TY - THES A1 - Bonfig, Katharina Barbara T1 - Untersuchungen zur Rolle des Kohlenhydratmetabolismus während Pflanze-Pathogen-Interaktionen und der Keimlingsentwicklung T1 - Studies on the role of carbohydrate metabolism during plant-pathogen-interactions and seedling development N2 - Invertasen sind Schlüsselenzyme in der Kohlenhydratverteilung und haben möglicherweise auch während einer Pathogeninfektion eine zentrale Bedeutung. In vorliegender Arbeit wurde zunächst die Regulation verschiedener Stoffwechselwege in Arabidopsis thaliana nach Infektionen mit einem virulenten oder avirulenten Stamm von Pseudomonas syringae untersucht. Mit Hilfe der Chlorophyllfluoreszenz-Bildgebung konnten räumliche und zeitliche Veränderungen der Photosynthese verfolgt werden. Verschiedene Parameter waren unterschiedlich reguliert. In beiden Interaktionen waren Effekte nur lokal um die Infektionsstellen erkennbar und qualitativ ähnlich. Unterschiede waren im zeitlichen Eintreten und Verlauf sichtbar. Die Methode schien geeignet für die sensitive, nicht-invasive Pathogenfrüherkennung vor dem Auftreten sichtbarer Symptome. Die Regulation verschiedener Gene innerhalb von Source-Sink-Übergängen und die Aktivität von Invertasen war in den beiden Interaktionen qualitativ unterschiedlich. Die Infektion mit virulenten Bakterien resultierte in einer Repression photosynthetischer Gene. Die Aktivität vakuolärer Invertasen stieg vorübergehend nach Infektion mit virulenten Bakterien an, während sie nach Infektion mit avirulenten Bakterien sank. Die Aktivität extrazellulärer Invertasen war in beiden Interaktionen reprimiert. Die erfolgreiche Generierung verschiedener Bakterienstämme von P. syringae, die das grün fluoreszierende Protein exprimieren, kann bei der weiteren Charakterisierung von Pflanze-Pathogen-Interaktionen helfen. Die Regulation von Invertasen erfolgt auf transkriptioneller und posttranslationaler Ebene. Um die Funktion von Invertasen in Pflanze-Pathogen-Interaktionen zu verstehen, wurde zunächst die Regulation von Invertasen durch endogene proteinogene Invertaseinhibitoren untersucht. In Übereinstimmung mit in silico Expressionsdaten konnte durch Untersuchung von Reportergenlinien und in Northern Blot Analysen eine starke Expression von Invertaseinhibitoren in Blättern von A. thaliana festgestellt werden. Nach Applikation biotischer und abiotischer Stressfaktoren wurde diese Expression nahezu vollständig reprimiert. Die indirekte Bestimmung der Invertaseinhibitoraktivität durch Messung der Invertaseaktivität in Mischextrakten zeigte, dass diese nach einer Pathogeninfektion vollständig reprimiert war. In funktionellen Ansätzen wurden transgene Pflanzen generiert, die Invertaseinhibitoren unter Kontrolle induzierbarer Promotoren exprimieren. Die Induktion der Invertaseinhibitorexpression änderte die Sensitivität gegenüber verschiedenen Pathogenen nicht signifikant. In einem pharmakologischen Ansatz wurde der chemische Inhibitor Acarbose zur Hemmung der Invertaseaktivität in A. thaliana verwendet. Eine Behandlung von Blättern bei gleichzeitiger Infektion mit Bakterien verursachte eine erhöhte Sensitivität der Pflanzen gegenüber der Infektion, eine stärkere Repression verschiedener Chlorophyllfluoreszenzparameter sowie ein erhöhtes Bakterienwachstum im Vergleich zu einer Infektion mit den Bakterien allein. Keine Effekte wurden auf transkriptioneller Ebene bei der Untersuchung von Genen verschiedener Stoffwechselwege gefunden. Die Invertaseaktivität nach zusätzlicher Behandlung mit Acarbose war tendenziell niedriger als die Aktivität nach einer Pathogeninfektion alleine. Acarbose erhöhte die Spiegel an Salicylsäure unabhängig von einer Pathogeninfektion. Da das Bakterienwachstum in Mutanten des Salicylsäure-vermittelten Abwehrweges bei zusätzlicher Behandlung mit Acarbose ebenfalls erhöht war, kann eine Beteiligung dieses Abwehrweges am Acarboseeffekt bisher ausgeschlossen werden. Invertasen sind neben ihrer Beteiligung an der Abwehr für die Regulation von Entwicklungsprozessen wichtig. In einem funktionellen Ansatz mit Pflanzen, die Invertaseinhibitoren induzierbar produzieren, wurde die Funktion von Invertasen getestet. Zur Generierung spezifischer Effekte wurden die Inhibitoren unter Kontrolle synthetischer Promotoren in A. thaliana exprimiert. Unerwarteterweise war das Wachstum putativ transgener Keimlinge jedoch im 4-Blatt-Stadium arretiert. Eine Analyse der Aktivität der ß-Glucuronidase in den entsprechenden Reporterlinien zeigte eine Korrelation zwischen der Wachstumsarretierung und einer hohen Aktivität dieser Promotoren unter verschiedenen in vitro Bedingungen. Dieser negative Effekt der Invertaseinhibition auf das Keimlingswachstum wurde in transgenen Tabakpflanzen bekräftigt, die Invertaseinhibitoren unter Kontrolle eines Tetracyclin-induzierbaren Promotors exprimierten. Eine erfolgreiche Induktion des Promotors resultierte in einer Reduktion