenteritis in humans, infection with H. pylori is associated with the development of gastric cancer. In particular, phenotypes were explored for the tRNA PUS enzymes TruA, TruB, and TruD in C. jejuni as well as TruA and TruD in H. pylori. Upon deletion of truD, a severe growth defect is observed for C. jejuni but not for H. pylori, highlighting a potential difference in function of the enzyme in the two related bacterial pathogens. Moreover, a genome-wide approach called Pseudo-seq is established and applied for RNA of these two pathogens, which allows, for the first time, the global identification of pseudouridine modifications at single-nucleotide resolution in the bacterial transcriptome. Applying Pseudo-seq in RNAs of wildtype and diverse PUS enzyme deletion mutants enabled the identification of the distinct RNA substrates of tRNA PUS enyzmes in C. jejuni and H. pylori. Hereby, the tRNA-Glu was determined to be the major tRNA substrate of TruD in C. jejuni. Interestingly, the tRNA-Glu is expressed as a single copy in the C. jejuni genome. To link the growth defect observed for a C. jejuni ∆truD mutant strain to the pseudouridine modification of the tRNA-Glu, a catalytically inactive TruD complementation was generated. This strain is unable to restore the tRNA-Glu modification but surprisingly, was able to complement the growth defect. The same observation was made for a cross-complementation with a copy of H. pylori TruD. This indicates that there is a potential additional function of the TruD PUS enzyme in C. jejuni that is independent of the pseudouridine modification. Using a combination of deep-sequencing technologies (RIP-seq, RNA-seq, Ribo-seq, and CLIP-seq), the dual function of TruD is investigated. Overall, this study provides the first in-depth investigation into pseudouridylation of bacteria in general and the bacterial pathogens C. jejuni and H. pylori in particular. The work presented in this thesis reveals not only a global map of pseudouridine in tRNAs and rRNAs of the two bacteria but it also explores the function of the responsible tRNA PUS enzymes. In addition, this study provides evidence for a dual function of the C. jejuni PUS enzyme TruD that goes beyond its RNA modifying function. Future research could focus on unravelling the function of TruD and its potential interaction partners and thus reveal new mechanisms of regulation of a protein previously only described as an RNA modification enzyme. N2 - Mehr als 150 verschiedene RNA-Modifikationen sind bislang in den unterschiedlichsten Organismen nachgewiesen worden, wovon 60 dieser Modifikationen in bakterieller RNA vorkommen. In Bakterien ist Pseudouridin eine der häufigsten Modifikationen, die in stabilen RNAs wie tRNAs und rRNAs zu finden sind. Hierbei wird das modifizierte Nukleotid auf posttranskriptioneller Ebene von speziellen Enzymen, den sogenannten Pseudouridin-Synthasen (PUS), generiert. Die Entwicklung und der Einsatz fortschrittlicher Deep-Sequencing Technologien ermöglichte es, Pseudouridin in unterschiedlichen RNA Klassen (tRNAs, rRNAs, mRNAs, snRNAs und lncRNAs) in verschiedenen eukaryotischen Organismen zu identifizieren. Diese Verfahren wurden jedoch noch nie auf Bakterien angewandt. Mutationen oder Deletionen spezifischer PUS Enzyme wurden im Menschen bereits mit der Entstehung von Krankheiten in Verbindung gebracht. Diese Enzyme sind daher für die korrekte Funktionsweise einer eukaryotischen Zelle unabdinglich. Nichtsdestotrotz führte die Deletion von tRNA oder rRNA PUS Enzymen im bakteriellen Modellorganismus Escherichia coli zu keinen solch drastischen Phänotypen. Dies wiederum deutet auf eine unterschiedliche Rolle und Funktion der Modifikation und der verantwortlichen Enzyme in verschiedenen Organismen hin. In der vorliegenden Arbeit werden tRNA PUS Enzyme der Epsilonproteobakterien Campylobacter jejuni und Helicobacter pylori funktionell charakterisiert. Der Lebensmittelkeim C. jejuni ist derzeit die häufigste Ursache für bakteriell verursachte Gastroenteritis im Menschen. Dahingegen wird eine H. pylori Infektion mit der Entwicklung von Magenkrebs in Verbindung