TY  - THES
A1  - Jung, Lisa Anna
T1  - Targeting MYC Function as a Strategy for Tumor Therapy
T1  - Hemmung der MYC-Funktion als Strategie für die zielgerichtete Tumortherapie
N2  - A large fraction of human tumors exhibits aberrant expression of the oncoprotein MYC. As a transcription factor regulating various cellular processes, MYC is also crucially involved in normal development. Direct targeting of MYC has been a major challenge for molecular cancer drug discovery. The proof of principle that its inhibition is nevertheless feasible came from in vivo studies using a dominant-negative allele of MYC termed OmoMYC. Systemic expression of OmoMYC triggered long-term tumor regression with mild and fully reversible side effects on normal tissues.
In this study, OmoMYC’s mode of action was investigated combining methods of structural biology and functional genomics to elucidate how it is able to preferentially affect oncogenic functions of MYC.
The crystal structure of the OmoMYC homodimer, both in the free and the E-box-bound state, was determined, which revealed that OmoMYC forms a stable homodimer, and as such, recognizes DNA via the same base-specific DNA contacts as the MYC/MAX heterodimer. OmoMYC binds DNA with an equally high affinity as MYC/MAX complexes. RNA-sequencing showed that OmoMYC blunts both MYC-dependent transcriptional activation and repression. Genome-wide DNA-binding studies using chromatin immunoprecipitation followed by high-throughput sequencing revealed that OmoMYC competes with MYC/MAX complexes on chromatin, thereby reducing their occupancy at consensus DNA binding sites. The most prominent decrease in MYC binding was seen at low-affinity promoters, which were invaded by MYC at oncogenic levels. Strikingly, gene set enrichment analyses using OmoMYC-regulated genes enabled the identification of tumor subgroups with high MYC levels in multiple tumor entities. Together with a targeted shRNA screen, this identified novel targets for the eradication of MYC-driven tumors, such as ATAD3A, BOP1, and ADRM1.
In summary, the findings suggest that OmoMYC specifically inhibits tumor cell growth by attenuating the expression of rate-limiting proteins in cellular processes that respond to elevated levels of MYC protein using a DNA-competitive mechanism. This opens up novel strategies to target oncogenic MYC functions for tumor therapy.
N2  - Eine Vielzahl humaner Tumore entsteht durch die aberrante Expression des Onkoproteins MYC. Da MYC als Transkriptionsfaktor viele zelluläre Prozesse reguliert, ist er auch maßgeblich an der Entwicklung von normalem Gewebe beteiligt. Die direkte Hemmung von MYC stellt eine große Herausforderung für die Wirkstoffentwicklung dar. Studien mit dem dominant-negativen MYC-Allel namens OmoMYC belegten, dass MYC ein potenzieller Angriffspunkt für die zielgerichtete Tumortherapie ist. Die systemische Expression dieser MYC-Mutante löste eine dauerhafte Tumorregression aus und zeigte milde sowie vollständig reversible Nebenwirkungen. In der vorliegenden Arbeit wurde der molekulare Wirkmechanismus von OmoMYC untersucht, wobei sowohl Methoden der Strukturbiologie als auch der funktionalen Genomik angewendet wurden.
Die Kristallstruktur des OmoMYC Proteins wurde im freien und E-Box-gebundenen Zustand bestimmt. Dadurch konnte gezeigt werden, dass OmoMYC ein stabiles Homodimer bildet. Als solches erkennt es DNA mittels derselben basenspezifischen Interaktionen wie der MYC/MAX-Komplex. Dabei bindet OmoMYC DNA mit einer ähnlichen Affinität wie das MYC/MAX-Heterodimer. Die genomweite Expressionsanalyse mittels RNA-Sequenzierung identifiziert eine Reduktion sowohl der MYC-abhängigen Transkriptionsaktiverung als auch der Transkriptionsrepression durch OmoMYC. Mittels Chromatin-Immunpräzipitation gefolgt von einer Hochdurchsatz-Sequenzierung wird gezeigt, dass OmoMYC mit MYC/MAXKomplexen
auf Chromatin konkurriert und so deren Besetzung global an Konsensus-Bindestellen verringert. Die stärkste Reduktion zeigt sich an Promoterregionen mit schwacher Affinität für die MYC-Bindung, welche durch onkogene MYC-Proteinmengen aufgefüllt werden. Gene set enrichment-Analysen unter Berücksichtigung von OmoMYC-regulierten Genen erlaubten die Identifizierung von Tumor-Subgruppen mit hohen MYC-Proteinmengen in zahlreichen Tumorentitäten. Zusammen mit einem fokussierten shRNA-Screen können so neue Zielproteine für die Bekämpfung von MYC-getriebenen Tumoren, wie zum Beispiel ATAD3A, BOP1 und ADRM1, identifiziert werden.
Zusammenfassend weisen die Ergebnisse darauf hin, dass OmoMYC spezifisch das Tumorzellwachstum inhibiert, indem es die Expression von zentralen Proteinen limitiert, welche durch erhöhte MYC-Proteinmengen reguliert werden. Somit können neue Strategien zur Tumortherapie identifiziert werden, die auf onkogene Funktionen von MYC zielen.
KW  - Myc
KW  - Kristallstruktur
KW  - Transkription <Genetik>
KW  - Bauchspeicheldrüsenkrebs
KW  - DNS-Bindung
KW  - OmoMYC
KW  - promoter invasion
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146993
ER  - 
TY  - THES
A1  - Krenz, Bastian
T1  - The immune-evasive potential of MYC in pancreatic ductal adenocarcinoma
T1  - Das immunevasive Potential von MYC im Pankreaskarzinom
N2  - Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is predominantly driven by mutations in KRAS and TP53. However, PDAC tumors display deregulated levels of MYC and are a paradigm example for MYC-driven and -addicted tumors. For many years MYC was described as a transcription factor that regulates a pleiotropic number of genes to drive proliferation. Recent work sheds a different light on MYC biology. First, changes in gene expression that come along with the activation of MYC are mild and MYC seems to act more as a factor that reduces stress and increases resilience towards challenges during transcription. Second, MYC is a strong driver of immune evasion in different entities. In this study we depleted MYC in murine PDAC cells and revealed the immune dependent regression of tumors in an orthotope transplant model, as well as the activation of the innate immune system using global expression analysis, immunoblotting and fCLIP. 

