TY - THES A1 - Rizzo, Giuseppe T1 - Determinants of macrophage and neutrophil heterogeneity in cardiac repair after myocardial infarction T1 - Determinante der Makrophagen- und Neutrophilien-Heterogenität bei der Herzreparatur nach Myokardinfarkt N2 - Current therapeutic strategies efficiently improve survival in patients after myocardial infarction (MI). Nevertheless, long-term consequences such as heart failure development, are still one of the leading causes of death worldwide. Inflammation is critically involved in the cardiac healing process after MI and has a dual role, contributing to both tissue healing and tissue damage. In the last decade, a lot of attention was given to targeting inflammation as a potential therapeutic approach in MI, but the poor understanding of inflammatory cell heterogeneity and function is a limit to the development of immune modulatory strategies. The recent development of tools to profile immune cells with high resolution has provided a unique opportunity to better understand immune cell heterogeneity and dynamics in the ischemic heart. In this thesis, we employed single-cell RNA-sequencing combined with detection of epitopes by sequencing (CITE-seq) to refine our understanding of neutrophils and monocytes/macrophages heterogeneity and dynamic after experimental myocardial infarction. Neutrophils rapidly invade the infarcted heart shortly after ischemic damage and have previously been proposed to display time-dependent functional heterogeneity. At the single-cell level, we observed dynamic transcriptional heterogeneity in neutrophil populations during the acute post-MI phase and defined previously unknown cardiac neutrophil states. In particular, we identified a locally acquired SiglecFhi neutrophil state that displayed higher ROS production and phagocytic ability compared to newly recruited neutrophils, suggesting the acquisition of specific function in the infarcted heart. These findings highlight the importance of the tissue microenvironment in shaping neutrophil response. From the macrophage perspective, we characterized MI-associated monocyte-derived macrophage subsets, two with a pro-inflammatory gene signature (MHCIIhiIl1βhi) and three Trem2hi macrophage populations with a lipid associated macrophage (LAM) signature, also expressing pro-fibrotic and tissue repair genes. Combined analysis of blood monocytes and cardiac monocyte/macrophages indicated that the Trem2hi LAM signature is acquired in the infarcted heart. We furthermore characterized the role of TREM2, a surface protein expressed mainly in macrophages and involved in macrophage survival and function, in the post-MI macrophage response and cardiac repair. Using TREM2 deficient mice, we demonstrate that acquisition of the LAM signature in cardiac macrophages after MI is partially dependent on TREM2. While their cardiac function was not affected, TREM2 deficient mice showed reduced collagen deposition in the heart after MI. Thus, our data in Trem2-deficient mice highlight the role of TREM2 in promoting a macrophage pro-fibrotic phenotype, in line with the pro-fibrotic/tissue repair gene signature of the Trem2hi LAM-signature genes. Overall, our data provide a high-resolution characterization of neutrophils and macrophage heterogeneity and dynamics in the ischemic heart and can be used as a valuable resource to investigate how these cells modulate the healing processes after MI. Furthermore, our work identified TREM2 as a regulator of macrophage phenotype in the infarcted heart N2 - Die derzeitigen therapeutischen Ansätze verbessern die Überlebenschancen von Patienten nach einem Myokardinfarkt wirksam, dennoch sind Langzeitfolgen wie die Entwicklung einer Herzinsuffizienz immer noch eine der häufigsten Todesursachen weltweit. An den Heilungsprozessen nach einem Herzinfarkt sind Entzündungreaktionen beteiligt, die sowohl zur Gewebeheilung als auch zur Gewebeschädigung beitragen. In den letzten zehn Jahren wurde besondere Aufmerksamkeit auf die gezielte Beeinflussung von Entzündungen als potenzieller therapeutischer Ansatz gewidmet, allerdings stellt die Komplexität der Entzündungszellen bezüglich Heterogenität und Funktion eine Herausforderung für die Entwicklung von Strategien zur Immunmodulation dar. Aus diesem Grund ist die Entwicklung von Methoden, mit denen Immunzellen mit hoher Auflösung charakterisiert werden können, für ein besseres Verständnis der Heterogenität und Dynamik von Immunzellen im ischämischen Herzen unerlässlich. In dieser Arbeit haben wir scRNA-seq eingesetzt, um die Heterogenität und Dynamik von Neutrophilen und Monozyten/Makrophagen nach einem experimentell-induzierten Myokardinfarkt zu bestimmen. Neutrophile dringen unmittelbar nach der ischämischen Schädigung in das infarzierte Herz ein wo ihre Zahl innerhalb der ersten Tage abnimmt. Zudem konnten wir eine transkriptionelle Heterogenität in neutrophilen Populationen während der akuten Entzündungsphase beobachten. Insbesondere konnten wir ab dem 3. Tag nach Infarkt einen SiglecFhi-Neutrophilenstatus identifizieren, der sich unseren Daten zufolge im betroffenen Gewebe entwickelt hat. SiglecFhi-Neutrophile zeigten im Vergleich zu neu rekrutierten Neutrophilen eine höhere ROS-Produktion und phagozytische Fähigkeit, was auf den Erwerb einer spezifischen Funktion im infarzierten Herzen hindeutet. Diese Ergebnisse unterstreichen die Wichtigkeit der unmittelbaren Umgebung des Gewebes für die Reaktion der Neutrophilen. Weiterhin zeigten unsere scRNA-seq-Daten eine erhebliche Heterogenität in der Monozyten-/Makrophagenpopulation. Durch die Kombination der scRNA-seq-Analyse von kardialen und zirkulierenden Leukozyten, konnten wir eine durch ischämische Verletzungen induzierte Monozytenpopulation mit einer "neutrophilenähnlichen" Gensignatur identifizieren. Aus der Makrophagenperspektive beobachteten wir verschiedene MI-assoziierte Makrophagenuntergruppen, zwei mit einer pro-inflammatorischen Gensignatur (MHCIIhiIl1βhi) und drei Trem2hi-Makrophagenpopulationen mit einer Lipid-assoziierten Makrophagensignatur (LAM), welche auch pro-fibrotische/Gewebereparaturgene exprimieren. Darüber hinaus entdeckten wir eine kleine Population von Fn1hiLtc4shi-Makrophagen mit unbekannter Funktion, die mit einigen cRTMs-Markern angereichert sind. CCR2-Depletion und Fate-Mapping-Studien zeigten einen eindeutigen monozytären Ursprung der MI-assoziierten Makrophagen-Untergruppen. TREM2 ist ein Oberflächenprotein, das hauptsächlich in Makrophagen exprimiert wird und an der Makrophagenfunktion beteiligt ist. Die Funktion von TREM2 in Makrophagen wird in verschiedenen Krankheitskontexten (z. B. Alzheimer-Krankheit, Fettleibigkeit, Atherosklerose usw.) eingehend untersucht, und ist für den Erwerb der LAM-Signatur wesentlich. In unserem Herzinfarkt-Mausmodell beobachteten wir die Expression von Genen der LAM-Signatur im infarzierten Herzen und dass TREM2 für diese Hochregulation der LAM-Gene in vivo erforderlich ist. Unsere vorläufigen Daten in Trem2-defizienten Mäusen unterstreichen die Rolle von TREM2 zur Förderung eines pro-fibrotischen Makrophagen-Phänotyps und dementsprechend für die pro-fibrotischen/Gewebereparatur-Gensignatur der Trem2-LAM-Signaturgene. Insgesamt liefern unsere Daten eine hochauflösende Charakterisierung der Heterogenität und Dynamik von Neutrophilen und Makrophagen im ischämischen Herzen und können als wertvolle Grundlage für die Untersuchung der Frage dienen, wie diese Zellen die Heilungsprozesse nach einem Herzinfarkt modulieren. KW - Macrophages KW - Neutrophils KW - Myocardial infarction KW - Makrophage KW - Herzinfarkt Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-310680 ER - TY - THES A1 - Ranecky, Maria Helena T1 - Experimentelle Charakterisierung intestinaler, GvHD-protektiver myeloider Empfängerzellen nach allogener Stammzelltransplantation T1 - Experimental Characterization of Intestinal GvHD-Protective Myeloid Host Cells after Allogeneic Stem Cell Transplantation N2 - Die akute Graft-versus-Host Disease (GvHD) und speziell ihre intestinale Manifestation ist eine schwere Komplikation der allogenen Stammzelltransplantation mit erheblichem Einfluss auf Mortalität und Morbidität der Patienten. Pathophysiologisch stellt sie eine Immunreaktion von Spender-T-Zellen auf Empfängergewebestrukturen dar. In Versuchsmäusen ist die experimentelle Depletion CD11c+ Antigen-präsentierender Empfängerzellen in der frühen GvHD-Effektorphase assoziiert mit einem schlechteren klinischen Outcome, einer höheren Dichte alloreaktiver T-Zellen und einer verstärkten Entzündungsreaktion in der intestinalen Mukosa. Ziel der Studie war eine umfassende Charakterisierung und systematische Einordnung der folglich GvHD-protektiven intestinalen CD11c+ Empfängerzellen. Bezüglich ihrer Oberflächenproteinsignatur analysierten wir die myeloiden Zellen der intestinalen Mukosa am Tag 6 nach allogener Stammzelltransplantation. Mittels durchflusszytometrischer Analyse und Vergleich zwischen gesunden, allein bestrahlten und GvHD-Mäusen ordneten wir die CD11c+ Empfängerzellen als Makrophagen ein und schlossen eine Identität als dendritische Zellen aus. In der Immunfluoreszenzmikroskopie wiesen wir ihre Kolokalisation mit allogenen T-Zellen nach und bestätigten darin eine PD-L1 Expression als möglichen T-Zell-Suppressionsmechanismus. Bezüglich ihres Transkriptoms führten wir eine Einzelzell-RNA-Sequenzierung intestinaler hämatopoetischer Empfängerzellen aus CD11c+ Zell-depletierten und nicht depletierten Mäusen durch. Auf rein bioinformatischer Grundlage wurden die Einzelzellen kombiniert und anhand ihrer Transkriptomprofile in Cluster eingeteilt. Der Vergleich beider Versuchsgruppen offenbarte zwei unterschiedliche präsente bzw. depletierte und damit GvHD-protektive Zellcluster: Cluster 4 enthielt Zellen mit deutlicher Makrophagensignatur und gewebeprotektivem, antipathogenem Effektorprofil, welches in Kombination mit weiteren Genen ein Kontinuum der in Homöostase vorhandenen Makrophagen nahelegte. Cluster 10 dagegen enthielt Zellen mit immun- und spezifisch T-Zell-suppressivem Effektorprofil, weniger deutlicher Makrophagensignatur und Ähnlichkeit zu myeloiden Suppressorzellen. Somit lieferte die Studie wichtige Hinweise auf einen Mechanismus der GvHD- bzw. T-Zell-Suppression und Gewebeprotektion in Form von physiologisch vorhandenen bzw. im Laufe der GvHD auftretenden Empfängermakrophagen. N2 - Acute Graft-versus-host disease (GvHD) is an immunoreaction of donor T cells against host tissue structures after allogeneic hematopoietic cell transplantation (allo-HCT). Especially intestinal GvHD greatly contributes to the patients´ morbidity and mortality. Experimental depletion of CD11c+ antigen-presenting host cells in the early effector phase of GvHD is associated with a worse clinical outcome, an increase of alloreactive T cell numbers and more severe inflammation in the small intestinal mucosa in mice. In this study we aimed to characterize and systematically classify intestinal CD11c+ host cell populations protecting from acute GvHD on proteome and transcriptome level. To address the protein expression signature we analyzed the surface antigens of intestinal CD11c+ antigen-presenting cells of host mice on day 6 after allo-HCT. By flow cytometric analysis and comparison of healthy, GvHD-, and mice only receiving myeloablative irradiation, we classified the GvHD-protective cells as macrophages and ruled out a dendritic cell identity. Utilizing immunofluorescence microscopy we localized intestinal host macrophages in close contact with allogeneic T cells and confirmed their expression of PD-L1 as possible mechanism of alloreactive T cell suppression. Concerning the transcriptome signature, we performed a single-cell RNA sequencing of host intestinal hematopoietic cells of GvHD-mice with and without CD11c+ cell depletion. Single cells were combined and clustered by transcriptional profiling based on bioinformatic calculation. In comparison of both groups we detected two different present, respectively depleted and hence GvHD-protective cell populations: Cluster 4 containing tissue-protective and antipathogenic cells with a distinct macrophage signature, suggesting a continuum of steady state’s macrophages. And Cluster 10 containing cells with highly immunomodulatory and T cell suppressive capacities, less distinct macrophage signature, and some similar features to myeloid-derived suppressor cells. This study details the characteristics of host intestinal macrophages that can regulate alloreactive T cells in the small intestinal mucosa, suppress lethal acute GvHD and protect the tissue from inflammatory destruction. KW - Makrophage KW - Dünndarm KW - PD-L1 KW - Single-cell RNA Sequencing KW - Graft-versus-host disease (GvHD) Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-310924 ER - TY - THES A1 - Reinsberg, Friederike Anna Christine T1 - Die Bedeutung des gp130-Internalisierungmotivs für IL-6-vermittelte Signale und das Antigenpräsentationspotential muriner Knochenmarksmakrophagen T1 - Relevance of the gp130 internalization motif for IL-6 signaling and antigen-presenting capacity of murine bone marrow-derived macrophages N2 - Interleukin 6 (IL-6) bewirkt als Entzündungsmediator eine autokrine Makrophagen (MΦ) -Stimulation. Zur Verhinderung pathologischer Entzündungsaktivität sind IL-6-Signale stark reguliert, unter anderem durch die Dileucin-vermittelte Endozytose des Signaltransduktors gp130. Klassisches IL-6-Signaling ist abhängig von der Expression von IL-6Rα und gp130 auf der Zelloberfläche, während IL-6-trans-Signaling durch löslichen IL-6Rα nur von der gp130-Expression abhängt. Die Bedeutung des Dileucin-Internalisierungsmotivs für IL-6-vermittelte Signale in MΦ ist jedoch unklar. Ziel der vorliegenden Arbeit war eine Charakterisierung muriner GM-CSF- und M-CSF-ausgereifter Knochenmarks (KM) -MΦ hinsichtlich der Relevanz des gp130-Internalisierungsmotivs für IL-6-vermittelte-Signale. Hierzu wurde die gp130LLAA-Mauslinie als knock in-Modell zur Suppression der gp130-Endozytose verwendet. KM-MΦ entwickeln durch die Ausreifung mittels GM-CSF oder M-CSF einen distinkten Phänotyp: M-CSF-ausgereifte KM-MΦ exprimieren mehr gp130 und IL-6Rα auf der Zelloberfläche als GM-CSF-ausgereifte KM-MΦ. Dies limitiert sowohl klassisches als auch IL-6-trans-Signaling in GM-CSF-ausgereiften KM-MΦ: IL-6 induziert in diesen eine geringere STAT1-Aktivierung, das IL-6/IL-6Ra-Fusionsprotein hyper-IL-6 eine geringere STAT1- und STAT3-Aktivierung. KM-MΦ aus gp130LLAA-Mäusen exprimieren mehr gp130 als KM-MΦ aus WT-Mäusen bei ähnlichen Mengen IL-6Rα. Dabei ist die Rezeptorexpression auf gp130LLAA-KM-MΦ unabhängig vom Ausreifungsfaktor GM-CSF oder M-CSF. Durch die erhöhte gp130-Expression induziert IL-6-trans-Signaling in gp130LLAA-KM-MΦ eine stärkere STAT1-Aktivierung als in WT-KM-MΦ, dies gilt insbesondere bei Ausreifung mit GM-CSF. Dagegen sind die STAT3-Aktivierung durch IL-6-trans-Signaling und die STAT1- und STAT3-Aktivierung durch klassisches IL-6-Signaling unabhängig von der Expression des Dileucin-Internalisierungsmotivs. Unklar bleibt, warum IL6-vermittelte Signale in GM-CSF-ausgereiften KM-MΦ stärker durch Dileucin-abhängige gp130-Endozytose reguliert werden als in M-CSF-ausgereifte KM-MΦ. Weitere Untersuchungen sind nötig. N2 - As a mediator of inflammation, interleukin 6 (IL-6) causes autocrine macrophage (MΦ) stimulation. To prevent pathological inflammatory activity, IL-6 signaling is regulated by di-leucine-mediated endocytosis of the signal transducer gp130, amongst other mechanisms. Classical IL-6 signaling depends on the expression of IL-6Rα and gp130 on the cell surface, whereas IL-6 trans-signaling initiated by soluble IL-6Rα depends only on gp130. However, the importance of the di-leucine internalization motif for IL-6-mediated signaling in MΦ is unclear. The aim of this thesis was to characterize murine GM-CSF- and M-CSF-cultured bone marrow-derived macrophages (BMDM) regarding the relevance of the gp130 internalization motif for IL-6 signaling. For this purpose, the gp130LLAA mouse line was used as a knock-in model for suppression of gp130 endocytosis. BMDM develop a distinct phenotype through culture with GM-CSF or M-CSF: M-CSF-cultured BMDM express more gp130 and IL-6Rα on the cell surface than GM-CSF-cultured BMDM. This limits both classical and trans-signaling in GM-CSF-cultured BMDM: IL-6 induces a weaker STAT1 activation in these, the IL-6/IL-6Rα fusion protein hyper-IL-6 a weaker STAT1 and STAT3 activation. BMDM from gp130LLAA mice express more gp130 than BMDM from WT mice but similar levels of IL-6Rα. The receptor expression on gp130LLAA-BMDM is independent of culture with