des Frischgewichtes der Keimlinge. Mittels in silico Expressionsdaten und Northern Blot Analysen konnte für A. thaliana eine spezifische und starke Expression verschiedener Invertaseisoformen in Keimlingen nachgewiesen werden. Diese komplementären Ergebnisse zeigen die Notwendigkeit der Invertaseaktivität für eine normale Keimlingsentwicklung. N2 - Invertases are key metabolic enzymes in carbohydrate partitioning which may also play an important role during pathogen infection. In this study, the regulation of different metabolic pathways in Arabidopsis thaliana plants after infection by a virulent and an avirulent strain of Pseudomonas syringae was investigated. With help of chlorophyll fluorescence imaging spatio-temporal changes in photosynthesis were monitored. The monitored chlorophyll fluorescence parameters were showing differential regulation. The effects were restricted to the vicinity of the infection site and did not spread to uninfected areas of the leaf. Qualitatively similar changes in photosynthetic parameters were observed in both interactions. Major differences between the responses to both strains were evident in the onset and time course of changes. Changes could be detected by chlorophyll fluorescence imaging before symptoms were visible by eye. In contrast to photosynthesis, the regulation of marker genes for source/sink relations and the activities of invertase isoenzymes showed qualitative differences between both interactions. Inoculation of the virulent but not the avirulent strain resulted in downregulation of photosynthetic genes and upregulation of vacuolar invertases. The activity of vacuolar invertases transiently increased upon infection with the virulent strain but decreased with the avirulent strain while extracellular invertase activity was downregulated in both interactions. As an advanced tool for the characterization of the interaction between A. thaliana and P. syringae bacteria expressing the green fluorescing protein were generated. Invertases are regulated on transcriptional and posttranscriptional level. To understand the function of invertases in plant-pathogen-interactions, the regulation of endogenous proteinaceous invertase inhibitors was investigated. According to expression profiling the analysis of reporter gene lines and Northern Blot analyses revealed a strong expression of invertase inhibitors in source leaves of A. thaliana. After application of biotic and abiotic stress factors this expression was completely repressed. Indirect determination of invertase inhibitor activity by measurement of invertase activity in mixed extracts revealed a complete repression of inhibitor activity after pathogen infection. In functional approaches transgenic plants were generated, expressing invertase inhibitor proteins under control of inducible promoters. However, no effect of the induction of inhibitor expression on the sensitivity to different pathogens could be observed so far. In a pharmacological approach acarbose war used as an invertase inhibitor. Simultaneous treatment of plants with acarbose and bacteria revealed an increased sensitivity of the plant towards the bacterial infection and a stronger repression of chlorophyll fluorescence parameters compared to plants treated with bacteria alone. No effects on photosynthesis, carbohydrate metabolism and defence could be observed on transcriptional level. A tendency of lowered invertase activity could be observed after treatment with acarbose and bacteria compared to bacterial treatment alone. Acarbose treatment enhanced the levels of salicylic acid independent of bacterial infection. The acarbose-mediated increase in sensitivity was also detectable in sid2 and cpr6 mutants indicating that the effect of acarbose is independent of the salicylic acid mediated defence pathway. Invertases are important enzymes in higher plants, which are involved in regulating developmental processes and responses to external factors. In a functional approach the role of invertases was investigated using transgenic plants ectopically expressing inhibitor proteins to decrease invertase activity. For generating specific effects, these inhibitor proteins were expressed in A. thaliana under the control of synthetic promoters consisting of tetramers of pathogeninducible elements, which were reported to yield low constitutive expression. Unexpectedly, seedling growth of putative transgenic plants was arrested at the four-leaf stage. Analysis of ß-glucuronidase activity of corresponding reporter gene lines showed a correlation of the growth arrest with high activity of these promoters in seedlings grown under tissue culture conditions. The negative effect of invertase inhibition on seedling growth was substantiated by transgenic tobacco plants expressing an invertase inhibitor under control of a tetracycline inducible promoter. Ectopic induction of the invertase inhibitor