TY - THES A1 - Kiepe, Felix T1 - Knorpelintegration unter Hemmung der Kollagensynthese im Disc-Ring-Modell: eine In-vitro-Studie T1 - Cartillage integration under inhibition of collagen synthesis in a disc-ring-model: an in vitro study N2 - Biomechanische, histologische und immunhistochemische Analyse der lateralen Integration von nativem hyalinem Knorpel in einen Gelenkknorpeldefekt unter Beeinflussung der Kollagensynthese.im Rahmen der in vitro Kultivierung für 7,14 und 21 Tage. Unter Hemmung der Kollagensynthese mittels Ethyl-3,4-dihydroxybenzoat (EDHB) zeigte sich weder kollagene, noch nicht-kollagene Matrixsynthese im Defektbereich. Eine mechanische Integration zeigte sich ebenso nicht. Gruppen ohne Hemmung der Kollagensynthese zeigten im Laufe der Kultivierung einen signifikanten Zuwachs der biomechanisch messbaren Integrationsstärke. Auch histologisch und immunhistochemisch zeigten sich Glykosaminoglykan- und Kollagen Typ II-Synthese im Defektbereich. Dies zeigt die Abhängigkeit der lateralen Integration von der Kollagensynthese im multifaktoriellen Prozess der Knorpelintegration. N2 - Biomechanical, histological and immunohistochemical testing of lateral integration of cartilage under inhibition of synthesis of collagen type II after 7, 14 and 21 days. Due to inhibition of collagen-synthesis there is no sign of cartilage integration, neither in biomechanical testing or in histological and immunohistochemical examinations. The results of our study show that lateral integration of cartilage depends on synthesis of collagen type II. KW - Knorpelintegration KW - Kollagensynthese KW - cartilage KW - integration KW - collagen synthesis Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-237610 ER - TY - THES A1 - Buss, Alexa T1 - Testung verschiedener Strategien für die Regeneration von Knorpeldefekten im Ex vivo-Testsystem T1 - Evaluation of cartilage regeneration strategies in an osteochondral ex vivo cartilage defect model N2 - Die Degeneration des Gelenkknorpels ist Hauptursache für chronische Schmerzen und eine dadurch bedingte Einschränkung der Lebensqualität. Für die Sozialversicherungssysteme ist dies mit steigenden Kosten verbunden. Gegenwärtige Behandlungsoptionen wie die Mikrofrakturierung oder die (matrix-assoziierte) Autologe Chondrozytentransplantation (M-) ACT führen zu einem minderwertigen Reparaturgewebe aus Faserknorpel mit unzureichenden mechanischen Eigenschaften an der Defektstelle. Es besteht ein Bedarf an der Entwicklung und Testung neuer Knorpeltherapien, die ein funktionelles Reparaturgewebe für nachhaltige Beschwerdefreiheit erzeugen. Das hier verwendete kürzlich etablierte osteochondrale Ex vivo-Testsystem (EVTS) eignet sich zur Evaluation unterschiedlicher zellbasierter Behandlungsansätze für die Knorpelregeneration. Aus der medialen Femurkondyle von Schweinen wurden zylindrische 8 mm große osteochondrale Explantate (OCE) isoliert. Es wurden Knorpel-Knochendefekte und reine Knorpeldefekte kreiert und mit autologen Schweine-Chondrozyten (CZ) bzw. einer Mischung aus CZ und mesenchymalen Stammzellen (MSC) gefüllt, die in Kollagen Typ I Hydrogel eingebettet waren. Nach vierwöchiger Kultivierung wurden die Proben histologisch und immunhistochemisch gefärbt (Safranin-O-Färbung, Kollagen Typ II, Aggrekan), die Zellvitalität (Lebend-Tot-Färbung) überprüft und die extrazelluläre Matrixproduktion analysiert. Nach vierwöchiger Kultur im EVTS in Normoxie und Hypoxie zeigten sich die in Kollagen-I-Hydrogel eingebetteten Zellen lebensfähig. Die Auswertung der verschiedenen Ansätze erfolgte über den standardisierten ICRS-II-Score der International Cartilage Repair Society (ICRS) mit drei unabhängigen Bewertern. Insgesamt resultierten bessere Ergebnisse im Hinblick auf die Matrixsynthese in den Monokulturen aus CZ im Vergleich zu den Co-Kulturen aus CZ und MSCs. Da dieser Unterschied