GM-CSF or M-CSF. Due to increased gp130 expression, IL-6 trans-signaling induces stronger STAT1 activation in gp130LLAA-BMDM than in WT-BMDM; this effect is more pronounced in BMDM cultured with GM-CSF. In contrast, STAT3 activation by IL-6 trans-signaling and STAT1 and STAT3 activation by classical IL-6 signaling are independent of the di-leucine internalization motif. It remains unclear why IL-6 signaling in GM-CSF-cultured BMDM is more tightly regulated by di-leucine-dependent gp130 endocytosis than in M-CSF-cultured BMDM. Further investigations are necessary. KW - gp130 KW - Makrophage KW - Interleukin 6 KW - Endozytose Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-277052 ER - TY - THES A1 - Tylek, Tina T1 - Establishment of a Co-culture System of human Macrophages and hMSCs to Evaluate the Immunomodulatory Properties of Biomaterials T1 - Etablierung eines Co-Kultur-Systems von humanen Makrophagen und hMSCs zur Bewertung der Immunmodulatorischen Eigenschaften von Biomaterialien N2 - The outcome of the innate immune response to biomaterials mainly determines whether the material will be incorporated in the body to fulfill its desired function or, when it gets encapsulated, will be rejected in the worst case. Macrophages are key players in this process, and their polarization state with either pro- (M1), anti-inflammatory (M2), or intermediate characteristics is crucial for deciding on the biomaterial’s fate. While a transient initial pro-inflammatory state is helpful, a prolonged inflammation deteriorates the proper healing and subsequent regeneration. Therefore, biomaterial-based polarization may aid in driving macrophages in the desired direction. However, the in vivo process is highly complex, and a mono-culture of macrophages in vitro displays only one part of the cellular system, but, to this date, there is a lack of established co-cultures to assess the immune response to biomaterials. Thus, this thesis aimed to establish a functional co-culture system of human macrophages and human mesenchymal stromal cells (hMSCs) to improve the assessment of the immune response to biomaterials in vitro. Together with macrophages, hMSCs are involved in tissue regeneration and inflammatory reactions and can modulate the immune response. In particular, endogenously derived hMSCs considerably contribute to the successful engrafting of biomaterials. This thesis focused on poly(ε-caprolactone) (PCL) fiber-based scaffolds produced by the technique of melt electrowriting (MEW) as biomaterial constructs. Via this fabrication technique, uniform, precisely ordered scaffolds varying in geometry and pore size have been created in-house. To determine the impact of scaffold geometries and pore sizes on macrophages, mono-cultures incubated on scaffolds were conducted. As a pre-requisite to achieve a functional co-culture system on scaffolds, setups for direct and indirect systems in 2D have initially been established. These setups were analyzed for the capability of cell-cell communication. In parallel, a co-culture medium suitable for both cell types was defined, prior to the establishment of a step-by-step procedure for the co-cultivation of human macrophages and hMSCs on fiber-based scaffolds. Regarding the scaffold morphologies tested within this thesis to improve M2-like polarization, box-shaped scaffolds outperformed triangular-, round- or disordered-shaped ones. Upon further investigation of scaffolds with box-shaped pores and precise inter-fiber spacing from 100 µm down to only 40 µm, decreasing pore sizes facilitated primary human macrophage elongation accompanied by their differentiation towards the M2 type, which was most pronounced for the smallest pore size of 40 µm. To the best of my knowledge, this was the first time that the elongation of human macrophages in a 3D environment has been correlated to their M2-like polarization. Thus, these results may set the stage for the design, the assessment, and the selection of new biomaterials, which can positively affect the tissue regeneration. The cell communication of both cell types, detected via mitochondria exchange in direct and indirect co-cultures systems, took place in both directions, i.e., from hMSCs to macrophages and vice versa. Thereby, in direct co-culture, tunneling nanotubes enabled the transfer from one cell type to the respective other, while in indirect co-culture, a non-directional transfer through extracellular vesicles (EVs) released into the medium seemed likely. Moreover, the phagocytic activity of macrophages after 2D co-cultivation and hence immunomodulation by hMSCs increased with the highest phagocytic rate after 48 h being most pronounced in direct co-cultivation. As the commonly used serum supplements for macrophages and hMSCs, i.e., human serum (hS) and fetal calf serum (FCS), respectively, failed to support the respective other cell type during prolonged cultivation, these sera were replaced by human platelet lysate (hPL), which has been proven to be the optimal supplement for the co-cultivation of human macrophages with hMSCs within this thesis. Thereby, the phenotype of both cell types, the distribution of both cell populations, the phagocytic activity of macrophages, and the gene expression profiles were maintained and comparable to the respective standard mono-culture conditions. This was even true when hPL was applied without the anticoagulant heparin in all cultures with macrophages, and therefore, heparin was omitted for further experiments comprising hPL and macrophages. Accordingly, a step-by-step operating procedure for the co-cultivation on fiber-based scaffolds has been established comprising the setup for 3D cultivation as well as the description of methods for the analysis of phenotypical and molecular changes upon contact with the biomaterial. The evaluation of the macrophage response depending on the cultivation with or without hMSCs and either on scaffolds or on plastic surfaces has been successfully achieved and confirmed the functionality of the suggested procedures. In conclusion, the functional co-culture system of human macrophages and hMSCs established here can now be employed to assess biomaterials in terms of the immune response in a more in vivo-related way. Moreover, specifically designed scaffolds used within the present thesis showed auspicious design criteria positively influencing the macrophage polarization towards the anti-inflammatory, pro-healing type and might be adaptable to other biomaterials in future approaches. Hence, follow-up experiments should focus on the evaluation of the co-culture outcome on promising scaffolds, and the suggested operating procedures should be adjusted to further kinds of biomaterials, such as cements or hydrogels. N2 - Der Verlauf der angeborene Immunantwort auf Biomaterialien bestimmt maßgebend, ob das Material vom Körper angenommen wird, um so seine gewünschte Funktion zu erfüllen, oder ob es zur Einkapselung und im schlimmsten Fall zur Abstoßung kommt. Makrophagen spielen in diesem Prozess eine Schlüsselrolle, und ihr Polarisationszustand, entweder pro (M1), antiinflammatorisch (M2) oder ein dazwischenliegender Subtyp, ist dabei von entscheidender Bedeutung. Während ein vorübergehender proinflammatorischer Anfangszustand hilfreich ist, verschlechtert eine anhaltende Entzündung eine zeitnahe Heilung und die anschließende Regeneration. Daher könnte eine durch Biomaterialien beeinflusste Polarisation hilfreich sein, um die Makrophagen in die gewünschte Richtung zu lenken. Die in vivo Reaktion ist jedoch äußerst komplex und die Kultivierung von Makrophagen in vitro stellt nur einen Teil des Prozesses dar. An etablierten Co-Kultursystem zur Untersuchung der immunmodulierenden Eigenschaften von Biomaterialien mangelt es jedoch. Daher war es Ziel dieser Arbeit ein funktionelles Co-Kultursystem von humanen Makrophagen und humanen mesenchymalen Stromazellen (hMSCs) zu etablieren um die in vitro Bewertung der Immunantwort nach Kontakt mit Biomaterialien zu verbessern. Von Interesse sind hMSCs hierbei, da sie zusammen mit Makrophagen an der Geweberegeneration und an Entzündungsreaktionen beteiligt sind. Zudem weisen MSCs immunmodulierende Eigenschaften in Hinblick auf Makrophagen auf und sind aktiv am Verlauf der Fremdkörperreaktion nach der Transplantation von Biomaterial beteiligt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Poly(ε-caprolactone) (PCL)-Scaffolds auf Faserbasis als Biomaterialkonstrukte verwendet, welche mit der Technik des Melt Electrowriting (MEW) hergestellt wurden. Mit dieser Technik kann sowohl die Form der Scaffolds als auch die Porengröße variiert werden. Um Unterschiede der Scaffoldgeometrien und Porengrößen in Hinblick auf die Makrophagenreaktion zu untersuchen, wurden zunächst Versuche mit Makrophagen-Monokulturen durchgeführt. Zur Etablierung eines funktionellen Co-Kultursystem, wurde zu Beginn ein Aufbau für ein direktes und indirektes System in 2D erstellt. Dieser Aufbau wurde anschließend auf die Möglichkeit der Zell-Zell-Kommunikation darin analysiert. Weiterhin wurde ein, für beide Zelltypen, geeignetes Kulturmedium definiert, gefolgt von der Etablierung eines Protokoll für die Co-Kultivierung beider Zelltypen auf faserbasierten Scaffolds. Im Bezug zu dieser Arbeit wurden Scaffolds mit unterschiedlicher Geometrie mittels der Technik des Melt Electrowriting hergestellt um die Veränderung der Makrophagenpolarisation zu untersuchen. Dabei zeigte sich eine verstärkte M2-Polarisation auf Scaffolds mit einer kastenförmigen Morphologie, verglichen mit dreieckigen, runden oder ungeordnet-strukturierten Scaffolds. Die weitere Untersuchung von Scaffolds mit kastenförmigen Poren und präzisen Faserabständen von 100 µm bis zu 40 µm zeigte das kleinere Porengrößen die Elongation primärer menschlicher Makrophagen förderten. Begleitet wurde die verstärkte Elongation mit einer gesteigerten Polarisation in Richtung des M2 Typs. Dieser Effekt war nach Kultivierung von Makrophagen auf Scaffolds mit 40 µm Poren am stärksten ausgeprägt. Im Rahmen dieser Arbeit konnte damit erstmals eine länglichen Morphologie humaner Makrophagen mit einer Polarisierung in den M2 Typ korreliert werden. Diese Ergebnisse könnten daher für das Design neuer Biomaterialien, welche sich positiv auf die Geweberegeneration auswirken sollen, von Bedeutung sein. Die Zellkommunikation beider Zelltypen, welche über Mitochondrienaustausch im direkten und indirekten Co-Kultur-System nachgewiesen wurde, fand sowohl ausgehend von Makrophagen als auch von hMSCs statt. Dabei ermöglichten „Tunneling Nanotubes“ in der direkten Co-Kultur den Transfer von Mitochondrien von einem Zelltyp zum jeweils anderen, während in der indirekter Co-Kultur ein ungerichteter Transfer durch in das Medium freigesetzte extrazelluläre Vesikel (EVs) stattfand. Darüber hinaus wurde die phagozytotische Aktivität von Makrophagen nach Co-Kultivierung untersucht, um die immunmodulatorischen Eigenschaften von hMSCs nachzuweisen, wobei die höchste phagozytotische Aktivität nach 48 stündiger Co-Kultivierung festgestellt wurde. Da die üblicherweise verwendeten Serumzusätze für Makrophagen (humanes Serum (hS)) und hMSCs (fötales Kälberserum (FCS)) bei längerer Kultivierung den jeweils anderen Zelltyp nicht unterstützen konnten, wurden diese Seren durch humanes Thrombozytenlysat (hPL) ersetzt. Dieses erwies sich im Rahmen dieser Arbeit als optimale Ergänzung für die gemeinsame Kultivierung beider Zelltypen in der Co-Kultur. Dabei wurden der Phänotyp und die Populationsverteilung beider Zelltypen, sowie die phagozytotische Aktivität und die Veränderung des Genexpressionsprofils von Makrophagen untersucht und mit den jeweiligen Standard-Monokulturbedingungen verglichen. Des Weiteren konnte gezeigt werde, dass eine Zugabe von Heparin in Zellkulturen mit Makrophagen und hPL nicht nötig ist. Daher wurde auf den Zusatz von Heparin für alle weitere Experimente, die hPL und Makrophagen umfassten, verzichtet. Im letzten Teil der Arbeit wurde ein Protokoll für die Co-Kultivierung auf MEW Scaffolds erstellt. Neben der Etablierung eines Setups für die 3D-Kultivierung wurden sowohl Protokolle zur Bewertung phänotypischer als auch molekularer Veränderungen entwickelt. Durch Feststellung von Unterschieden in der Makrophagenreaktion in Abhängigkeit zu der Kultivierung mit / ohne hMSCs und entweder auf Scaffolds oder Plastik-Kulturschalen konnte die Funktionalität der Protokolle nachgewiesen werden. Mit dem in dieser Arbeit etabliertem funktionellen Co-Kultursystem von humanen Makrophagen und hMSCs können zukünftig Biomaterialien mit einem stärkeren in vivo -Bezug in Hinblick auf die Immunantwort bewertet werden. Darüber hinaus deuten Ergebnisse auf speziell konstruierte MEW-Scaffolds ein vielversprechendes Designkriterium für neu entwickelte Biomaterialien an, wobei die Polarisation der Makrophagen in Richtung des entzündungshemmenden, heilungsfördernden Typens durch eine gesteuerte Morphologieänderung beeinflusst werden kann. An diese Arbeit anschließende Experimente sollten sich auf die Untersuchung vielversprechender Scaffolds mittels Co-Kultivierung sowie auf die Anpassung der etablierten Protokolle an andere Biomaterialgruppen, wie beispielsweiße für Zemente oder Hydrogele, konzentrieren. KW - Makrophage KW - Biomaterial KW - Co-culture system KW - Mesenchymal stromal cells KW - Macrophages Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-203570 ER - TY - THES A1 - Krakow, Sören T1 - CD14-Reexpression definiert einen immunregulatorischen Phänotyp Monozyten-gereifter Zellen nach IL-10/R848-Stimulation T1 - Re-expression of CD14 in Response to a Combined IL-10/TLR Stimulus Defines Monocyte-Derived Cells With an Immunoregulatory Phenotype N2 - Dendritische Zellen können als antigenpräsentierende Zellen sowohl immunogene als auch tolerogene Funktionen im Immunsystem wahrnehmen und werden in der Therapie von Tumorerkrankungen und Autoimmunerkrankungen eingesetzt. IL-10 gilt als Induktor tolerogener dendritischer Zellen. Diese werden in der Literatur oft als unreif bezeichnet und stehen im Gegensatz zu den reifen immunogenen dendritischen Zellen, die durch die Expression des Reifungsmarkers CD83 gekennzeichnet sind. Ausdifferenzierte dendritische Zellen exprimieren zudem das Antigen CD86, das der T-Zell-Aktivierung dient. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von IL-10 auf den Reifungsprozess dendritischer Zellen in vitro untersucht. Zur Generierung unreifer dendritischer Zellen wurden humane Monozyten nach etabliertem Protokoll mit IL-4 und GM-CSF stimuliert. Nach anschließender IL-10-Stimulation, insbesondere in Kombination mit einem TLR-Agonisten, bildeten sich zwei exklusive Zellpopulationen: eine CD14+ Population und eine CD83+ Population. Unreife CD14-CD83- dendritische Zellen reexprimierten einerseits CD14 oder exprimierten andererseits CD83. Dabei zeigte sich, dass das kostimulierende Antigen CD86 gleichermaßen sowohl mit als auch ohne IL-10-Inkubation hoch exprimiert wurde und IL-10 folglich keinen zusätzlichen Einfluss auf dessen Expression hat. Insgesamt waren Veränderungen bezüglich der Oberflächenantigene, die bei der Betrachtung der Gesamtheit aller Zellen auffallen, auf eine quantitative Verschiebung der beiden Zellpopulationen zurückzuführen. IL-10 beeinflusst also nicht direkt einzelne kostimulierende oder inhibitorische Moleküle, sondern beeinflusst den Anteil der CD14+ Zellen gegenüber den CD83+ dendritischen Zellen. Funktionell betrachtet zeigten die CD14+ Zellen eine gesteigerte Makropinozytose im Gegensatz zu den reifen CD83+ dendritischen Zellen. Zusammenfassend führt IL-10 zu einer Reexpression von CD14 auf unreifen dendritischen Zellen und aktiviert einen alternativen Differenzierungsweg. Die CD14+ Zellen weisen einen stabilen immunregulatorischen Phänotyp auf und unterscheiden sich somit von reifen dendritischen Zellen, die nach Inkubation mit IL-10 nicht reguliert werden. Damit muss die Begrifflichkeit und Klassifikation tolerogener dendritischer Zellen weiter diskutiert werden. N2 - Dendritic cells (DCs) are antigen-presenting cells and play a critical role in innate and acquired immunity as far as they can initiate and boost T cell responses. They also maintain the balance between tolerance and immunity. However, the phenotypic and functional diversity of dendritic cell subsets still are the main subject of research. Interleukin 10 is a central regulator of the antigen-presenting function of myeloid cells. It exerts immunomodulatory effects in vivo and induces a regulatory phenotype in monocyte-derived cells in vitro. In this study, the phenotype and function of monocytic cells are analyzed in vitro in relation to the cytokine milieu and the timing of TLR-based activation. In GM-CSF/IL-4 cultured human monocytic cells, two mutually exclusive cell populations - arising from undifferentiated cells - are identified: CD83+ fully activated dendritic cells and CD14+ macrophage like cells. Re-expression of CD14 occurs primarily after a sequential trigger with a TLR signal following IL-10 preincubation. This cell population with re-expressed CD14 substantially differs in phenotype and function from the CD83+ cells. Detailed analysis of individual subpopulations reveals that exogenous IL-10 is critical for inducing the shift toward the CD14+ population but does not affect individual changes in marker expression or cell function in most cases. Thus, plasticity of CD14 expression, defining a subset of immunoregulatory cells, is highly relevant for the composition of cellular products (such as DC vaccines) as it affects the function of the total product. KW - Dendritische Zelle KW - Monozyt KW - Makrophage KW - IL-10 Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-224280 ER - TY - THES A1 - Schreiber, David Lukas T1 - CSF-1-Rezeptor Inhibitor als Therapieansatz in Mausmodellen für Charcot-Marie-Tooth Neuropathien Typ 1 T1 - CSF-1-Receptor Inhibitor as treatment approach in mouse models for Charcot-Marie-Tooth neuropathies typ 1 N2 - Charcot-Marie-Tooth Neuropathien sind die häufigsten hereditären Erkrankungen des peripheren Nervensystems und dennoch bis heute nicht therapierbar. Die Lebensqualität der Patienten ist durch motorische und sensorische Defizite der Extremitäten häufig stark eingeschränkt. Ursache können unter anderem Mutationen in Schwann-Zellen sein, die zu dem typischen Bild von Demyelinisierung und axonalem Schaden führen. In den letzten Jahren konnte in Mausmodellen das Immunsystem als wichtiger Mediator in der Pathogenese der CMT 1 Subtypen A, B und X identifiziert werden. Insbesondere Makrophagen spielen eine tragende Rolle bei dem Verlust der axonalen Integrität, bei der Schädigung der Myelinscheiden, sowie bei der Dedifferenzierung von Schwann-Zellen. Entscheidender Faktor für Proliferation und Aktivierung der Makrophagen ist hierbei das Zytokin CSF-1, dessen korrespondierender Rezeptor auf Makrophagen exprimiert wird. Der CSF-1/CSF1R Signalweg bietet somit einen vielversprechenden Angriffspunkt. In der vorliegenden Arbeit wurden Mausmodelle der CMT 1 Subtypen A, B und X mit einem niedermolekularen CSF-1-Rezeptor Inhibitor behandelt. Anschließend erfolgte eine funktionelle und strukturelle Auswertung der peripheren Nerven. Das beste Ansprechen auf die Therapie zeigten Cx32def Mutanten. Strukturell fielen ein verringerter axonaler Schaden und eine verbesserte axonale Regenerationsfähigkeit sowie erhaltene neuromuskuläre Synapsen auf. Funktionell äußerte sich dies in verbesserten elektrophysiologischen Parametern und einem Krafterhalt, welcher als klinischer Parameter die größte Relevanz für betroffene Patienten hat und somit besonders hervorzuheben ist. Auch P0het Mutanten zeigten Verbesserungen nach der CSF1RI Behandlung. Anders als bei Cx32def Tieren zeigte sich hier jedoch vor allem ein Erhalt der Myelinintegrität. Weiterhin wirkte sich die Therapie positiv auf elektrophysiologische Parameter und Krafttests aus. Vor allem besonders stark betroffene Individuen schienen hierbei von der CSF1RI Behandlung zu profitieren. Bei PMP22tg Mutanten hingegen konnten keine positiven Effekte der CSF1RI Behandlung nachgewiesen werden. Strukturelle und funktionelle Parameter behandelter Tiere unterschieden sich nicht von unbehandelten. Diese Ergebnisse unterstreichen die Relevanz der sekundären Entzündungsreaktion in CMT 1 Neuropathien als wichtigen Mediator in der Pathogenese. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass eine Intervention im CSF-1/CSF1R Signalweg einen vielversprechenden möglichen Ansatz für die Therapie der bisher nicht behandelbaren CMT 1 Subypen X und B darstellt. Unausweichlich ist hierbei ein möglichst früher Therapiestart vor Ausprägung der ersten molekularen und histologischen Veränderungen. Im Hinblick auf die nicht die Lebenserwartung reduzierende Erkrankung muss ferner eine Minimierung der Nebenwirkungen der Therapie gewährleistet sein. Besonders hervorzuheben ist hier die Verwendung eines Inhibitors, welcher nicht in das zentrale Nervensystem vordringen kann und somit die Funktion der Mikroglia nicht beeinträchtigt. N2 - Charcot-Marie-Tooth neuropathies are the most abundant inherited disorders of the peripheral nervous system, caused by a various number of mutations in schwann cell proteins which lead to the typical outcome with demyelination and axonal damage. Affected Patients suffer from motor and sensory deficits of the upper and lower extremities. To this day there is no specific therapy available. Within the last years the immune system has been identified as a mediator in the pathogenesis oft the CMT 1 subtypes A, B and X. It was shown that macrophages play a crucial role in demyelination, loss of axonal integrity and schwann cell dedifferentiation. As main factor for macrophage proliferation and differentiation cytokine CSF-1 has been identified which corresponding receptor is expressed on the outer surface oft he macrophages. Hence the CSF-1/CSF1R signalling pathway represent a promising target for pharmacological approaches. In this study we treated mouse models of CMT 1 subtypes A, B and X with a small-molecule CSF-1-receptor inhibitor, followed by histological and functional evaluation of peripheral nerves and muscles. The best response to the treatment was observed in Cx32def mutants. The treatment resulted in reduced axonal damage, improved axonal regeneration and preserved neuromuscular junctions. In addition we found improved functional parameters in grip strength testing and in electrophysiological studies. In contrast to Cx32def mutants, the characteristic feature observed in P0het mutants after CSF-1-receptor inhibitor treatment was preserved myelin integrity. Especially strongly affected individuals seemed to benefit from the treatment. PMP22tg mutants did not respond to CSF-1-receptor inhibitor treatment. The results of this study emphaize the importance of low-grade secondary inflammation as a desease amplifier in CMT 1 neuropathies. Furthermore we could show that targeting the CSF-1/CSF1RI signalling pathway might represent a promising treatment approach for CMT 1 subtypes X and B. It should be started preferably in early childhood before the developement of the typical histopathological alterations. KW - CSF-1 KW - Charcot-Marie-Tooth-Hoffmann-Syndrom KW - Makrophage KW - Immunsystem KW - CSF-1 KW - Makrophagen KW - Charcot-Marie-Tooth Neuropathie KW - Heriditäre sensomotorische Neuropathie KW - CSF-1 Rezeptor Inhibitor KW - Macrophage KW - Charcot-Marie-Tooth Neuropathy KW - Heriditary sensor and motor neuropathy KW - CSF-1 receptor inhibitor Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-174931 ER - TY - THES A1 - Werner, Vera T1 - Pharmaceutically relevant protein-protein interactions for controlled drug delivery T1 - Pharmazeutisch relevante Protein-Protein-Wechselwirkung für "Controlled drug delivery" N2 - Protein-protein interactions play a crucial role in the development of drug delivery devices for the increasingly important biologicals, including antibodies, growth factors and cytokines. The understanding thereof might offer opportunities for tailoring carriers or drug proteins specifically for this purpose and thereby allow controlled delivery to a chosen target. The possible applications range from trigger-dependent release to sustained drug delivery and possibly permanently present stimuli, depending on the anticipated mechanism. Silk fibroin (SF) is a biomaterial that is suitable as a carrier for protein drug delivery devices. It combines processability under mild conditions, good biocompatibility and stabilizing effects on incorporated proteins. As SF is naturally produced by spiders and silkworms, the understanding of this process and its major factors might offer a blueprint for formulation scientists, interested in working with this biopolymer. The natural process of silk spinning covers a fascinating versatility of aggregate states, ranging from colloidal solutions through hydrogels to solid systems. The transition among these states is controlled by a carefully orchestrated process in vivo. Major players within the natural process include the control of spatial pH throughout passage of the silk dope, the composition and type of ions, and fluid flow mechanics within the duct, respectively. The function of these input parameters on the spinning process is reviewed before detailing their impact on the design and manufacture of silk based drug delivery systems (DDS). Examples are reported including the control of hydrogel formation during storage or significant parameters controlling precipitation in the presence of appropriate salts, respectively. The review details the use of silk fibroin to develop liquid, semiliquid or solid DDS with a focus on the control of SF crystallization, particle formation, and drug-SF interaction for tailored drug load. Although we were able to show many examples for SF drug delivery applications and there are many publications about the loading of biologics to SF systems, the mechanism of interaction between both in solution was not yet extensively explored. This is why we made this the subject of our work, as it might allow for direct influence on pharmaceutical parameters, like aggregation and drug load. In order to understand the underlying mechanism for the interaction between SF and positively charged model proteins, we used isothermal titration calorimetry for thermodynamic characterization. This was supported by hydrophobicity analysis and by colloidal characterization methods including static light scattering, nanoparticle tracking analysis and zeta potential measurements. We studied the effects of three Hofmeister salts – NaCl (neutral), NaSCN (chaotropic) and Na2SO4 (cosmotropic) – and the pH on the interaction of SF with the model proteins in dependence of the ratio from one to another. The salts impacted the SF structure by stabilizing (cosmotropic) or destabilizing (chaotropic) the SF micelles, resulting in completely abolished (cosmotropic) or strongly enhanced (chaotropic) interaction. These effects were responsible for different levels of loading and coacervation when varying type of salt and its concentration. Additionally, NaCl and NaSCN were able to prolong the stability of aqueous SF solution during storage at 25°C in a preliminary study. Another approach to influence protein-protein interactions was followed by covalent modification. Interleukin-4 (IL-4) is a cytokine driving macrophages to M2 macrophages, which are known to provide anti-inflammatory effects. The possibility to regulate the polarization of macrophages to this state might be attractive for a variety of diseases, like atherosclerosis, in which macrophages are involved. As these cases demand a long-term treatment, this polarization was supposed to be maintained over time and we were planning to achieve this by keeping IL-4 permanently present in an immobilized way. In order to immobilize it, we genetically introduced an alkyne-carrying, artificial amino acid in the IL-4 sequence. This allowed access to a site-specific click reaction (Cu(I)-catalyzed Huisgen azide-alkyne cycloaddition) with an azide partner. This study was able to set the basis for the project by successful expression and purification of the IL-4 analogue and by proving the availability for the click reaction and maintained bioactivity. The other side of this project was the isolation of human monocytes and the polarization and characterization of human macrophages. The challenge here was that the majority of related research was based on murine macrophages which was not applicable to human cells and the successful work was so far limited to establishing the necessary methods. In conclusion, we were able to show two different methods that allow the influence of protein-protein interactions and thereby the possible tailoring of drug loading. Although the results were very promising for both systems, their applicability in the development of drug delivery devices needs to be shown by further studies. N2 - Die Wechselwirkungen zwischen Proteinen spielen eine entscheidende Rolle in der Entwicklung von Freigabesystemen für die immer wichtiger werdenden Protein-Therapeutika, wie Antikörper, Wachstumsfaktoren und Zytokine. Das Verständnis dieser Mechanismen würde die Möglichkeit eröffnen, sowohl die Träger, als auch die zu verabreichenden Proteine so zu verändern und zu steuern, dass sie auf kontrollierte Weise an einem bestimmten Ort freigesetzt werden. Die Anwendungen hierfür reichen von Trigger gesteuerter Freisetzung, über verzögerte Freigabe bis zur permanenten Präsentation von Stimuli, abhängig davon was für die jeweilige Applikation gewünscht ist. Seidenfibroin (SF) ist ein Biomaterial, welches verschiedene positive Eigenschaften für die Anwendung als Trägermaterial in sich vereint, indem es unter sehr milden Bedingungen verarbeitet werden kann, gut biokompatibel ist und stabilisierend auf eingebettete Proteine wirken kann. Da SF in der Natur von Spinnen und Seidenraupen produziert wird, könnte das Verständnis dieses Prozesses, sowie seiner wichtigsten Faktoren eine Vorlage für die Formulierung dieses Biopolymers geben. Der natürliche Prozess des Seidenspinnens vereint eine faszinierende Vielfalt von Aggregatszuständen, die von kolloidalen Lösungen über Hydrogele bis hin zu festen System reichen. Die Übergänge zwischen diesen Zuständen sind in vivo sehr sorgfältig kontrolliert. Die Hauptfaktoren dieses Prozesses sind der pH-Wert während der Passage der Spinnlösung durch die Drüse, sowie die Art und Zusammensetzung der Ionen und die herrschenden Scherkräfte. Die Funktion dieser einzelnen Faktoren auf den Spinnprozess wurde recherchiert und wird beschrieben, bevor ihr Einfluss auf die Entwicklung und Herstellung von seidenbasierten Freigabesystemen untersucht wird. Es werden Beispiele vorgestellt, die die Kontrolle der Hydrogelbildung während der Lagerung untersuchen oder signifikante Parameter für die kontrollierte Präzipitation in Gegenwart bestimmter Salze zeigen. Der Review betrachtet den Einsatz von Seidenfibroin in der Entwicklung von flüssigen, halbfesten oder festen Freigabesystemen und legt besonderen Fokus auf die Kontrolle der SF Kristallisation, Partikelbildung und Interaktion mit dem Arzneistoff für steuerbare Beladung. Obwohl wir viele Beispiele für die Anwendung von SF in Freigabesystemen zeigen konnten und viele Publikationen die Beladung von Proteinen auf SF-Systeme behandeln, wurde der Mechanismus der Interaktion zwischen beiden bisher nicht detailliert untersucht. Es gibt wenige Studien die einige Aspekte abdecken, aber keines beschäftigte sich spezifisch mit dieser Fragestellung. Darum machen wir dies zum Gegenstand unserer Arbeit, da dies einen direkten Einfluss auf pharmazeutische Parameter, wie Aggregation und Beladung, erlauben würde. Um den zugrundeliegenden Mechanismus der Wechselwirkung zwischen SF und einem positiv geladenen Modellprotein zu verstehen, nutzten wir isotherme Titrationskalorimetrie für eine thermodynamische Charakterisierung. Diese wurde durch kolloidale Charakterisierungsmethoden wie Statische Lichtstreuung, nanoparticle tracking analysis und Zeta-potentialmessungen, sowie Hydrophobitätsbestimmungen unterstützt. Wir untersuchten die Effekte von drei verschiedenen Hofmeister Salzen - NaCl (neutral), NaSCN (chaotrop) und Na2SO4 (kosmotrop) – und des pH Wertes auf die Interaktion von SF mit dem Modellprotein in Abhängigkeit vom Verhältnis der beiden zueinander. Die Salze beeinflussten die SF Struktur, indem sie die SF Mizellen entweder stabilisierten (kosmotrop) oder destabilisierten (chaotrop) und dadurch die Interaktion entweder vollständig unterbanden (kosmotrop) oder verstärkten (chaotrop). Diese Effekte waren verantwortlich für verschiedene Level des Loadings und der Koazervation, wenn Salzart und –konzentration variiert wurden. Außerdem waren NaCl und NaSCN in der Lage die Stabilität einer wässrigen SF-Lösung während der Lagerung bei 25°C zu verlängern. Ein andere Ansatz um die Wechselwirkung zwischen Proteinen zu beinflussen wurde mit kovalenter Modifikation verfolgt. Interleukin-4 (IL-4) ist ein Zytokin und kann Makrophagen zu M2 Makrophagen polarisieren, welche dann anti-inflammatorische Wirkungen haben. Die Möglichkeit diese Polarisation zu regulieren wäre für verschiedene Krankheiten, wie