gebracht. Insbesondere wurden die Funktionen der tRNA PUS Enzyme TruA, TruB und TruD in C. jejuni sowie TruA und TruD in H. pylori untersucht. Während die Deletion von TruD keine phänotypischen Auswirkungen in H. pylori hat, führt diese in C. jejuni zu einem Wachstumsdefekt. Dies weist auf eine möglicherweise unterschiedliche Funktion des Enzyms in den beiden verwandten bakteriellen Krankheitserregern hin. Zusätzlich beschreibt diese Arbeit die Etablierung und Anwendung von Pseudo-seq in C. jejuni und H. pylori, einem genomweiten Ansatz mittels dessen zum ersten Mal die globale Identifizierung von Pseudouridin Modifikationen auf Einzel-Nukleotid-Ebene im bakteriellen Transkriptom ermöglicht wird. Durch Pseudo-seq Analysen von wildtypischer RNA und RNA isoliert aus unterschiedlichen PUS Enzym Deletionen, konnten die RNA Substrate dieser Enzyme in C. jejuni und H. pylori ermittelt werden. Für TruD stellte sich dabei die tRNA-Glu als Hauptsubstrat heraus. Interessanterweise ist diese im Genom von C. jejuni nur als einzelne Kopie vorhanden. Da eine TruD Deletionsmutante in C. jejuni einen Wachstumsdefekt aufweist, wurde dieser Phänotyp in Zusammenhang mit dem Auftreten der Pseudouridin Modifikation an der tRNA-Glu untersucht. Zu diesem Zweck wurde ein TruD Komplementationsstamm generiert, der jedoch katalytisch inaktiv ist und somit nicht in der Lage ist die Modifikation der tRNA-Glu wiederherzustellen. Überraschenderweise komplementierte dieser Stamm dennoch den Wachstumsdefekt. Eine ähnliche Beobachtung wurde bei einer Kreuzkomplementation mit einer Kopie von H. pylori TruD gemacht. Dies deutet darauf hin, dass das TruD PUS Enzym in C. jejuni möglicherweise eine zusätzliche Funktion unabhängig von der Pseudouridin Modifikation hat. Diese potentiell duale Funktion von TruD wird in dieser Arbeit durch die Anwendung einer Kombination von Deep-Sequencing Technologien (RIP-seq, RNA-seq, Ribo-seq und CLIP-seq) untersucht. Insgesamt stellt diese Studie die erste eingehende Untersuchung von Pseudouridin Modifikationen in Bakterien im Allgemeinen, und in den Krankheitserregern C. jejuni und H. pylori im Speziellen, dar. Die in dieser Arbeit vorgelegten Ergebnisse beschreiben nicht nur eine globale Kartierung von Pseudouridin Modifikationen in bakteriellen tRNAs und rRNAs sondern erforschen auch die Funktionen der für die Modifikation verantwortlichen tRNA PUS Enzyme. Darüber hinaus liefert diese Arbeit Hinweise auf eine duale Funktion des C. jejuni PUS Enzyms TruD, die über die Funktion als RNA-modifizierendes Enzym hinausgeht. Zukünftige Untersuchungen könnten sich dementsprechend darauf konzentrieren, die Funktion von TruD und seinen potenziellen Interaktionspartnern zu entschlüsseln. Dies könnte neue Erkenntnisse über Mechanismen der Regulierung eines Enzyms/Proteins liefern, das bislang nur als RNA modifizierendes Enzym beschrieben war. KW - Pseudouridin KW - Campylobacter jejuni KW - Helicobacter pylori KW - TruD KW - Deep-sequencing KW - RNA modifications Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-288736 ER - TY - THES A1 - Endrich, Simon T1 - Expression von Chemokinrezeptoren auf Magenepithelien und neutrophilen Granulozyten während der Helicobacter pylori Infektion T1 - Expression of chemokinereceptors on gastric epithelia and neutrophil granulocytes during the infection with helicobacter pylori N2 - Bekanntermaßen führt die H.pylori Infektion des Magens über eine komplexe Modulation des Chemokinsystems zur Ausbildung der H.pylori Gastritis. Die Chemokinrezeptorexpression in der H.pylori Gastritis ist jedoch bisher noch fast nicht untersucht. Das Ziel der Arbeit war die Charakterisierung der Chemokinrezeptorexpression im Magen und die Testung eines Einfluss von H.pylori auf die Expression von Chemokinrezeptoren. In vitro führt die Inkubation von neutrophilen Granulozyten mit H. pylori zu einer schnellen Herunterregulation von CXCR1 und CXCR2 auf Proteinebene durch Rezeptorinternalisation und intrazellulären Abbau. Der Effekt ist unabhängig vom cag Status von H. pylori, sowie von TNF-α- oder IL-8. Als möglicher Signaltransduktionsmechanismus für diesen Effekt wäre