These experiments revealed that endogenous double-stranded RNA is binding as a viral mimicry to Toll-like receptor 3, causing activation of TBK1 and downstream activation of a proimmunogenic transcription program. The regression of tumors upon depletion of MYC is dependent on this pathway since the knockout of TBK1 prevents regression of tumors after depletion of MYC.

We can summarize this study in three main findings: First, the dominant and most important function of MYC in tumors is not to drive proliferation but to promote immune evasion and prevent immune-dependent regression of tumors. Second, cells monitor defects or delay in splicing and RNA processing and activate the immune system to clear cells that face problems with co-transcriptional processing. Third, MYC suppresses the activation of the cell-intrinsic innate immune system and shields highly proliferating cells from the recognition by the immune system. 

To translate this into a therapeutically approach, we replaced the shRNA mediated depletion of MYC by treatment with cardiac glycosides. Upon treatment with cardiac glycosides tumor cells reduce uptake of nutrients, causing a downregulation of MYC translation, inhibition of proliferation, glycolysis and lactate secretion. Lactate is a major reason for immune evasion in solid tumors since it dampens, amongst others, cytotoxic T cells and promotes regulatory T cells. 
Treatment of mice with cardiac glycosides causes a complete and immune-dependent remission of PDAC tumors in vivo, pointing out that cardiac glycosides have strong proimmunogenic, anti-cancer effects. More detailed analyses will be needed to dissect the full mechanism how cardiac glycosides act on MYC translation and immune evasion in PDAC tumors.
N2  - Pankreaskarzinome entwickeln sich in den meisten Fällen durch die Mutation von KRAS und TP53. Nichtsdestotrotz weisen Pankreaskarzinome sehr hohe, deregulierte Level des MYC Proteins auf und sind exemplarisch für Tumore, deren Wachstum abhängig von MYC ist. Für lange Zeit wurde MYC als Transkriptionsfaktor beschrieben, der vor allem Gene aktiviert, die für die Proliferation von Zellen notwendig sind. Die jüngste Forschung wirft jedoch ein anderes Bild auf die Biologie von MYC. Zum einen sind die transkriptionellen Veränderung nach Aktivierung von MYC mild und vieles deutet darauf hin, dass die Funktion von MYC zum einen in der Reduktion von transkriptionellem Stress liegt. Zum anderen verhindert MYC die Erkennung von Tumorzellen durch das Immunsystem. In dieser Studie wurde MYC in murinen Pankreaskarzinomzellen depletiert und die immunabhängige Regression der Tumore in einem orthotopen Transplantationsmodel untersucht. Die Aktivierung der zell-intrinsischen Immunantwort wurde mittels globaler Expressionsanalyse, Immunoblots und fCLIP Experimenten untersucht. 