nicht groß war, könnten MSCs zur Einsparung autologer CZ eine Alternative in der Behandlung von Knorpeldefekten darstellen. Hypoxie spielte eine Rolle bei reinen Knorpeldefekten, nicht bei Knorpel-Knochendefekten. Dies bestätigt die Bedeutung des physiologischen hypoxischen Milieus des Gelenkknorpels, das einen niedrigen Sauerstoffgehalt von 2-5 VII % aufweist. Die Ergebnisse zeigen, dass die unterschiedlichen Faktoren aus Zellkombination, Knorpeldefektgröße und Kultivierung in Hypoxie oder Normoxie Einfluss auf die Ausbildung der extrazellulären Matrix haben. Weiterhin fehlt jedoch das Verständnis für die genauen Mechanismen des Knorpelregenerationsverhaltens. Ex vivo-Testsysteme können dabei helfen ein weiteres Verständnis zu erlangen und entsprechende Behandlungsstrategien zu evaluieren. N2 - Degeneration of articular cartilage is a major cause of chronic pain - impairing the quality of life and rising health care costs. Current treatment options like microfracture, ACT or MACT result in fibrocartilaginous repair tissue with insufficient mechanical properties at the defect site. Hence, new cartilage therapies generating functional repair tissue need to be developed and tested. Here we used a recently established ex vivo osteochondral model to evaluate the therapeutic potential of several cell-based cartilage regeneration approaches. Reproducible cylindrical 8 mm osteochondral explants (OCE) were isolated from porcine medial condyles. Full-thickness and cartilage-only defects were created and filled with autologous porcine chondrocytes respectively a mixture of chondrocytes and mesenchymal stem cells, embedded in collagen type I hydrogel. After static culture for four weeks, samples were analyzed for cell viability (live/dead staining) and extracellular matrix production, using immunohistochemical staining (Safranin-O-staining, collagen type II, aggrecan). Embedded cells remain viable after four weeks culture in ex vivo osteochondral model. Outcome of different cartilage regeneration approaches were compared using the recommended guidelines proposed by the International Cartilage Repair Society (ICRS) and ICRS-II-score with three independent evaluators. Overall, the monocultures from CZ performed better than the co-cultures from CZ and MSCs. Since this difference was not large, MSCs could be an alternative in the treatment of cartilage defects to save autologous CZ. Hypoxia played a role in pure cartilage defects, but not in cartilage-bone defects. This confirms the importance of the physiological hypoxic milieu of the articular cartilage, which has a low oxygen content of 2-5 %. The results show that the different factors from cell combination, cartilage defect size and cultivation in hypoxia or normoxia influence the formation of the extracellular matrix. However, there is still no understanding of the exact mechanisms of cartilage regeneration behavior. Ex vivo test systems can help to gain further understanding and to evaluate appropriate treatment strategies. KW - cartilage KW - test system KW - Knorpel KW - in vitro Testsystem Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-246714 ER - TY - THES A1 - Bleuel, Gabriel T1 - Entwicklung und Validierung eines quantitativen Verfahrens zur Beurteilung der Viabilität von entsprechend der GMP-Richtlinien hergestellter Knorpelimplantate für das Knie T1 - Development and validation of a quantitative assay for a viability test of cultivated knee cartilage implants N2 - Due to the reversing age pyramid in Germany, more and more people are already suffering from joint cartilage damage. But not only age, but also accidents and sports injuries and being overweight can lead to irreversible cartilage defects. Although there are various treatment options, the previous methods cannot be considered a permanent cure. As part of the international research project