die direkte Interaktion von H. pylori mit „toll-like receptors“ (TLRs) denkbar. Auf mRNA Ebene kommt es in vitro bei der Inkubation von neutrophilen Granulozyten mit H. pylori zu einer Herunterregulation von CXCR1 und CXCR2 mRNA nach 3 Stunden. Dieser Effekt tritt bei Inkubation mit einem cag positiven H. pylori Stamm verstärkt auf und könnte bedingt sein durch autokrine Herunterregulation der Expression von CXCR1 und CXCR2 durch IL-8. In vivo exprimieren neutrophile Granulozyten in der H. pylori Gastritis in den Krypten ebenfalls vermindert CXCR1 und CXCR2. Sowohl die Expression der Chemokine als auch der korrespondierenden Chemokinrezeptoren wird somit durch H.pylori beeinflusst. Es lässt sich somit der folgende Pathomechanismus postulieren: Nach dem Eintritt der neutrophilen Granulozyten in die Schleimhaut, kommt es über den direkten Kontakt mit H.pylori zum Verlust der Chemokinrezeptoren. Die neutrophilen Granulozyten können somit nicht mehr auf Chemokinsignale reagieren und werden in der Magenschleimhaut immobilisiert. Dort setzen sie reaktive Sauerstoffradikale, proinflammatorische Zytokine und Chemokine frei, die zur Schleimhautschädigung führen. Magenkarzinome exprimieren die Chemokinrezeptoren CXCR4 und CCR7. Die Expression wird mit der Neigung zur Metastasierung und einer schlechten klinischen Prognose assoziiert. In unseren Untersuchungen wird CXCR4 in vivo während des Prozess der Karzinogenese im Magen ab dem Stadium der intestinalen Metaplasie exprimiert. Bei Inkubation der Zelllinien mit cagA positiven und cagA negativen H. pylori – Stämmen, kommt es zu keiner Änderung der Expression von CXCR4. Die Infektion mit H. pylori ist zwar die Voraussetzung für die Genese der intestinalen Metaplasie, scheint jedoch nicht ursächlich an der Expression von CXCR4 beteiligt zu sein. CCR7 tritt in vivo auf den Magenepithelien der H. pylori Gastritis, der intestinalen Metaplasie, Dysplasie und Magenkarzinomen auf. In vitro führt die Koinkubation von CCR7 tragenden Magenzelllinien mit H. pylori zur Hochregulation von CCR7 kommt. Die Expression von CCR7 auf Karzinomzellen wird ebenfalls möglicherweise durch eine begleitende Infektion mit H. pylori begünstigt. Der Effekt der CCR7 Induktion durch H. pylori in vitro ist unabhängig vom cag Status des für die Infektion verwendeten H. pylori Stammes. Die Hochregulation von CCR7 ist möglicherweise bedingt durch die intrazelluläre Aktivierung von NFκB infolge der H. pylori Infektion. Denkbar wäre auch eine Induktion der Expression von CCR7 in den Magenepithelzellen in TLR abhängiger Weise, äquivalent zu Mechanismen, die in dendritischen Zellen beschrieben wurden. Es lässt sich abschließend feststellen, dass die H.pylori Infektion nicht nur die Freisetzung von Chemokinen, sondern auch die Expression von Chemokinrezeptoren wesentlich beeinflusst. Neutrophile Granulozyten verlieren in direktem Kontakt zu H.pylori die Chemokinrezeptoren CXCR1 und CXCR2. Auf Epithelzellen führt der direkte Kontakt zu H.pylori zur vermehrten Expression von CCR7. Die direkte Regulation von Chemokinrezeptoren durch H.pylori scheint also sowohl bei der H.pylori Gastritis, als auch bei der Entstehung und Progression von Magenkarzinomen eine Rolle zu spielen. N2 - It is known that the infection with helicobacter pylori leads by a complex modulation of the chemokine system to the helicobacter pylori gastritis. Interestingly, the expression of chemokinereceptors in the helicobacter pylori gastritis is nearly not investigated now. The aim of this study was to characterize the expression of chemokinereceptors in the stomach and to test if there in an influece of helicobacter pylori. In vitro, the coincubation of neutrophils leads to a rapid downregulation of CXCR1 and CXCR2 proteine via internalisation of the receptor and proteolytic digestion. The effect is independant of the cag status of the infecting helicobacter pylori, as well as of TNF-α or IL-8. A possible mechanism could be an interaction with toll like receptors. The mRNA aof CXCR1 and CXCR2 is downregulated during the incubation of neutrophils with h.pylori after 3 hours. This effect is stronger