Diese Experimente haben gezeigt, dass endogene doppel-strängige RNAs als virales Mimikry an Toll-like Rezeptor 3 binden, worauf TBK1 phosphoryliert und ein pro-immunogenes Transkriptionsprogram aktiviert wird. Die Deletion von TBK1 konnte beweisen werden, dass die Regression der Tumore von diesem Signalweg abhängig ist. 

Die Ergebnisse der Studie lassen sich in drei zentrale Erkenntnisse zusammenfassen: Erstens ist die prä-dominante Funktion von MYC in Tumoren in vivo nicht die Proliferation der Zellen zu fördern, sondern zu verhindern, dass der Tumor vom Immunsystem erkannt und bekämpft wird. Zweitens überwachen Zellen das richtige Prozessieren von RNA und aktivieren bei Bedarf das Immunsystem um defekte Zellen zu entfernen. Drittens unterdrückt MYC die Aktivierung dieses zell-intrinsischen Signalweges und schirmt den Tumor dadurch vom Immunsystem ab.

Um diese Ergebnisse in einen translationalen Ansatz zu überführen, haben wir die shRNA vermittelte Depletion von MYC durch die Behandlung mit Herzglykosiden ersetzt, die die Aufnahme von Nährstoffen reduzieren, Proliferation einschränken, die Translation des MYC Proteins stoppen und Glykolyse und Laktatsekretion herunterfahren. Laktat hat starke immunsuppressive Eigenschaften in soliden Tumoren, da es zytotoxische T Zellen erschöpft und regulatorische T Zellen aktiviert. 
Die Behandlung von Mäusen mit Herzglykosiden führte in Abhängigkeit vom Immunsystem zur kompletten Remission der Tumore, auch wenn noch weitere Forschung notwendig ist, um die exakten Zusammenhänge besser zu verstehen.
KW  - immune evasion
KW  - pancreatic cancer
KW  - innate immunity
KW  - TLR3
KW  - Bauchspeicheldrüsenkrebs
KW  - Myc
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-325903
ER  - 
TY  - THES
A1  - Lütkenhaus, Katharina
T1  - Tumour development in Raf-driven cancer mouse models
T1  - Tumor-Entwicklung in Raf-transgenen Mausmodellen
N2  - Metastasis is the cause of death in 90% of cancer-related deaths in men. Melanoma and Non-Small-Cell Lung Cancer (NSCLC) are both tumour types with poor prognosis, lacking appropriate therapeutic possibilities, not least because of their high rate of metastasis. Thus understanding the process of metastasis might unravel therapeutic targets for developing further therapeutic strategies. The generation of a transgenic mouse model expressing B-RafV600E in melanocytes, a mutation that is found in about 60% of all melanoma, would result in an ideal tool to study melanoma progression and metastasis. In this work, a doxycycline-inducible system was constructed for expression of B-RafV600E and transgenic animals were generated, but the expression system has to be improved, since this strategy didn’t give rise to any viable, transgene carrying mice. Furthermore, since it was shown in the work of others that the metastatic behavior of tumour cell lines could be reversed by an embryonic microenvironment and the influence of a tumourigenic microenvironment on melanocytes lead to the acquisition of tumour cell-like characteristics, the question arose, whether B-Raf is as important in melanocyte development as it is in melanoma progression. In this work, the embryonal melanocyte development in B-Raf-deficient and wildtype mouse embryos was examined and there were no differences observed in the localization and number of neural crest stem cells as well as in the localization of the dopachrome-tautomerase positive melanoblasts in the embryos and in cultured neural tube explants. The expression of oncogenic C-Raf in lung epithelial cells has yielded a model for NSCLC giving rise to adenomas lacking spontaneous progression or metastasis. The co-expression of c-Myc in the same cells accelerates the tumour development and gives rise to liver and lymphnode metastases. The expression of c-Myc alone in lung epithelial cells leads to late tumour development with incomplete penetrance. A mutation screen in this work resulted in the observation that a secondary mutation in KRas or LKB1 is necessary for tumour formation in the c-Myc single transgenic animals and suggested metastasis as an early event, since the corresponding metastases of the mutation-prone primary lung tumours were negative for the observed mutations. Furthermore, in this work it was shown that the expression of chicken c-Myc in a non-metastatic NSCLC cell line leads to metastatic clones, showing that c-Myc is sufficient to induce metastasis. Additionally a panel of metastasis markers was identified, that might serve as diagnostic markers in the future.