Arteriosklerose, bei denen Makrophagen eine Rolle spielen interessant. Da in diesen Fällen eine Langzeitbehandlung von Nöten ist sollte die Polarisation über die Zeit erhalten bleiben. Wir planten dies durch die Immobilisation von IL-4 zu erreichen, die für eine permanente Präsenz sorgen würde. Um IL-4 zu immobilisieren haben wir eine künstliche Aminosäure in die Sequenz eingeführt, die eine Alkingruppe trägt. Diese ermöglicht den Zugang zu einer Kupfer vermittelten, spezifischen Click-Reaktion (Cu(I)-catalyzed Huisgen azide-alkyne cycloaddition) mit einem Azid-Partner. Diese Studie war in der Lage die Basis für dieses Projekt zu erstellen, indem wir eine erfolgreiche Expression und Aufreinigung des IL-4 Analogons leisten konnten und dieses sowohl erhaltene Bioaktivität als auch Verfügbarkeit für die Clickreaktion zeigte. Die andere Seite dieses Projekts bestand aus der Isolation von humanen Monozyten und der Polarisation und Charakterisierung von humanen Makrophagen. Die Herausforderung hierbei lag darin dass die meiste Forschung auf diesem Gebiet an murinen Makrophagen durchgeführt wurde und dies nicht auf humane Zellen übertragbar war, und die erfolgreiche Arbeit bisher, beschränkte sich auf die Etablierung der nötigen Methoden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir in der Lage waren zwei verschiedene Methoden zur Beeinflussung der Protein-Protein Wechselwirkungen und damit der Beladung zu zeigen. Obwohl die Ergebnisse für beide Systeme vielversprechend waren muss ihre Anwendbarkeit in der Entwicklung von Freigabesystemen noch durch weitere Studien belegt werden. KW - Protein-Protein-Wechselwirkung KW - Makrophage KW - Seide KW - silk fibroin KW - drug delivery KW - click chemistry KW - interleukin-4 KW - thermodynamics KW - Wirkstofffreisetzung KW - Interleukin 4 Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-117409 ER - TY - THES A1 - Wenzel, Jens T1 - Regulation of TLR-induced macrophage responses by cytoskeleton-associated phosphoproteins T1 - Regulation der Antwort von Makrophagen auf TLR-Stimulation durch Zytoskelett-assoziierte Phosphoproteine N2 - Toll-like receptors (TLR) are pattern recognition receptors (PRR) by which macrophages (MØ) sense pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). The recognition of lipopolysaccharide (LPS), the PAMP of gram negative bacteria, by TLR4 triggers signaling cascades and leads to the pro-inflammatory activation of the cells. A recent quantitative and kinetic analysis of the phosphoproteome of LPS-activated primary macrophages highlighted the cytoskeleton as a cell compartment with an enriched protein phosphorylation. In total 44 cytoskeleton-associated proteins were regulated by this post-translational modification and thus might be involved in the control and regulation of key macrophage functions like spreading, motility and phagocytosis. To investigate the control of cytoskeleton-associated cell functions by TLR4 activation, we first developed a method to quantitatively measure the spreading response of bone marrow MØ after stimulation with LPS. Fluorescence microscopy was used for cell imaging and visualisation of the MØ contact area. In collaboration with the Fraunhofer Institute Erlangen, we developed and validated a software tool for the semi-automated segmentation and quantitation of MØ fluorescence microscopy data, which allowed fast, robust and objective image analysis. Using this method, we observed that LPS caused time-dependent spreading, which was detectable after 1-2 h and maximal after 24 h. Next, the impact of genetic or pharmacological inhibition of known TLR signaling components was investigated. Deficiency in the adapter protein MYD88 strongly reduced spreading activity at the late time points, but had no impact early after LPS-stimulation. A similar effect was observed upon pharmacological inhibition of ERK1/2 signaling, indicating that ERK1/2 mediates MYD88-dependent MØ spreading. In contrast, MØ lacking the MAPK p38 were impaired in the initial spreading response but responded normally 8-24 h after stimulation. The genetic deletion of the MAPK phosphatases DUSP1 and DUSP16 resulted in impaired late spreading, corroborating the essential role for functional MAPK signaling in TLR4-driven MØ spreading. To identify the contribution of other cytoskeletal phosphoproteins to MØ spreading, siRNA knockdown of selected candidate genes in primary murine MØ was employed and combined with automated quantitative image analysis. These experiments revealed a functional role for the Myosins MYO1e and MYO1f in MØ spreading. These motor proteins are strongly phosphorylated in LPS-activated MØ. Because of their ability to simultaneously bind to actin filaments and cell membrane or other proteins, we investigated their role in phagocytosis, cytokine production and antigen presentation. Phagocytosis and killing of bacteria were not affected in Myo1e-/- macrophages. However, MYO1e plays a role in chemokine secretion and antigen presentation processes. MCP1 (CCL2) release was selectively increased in Myo1e-deficient MØ and dendritic cells (DC), while cytokine secretion was unaffected. Furthermore, macrophages and DCs lacking MYO1e showed lower levels of MHC-II on the cell surface. However, mRNA levels of CCL2 and of MHC-II were unaltered. These data suggest a role for MYO1e in the transport of selected chemokines and of MHC-II molecules to the cell surface. MHC-II-restricted antigen presentation assays revealed an impaired capacity of macrophages and DC lacking MYO1e to stimulate antigen-specific T cells, suggesting that the reduced MHC-II expression is functionally relevant. Taken together, in this study first a quantitative image analysis method was developed which allows the unbiased, robust and efficient investigation of the macrophage spreading response. Combination of this method with siRNA knockdown of selected cytoskeleton-associated phosphoproteins led to the identification of MYO1e and MYO1f as regulators of macrophage spreading. Furthermore, we identified MYO1e in MØ and DC to be essential for the intracellular transport of CCL2 and MHC-II to the cell surface and for optimal stimulation of antigen-specific CD4 T cells. N2 - Toll-like Rezeptoren (TLR) sind Mustererkennungsrezeptoren (PRR) durch die Makrophagen (MØ) pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs) erkennen. Die Erkennung von Lipopolysacchariden (LPS), dem PAMP gramnegativer Bakterien, durch TLR4 löst Signalkaskaden aus, die zu einer pro-inflammatorischen Aktivierung der Zellen führen. Eine quantitative und kinetische Analyse des Phosphoproteoms LPS-aktivierter primärer Makrophagen identifizierte das Zytoskelett als ein Zellkompartiment mit gesteigerter Proteinphosphorylierung. Insgesamt wurden 44 Zytoskelett-assoziierte Proteine identifiziert, die durch diese post-translationale Modifikation reguliert wurden und demzufolge an der Regulation wichtiger Zellfunktionen von Makrophagen wie Spreading, Motilität und Phagozytose beteiligt sein könnten. Um die Kontrolle Zytoskelett-vermittelter Zellfunktionen nach TLR4 Aktivierung zu untersuchen, entwickelten wir zunächst eine Methode zur quantitativen Messung der Spreadingantwort von Knochenmarksmakrophagen nach LPS Stimulation. Die Visualisierung der Zellen sowie ihrer Kontaktfläche erfolgte hierbei mittels Fluoreszenzmikroskopie. Für eine schnelle, robuste und objektive Analyse der Fluoreszenzaufnahmen entwickelten und validierten wir in Kollaboration mit dem Fraunhofer Institut in Erlangen eine Software zur halbautomatischen Segmentierung und Quantifizierung der Kontaktfläche. Unter Verwendung dieser Methode konnte eine zeitabhängige LPS-induzierte Zunahme der Zellkontaktfläche beobachtet werden, die nach 1-2 Stunden detektierbar war und ein Maximum nach 24 Stunden erreichte. Durch den Einsatz pharmakologischer Inhibitoren sowie genetisch veränderter Zellen wurde anschließend der Einfluss bekannter TLR4-Signalwegkomponenten untersucht. Die genetische Defizienz des Adapterproteins MYD88 führte hierbei zu einer stark reduzierten Spreadingaktivität der Zellen während der späten LPS Stimulationsphase, wohingegen das initiale Spreading nicht beeinflusst wurde. Ein vergleichbarer Effekt konnte unter Verwendung eines pharmakologischen Inhibitors zur Hemmung des ERK1/2 Signalweges identifiziert werden. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass ERK1/2 für die Weiterleitung des MYD88 vermittelten Spreading notwendig ist. Im Gegensatz dazu wurde in p38-defizienten Makrophagen ein beeinträchtigtes initiales Spreading beobachtet, wohingegen das späte Spreading nach 8 – 24 Stunden nicht beeinflusst war. Die genetische Deletion der MAPK Phosphatasen DUSP1 und DUSP16 resultierte ebenfalls in einer Minderung des späten Spreadings, ebenfalls ein Hinweis auf die essentielle Rolle funktioneller MAPK Signalwege. Um die Beteiligung weiter Zytoskelett-Phosphoproteine am Zellspreading zu identifizieren, wurde die Expression ausgewählter Kandidatengene in primären Makrophagen mittels spezifischer siRNA unterdrückt und das Zellspreading mit Hilfe der entwickelten Software quantifiziert. Diese Versuche zeigten eine funktionelle Rolle der Myosine MYO1e und MYO1f. Diese Motorproteine weisen ebenfalls eine starke Phosphorylierung nach LPS Stimulation auf. Aufgrund ihrer Eigenschaft simultan mit Aktinfilamenten und Zellmembranen sowie anderen Proteinen zu interagieren, untersuchten wir ihre Rolle während der Phagozytose, Zytokinfreisetzung und Antigenpräsentation. Obwohl Myo1e defiziente Makrophagen keine Beeinträchtigung der Phagozytose oder Abtötung von Bakterien aufwiesen, spielte das Motorprotein eine wichtige Rolle in der Chemokinfreisetzung und Antigenpräsentation. Interessanterweise war die Sekretion des Chemokins MCP1 (CCL2) in Myo1e-defizienten Makrophagen und dendritischen Zellen (DC) selektiv erhöht, während die Zytokinfreisetzung unbeeinträchtigt war. Des Weiteren wiesen Myo1e KO Makrophagen und DC eine reduzierte MHC-II Oberflächen-Expression auf, obwohl die MHC-II als auch die CCL2 Transkription auf mRNA Ebene nicht beeinflusst war. Diese Daten legen nahe, dass MYO1e während des Transports bestimmter Chemokine, sowie von MHC-II zur Zelloberfläche eine wichtige Rolle spielt. Zudem zeigten Myo1e KO Makrophagen und DC in einem MHC-II-abhängigen Antigenpräsentationsassay eine abgeschwächte Fähigkeit zur Antigen-spezifischen T-Zell Aktivierung, was die funktionelle Relevanz der reduzierten Expression von MHC-II nahelegt. Zusammenfassend wurde in dieser Studie zunächst eine Methode zur quantitativen Bildanalyse entwickelt, welche eine unvoreingenommene, robuste und effiziente Untersuchung des Spreadings von Makrophagen erlaubte. Die Kombination dieser Methode mit dem spezifischen siRNA Knockdown ausgewählter Zytoskelett-assoziierter Phosphoproteine führte zur Identifizierung von MYO1e und MYO1f als wichtige Regulatoren dieser Zellfunktion. Darüber hinaus konnte in Makrophagen und DC eine essentielle Rolle für MYO1e im intrazellulären Transport von CCL2 und MHC-II an die Zelloberfläche identifiziert werden, sowie dessen Notwendigkeit für eine vollständige Aktivierung antigen-spezifischer CD4 T Zellen. KW - Toll-like-Rezeptoren KW - Makrophage KW - Phosphoproteine KW - Zellskelett KW - macrophage KW - cytoskeleton KW - phosphorylation KW - TLR4 Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-98843 ER - TY - THES A1 - Heydenreich, Nadine T1 - Studies on the contact-kinin system and macrophage activation in experimental focal cerebral ischemia T1 - Untersuchungen zum Kontakt-Kinin-System und zur Makrophagen-Aktivierung beim Experimentellen Schlaganfall N2 - Traditionally, ischemic stroke has been regarded as the mere consequence of cessation of cerebral blood flow, e.g. due to the thromboembolic occlusion of a major brain supplying vessel. However, the simple restoration of blood flow via thrombolysis and/or mechanical recanalization alone often does not guarantee a good functional outcome. It appears that secondary detrimental processes are triggered by hypoxia and reoxygenation, which are referred to as ischemia/reperfusion (I/R) injury. During recent years it became evident that, beside thrombosis inflammation and edema formation are key players in the pathophysiology of cerebral ischemia. The contact-kinin system represents an interface between thrombotic, inflammatory and edematous circuits. It connects the intrinsic coagulation pathway with the plasma kallikrein-kinin system (KKS) via coagulation factor FXII. The serine protease inhibitor C1-inhibitor (C1-INH) has a wide spectrum of inhibitory activities and counteracts activation of the contact-kinin system at multiple levels. The first part of the thesis aimed to multimodally interfere with infarct development by C1-INH and to analyze modes of actions of human plasma derived C1-INH Berinert® P in a murine model of focal cerebral ischemia. It was shown that C57BL/6 mice following early application of 15.0 units (U) C1-INH, but not 7.5 U developed reduced brain infarctions by ~60% and less neurological deficits in the model of transient occlusion of the middle cerebral artery (tMCAO). This protective effect was preserved at more advanced stages of infarction (day 7), without increasing the risk of intracerebral bleeding or affecting normal hemostasis. Less neurological deficits could also be observed with delayed C1-INH treatment, whereas no improvement was achieved in the model of permanent MCAO (pMCAO). Blood-brain-barrier (BBB) damage, inflammation and thrombosis were significantly improved following 15.0 U C1-INH application early after onset of ischemia. Based on its strong antiedematous, antiinflammatory and antithrombotic properties C1-INH constitutes a multifaceted therapeutic compound that protects from ischemic neurodegeneration in ‘clinically meaningful’ settings. The second part of the thesis addresses the still elusive functional role of macrophages in the early phase of stroke, especially the role of the macrophage-specific adhesion molecule sialoadhesin (Sn). For the first time, sialoadhesin null (Sn-/-) mice, homozygous deficient for Sn on macrophages were subjected to tMCAO to assess the clinical outcome. Neurological and motor function was significantly improved in Sn-/- mice on day 1 after ischemic stroke compared with wildtype (Sn+/+) animals. These clinical improvements were clearly detectable even on day 3 following tMCAO. Infarctions on day 1 were roughly the same size as in Sn+/+ mice and did not grow until day 3. No intracerebral bleeding could be detected at any time point of data acquisition. Twenty four hours after ischemia a strong induction of Sn was detectable in Sn+/+ mice, which was previously observed only on perivascular macrophages in the normal brain. Deletion of Sn on macrophages resulted in less disturbance of the BBB and a reduced number of CD11b+ (specific marker for macrophages/microglia) cells, which, however, was not associated with altered expression levels of inflammatory cytokines. To further analyze the function of macrophages following stroke this thesis took advantage of LysM-Cre+/-/IKK2-/- mice bearing a nuclear factor (NF)-ϰB activation defect in the myeloid lineage, including macrophages. Consequently, macrophages were not able to synthesize inflammatory cytokines under the control of NF-ϰB. Surprisingly, infarct sizes and neurological deficits upon tMCAO were roughly the same in conditional knockout mice and respective wildtype littermates. These findings provide evidence that macrophages do not contribute to tissue damage and neurological deficits, at least, not by release of inflammatory cytokines in the early phase of cerebral ischemia. In contrast, Sn which is initially expressed on perivascular macrophages and upregulated on macrophages/microglia within the parenchyma following stroke, influenced functional outcome. N2 - Der ischämische Schlaganfall wird traditionell als unmittelbare und „einfache“ Folge der Unterbrechung des Blutflusses zum Gehirn z.B. durch thromboembolische Gefäßverschlüsse gesehen. Häufig führt die alleinige Wiederherstellung des Blutflusses durch Lysetherapie bzw. mechanische Rekanalisation jedoch nicht zu einer Funktionserholung. Dies rückt sekundäre pathophysiologische Prozesse in den Fokus, die durch die Hypoxie und anschließende Wiederversorgung mit Sauerstoff angestoßen werden und zu einem sogenannten Reperfusionsschaden führen. In den letzten Jahren wurde klar, dass neben der Thrombenbildung Entzündungsprozesse und Hirnschwellung zentrale Bestandteile der Pathophysiologie von ischämischen Schlaganfällen sind, die über ein komplexes Netzwerk von Signalwegen eng miteinander verknüpft