using a cag positve helcobacter strain and could be an autocrine effect of IL-8. In vivo, neutrophils also express CXCR1 and CXCR2 in a lower level in the gastric crypts. So the expression of the chemokines, as well as of the corresponding chemokine receptors are under the influence of helicobacter pylori. It is possible to postulate the following pathomechanism: After the entrance of neutrophils in the gastric epithelia, the contact to helicobacter pylori leads to al loss of their chemokinreceptors. They can nomore react to chemotaktic signals and are immobilised in the epithelia. The release of oxigen radicals and proinflammatory cytokines leads to a progressive demolition of the epithelia. Gastric carcinoma express the chemokinreceptors CXCR4 and CCR7. The expression is associated with metastasis and a poor prognosis. In our study, CXCR4 is expressed in vivo during the carcinogenesis at the point of intestinal metaplasia. The Infection of gastric epithelial cell lines with H. pylori however has no influence on the expression of the chemokine receptors. In our study, CCR7 is expressed in a higher level in vivo during the carcinogenesis at the point of the helicbacter gastritis. In vivo it comes to a upregulation of CCR7 on gastric epithelial cell lines when infected with helicobacter pylori. Possibly toll like receptors are involved in thee mechanism. So the direct regulation of chemoikne receptors seems to play a role in the carcinogenesis of gastric carcinoma, as well as in the helicobacter pylori gastritis. KW - Helicobacter KW - Helicobacter pylori KW - Helicobacter-pylori-Infektion KW - Magenkrebs KW - Magenkarzinom KW - Chemokinrezeptor KW - Chemokin KW - CCR7 KW - CXCR1 KW - CXCR2 KW - CXCR4 KW - gastric carcinoma KW - chemokine KW - chemokinereceptor KW - helicobacter KW - helicobacter pylori Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51435 ER - TY - JOUR A1 - Belair, Cédric A1 - Baud, Jessica A1 - Chabas, Sandrine A1 - Sharma, Cynthia M A1 - Vogel, Jörg A1 - Staedel, Cathy A1 - Darfeuille, Fabien T1 - Helicobacter pylori interferes with an embryonic stem cell micro RNA cluster to block cell cycle progression JF - Silence : a Journal of RNA regulation N2 - Background MicroRNAs, post-transcriptional regulators of eukaryotic gene expression, are implicated in host defense against pathogens. Viruses and bacteria have evolved strategies that suppress microRNA functions, resulting in a sustainable infection. In this work we report that Helicobacter pylori, a human stomach-colonizing bacterium responsible for severe gastric inflammatory diseases and gastric cancers, downregulates an embryonic stem cell microRNA cluster in proliferating gastric epithelial cells to achieve cell cycle arrest. Results Using a deep sequencing approach in the AGS cell line, a widely used cell culture model to recapitulate early events of H. pylori infection of gastric mucosa, we reveal that hsa-miR-372 is the most abundant microRNA expressed in this cell line, where, together with hsa-miR-373, it promotes cell proliferation by silencing large tumor suppressor homolog 2 (LATS2) gene expression. Shortly after H. pylori infection, miR-372 and miR-373 synthesis is highly inhibited, leading to the post-transcriptional release of LATS2 expression and thus, to a cell cycle arrest at the G1/S transition. This downregulation of a specific cell-cycle-regulating microRNA is dependent on the translocation of the bacterial effector CagA into the host cells, a mechanism highly associated with the development of severe atrophic gastritis and intestinal-type gastric carcinoma. Conclusions These data constitute a novel example of host-pathogen interplay involving microRNAs, and unveil the couple LATS2/miR-372 and miR-373 as an unexpected mechanism in infection-induced cell cycle arrest in proliferating gastric cells, which may be relevant in inhibition of gastric epithelium renewal, a major host defense mechanism against bacterial infections. KW - MicroRNAs KW - cell cycle KW - Helicobacter pylori KW - gastric cancer Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-140438 VL - 2 IS - 7 ER -