N2  - In 90% der Todesfälle aufgrund von Krebserkrankungen sind Metastasen für den Tod des Patienten verantwortlich. Sowohl Melanom, als auch nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom (Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC) sind beides Tumortypen, die eine schlechte Prognose haben und für die sich wenige Therapiemöglichkeiten bieten, nicht zuletzt aufgrund ihrer häufigen Metastasierung. Somit würde ein besseres Verständnis des Metastasierungsprozesses neue therapeutische Angriffspunkte aufdecken und damit die Möglichkeit zur Entwicklung neuer Therapieansätze bieten. Die Entwicklung eines transgenen Mausmodells, in dem B-RafV600E, eine Mutation die man in 60% der Melanompatienten findet, melanocyten-spezifisch exprimiert wird, würde ein geeignetes Werkzeug ergeben, um die Entstehung und die Metastasierung von Melanom zu untersuchen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Konstrukt zur Doxycyclin-abhängingen Expression von B-RafV600E erzeugt und mit diesem wurden transgene Tiere generiert. Da dieser Ansatz nicht zu lebensfähigen, das Transgen tragenden Linien führte, muss das Expressionssystem weiter verbessert werden. Da in der Arbeit von anderen gezeigt wurde, dass das metastasierende Verhalten von Tumor-Zelllinien durch eine embryonale Mikroumgebung aufgehoben werden konnte, und dass der Einfluss einer tumorähnlichen Mikroumgebung in Melanocyten zur Erlangung von Tumorzell-Charakteristika führte, kam die Frage auf, ob B-Raf eine ähnlich wichtige Rolle in der Entwicklung von Melanocyten wie in der Entstehung von Melanomen spielt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die embryonale Melanocytenentwicklung in B-Raf-defizienten sowie in wildtypischen Mausembryonen untersucht. Es konnten keine Unterschiede in der Lokalisation und Anzahl von Stammzellen des Neuralrohres und in der Lokalisation von Dopachrome-tautomerase positiven Melanoblasten in den Embryonen und in kultivierten Explantaten des Neuralrohres festgestellt werden. Die Expression von oncogenem C-Raf in Lungenepithelzellen von Mäusen ist ein Modell für NSCLC und führt zur Ausbildung von Adenomen ohne spontane Weiterentwicklung oder Metastasen. Die Koexpression von C-Raf mit c-Myc in denselben Zellen beschleunigt die Entwicklung von Tumoren und führt zu Metastasen in Leber und Lymphknoten. Die Expression von c-Myc alleine in Lungenepithelzellen führt zu einer verspäteten Entwicklung von Tumoren mit nicht vollständiger Penetranz. Ein Screening für Mutation im Rahmen dieser Arbeit führte zu der Beobachtung, dass Sekundärmutationen in KRas oder LKB1 für die Tumorentwicklung in den c-Myc transgenen Tieren notwendig sind und dass die Metastasierung ein frühes Ereignis zu seien scheint, da die zugehörigen Metastasen in Leber und Lymphknoten im Gegensatz zum Primärtumor in der Lunge keine Mutationen in diesen Genen trugen. Desweiteren wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die Expression von avianem c-Myc in einer nicht-metastasierenden NSCLC Zelllinie zu metastasierenden Klonen führte, was zeigt, dass c-Myc ausreichend ist um Metastasierung auszulösen. Zusätzlich wurde eine Reihe von Markern für Metastasen identifiziert, die in Zukunft als diagnostische Marker Verwendung finden könnten.
KW  - Raf <Biochemie>
KW  - Melanom
KW  - Metastase
KW  - Lungenkrebs
KW  - Raf
KW  - Myc
KW  - NSCLC
KW  - metastasis
KW  - Raf
KW  - Myc
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48332
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TY  - THES
A1  - Pfann, Christina
T1  - Untersuchungen zu neuen therapeutischen Ansätzen zur Beeinflussung der MYC-Expression im kolorektalen Karzinom
T1  - Experiments on new therapeutic strategies to influence MYC expression in colorectal cancer
N2  - Eine veränderte Expression des Transkriptionsfaktors MYC wird als entscheidender Faktor für Tumorentstehung und -progress im kolorektalen Karzinom gesehen. Somit ist die Hemmung dessen Expression und Funktion ein zentraler Ansatz bei der zielgerichteten Tumortherapie. 
Als geeignete Strategie, sowohl die Halbwertszeit als auch die Translation von MYC zu verringern, erschien eine duale PI3K-/mTOR-Hemmung durch den small molecule-Inhibitor BEZ235. Gegenteilig ist jedoch unter Behandlung mit BEZ235 eine verstärkte MYC-Expression in verschiedenen Kolonkarzinom-Zelllinien zu beobachten. Neben verstärkter Transkription, konnte eine verstärkte IRES-abhängige Translation von MYC nach Hemmung der mTOR-/5´Cap-abhängigen Translation durch BEZ235, als Ursache der MYC-Induktion nachgewiesen werden. 
Es konnte gezeigt werden, dass die Induktion von MYC nach PI3K-/mTOR-Hemmung durch eine kompensatorische Aktivierung des MAPK-Signalwegs in Folge einer FOXO-abhängigen Induktion von Rezeptortyrosinkinasen, stattfindet. 