sind. An dieser Schnittstelle setzt die vorliegende Dissertation an. Das Kontakt-Kinin-System verbindet das plasmatische Kallikrein-Kinin-System (KKS), welches entzündliche und ödematöse Prozesse anstößt, über den Blutgerinnungsfaktor FXII mit dem intrinsischen Blutgerinnungsweg, der letztlich für die Thrombenbildung verantwortlich ist. Der endogene Serinprotease-Inhibitor C1-Inhibitor (C1-INH) besitzt ein breites Wirkungsspektrum und wirkt der Aktivierung des Kontakt-Kinin-Systems auf verschiedenen Ebenen entgegen. Ziel des ersten Teils der vorliegenden Dissertation war es, mittels C1-INH auf multimodale Weise ins Infarktgeschehen einzugreifen und die Wirkmechanismen des humanen C1-INH Berinert® P im Mausmodell nach fokaler zerebraler Ischämie zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass die frühe Behandlung von C57BL/6 Mäusen mit 15.0 Units (U) C1-INH im Modell der transienten Okklusion der Arteria cerebri media (tMCAO) eine drastische Reduzierung der Infarktvolumina um annähernd 60%, sowie deutlich weniger neurologische und funktionelle Defizite zur Folge hatte. Diese Schutzwirkung war auch im fortgeschrittenen Stadium (Tag 7) der Schlaganfallentwicklung zu beobachten, ohne das Risiko einer intrazerebralen Blutung zu erhöhen oder die normale Hämostase zu beeinflussen. Die Applikation von 7.5 U C1-INH hatte dagegen keinen Effekt. Ein wesentlich verbessertes neurologisches Verhalten konnte auch nach verzögerter Injektion von 15.0 U C1-INH erzielt werden. Im Gegensatz dazu bewirkte die Behandlung im Modell der permanenten MCAO (pMCAO) keine Verbesserung. Mechanistisch führte die Gabe von 15.0 U C1-INH zu einer deutlichen Stabilisierung der Bluthirnschranke und weniger Ödembildung. Darüber hinaus war die lokale Entzündungsreaktion nach C1-INH-Applikation abgeschwächt und es bildeten sich weniger Thromben in der zerebralen Mikrozirkulation. Basierend auf seiner vielfältigen antithrombotischen, antientzündlichen und antiödematösen Potenz stellt C1-INH einen vielversprechenden Ansatz zum Schutz vor ischämischer Neurodegeneration nach Schlaganfall unter ‚klinisch relevanten‘ Bedingungen dar. Der zweite Teil der Dissertation beschäftigt sich mit der bislang ungeklärten funktionellen Rolle von Makrophagen in der Frühphase nach Schlaganfall, speziell der Rolle des Makrophagen-spezifischen Signalmoleküls Sialoadhesin (Sn). Hierzu wurden erstmals Sialoadhesin-defiziente (Sn-/-) Mäuse, deren Makrophagen kein Sn exprimieren, der tMCAO unterzogen und die klinischen Folgen bewertet. Sn-/- Tiere zeigten verglichen mit Wildtypen (Sn+/+) verbesserte neurologische und motorische Funktionen an Tag 1 nach Schlaganfall. Diese Verbesserung war auch an Tag 3 nach Schlaganfall eindeutig nachweisbar. Die Infarkte an Tag 1 waren größenmäßig vergleichbar mit Sn+/+ Mäusen und nahmen bis Tag 3 nicht an Größe zu. Zu keinem Zeitpunkt wurde eine intrazerebrale Blutung beobachtet. 24 Stunden nach Schlaganfall kam es bei Sn+/+ Mäusen zu einer starken Induktion von Sn, welches im normalen Gehirn nur auf perivaskulären Makrophagen exprimiert wurde. Die Deletion von Sn auf Makrophagen wirkte einer Bluthirnschrankenstörung entgegen und hatte eine deutlich geringere Infiltration von CD11b+ (spezifischer Marker für Makrophagen/Mikroglia) Zellen ins ischämische Gewebe zur Folge. Dies war interessanterweise nicht mit einer Veränderung der Zytokinexpression verknüpft. Zur weiteren Untersuchung der Makrophagenrolle nach Schlaganfall wurde die Dissertation auf LysM-Cre+/-/IKK2-/- Mäuse ausgedehnt. Diese wiesen einen Makrophagen-spezifischen Defekt in der Aktivierung des Transkriptionsfaktors Nuklearfaktor (NF)-ϰB auf, und konnten folglich inflammatorische Zytokine unter der Transkriptionskontrolle von NF-ϰB nicht synthetisieren. Die Infarktgrößen und neurologischen Defizite der transgenen Tiere waren überraschenderweise vergleichbar mit wildtypischen Wurfgeschwistern. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Makrophagen zumindest nicht durch die Synthese von inflammatorischen Zytokinen zum Gewebeschaden und zu neurologischen Defiziten in der Frühphase nach Schlaganfall beitragen, während Sn, das initial nur auf perivaskulären Makrophagen exprimiert und später im ischämischen Parenchym auf Makrophagen/Mikroglia hochreguliert wird, Einfluss auf das funktionelle Outcome hatte. KW - Blut-Hirn-Schranke KW - Thrombose KW - Entzündung KW - Schlaganfall KW - Makrophage KW - C1-inibitor KW - Sialoadhesin KW - Contact-Kinin System KW - Ischämischer Schlaganfall KW - Bluthirnschranke Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-94534 ER - TY - THES A1 - Li, Xiang T1 - Molecular imaging of inflammation in atherosclerosis: Preclinical study in Apolipoprotein E-Deficient mice and preliminary evaluation in human using positron emission tomography T1 - Molekulare Bildgebung inflammatorischer Prozesse bei Atherosklerose: Präklinische Studie in Apolipoprotein-E Knockout-Mäusen sowie erste Evaluation humaner PET-Studien N2 - Motivation and Aim: Cardiovascular disease has been the leading cause of mortality and morbidity throughout the world. In developed countries, cardiovascular diseases are already responsible for a majority of deaths and will become the pre-eminent health problem worldwide (1,2). Rupture of atherosclerotic plaque accounts for approximately 70% of fatal acute myocardial infarction and sudden heart deaths. Conventional criterias for the diagnosis of “vulnerable plaques” are calcified nodules, yellow appearance of plaque, a thin cap, a large lipid core, severe luminal stenosis, intraplaque hemorrhage, inflammation, thrombogenicity, and plaque injury (3-5). Noninvasive diagnosis of vulnerable plaque still remains a great challenge and a huge research prospect, which triggered us to investigate the feasibility of PET imaging on the evaluation of atherosclerosis. Nuclear imaging of atherosclerosis， especially co-registered imaging modalities, could provide a promising diagnostic tool including both anatomy and activities to identify vulnerable atherosclerotic plaque or early detection of inflammatory endothelium at risk. Furthermore, the development of specific imaging tracers for clinical applications is also a challenging task. The aim of this work was to assess the potential of novel PET imaging probes associated with intra-plaque inflammation on animal models and in human respectively. Methods In this work, several molecular imaging modalities were employed for evaluation of atherosclerosis. They included Positron emission tomography / Computed tomography (PET/CT) for human studies, and micro-PET, autoradiography and high-resolution magnetic resonance imaging (MRI) for animal studies. Radiotracers for PET imaging included the glucose analogue 18F-Fluorodeoxyglucose (18F-FDG), the somatostatin receptor avide tracer 68Ga-DOTATATE, and the Gallium-68 labeled fucoidan (68Ga-Fucoidan), which was developed as a PET tracer to detect endothelial P-selectin, which overexpressed at early stage of atherosclerosis and endothelial overlying activated plaque. Tracer’s capabilities were firstly assessed on cellular level in vitro. Subsequently, Animal studies were conducted in two animal models: 1, Apolipoprotein E (ApoE-/-) mice having severe atherosclerotic plaque; 2, Lipopolysaccharide (LPS) -induced mice for receiving acute vascular inflammation. Corresponding analyses on protein and histological level were conducted as well to confirm our results. In human study, 16 patients with neuroendocrine tumors (NETs) were investigated on imaging vascular inflammation. These patients had undergone both 68Ga-DOTATATE PET/CT and 18F-FDG PET/CT for staging or restaging within 6 weeks. 16 patients were randomized into two groups: high-risk group and low-risk group. Uptake ratio of both tracers from two groups were compared and correlated with common cardiovascular risk factors. Results and Conclusion In murine study, the expression of somatostatin receptor 2, which is the main bio-target of 68Ga-DOTATATE on macrophage/monocyte was confirmed by flow cytometry and immunohistochemistry. Prospectively, high specific accumulation of 68Ga-DOTATATE to the macrophage within the plaques was observed in aorta lesions by autoradiography and by micro-PET. In study with 68Ga-fucoidan, a strong expression of P-selectin on active endothelium overlying on inflamed plaque but weaker on inactive plaques was confirmed. Specific focal uptake of 68Ga-fucoidan were detected at aorta segments by micro-PET, and correlated with high-resolution magnetic resonance imaging (MRI), which was used to characterize the morphology of plaques. 68Ga-fucoidan also showed a greater affinity to active inflamed plaque in comparison of inactive fibrous plaque, which was assessed by autoradiography. Specificity of 68Ga-DOTATATE and 68Ga-fucoidan were confirmed by ex-vivo blocking autoradiography and in vivo blocking PET imaging respectively. In human study, focal uptake of both 18F-FDG and 68Ga-DOTATATE was detected. Analyzing concordance of two tracers’ uptake ratio, Out of the 37 sites with highest focal 68Ga-DOTATATE uptake, 16 (43.2%) also had focal 18F-FDG uptake. Of 39 sites with highest 18F-FDG uptake, only 11 (28.2%) had a colocalized 68Ga-DOTATATE accumulation. Correlated tracers’ uptake and calcium burden and risk factors, Mean target-to-background ratio (TBR) of 68Ga-DOTATATE correlated significantly with the presence of calcified plaques (r=0.52), hypertension (r=0.60), age (r=0.56) and uptake of 18F-FDG (r=0.64). TBRmean of 18F-FDG correlated significantly only with hypertension (r=0.58; p<0.05). Additionally, TBRmean of 68Ga-DOTATATE is significant higher in the high risk group while TBRmean of 18F-FDG is not. In conclusion, we evaluated vascular inflammation of atherosclerosis non-invasively using the two PET tracers: 68Ga-DOTATATE and 68Ga-Fucoidan. 68Ga-DOTATATE show specific affinity to infiltrated macrophage within the plaques. 68Ga-Fucoidan may hold the potential to discriminate between active and inactive atherosclerotic plaques in terms of variant accumulation on different-types of plaques. PET as leading molecular imaging technique provides superiority in assessing cellular activity, which is pivotal for understanding internal activity of atherosclerotic plaques. Since diagnosis of atherosclerosis is a complex and multi-dimensional task. More integrated imaging technology such as PET/MRI, faster imaging algorithm, more efficient radiotracer are required for further development of atherosclerosis imaging, N2 - Ziel: Kardiovaskuläre Erkrankungen stellen die häufigste Todesursache der westlichen Industrieländer dar und führen zu einem zunehmenden Gesundheitsproblem weltweit. (1,2). Ca. 70 % aller akuten Myocardinfarkte sind auf die Ruptur atherosklerotischer Plaques zurück zuführen, deren typische Charakteristika ein kalzifizierter, lipidhaltiger Kern, überzogen von einer dünnen fibrösen Kappe, darstellt. Innerhalb der atherosklerotischer Plaques kommt es zu Makrophageneinlagerung und im weiteren Verlauf zu entzündlichen und angiogentischen Prozesse, die zu Einblutungen führen und die Instabilität der Plaques zur Folge hat (3-5). Die nichtinvasive Diagnostik rupturgefährdeter Plaques stellt immer noch eine große medizinische Herausforderung dar. Die nuklearmedizinische Bildgebung, kombiniert mit MRT/CT zur anatomischen Co-Registrierung, könnte eine verbesserte diagnostische Methode zur Darstellung rupturgefährdeter atherosklerotischen Plaques und frühzeitiger entzündlicher Prozesse darstellen. Ziel dieser Arbeit war es daher, atherosklerosische Plaques mittels Positronen¬emissions¬tomografie (PET) unter Verwendung neuer PET Tracer für die Darstellung von Entzündungs¬prozesse im Tiermodell und der humanen Anwendung zu untersuchen. Material und Methoden: Im Rahmen dieser Arbeit kamen verschiedene bildgebende Verfahren zur Anwendung. Im Einzelnen waren dies PET/CT bei humanen Studien sowie micro-PET, Autoradiografie und hochauflösende Magnetresonanztomografie (MRT) bei Untersuchungen im Tiermodell. Als PET-Tracer wurden das Glukosederivat 18F-Flurodesoxyglukose (18F-FDG), 68Ga-DOTATATE, das an Somatostatin-Rezeptoren bindet sowie Gallium-68 markiertes Fucoidan (68Ga-Fucoidan) verwendet. Bei 68Ga-Fucoidan handelt es sich um einen neu entwickelten PET-Tracer zur Darstellung von P-Selectin, welches an aktivieren Plaques im frühen Stadium der Atherosklerose überexprimiert wird. Die Untersuchungen im Tiermodell fanden sowohl an Apolipoprotein E Knockout-Mäusen (ApoE-/-) als auch an Lipopolysaccharid- (LPS) induzierten Mäusen statt. Des Weiteren wurden uptake-Untersuchungen auf in Zellkulturexperimenten durchgeführt. Zur Bestätigung der der Untersuchungsergebnisse wurden zusätzlich histochemische Untersuchungen durchgeführt. Im Rahmen der humanen Studien wurden 16 Patienten mit neuroendokrinenen Tumoren (NET) hinsichtlich vaskulärer Entzündungsprozesse untersucht. Alle Patienten erhielten ein 68Ga-DOTATATE PET/CT und 18F-FDG PET/CT zum Staging bzw. Restaging innerhalb von 6 Wochen. Die Einteilung der Patienten erfolgte in zwei Gruppen: hohes Risiko und geringes Risiko. Die uptake-Verhältnisse beider Tracer in beiden Gruppen wurden mit einander verglichen und hinsichtlich bekannter cardiocaskulärer Risikofaktoren in Beziehung gesetzt. Ergebnisse und Zusammenfassung: Die Expression der Somatostatin-Rezeptor Subtyps 2, an den 68Ga-DOTATATE an Makrophagen/Monocyten bindet, konnte mittels flow cytometrischer und immunhistochemischer Experimente im Mausmodell bestätigt werden. Mit Hilfe von micro-PET Untersuchungen und Autoradiografie wurde eine hohe spezifische Anreicherung von 68Ga-DOTATATE an Makrophagen innerhalb der Plaques beobachtet.Im Rahmen der Untersuchungen mit 68Ga-Fucoidan konnte eine hohe P-Selectin-Expression an aktiviertem Endothelium, welches die entzündlichen Plaques überlagert festgestellt werden. Bei inaktiven Plaques hingegen zeigte sich eine geringe P-Selectin-Expression. In micro-PET-Studien konnte ein spezifischer fokaler uptake von 68Ga-Fucoidan in der Aorta nachgewiesen werden. Dieser korrelierte mit den zusätzlich durchgeführten MRT-Unter¬suchungen zur Charakterisierung der Plaquemorphologie. Mittels Autoradiografie konnte nachgewiesen werden, dass 68Ga-Fucoidan eine höhere Affinität zu aktivierten entzündlichen Plaques im Vergleich zu inaktivieren fibrösen Plaques zeigt. Die spezifische Bindung von 68Ga-DOTATATE und 68Ga-Fucoidan wurde über Blockadeexperimente mittels Autoradiografie und PET bestätigt. In der humanen Anwendung wurde ein fokaler uptake von 18F-FDG und 68Ga-DOTATATE detektiert. Die Analyse der Übereinstimmung des uptakes beider Tracer ergab: Von 37 spots mit hohem 68Ga-DOTATATE-uptake zeigten 16 (43,2 %) ebenfalls einen fokalen 18F-FDG -uptake. Von 39 spots mit hohem 18F-FDG -uptake zeigten nur 11(28,2%) eine 68Ga-DOTATATE-Anreicherung. Betrachtet man den Tracer-uptake hinsichtlich des Calcium-burden und weiterer Risikofakoren, so ergeben sich folgende Korrelationskoeffizienten: TBRmean of 68Ga-DOTATATE korreliert signifikant mit der Anwesenheit von kalzifizierten Plaques (r=0,52), Blutdruck (r=0,60), Alter (r=0,56) und 18F-FDG uptake (r=0,64). Eine signifikante Korrelation von TBRmean 18F-FDG konnte lediglich beim Risikofaktor Blutdruck (r=0,58, p<0,05) festgestellt werden. Weiterhin zeigte sich, dass der TBRmean von Ga-DOTATATE in der Hoch-Risiko-Gruppe signifikant höher, dies gilt jedoch nicht für TBRmean 18F-FDG. Zusammenfassung: In dieser Arbeit wurden die vaskulären Entzündungsprozessen der Atherosklerose mittels der nichtinvasiven PET unter Verwendung von 68Ga-DOTATATE und 68Ga-Fucoidan untersucht und bewertet. 