BIO-CHIP, a promising treatment method with novel drugs was to be investigated. The patient's own cartilage cells from the nose serve as the starting material for the drug, a manufactured cartilage implant. These are isolated, multiplied and ultimately cultivated on a matrix to form a cartilage implant. In addition to toxicological and biological safety tests, an essential prerequisite for the approval of the implant is the assessment of the viability. This was previously carried out on the basis of histology from the pathology department. The aim of the present work was the development and validation of a standardized and objective viability test for the chondrocytes within the cartilage matrix. For this, the LDH was used as a marker for irreversibly damaged cells. The LDH concentration could be measured with the CyQuant LDH assay by measuring the absorption. It could be proven that LDH has the required stability and detectability in the medium. With the help of the lysis, of cultivated mini-cartilage implants, the maximum achievable LDH concentrations could be determined. A calibration curve was generated using these concentrations. This serves to assess the viability of future measured absorptions of the supernatant medium. The developed method does not require any invasive interventions on the implant and is characterized by its simple implementation, since only the protrusion has to be measured. The validation of the method certified a high level of robustness, linearity, accuracy and precision. N2 - Aufgrund der sich umkehrenden Alterspyramide in Deutschland leiden bereits jetzt immer mehr Menschen an Gelenkknorpelschäden. Doch nicht nur das Alter, sondern auch Unfälle und Sportverletzungen und Übergewicht können zu irreversiblen Knorpeldefekten führen. Obwohl es diverse Behandlungsmöglichkeiten gibt, können die bisherige Methoden nicht als dauerhafte Heilung betrachtet werden. Im Rahmen des internationalen Forschungsprojektes BIO-CHIP sollte eine vielsprechende Behandlungsmethode mit neuartigen Arzneimitteln untersucht werden. Als Ausgangsmaterial des Arzneimittels, ein hergestelltes Knorpelimplantat, dienen patienteneigene Knorpelzellen aus der Nase. Diese werden isoliert, vermehrt und letztlich auf einer Matrix zu einem Knorpelimplantat kultiviert. Wesentliche Voraussetzung für die Implantatfreigabe stellt neben toxikologischen und biologischen Unbedenklichkeitstests die Beurteilung der Viabilität dar. Diese wurde bisher anhand von Histologieschnitten von der Pathologie durchgeführt. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Validierung eines standardisierten und objektiven Viabilitätstests für die Chondrozyten innerhalb der Knorpelmatrix. Hierfür wurde die LDH als Marker für irreversibel geschädigte Zellen verwendet. Die LDH Konzentration konnte mit dem CyQuant LDH-Assay durch die Messung der Absorption gemessen werden. Es konnte nachgewiesen werden, dass LDH die erforderliche Stabilität und Nachweisbarkeit im Medium besitzt. Mithilfe der Lyse, analog zum Herstellungsprozess, gezüchteter Mini-Knorpelimplantate, konnten die maximal erreichbaren LDH Konzentrationen ermittelt werden. Mithilfe dieser Konzentrationen wurde eine Eichkurve generiert. Diese dient als Beurteilung der Viabilität zukünftig gemessener Absorptionen des Überstandmediums. Das entwickelte Verfahren erfordert keine invasiven Eingriffe am Implantat und zeichnet sich durch eine einfache Durchführung aus, da nur der Überstand gemessen werden muss. Die durchgeführte Validierung der Methode bescheinigte eine hohe Robustheit, Linearität, Genauigkeit und Präzision. KW - Hyaliner Knorpel KW - Lactatdehydrogenase KW - Kniegelenk KW - Zellkultur KW - Entwicklung KW - development KW - Validierung KW - LDH-assay KW - Knorpelimplantate KW - validation KW - cartilage Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-242481 ER -