Eine mögliche Strategie, diese Feedback-Mechanismen zu umgehen, ist die direkte Hemmung der Translationsinitiation. Hierfür wurden Rocaglamid und dessen Derivat Silvestrol als small molecule-Inhibitoren der eIF4A-Helikase verwendet. Im Gegensatz zur PI3K/mTOR-Hemmung, ist durch eIF4A-Inhibition eine Reduktion der MYC-Proteinexpression in verschiedenen Kolonkarzinom-Zelllinien zu erreichen – ohne einhergehende MAPK-Aktivierung. 
Anhand der Ergebnisse kann postuliert werden, dass Silvestrol das Potential besitzt, sowohl die Cap-/eIF4F-abhängie als auch die somit eIF4A-abhängige IRES-vermittelte Translation von MYC zu hemmen. 
Weiterhin kann eine proliferationshemmende Wirkung durch Silvestrol auf Kolonkarzinom-Zellen in vitro, via Zellzyklusarrest und Induktion von Apoptose, gezeigt werden. Dies stellt die Voraussetzung für eine potentielle Eignung als tumorhemmender Wirkstoff in der Therapie des kolorektalen Karzinoms dar.
N2  - Deregulated expression of MYC is a driver of colorectal carcinogenesis. Thus inhibition of MYC function and expression may be a central aim in targeted therapy. 
Inhibiting the PI3K-and mTOR pathway seemed to be a proper strategy to increase MYC turnover and reduce its translation. Instead, we observe enhanced MYC expression in colon carcinoma cells upon treatment with the dual PI3K-/mTOR-inhibitor BEZ235. PI3K-/mTOR-Inhibition permits both enhanced transcription and induction of IRES-dependent translation of MYC through feedback activation of the MAPK pathway via FOXO-dependent induction of receptor tyrosine kinases. 

A strategy to bypass the signalling feedback mechanisms, is targeting the translation initiation. Using Silvestrol, a Rocaglamid derivate as small molecule inhibitor of the initiation factor eIF4A, MYC protein expression can be reduced in colorectal cancer cells – without observed MAPK-activation. So Silvestrol has he potential to inhibit Cap-/eIF4F-dependend as well as eIF4A-dependent IRES-mediated tranlation of MYC.
Furthermore Silvestrol inhibits proliferation of colon carcinoma  cells in vitro, shown by cell cycle arrest and induction of apoptosis. 

Our data argue that targeting translation initiation is a promising strategy to limit MYC expression in colorectal cancer. Thus, together with its antiproliferative effect, Silvestrol might be a potential anti-tumor agent.
KW  - Myc
KW  - colorectal cancer
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-216687
ER  -