68Ga-DOTATATE zeigte eine spezifische Affinität zu Makrophagen innerhalb der atherosklerotischen Plaques. Mit 68Ga-Fucoidan konnt zwischen aktiven und inaktiven Plaques unterschieden werden. Die molekulare Bildgebung mittels PET eignet sich hervorragend zur Darstellung und Untersuchung molekularer Prozesse innerhalb atheroskerotischer Plaques. Dennoch sind weiterführende Technologien wie PET/MR, schnellere Algorithmen, hoch spezifische Radiotracer zur Weiterentwicklung der PET-Bildgebung atherosklerotischer Plaques notwendig. KW - Arteriosklerose KW - Entzündung KW - Makrophage KW - Positronen-Emissions-Tomographie KW - Non-invasive imaging KW - Atherosclerosis KW - PET KW - Nuclear imaging KW - Inflammation KW - Positron emission tomography KW - Vulnerable plaque KW - Macrophage Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-104622 ER - TY - JOUR A1 - Dickneite, G. A1 - Schorlemmer, H. U. A1 - Sedlacek, H. H. A1 - Falk, W. A1 - Ulrichs, Karin A1 - Müller-Ruchholtz, W. T1 - Suppression of macrophage function and prolongation of graft survival by the new guanidinic-like structure, 15-deoxyspergualin N2 - No abstract available. KW - Makrophage Y1 - 1987 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-86991 ER - TY - THES A1 - Patzkó, Ágnes T1 - CSF-1 receptor as a target for the treatment of Charcot-Marie-Tooth disease 1 T1 - CSF-1 Rezeptor als Target für die Behandlung der Charcot-Marie-Tooth Krankheit Typ 1 N2 - Previous studies by our group revealed that chronic low grade inflammation implicating phagocytosing macrophages is a highly relevant mechanism in the pathogenesis of Charcot-Marie-Tooth disease. The lack of CSF-1, the primary regulator of macrophage function and survival, led to a robust and persistent amelioration of the phenotype in two authentic mouse models of CMT. Moreover, a close contact between CSF-1 producing fibroblasts and endoneurial macrophages carrying CSF-1R has been confirmed in nerve biopsies of CMT patients, further supporting the clinical significance of this pathway. In the current study we treated 3 distinct mouse models of CMT1: the PMP22tg mice as a model for CMT1A, the P0+/- mice as a model for CMT1B and the Cx32def mice as a model for CMT1X, with a CSF-1R specific kinase (c-FMS) inhibitor (800-1200 mg PLX5622/ kg chow) according to different treatment regimes mimicking an ideal early onset treatment, a late onset treatment and the withdrawal of the drug. Using the above mentioned doses of PLX5622, we documented a dramatic decrease in macrophage numbers in the PNS of all 3 myelin mutants, except for the quadriceps nerve of Cx32def mice. Fibroblast numbers remained unchanged in treated animals. Surprisingly, in spite of the decrease in the number of detrimental macrophages we could not detect an unequivocal phenotypic improvement. CMAP amplitudes were reduced in both wild type and myelin mutant mice treated with CSF-1R inhibitor in comparison to untreated littermates. Corresponding to the electrophysiological findings, the axon number and the percentage of large diameter axons were reduced in the quadriceps nerve of treated P0+/- and Cx32def mice. By contrast we observed a higher number of fully myelinated axons, in parallel with a decrease in the percentage of demyelinated (and hypermyelinated in PMP22tg mice) fibers in the ventral roots of P0+/- mice treated with CSF-1R inhibitor from 3 months up to 6 months of age and PMP22tg animals treated from 9 months up to 15 months of age. Our results indicate that CSF-1R inhibitor has the potential to improve the demyelinating phenotype of at least two models of CMT1. Nevertheless, further studies are necessary (for example with lower doses of the inhibitor) to minimize or even eliminate the putative neurotoxic effect we observed with high dose treatment conditions. N2 - Vorhergehende Studien unserer Gruppe haben gezeigt, dass eine niedriggradige Entzündung, die von phagozytierenden Makrophagen ausgeht, von ausserordentlicher Bedeutung für die Pathogenese der Charcot-Marie-Tooth Krankheit ist. In Abwesenheit von CSF-1, des primären Regulators für Funktion und Überleben von Makrophagen, trat eine stabile und dauerhafte Verbesserung des Phänotyps in den zwei etablierten CMT Mausmodellen auf. Darüber hinaus konnte ein enger Kontakt zwischen CSF-1-produzierenden Fibroblasten und Makrophagen, die den zugehörigen Rezeptor CSF-1Rexprimieren, in Nervbiopsien von CMT Patienten bestätigt werden, was die klinische Relevanz dieses Mechanismus weiter verdeutlicht. In der aktuellen Studie wurden drei verschiedene CMT1 Mausmodelle, PMP22tg Mäuse als Modell für CMT1A, P0+/- Mäuse als Modell für CMT1B und Cx32-defiziente Mäuse als Modell für CMT1X, mit einem Inhibitor der CSF-1R spezifischen Kinase (c-FMS) (800-1200 mg PLX5622/kg Futter) behandelt. Der Inhibitor wurde gemäß den verschiedenen Behandlungsmethoden eingesetzt, um den Verlauf eineridealerweise frühzeitigen und einer spät-beginnenden Behandlung und des Entzug des Medikaments zu imitieren. Nach der Behandlung mit PLX5622 konnten wir im PNS aller drei Myelin-Mutanten, mit Ausnahme des N. quadriceps von Cx32-defizienten Mäusen, einen drastischen Rückgang der Makrophagenanzahl feststellen. Die Anzahl der Fibroblasten blieb in den behandelten Tieren unverändert. Überraschenderweise konnten wir, trotz des Rückgangs der Anzahl an schädlichen Makrophagen, keine einheitliche Verbesserung des Phänotyps dokumentieren. CMAP Amplituden waren nach CSF-1R Inhibitor Behandlung sowohl in Wild-Typ Mäusenals auch in den Myelin-Mutanten geringer als in unbehandelten Kontrolltieren. Passend zu den elektrophysiologischen Ergebnissen war die Anzahl an Axonen und die Prozentzahl an großkalibrigen Axonen im N. quadriceps von behandelten P0+/- und Cx32-defizienten Mäusen reduziert.Im Gegensatz dazu war eine erhöhte Menge an normalmyelinisierten Axonen, mit einer gleichzeitigen Reduktiondemyelinisierter Fasern (und hypermyelinisierten in PMP22tg Mäusen) in den ventralen Spinalwurzeln von P0+/- Mäusen zu beobachten, die mit dem CSF-1R Inhibitor im Alter von 3 bis 6 Monaten behandelt worden waren sowie bei PMP22tg Mäusen, die im Alter von 9 bis 15 Monaten den Inhibitor erhalten hatten. Unsere Ergebnisse deuten an, dass der CSF-1R Inhibitor das Potential besitzt, zumindest in zwei Modellen von CMT1 den demyelinisierenden Phänotyp zu verbessern. Dennoch müssen weitere Studien durchgeführt werden (z.B. die Verwendung einer niedrigeren Dosis des Inhibitors), um den möglichen neurotoxischen Effekt, der bei oben genannten Behandlungsbedingungen zu beobachten war, zu minimieren oder ganz zu beheben. KW - Makrophage KW - Charcot-Marie-Tooth KW - Charcot-Marie-Tooth disease KW - Myelin KW - CSF-1 Rezeptor KW - Neuropathie KW - macrophage KW - CSF-1 receptor KW - neuropathy KW - myelin Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85325 ER - TY - THES A1 - Hausmann, Michael Franz Toni T1 - Untersuchungen zum Differenzierungspotential humaner Monozyten / Makrophagen in vitro T1 - A study: The Potential of human monocyte / macrophage-differentiation in vitro N2 - Unter dem Einfluss von M-CSF und GM-CSF entwickeln sich CD14-positive periphere humane Blutmonozyten zu CD68-positiven M-CSF- bzw. GM-CSF-Makrophagen. M-CSF-Makrophagen lassen sich mit INFg und LPS zu klassisch aktivierten M1-Makrophagen, oder mit IL-4 und IL-10 zu alternativ aktivierten M2-Makrophagen differenzieren. Durch GM-CSF werden aus Monozyten GM-CSF-Makrophagen induziert. Im Gegensatz zu M1-Makrophagen sind GM1-Makrophagen bisher noch wenig untersucht. Mit INFg und LPS werden GM-CSF-Makrophagen zu GM1-Makrophagen aktivert. In der vorliegenden Arbeit wurde überprüft, wie groß die Übereinstimmung zwischen M-CSF- und M2-Makrophagen sowie zwischen GM-CSF- und M1-Makrophagen / GM1-Makrophagen ist. Im Gegensatz zu M-CSF- und GM-CSF stellt Laktat aber keinen Differenzierungsfaktor für Monozyten dar. Jedoch beeinflusst Laktat den Phänotyp von M2-Makrophagen und hemmt die Ausschüttung von IL-12 und NO durch M1- und GM1-Makrophagen. N2 - In the presence of M-CSF and GM-CSF CD14-positive human blood monocytes develop into CD68-pos M-CSF- or GM-CSF-macrophages. M-CSF-macrophages differentiate when incubated with INFg and LPS to classicly activated M1-marophages, when incubated with IL-4 and IL-10 zu alternativly activated M2-macrophages. Monocytes presented to GM-CSF eventually become GM-CSF-macrophages. There are only few examinations of GM-CSF-macrophages and classicly activated GM1-macrophages compared to M1-macrophages. In this study we focused on comparing the non-activated M-CSF-macrophages to alternativly activated M2-macrophages and non-activated GM-CSF-macrophages to classicly activated GM1-macrophages/M1-macrophages. Furthermore we point out that lactate is not a potential differentiation-signal für monocytes. But lactate does infact interfere with certain macrophage-phenotypes and the secretion of proinflammatory IL-12 and NO-molecules. KW - Differenzierung KW - Makrophage KW - Monozyt KW - Mensch KW - Zellkultur KW - differentiation KW - macrophage KW - monocyte KW - human KW - in-vitro Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77801 ER - TY - THES A1 - Bremicker, Johannes T1 - T2/T2*-Messung an VSOP-gelabelten Makrophagen und Sensitivität der Preußisch-Blau-Färbung T1 - T2/T2*-Measurements of VSOP-labeled Makrophages and Sensitivity of Prussian-Blue-Staining N2 - Zielsetzung: Diese Arbeit untersuchte die Beziehung zwischen intrazellulärem Eisengehalt (pgFe/Zelle) und der Fähigkeit der Histochemie und des MRT, in vitro mit Eisenoxidnanopartikel gelabelte Zellen zu detektieren. Methoden: Immortalisierte murine Peritonealmakrophagen wurden mit Very Small Iron Oxide Nanoparticles (VSOP) in aufsteigenden Konzentrationen (n=10) von 0 bis 200 µg/ml für 4 Stunden inkubiert. Die MRT-Messungen wurden an einem 7-Tesla Bruker Biospec durchgeführt. Für jedes Label-Protokoll wurden Objektträgerproben (n=6) mit den Zellen angefertigt und mit der PB-, DAB-PB- und AgAu-DAB-PB-Färbung gefärbt. Es wurde der prozentuale Anteil der sichtbar gefärbten Zellen ermittelt. Über ICP-MS bestimmten wir den intrazellulären Eisengehalt und TEM-Aufnahmen bestätigten den vesikulären Uptake von VSOP. Zusätzlich wurde der Einfluss der Zelldichte auf MR-Detektionsgrenzen an identisch gelabelten Zellen zwischen 2x10^5 und 8x10^6 Zellen/0,5ml zwischen nierigen (0,22 pgFe/Zelle) und hohen (3,81pgFe/Zelle) Eisenbeladungen untersucht. Ergebnisse: Der intrazelluläre Eisengehalt reichte von 0.12 bis 12.25 pgFe/Zelle. Die Histochemie zeigte einen höheren Prozentsatz an eisen-positiven Zellen mit steigendem Eisengehalt. Das Enhancement der Preußisch Blau Färbung(PB) mit Diaminobenzidin (DAB) und einer modifizierten AgAu-DAB Färbung führte zu einer höheren Sensitivität für intrazelluläres Eisen (>50% gefärbte Zellen bei 1,3 pgFe/Zelle versus 1,6 pgFe/Zelle) als die Preußisch Blau Färbung selbst (2,2 pgFe/Zelle). Jedoch zeigten beide Färbungen bei einem Eisengehalt unter 0,7 pgFe/Zelle weniger als 25% eisenpositive Zellen. Die T2 und T2* verkürzenden Effekte von VSOP zeigten eine positive Korrelation zur intrazellulären Eisenbeladung und zur Zelldichte. Selbst bei 0.26 pgFe/Zelle war eine sichtbare Änderung der Relaxationsraten sichtbar. Schlussfolgerung: Diese Arbeit zeigte, dass in MRT-Messungen selbst kleinste Mengen an intrazellulärem VSOP nachgewiesen werden können, welche in der Histochemie noch nicht nachgewiesen werden können. Es wurde ebenso gezeigt, dass positive Korrelationen zwischen der Zelldichte, dem intrazellulären Eisengehalt und der T2/T2*-Relaxationsraten bestehen. N2 - Purpose: This work investigated the relation between intracellular iron content (pgFe/cell) and the capability of histochemistry and MRI to detect in vitro iron-oxide-nanoparticles labeled cells. Methods: Immortalized peritoneal mouse macrophages were incubated with Very Small Iron Oxide Nanoparticles (VSOP) at increasing concentrations (n=10) ranging from 0 to 200 μg/ml for 4 hours. MR relaxometry was performed on a 7 Tesla Bruker Biospec. Histological slides (n=6) were prepared from cells of each labeling-protocol for PB-, DAB-PB- and AgAu-DAB-PB-staining and the percentage of apparently stained cells was recorded. ICP-MS was used to determine intracellular iron content and TEM images confirmed vesicular uptake of VSOPs. Additionally, the impact of cell densitiy on MR detection limits was investigated on 2x10^5 to 8x10^6 identically prepared cells per 0.5 ml with low (0.22 pgFe/cell) and high (3.81 pgFe/cell) iron content. Results: Intracellular iron content after cell labeling ranged form 0.12 to 12.25 pg/cell. Histological slides showed a higher percentage of iron-positive cells with increasing intracellular iron content. The enhancement of Prussian-blue (PB) by diaminobenzidine (DAB) and a modified AgAu-DAB staining lead to a higher sensitivity for intracellular iron (>50% stained cells at 1,3 pgFe/cell versus 1,6 pgFe/cell) than PB staining alone (2,2 pgFe/cell) . Nevertheless at iron contents below 0,7 pgFe/cell both staining methods showed less than 25% iron positive cells. The T2 and T2* shortening effects of VSOP were positively correlated with intracellular iron content and cell density. Even at 0.26 pg/cell a significant change of relaxation rates was observed. Conclusion: We have shown that MRI is able to detect even low amounts of intracellular VSOP that histochemistry might fail to detect. We also showed that there are positive correlations between cell density, intracellular iron content and T2/T2*-values. KW - Makrophage KW - Kontrastmittel KW - Berliner Blau KW - NMR-Tomographie KW - Sensitivität KW - Macrophages KW - Contrast agent KW - Prussian Blue KW - NMR-Tomography KW - Sensitivity Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72766 ER - TY - THES A1 - Schnitzer, Johannes K. T1 - Mechanism of dendritic cell-based vaccination against Leishmania major T1 - Mechanismus der auf dendritischen Zellen beruhenden Impfung gegen Leishmania major N2 - Die Impfung mittels Antigen-beladener dendritischer Zellen [DZ] ist mittlerweile eine gut etablierte Technik, die dann zum Einsatz kommt, wenn Standard-Impftechniken versagen, vor Krankheiten zu schützen beziehungsweise diese zu heilen. Die Effizienz dieser Technik konnte bereits für diverse Infektionskrankheiten und Krebserkrankungen in experimentellen Tiermodellen sowie am Menschen gezeigt werden. Hierbei ist die Möglichkeit zur wohldefinierten Manipulation und Antigenbeladung der DZ ein großer Vorteil gegenüber den konventionellen Ansätzen. Jedoch ist vor allem bei der Anwendung im klinischen Bereich die Präparation, Herstellung und Manipulation dieser autologen DZ mit einem erheblichen technischen, zeitlichen sowie finanziellen Aufwand verbunden. Hinsichtlich einer Präventivimpfung gegen eine pandemische Infektionskrankheit, die in hauptsächlich unterentwickelten Ländern vorkommt, wird dieser Aufwand sicherlich ein Hindernis darstellen. Daher muss für solche Fälle ein maßgeschneiderter Impfstoff entwickelt werden, der sich am Vorbild des effektiven DZ-basierten Impfstoffs orientiert. Für die Impfung gegen die Leishmania Parasiten besteht so ein DZ-basierter Impfstoff bereits. Dessen Wirkung, eine T-Zell Antwort vom Typ Th1 zu induzieren, wurde bereits in mehreren Veröffentlichungen demonstriert. Zusätzlich hat aber eine unserer Studien gezeigt, dass das typische Th1-bezogene Zytokin IL-12 zur Differenzierung naiver T-Zellen nicht von den injizierten DZ bereitgestellt werden muss, sondern von der geimpften Maus. Dies gab erste Hinweise auf eine stärkere Beteiligung des Wirts-Immunsystems als zuvor angenommen. Daher sollte hier vertieft der Mechanismus dieser DZ-basierten Impfung untersucht werden, wobei modifizierte Impfstoff-Ansätze zum Einsatz kommen sollten. Dabei wurden die Fragen nach der vom Impfstoff transportierten Information und dem Empfänger dieser Information berücksichtigt. Das aktuelle Paradigma zur DZ-basierten Impfung besagt, dass transferierte DZ im direkten Kontakt mittels dreier Signale T-Zellen stimulieren und aktivieren. Dafür müssen diese DZ mit dem entsprechenden Antigen beladen und aktiviert worden sein um das Antigen-Peptide mittels MHC Molekül im Kontext der Co-Stimulation präsentieren zu können. Jedoch zeigt diese Studie hier, dass weder eine Aktivierung der DZ noch die Präsentation des Antigens mittels passender MHC Moleküle notwendig ist für die Induktion einer protektiven Immunantwort gegen Leishmania Parasiten. Aufgeschlossene, mit Antigen beladene DZ müssen nicht vor dem Transfer mit CpG ODN aktiviert worden sein, um entsprechende Immunität zu verleihen. Ebenso hat der MHC Typ in diesem Falle auch keinen Einfluss auf die Effektivität des Impfstoffs. Da im Weiteren aufgeschlossene mit Leishmania-Antigen beladene Makrophagen nach Impfung die gleiche Wirkung erzielen, wie vorangegangene DZ-basierte Impfstoffe, können keine DZ spezifischen Mechanismen Schlüsselkomponenten der Induktion einer protektiven Immunität sein. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die DZ der geimpften Mäuse, eine maßgebliche Rolle bei der Verarbeitung transferierter Signale spielen. Suspensionen aufgeschlossener DZ stellen eine Kombination aus freigesetzten löslichen Molekülen sowie Membranvesikeln dar, die sich nach dem Aufschluss gebildet haben. Nach Auftrennung dieser beiden Fraktionen konnte gezeigt werden, dass ausschließlich die Membran-Fraktion nach Verimpfung eine geeignete Immunantwort zum Schutz vor Leishmania Parasiten induzieren kann. Als Vorteil dieser Aufreinigung erweist sich zudem die stabile Lagermöglichkeit bei -80°C. Somit ist klar gezeigt, dass die Immunität-verleihende Einheit dieser Impfstoffvarianten in der Membran-Fraktion liegt. Verfolgt man die Induktion Th1-zugehöriger Zytokine in in vivo Experimenten so ergibt sich im Falle der Gesamtsuspension aufgeschlossener, mit Leishmania-Antigen beladener DZ ein klares Bild. Diese Suspension erzeugt das volle Spektrum der DZ-basierten Impfung gegen Leishmania Parasiten. Es kann sowohl Produktion von IL-12 und IL-2 als auch eine antigenspezifische T-Zell Proliferation nach Stimulation von Splenozyten mit der entsprechenden Suspension verzeichnet werden. Außerdem produzieren Splenozyten von entsprechend geimpften Mäusen nach Stimulation mit Leishmania-Antigen erhebliche Mengen des entscheidenden Zytokins IFNγ. Obwohl jedoch die Verimpfung aufgereinigter Membranvesikel dieses Ansatzes im Tierversuch zu biologisch sowie statistisch signifikanten Ergebnissen führt, lassen sich die entsprechend Th1-bezogenen Zytokine im in vivo Ansatz nur in geringen Maße nachweisen. Ob dies jedoch für einen in vivo unbemerkten Aktivitätsverlust des Vakzins oder für andere lymphatische Organe als Ort der T-Zell Instruktion spricht, ist noch unbekannt und muss noch geklärt werden. N2 - Dendritic cell-based vaccination is a well established technique for preventive and therapeutic instruction of the immune system where conservative vaccine formulations fail to cure or prevent diseases, respectively. Efficiency of this technique already was demonstrated in infectious diseases as well as for cancer in animal or human studies. Well controlled manipulation and antigen-loading of immature DC is most beneficial to this technique. But, time-consuming and cost-extensive procedures for preparation of DC precursors, expansion and stimulation of DC and inpatient administration are big disadvantages regarding vaccine development for pandemic infectious diseases that occur mainly in underdeveloped countries. Therefore vaccines are needed that are pathogen-tailored and able to induce equal immune responses as their DC-based vaccine models. For vaccination against Leishmania parasites such a DC-based vaccine is feasible and its efficacy to induce protective Th1-based immune responses was already demonstrated in several animal studies. But, one of our own studies indicated supportive activity of host cells exceeding the allocation of T cells to become activated by transferred DC. IL-12, an important cytokine for the induction of Th1-related immune responses, has to be produced by host cells. Therefore, the aim of this study was to investigate the mechanism of BMDC-based vaccination with regard to simplification of the vaccine formulation. Key questions that have been addressed are: Which cells process the information that is transferred by the injected DC and what are the key components of this information? Further more, it was looked at whether altered vaccine formulations are able to induce protective immunity and whether they share equal molecular mechanisms. The current paradigm of BMDC-based vaccination proposes direct interaction of transferred BMDC with host T cells. These BMDC have to be antigen-loaded for stimulation via antigen-peptide-MHC molecule-complexes and they have to be activated for proper co-stimulation of T cells. Here, this study demonstrates that neither activation for co-stimulation nor direct interaction with adequate MHC molecules is needed for the induction of protective immunity against infection with Leishmania-parasites. Disrupted antigen-loaded BMDC are able to induce protective immunity in BALB/c mice without pre-stimulation via CpG ODN. Beyond, if BMDC were used with a different MHC-background than recipient mice then the vaccine still would be efficient in terms of reduction of footpad swelling and parasite load in draining lymph nodes. Even more, DC-specific features are no key component that leads to protective immunity as vaccination with disrupted antigen-loaded MΦ shows equal properties than before mentioned vaccine formulations. Further more, it was found that host DC play a major role in transforming the incoming signal, received from transferred antigen-loaded DC, into Th1-related stimuli and Leishmania-antigen-specific T cell activation. Suspensions of disrupted antigen-loaded DC resemble a combination of laid off soluble molecules together with exosome-like vesicles that formed after disruption of membranes. Here it was shown that separation of the membranous and soluble fractions and subsequent transfer into BALB/c mice will lead to protection of these mice against infection with L. major promastigotes only if the membranous fraction is used as vaccine. More, this vaccine formulation takes advantage of easy storage at -80°C with no need of fresh production. This clearly demonstrates that the immunity-inducing principle of disrupted DC-based vaccination lies within the membrane enclosed fraction. On a molecular level, disrupted antigen-loaded DC induce Th1-related cytokines during vaccination and as response on pathogen encounter. In vivo assays revealed IL-12 production and antigen-specific T cell proliferation among splenocytes that were stimulated with disrupted antigen-loaded DC. Splenocytes of accordingly vaccinated mice produce tremendous amounts of IFNγ after stimulation with Leishmania parasites. In summary, disrupted antigen-loaded BMDC fulfil all characteristics of DC-based vaccination against Leishmania major. But, while purification of membranes of antigen-loaded DC and subsequent transfer to BALB/c mice leads to control of the disease in the animal model, only slight levels of Th1-related cytokines are seen in the in vivo assays. Whether this points towards a loss of vaccine activity on unseen levels or unknown sites where Th1-related immunity is induced by both, complete solution and purified membranes, still has to be determined. KW - Leishmania major KW - Immunsystem KW - Impfung KW - Dendritische Zelle KW - Makrophage KW - Interferon KW - Interleukin 12 KW - Leishmania KW - Immunologie KW - Dendritic cell Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74865 ER - TY - THES A1 - Mertens, Christina T1 - Phänotypische und funktionelle Charakterisierung von Alveolarmakrophagen der Ratte T1 - Phenotypic and functional characterisation of alveolar macrophages of the rat N2 - Makrophagen spielen als Zellen der angeborenen Abwehr eine wichtige Rolle bei der Immunabwehr. Ziel dieser Arbeit war die phänotypische und funktionelle Charakterisierung von Alveolarmakrophagen der Ratte. Hierzu wurden die durch eine bronchoalveoläre Lavage gewonnenen Alveolarmakrophagen immunhistologisch und durchflusszytometrisch untersucht. Zusätzlich wurden sie in vitro mit LPS und IFN-g stimuliert. Die Produktion von Stickstoffmonoxid wurde mit dem Griess Reagenz bestimmt und die Expression von iNOS im Immunoblot nachgewiesen. Zudem wurde die Interaktion mit naiven T-Lymphozyten untersucht. Als Vergleichszellen wurden Peritonealmakrophagen verwendet. Bei den aus bronchoalveolären Lavagen gewonnenen Zellen handelte es sich eindeutig um CD68- und CD11b-positive Alveolarmakrophagen. Vollständig aktivierte Alveolarmakrophagen exprimierten zum Teil andere Oberflächenmoleküle als nicht-aktivierte. So stieg nach Stimulierung der Anteil der Makrophagen, die die kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86 exprimierten, auf ca. 80 Prozent an. Ebenso bildeten sie große Mengen an Stickstoffmonoxid (380 μmol/L NO nach 48 Stunden bei 1 μg/mL LPS) und exprimierten auch das Enzym iNOS. Die aktivierten Alveolarmakrophagen waren nicht in der Lage, naive T-Lymphozyten zu aktivieren. Die Stimulierung der Alveolarmakrophagen in vitro hat gezeigt, dass LPS und IFN-g in den getesteten Konzentrationen in der Lage waren, Makrophagen vollständig zu aktivieren. Die zweistufige Aktivierung von Makrophagen durch ein Priming mit IFN-g und eine darauf folgende vollständige Aktivierung mit LPS, ist bei hohen lokalen Konzentrationen auch nur mit LPS bzw. IFN- g möglich. Dies unterstreicht die besondere Bedeutung der beiden Mediatoren für die Aktivierung von Makrophagen. N2 - Macrophages play an important role as cells of the innate immune system. The functional and phenotypic characterisation of alveolar macrophages of the rat was the purpose of this dissertation. Alveolar macrophages, extracted by bronchoalveolar lavage, were studied with immunohistologic and flow cytometric methods. In addition they were stimulated in vitro with LPS and IFN-. The production of nitrogenmonoxid was measured using the Griess Reagent System and the expression of iNOS was shown by immunoblotting. Further examinations of the interaction between alveolar macrophages and naive T lymphocytes were also performed. Peritoneal macrophages were used to perform a comparative analysis. The cells extracted by bronchoalveolar lavage are clearly alveolar macrophages (CD68 and CD11b in immunohistology almost 100 percent positive). The expression of surface proteins differed between completely activated alveolar macrophages and non-activated ones. After stimulation the amount of macrophages expressing the co-stimulatory molecules CD80 and CD86 rose up to 80 percent. Furthermore they were producing large amounts of nitrogenmonoxid (380 µmol/L NO after 48 hours with 1 µg/mL LPS) (see pictures 4.16 and 4.17) and were expressing the enzyme iNOS (picture 4.19) all of which cannot be observed for non-activated macrophages. Activated macrophages were not able to stimulate naïve T lymphocytes; explaining the absence of proliferation of T lymphocytes in MLR measurements. The in vitro stimulation of alveolar macrophages showed that LPS (125, 250, 1000 ng/mL) and IFN-g(250 ng/mL) were able to stimulate alveolar macrophages completely. The two-stage activation of macrophages utilizing IFN-gfor priming and a subsequently complete activation using LPS, is also possible using high concentrations of LPS or IFN-g alone. This points out the importance of the two mediators for the activation of macrophages. KW - Makrophage KW - Lunge KW - Ratte KW - Alveolar KW - Stimulation KW - Interferon KW - Immuncytochemie KW - Durchflusscytometrie KW - Alveolarmakrophagen KW - LPS KW - Lipopolysaccharid KW - macrophages KW - alveolar macrophages . rat . lung KW - stimulation Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69309 ER - TY - THES A1 - Sienerth, Arnold R. T1 - Regulation of anti-inflammatory cytokine IL-10 by the Polycomb Group Protein Bmi1 T1 - Regulation des anti-inflammatorischen Zytokines Il-10 durch das Polycomb Group Protein Bmi1 N2 - Macrophages are important effector cells of the innate and adaptive immune response and exert a wide variety of immunological functions which necessitates a high level of plasticity on the chromatin level. In response to pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) or inflammatory signals macrophages undergo a process of cellular activation which is associated with morphologic, functional and biochemical changes. Toll-like receptors (TLR) are able to sense many different PAMPs. TLR4 is an important sensor for lipopolysaccharide (LPS) which elicits a major portion of the host’s inflammatory response through the activation of many different signaling pathways such as the NF-κB and the MAPK protein kinase pathways RASRAF- MEK-ERK, p38 and JNK. Polycomb group (PcG) proteins are well known chromatin modifiers which function in large complexes and are required to maintain chromatin structure in a transcriptionally repressed state. It has previously been shown that the PcG protein Bmi1 is phosphorylated by 3pK, a downstream effector kinase of the MAPK protein kinase pathways RAS-RAF-MEK-ERK, p38 and JNK. In this work I analyzed the role of Bmi1 as a downstream effector of MAPK signaling during macrophage activation. Unexpectedly a rapid up-regulation on the Bmi1 protein level was observed in bone marrow derived macrophages (BMDMs) after LPS treatment. The Bmi1 induction was associated with transient protein phosphorylation that occured downstream of MAPK signaling. LPS treatment of BMDMs in the absence of Bmi1 resulted in a pronounced increase of IL-10 secretion. This secretion of the anti-inflammatory cytokine IL-10 was associated with increased IL-10 mRNA levels. Furthermore, siRNA mediated knock down of Bmi1 in J774A.1 macrophages also resulted in elevated IL-10 mRNA levels in response to LPS. ChIP analysis revealed that Bmi1 binds to throughout the il-10 locus. Alternative activation of wild type BMDMs via concomitant TLR4 and FcγR activation which triggers high IL-10 expression is paralleled by an attenuated Bmi1 protein expression. These results identify Bmi1 as a repressor of IL-10 expression during activation of macrophages. N2 - Makrophagen sind wichtige Effektorzellen der angeborenen und adaptiven Immunantwort und üben eine große Fülle von immunologischen Funktionen aus. Deshalb benötigen sie eine hohe Plastizität auf Chromatinebene. Als Antwort auf pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs) oder andere inflammatorische Signale machen Makrophagen einen zellulären Aktivierungsprozess durch, der mit morphologischen, funktionellen und biochemischen Veränderungen assoziiert ist. Toll-like Rezeptoren (TLR) sind fähig, solche PAMPs zu erkennen. Der TLR4 ist ein wichtiger Sensor für Lipopolysaccharid (LPS). LPS löst eine inflammatorische Antwort des Wirtes durch die Aktivierung vieler verschiedener Signalwege wie zum Beispiel des NF-κB Signalwegs und der MAPK Proteinkinasensignalwege RAS-RAFMEK- ERK, p38 und JNK aus. Polycomb Gruppen (PcG) Proteine arbeiten in großen Proteinkomplexen zusammen und werden benötigt, um das Chromatin in einem transkriptionell reprimierten Zustand beizubehalten. Es konnte gezeigt werden, dass das PcG Protein Bmi1 von 3pK, einer Effektorkinase der MAPK Proteinkinasensignalwege RAS-RAF-MEK-ERK, p38 und JNK, phosphoryliert wird. In meiner Doktorabeit analysierte ich die Rolle von Bmi1 als downstream-Effektor der MAPKSignaltransduktion während der Makrophagenaktivierung. Es wurde unerwarteterweise eine schnelle Induktion von Bmi1 auf Proteinebene in Knochenmarks-Makrophagen (BMDMs) beobachtet. Diese Induktion war MAPK-abhängig und mit einer transienten Proteinphosphorylierung assoziiert. Die LPS-Behandlung der BMDMs in Abwesenheit von Bmi1 hatte erhöhte IL-10 Sekretion zur Folge. Diese erhöhte Sekretion des antiinflammatorischen Zytokines IL-10 war mit erhöhten IL-10 mRNA Expression verbunden. Des Weiteren hatte ein Bmi1 siRNA-vermittelter Gen-Knockdown in J774A.1 Makrophagen eine erhöhte IL-10 mRNA-Expression zur Folge. ChIP Analysen haben gezeigt, dass Bmi1 am ganzen il-10-Locus verteilt binden kann. Eine TLR4 und FcγR vermittelte alternative Aktivierung von BMDMs, die mit hoher IL-10 Expression verbunden ist, führte zu einer attenuierten Bmi1 Proteinexpression. Diese Ergebnisse zusammengenommen weisen Bmi1 als Repressor von IL-10 während der Makrophagenaktivierung aus. KW - Interleukin 10 KW - Makrophage KW - Repression KW - Immunologie KW - Cytologie KW - Makrophage KW - Genregulation KW - Bmi1 KW - Polycomb KW - LPS KW - IL-10 KW - Bmi1 KW - Polycomb KW - LPS KW - IL-10 KW - Cell Biology KW - Immunology Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49990 ER - TY - THES A1 - Kohl, Bianca Dorothea T1 - PMP22-overexpressing mice as a model for Charcot-Marie-Tooth 1A neuropathy implicate a role of immune-related cells T1 - PMP22-überexprimierende Mäuse als Modell einer Charcot-Marie-Tooth 1A Neuropatie. N2 - Charcot-Marie-Tooth disease (CMT) is a cohort of human hereditary disorders of the peripheral nervous system (PNS) which exhibit symptoms like sensory dysfunction, muscle weakness and gait disturbances. Different mutations are described as causation for this neuropathy, such as a duplication of chromosome 17 comprising the gene for the peripheral myelin protein-22 (PMP22). Based on different animal models former studies identified immune cells, i.e. macrophages and T-lymphocytes, as crucial mediators of pathology in these neuropathies. In this study, PMP22-overexpressing mice (PMP22tg, C61), serving as a model for a specific type of CMT – CMT1A – were crossbred with immune-deficient mutant mice to examine the impact of the immune system on nerve pathology. Crossbreeding of PMP22tg mice with recombination activating gene-1 (RAG-1) deficient mice, lacking mature T- and B-lymphocytes, caused no striking alterations of pathogenesis in peripheral nerves of mutant mice. In contrast, crossbreeding of PMP22tg myelin mutants with mice deficient in the chemokine monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1, CCL2) caused an amelioration of the demyelinating phenotype of peripheral nerves when MCP-1 was either reduced or completely absent. Furthermore, functional investigations, i.e. neurographic recordings and examinations of the grip strength of the extremities, revealed an amelioration in PMP22tg/MCP-1-/- mice in regard to a symptomatic improvement in the compound action muscle potential (CMAP) and stronger grip strength of the hindlimbs. Interestingly, peripheral nerves of PMP22tg mice showed an irregular distribution of potassium channels in presence of MCP-1, whereas the absence of MCP-1 in the myelin mutants rescued the ion channel distribution and resulted in a more wild type-like phenotype. Having shown the impact of MCP-1 as an important mediator of nerve pathology in PMP22/MCP-1 double mutants, the regulation of this chemokine became an important target for potential treatment strategies. We found that the signaling cascade MEK1/2/ERK1/2 was more strongly activated in peripheral nerves of PMP22tg mice compared to nerves of wild type mice. This activation corresponded to an increase in MCP-1 mRNA expression in peripheral nerves at the same age. Furthermore, a MEK1/2-inhibitor was used in vivo to confirm the regulation of MCP-1 by the MEK1/2/ERK1/2 pathway. After a treatment period of three weeks, a clear reduction of ERK1/2-phosphorylation as well as a reduction of MCP-1 mRNA expression was observed, accompanied by a decline in macrophage number in peripheral nerves of PMP22tg mice. These observations suggest that the expression of MCP-1 is crucial for the neuropathological progression in a mouse model for CMT1A. Therefore, this chemokine could provide a basis for a putative treatment strategy of inherited neuropathies. N2 - Die Charcot-Marie-Tooth Erkrankungen (CMT) sind eine Gruppe von humanen, erblichen Erkrankungen des peripheren Nervensystems (PNS), welche Symptome wie sensible Störungen, Muskelschwäche und Gangstörungen verursachen können. Verschiedene Mutationen, z.B. eine Duplikation des Chromosoms 17, welches das Gen für das periphere Myelinprotein-22 (PMP22) enthält, sind als Ursache für diese Neuropathie beschrieben. Anhand verschiedener Tiermodelle wurde in früheren Studien gezeigt, dass Immunzellen, insbesondere Makrophagen und T-Lymphozyten, maßgeblich an der Pathogenese dieser Neuropathien beteiligt sind. In der vorliegenden Studie wurden PMP22-überexprimierende Mäuse (PMP22tg, C61) als Modell einer spezifischen CMT-Form – CMT1A – mit immun-defizienten Mutanten verkreuzt, um die modulierende Rolle des Immunsystems innerhalb der Pathogenese peripherer Nerven untersuchen zu können. Die Verkreuzung von PMP22tg Mäusen mit „recombination activating gene-1“-defizienten Mutanten (RAG-1-/-), die keine reifen T- und B-Lymphozyten besitzen, resultierte in keiner deutlich veränderten Pathologie der peripheren Nerven. Im Gegensatz hierzu führte die Verkreuzung der Myelinmutanten mit Mäusen, defizient für das Chemokin „monocyte chemoattractant protein-1“ (MCP-1), zu einer Abschwächung des demyelinisierenden Phänotyps in peripheren Nerven, wenn MCP-1 reduziert war oder völlig fehlte. Funktionelle Analysen, wie elektrophysiologische Messungen und Untersuchungen der Kraft in den Extremitäten, zeigten zudem in PMP22tg/MCP-1-/- Mäusen eine symptomatische Verbesserung, was sich in einer höheren Amplitude (compound muscle action potential, CMAP) und einer erhöhten Kraft in den Hinterpfoten der Mäuse widerspiegelte. Interessanterweise zeigten periphere Nerven der PMP22tg Mäuse eine abnorme Verteilung von Kalium-Kanälen, wohingegen das Fehlen von MCP-1 in den Myelinmutanten zu einer Verteilung dieser Ionenkanäle führte, die ähnlich zu Wildtyp-Mäusen war. Da MCP-1 in den PMP22/MCP-1 Doppelmutanten einen deutlichen Einfluss auf die Pathogenese aufwies, wurde die Regulation dieses Chemokins im Hinblick auf mögliche Therapie-Ansätze untersucht. Diese Untersuchung zeigte, dass die MEK1/2/ERK1/2-Signalkaskade in peripheren Nerven von PMP22tg Mäusen stärker aktiviert wird als in Nerven von Wildtyp-Tieren. Die Aktivierung dieser Signalkaskade ging dabei mit einer erhöhten MCP-1 mRNA Expression in peripheren Nerven von Tieren des gleichen Alters einher. Ergänzend wurde ein MEK1/2-Inhibitor in vivo verwendet, um die Regulation von MCP-1 durch die MEK1/2/ERK1/2 Kaskade zu bestätigen. Nach einer Behandlungszeit von drei Wochen wurde eine deutliche Reduktion der ERK1/2-Phosphorylierung, sowie eine Reduktion der MCP-1 mRNA Expression und eine geringere Makrophagen-Anzahl in peripheren Nerven von PMP22tg Mäusen detektiert. Diese Untersuchungen zeigen, dass die Expression von MCP-1 entscheidend für den neuropathologischen Verlauf in einem Mausmodell für CMT1A ist. Somit bietet dieses Chemokin eine Basis für die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien peripherer Neuropathien. KW - Myelin KW - Makrophage KW - Entmarkung KW - Schwann Zellen KW - PMP22 KW - MCP-1 KW - Immunzellen KW - Periphere Nerven KW - Schwann cells KW - PMP22 KW - MCP-1 KW - immune cells KW - peripheral nerves Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-43066 ER - TY - THES A1 - Galmbacher, Katharina Monika T1 - Caspase-1 as a target of bacterial tumor therapy T1 - Caspase-1 als Angriffsziel bakterieller Tumortherapie N2 - Tumorstroma und Tumor-assoziierte Makrophagen (TAMs) spielen in neoplastischen Erkrankungen eine wichtige Rolle im Bezug auf Tumorwachstum und Progression. In einigen Krebsarten besteht zwischen den Tumor-assoziierten Makrophagen und den Krebszellen eine intensive Interaktion, welche zu vermehrter Angiogenese und zur Unterdrückung lokaler Immunantworten führt. Aus diesem Grund stellen TAMs einen vielversprechenden Angriffspunkt für eine Krebstherapie da. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass intrazelluläre Bakterien wie Salmonella und Shigella hauptsächlich TAMs im Tumorgewebe infizierten. Um dieses Verhalten näher zu untersuchen, konstruierten wir einen im Wachstum abgeschwächten Shigella Stamm, welcher jedoch noch die Fähigkeit hat, Apoptose in Makrophagen zu induzieren. Shigellen sind invasive Bakterien, die in das Darmgewebe einwandern und dort eine massive Inflammation induzieren. Intrazelluläre Shigellen aktivieren Caspase-1 und induzieren dadurch Apoptose in Makrophagen durch den sekretierten Virulenzfaktor IpaB. Durch eine Deletion des genomischen aroA-Gens, wurde ein Shigella Stamm konstruiert, der Defekte im intrazellulären Wachstum aufweist. Dennoch war dieser Stamm noch fähig eukaryotische Zellen zu infizieren, sich interzellulär fortzubewegen, Caspase-1 zu aktivieren und Apoptose in Makrophagen zu induzieren. Es wurde gezeigt, dass dieser Shigellen Stamm nach i.v. Injektion hauptsächlich die TAMs im 4T1-induzierten und transgenen MMTV-HER2/neu Brustkrebsmodel infizieren. Diese attenuierten Shigellen wurden im Tumorgewebe hauptsächlich intrazellulär detektiert, im Gegensatz dazu wurden attenuierte Salmonellen zu späten Zeitpunkten (7 d p.i.) auch extrazellulär im Tumorgewebe aufgefunden. Der metabolisch aber nicht in der Virulenz attenuierte Shigella Stamm konnte in beiden Brustkrebsmodellen zu allen Zeitpunkten (4 h, 6h and 7 d p.i.) Caspase-1 in TAMs aktivieren und Apoptose induzieren. Diese Apoptose führte in beiden Brustkrebsmodellen zu einer langandauernden und hoch signifikanten Reduktion der TAMs-Anzahl (bis zu 70 %). Im Gegensatz dazu konnten Salmonellen nur zu frühen Zeitpunkten (6 h p.i.) Apoptose in TAMs induzieren und dies führte in beiden Modellen zu keiner Reduzierung der TAMs-Anzahl. In dem 4T1-induzierten Tumormodel wurden die Mäuse mit dem attenuierten Shigella Stamm behandelt, was zu einer kompletten Blockierung des Tumorwachstums führte, dies traf aber nicht für den avirulenten Stamm zu. Darüberhinaus infizierte Shigella hauptsächlich die Makrophagen Fraktion eines Ovarkarzinoms ex vivo und induzierte in diesen Zellen Caspase- 1 Aktivierung und Apoptose. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass im Wachstum attenuierte intrazelluläre Bakterien dazu fähig sind Apoptose in TAMs zu induzieren. Dadurch werden sie zu einem vielversprechenden Therapeutikum zur Behandlung von betimmten Krebserkrankungen, bei denen TAMs eine erwiesene Rolle im Tumorwachstum und der Tumorprogression spielen. N2 - In neoplastic diseases the tumor stroma and especially tumor-associated macrophages (TAMs) play an important role in tumor growth and progression. TAMs exhibit an intensive cross-talk with tumor cells resulting in the promotion of angiogenesis and the inhibition of local protective immune responses in certain tumor entities. Therefore, TAMs are a potential target for tumor therapy. Here it was shown that intravenously applied intracellular bacteria like Salmonella and Shigella primarily target TAMs. To exploit this feature a growth attenuated Shigella strain with the capacity to induce apoptosis in macrophages was designed. Shigella are invasive bacteria that penetrate the colonic tissue and initiate an acute inflammation. In macrophages, Shigella rapidly induces caspase-1 processing and apoptosis via the virulence factor IpaB. By genomic deletion of the aroA-locus a metabolically attenuated strain defective in intracellular growth but with retained capacity of infection, cell-to-cell spread, caspase-1 processing and apoptosis induction in macrophages was designed. It was shown that this strain primarily targets TAMs in 4T1 cell induced and transgenic MMTV-HER2/new breast cancer models. Shigella were almost exclusively found intracellularly, whereas growth attenuated Salmonella were also found extracellularly at late time points. The metabollically attenuated Shigella strain with retained virulence, but not avirulent Shigella strains, was able to activate caspase-1 and induce apoptosis in TAMs at all time points (4 h, 6 h and 7 d p.i.) in both breast cancer models. This unrestricted apoptosis induction translated into a substantial, long-lasting and highly significant reduction of TAMs number (up to 70 %) in both models. In contrast, Salmonella could only induce apoptosis in TAMs at early time points (6 h p.i.) and failed to reduce TAMs in both models. In the 4T1 model, the effect on tumor size was monitored and treatment of the mice with the attenuated Shigella strain resulted in a complete block of tumor growth. Finally, Shigella primarily infected the macrophage fraction, activated caspase-1 and induced apoptosis in cells derived from a human ovarian carcinoma ex vivo. Taken together, this data suggests that growth attenuated intracellular bacteria capable of inducing apoptosis in TAMs are a promising therapeutic option for certain cancer diseases where TAMs have a proven role for tumor growth or progression. KW - Shigella flexneri KW - Makrophage KW - Apoptosis KW - Caspase-1 KW - bacterial tumor therapy Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-33506 ER - TY - THES A1 - Fischer, Stefan Martin T1 - Regulation and functional consequences of MCP-1 expression in a model of Charcot-Marie-Tooth 1B disease T1 - Regulation und funktionelle Relevanz von MCP-1 in einem Model der Charcot-Marie-Tooth 1B Erkrankung N2 - Charcot-Marie-Tooth 1B (CMT1B) is a progressive inherited demyelinating disease of human peripheral nervous system leading to sensory and/or motor function disability and is caused by mutations in the P0 gene. Mice heterozygously deficient for P0 (P0+/-) are an adequate model of this human disorder showing myelin degeneration, formation of onion bulbs, remyelination and a reduced motor conduction velocity of around 30m/s similar to patients. Previously, it had been shown that T-lymphocytes and macrophages play a crucial role during pathogenesis in peripheral nerves of P0+/- mice. Both, T-lymphocytes and macrophages increase in number in the endoneurium and deletion of T-lymphocytes or deletion of a macrophage-directed cytokine ameliorates the disease. In this study the monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) was identified as an early regulated cytokine before onset of disease is visible at the age of six months. MCP-1 mRNA and protein expression could be detected in femoral quadriceps and sciatic nerves of P0+/- mice already at the age of one month but not in cutaneous saphenous nerves which are never affected by the disease. MCP-1 was shown to be expressed by Schwann cells and to mediate the immigration of immune cells into peripheral nerves. Deletion of MCP-1 in P0+/- mice accomplished by crossbreeding P0 and MCP-1 deficient mice revealed a substantial reduction of immune cells in peripheral nerves of P0+/-/MCP-1+/- and P0+/-/MCP-1-/- mice at the age of six months. In twelve months old mice reduction of immune cells in peripheral nerves is accompanied by amelioration of demyelinating disease in P0+/-/MCP-1+/- and aggravation of demyelinating disease in lumbar ventral roots of P0+/ /MCP-1-/- mice in comparison to P0+/ /MCP 1+/+ mice. Furthermore, activation of the MEK1/2-ERK1/2 signalling cascade could be demonstrated to take place in Schwann cells of affected peripheral nerves of P0+/- mice overlapping temporarily and spatially with MCP-1 expression. An animal experiment using a MEK1/2-inhibitor in vivo, CI-1040, revealed that upon reduction of ERK1/2 phosphorylation MCP-1 mRNA expression is diminished suggesting that the activation of the MEK1/2-ERK1/2 signalling cascade is necessary for MCP-1 expression. Additionally, peripheral nerves of P0+/- mice showing reduced ERK1/2 phosphorylation and MCP-1 mRNA expression also show reduced numbers of macrophages in the endoneurium. This study shows a molecular link between a Schwann cell based mutation and immune cell function. Inhibition of the identified signalling cascade might be a putative target for therapeutic approaches. N2 - Die humane Erkrankung Charcot-Marie-Tooth 1B (CMT1B) ist eine erbliche, chronisch fortschreitende Erkrankung des peripheren Nervensystems die durch Mutation des P0-Gens verursacht wird und zu motorischen und/oder sensorischen Defiziten führt. Sehr ähnlich der humanen Erkrankung weist das Mausmodell, eine für das Myelinprotein P0 heterozygot-defiziente Maus (P0+/-), Degeneration peripheren Myelins, aufeinanderfolgende Zyklen von De- und Remyelinisierung als auch reduzierte Nervenleitgeschwindigkeiten auf. Wissenschaftliche Untersuchungen am Mausmodell ergaben eine Beteiligung von T-Lymphozyten und Makrophagen an der Pathogenese. In dieser Studie wurde das Chemokin „Monocyte Chemoattractant Protein-1“ (MCP-1) als pathogen-relevant in P0+/- Mäusen identifiziert. MCP-1 mRNA und Protein wurden sowohl im Alter von sechs und zwölf Monaten nachgewiesen, Stadien, in denen morphologische Veränderungen peripherer Nerven von P0+/- Mäusen zu erkennen sind, aber auch im Alter von einen und drei Monaten, ein Alter bei dem pathologischen Veränderungen nicht zu finden sind. Mit Hilfe von MCP-1 defizienten Mäusen (MCP-1-/-) und Verpaarung mit P0-defizienten Mäusen konnten weiterführende Untersuchungen zur Rolle von MCP-1 im peripheren Nerv der Maus durchgeführt werden. So zeigte es sich mittels Transplantation von GFP-positivem Knochenmark, dass MCP 1 die Infiltration von Makrophagen aus dem Blut in periphere Nerven vermittelt. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass periphere Nerven von sechs Monate alten P0+/-/MCP-1+/- und P0+/-/MCP-1-/- Mäusen trotz signifikant niedrigerer Anzahl von Immunzellen keine Milderung der Demyelinisierung zeigen. Hingegen weisen periphere Nerven von zwölf Monate alten P0+/ /MCP-1+/- Mäusen sowohl weniger Makrophagen und T-Lymphozyten als auch wesentlich weniger pathologische Veränderungen auf. Periphere Nerven von P0+/-/MCP-1-/- Tieren dagegen zeigen nur eine nicht signifikante Reduktion von Immunzellen und sogar eine Verschlechterung des Phänotyps im Vergleich zu ventralen Spinalwurzeln von P0+/-/MCP-1+/+ Mäusen. Weiterführende Untersuchungen ergaben, dass eine Aktivierung der MEK1/2-ERK1/2 Signalkaskade sowohl in peripheren Nerven von drei und sechs Monate alten P0+/- Mäusen zu finden ist, allerdings, ähnlich der Expression von MCP-1, nur in peripheren Nerven, die von der Demyelinisierung betroffen sein können. Unter Verwendung eines Inhibitors der Kinasen MEK1 und 2 konnte in vivo gezeigt werden, dass Phosphorylierung von ERK1/2 für die erhöhte MCP-1 Expression in peripheren Nerven von P0+/- Mäusen notwendig ist. Darüber hinaus wurde durch Verminderung der ERK1/2-Phosphorylierung eine Reduktion von Makrophagen im Endoneurium von P0+/- Tieren erzielt. KW - Schwann-Zelle KW - Peripheres Nervensystem KW - Charcot-Marie-Syndrom KW - Makrophage KW - Entmarkung KW - Myelin KW - Chemokine KW - Schwann cell KW - Peripheral nervous system KW - Charcot-Marie-Tooth syndrom KW - Macrophage KW - Demyelination KW - Myelin KW - Chemokine Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29189 ER -