during early seedling development resulted in a reduced fresh weight of seedlings. Expression profiling and Northern Blot analyses further supported the importance of invertase in Arabidopsis thaliana seedling development. Different invertases were specifically and strongly expressed. These complementing results show that invertase activity is required for normal seedling development. KW - Invertase KW - Invertaseinhibitor KW - Arabidopsis thaliana KW - Pseudomonas syringae KW - invertase KW - invertase inhibitor KW - Arabidopsis thaliana KW - Pseudomonas syringae Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-32488 ER - TY - THES A1 - Pimentel Elardo, Sheila Marie T1 - Novel anti-infective secondary metabolites and biosynthetic gene clusters from actinomycetes associated with marine sponges T1 - Neue anti-infektive Sekundärmetabolite und biosynthetische Gencluster aus mit marinen Schwämmen assoziierten Actinomyceten N2 - Marine sponges (Porifera) harbor diverse microbial communities within their mesohyl, among them representatives of the phylum Actinobacteria, commonly known as actinomycetes. Actinomycetes are prolific producers of pharmacologically important compounds and are responsible for producing the majority of antibiotics. The main aim of this Ph.D. study was to investigate the metabolic potential of the sponge-associated actinomycetes to produce novel anti-infective agents. The first aim was to cultivate actinomycetes derived from different marine sponges. 16S rDNA sequencing revealed that the strains belonged to diverse actinomycete genera such as Gordonia, Isoptericola, Micromonospora, Nocardiopsis, Saccharopolyspora and Streptomyces. Phylogenetic analyses and polyphasic characterization further revealed that two of these strains represent new species, namely Saccharopolyspora cebuensis strain SPE 10-1T (Pimentel-Elardo et al. 2008a) and Streptomyces axinellae strain Pol001T (Pimentel-Elardo et al. 2008b). Furthermore, secondary metabolite production of the actinomycete strains was investigated. The metabolites were isolated using a bioassay-guided purification scheme followed by structure elucidation using spectroscopic methods and subjected to an elaborate anti-infective screening panel. Several interesting compounds were isolated namely, the novel polyketides cebulactam A1 and A2 (Pimentel-Elardo et al. 2008c), a family of tetromycin compounds including novel derivatives, cyclodepsipeptide valinomycin, indolocarbazole staurosporine, diketopiperazine cycloisoleucylprolyl and butenolide. These compounds exhibited significant anti-parasitic as well as protease inhibitory activities. The third aim of this Ph.D. study was to identify biosynthetic gene clusters encoding for nonribosomal peptide synthetases (NRPS) and polyketide synthases (PKS) present in the actinomycete strains. Genomic library construction and sequencing revealed insights into the metabolic potential and biosynthetic pathways of selected strains. An interesting NRPS system detected in Streptomyces sp. strain Aer003 was found to be widely distributed in several sponge species, in an ascidian and in seawater and is postulated to encode for a large peptide molecule. Sequencing of the PKS gene cluster of Saccharopolyspora cebuensis strain SPE 10-1T allowed the prediction of the cebulactam biosynthetic pathway which utilizes 3-amino-5-hydroxybenzoic acid as the starter unit followed by successive condensation steps involving methylmalonyl extender units and auxiliary domains responsible for the polyketide assembly. In conclusion, this Ph.D. study has shown that diverse actinomycete genera are associated with marine sponges. The strains, two of them novel species, produced diverse chemical structures with interesting anti-infective properties. Lastly, the presence of biosynthetic gene clusters identified in this study substantiates the biosynthetic potential of actinomycetes to produce exploitable natural products and hopefully provides a sustainable supply of anti-infective compounds. N2 - Zahlreiche marine Schwämme (Phylum: Porifera) beherbergen eine phylogenetisch diverse mikrobielle Gemeinschaft in der Mesohyl-Matrix, darunter auch viele Vertreter des bakteriellen Phylums Actinobacteria, die umgangssprachlich als Actinomyceten bekannt sind. Actinomyceten sind wichtige Produzenten vieler Antibiotika und von weiteren pharmazeutisch relevanten Substanzen. Das Hauptziel dieser Promotionsarbeit war die Untersuchung des Potentials Schwamm-assoziierter Actinomyceten zur Produktion neuer Infektions-hemmender Substanzen. Ein erstes Ziel dieser Doktorarbeit war die Kultivierung von Actinomyceten aus verschiedenen marinen Schwammarten. Die Sequenzierung der respektiven 16S rRNA Gene zeigte eine phylogenetische Zugehörigkeit der Isolate zu verschiedenen Actinomyceten-Familien, wie Gordonia, Isoptericola, Micromonospora, Nocardiopsis, Saccharopolyspora und Streptomyces. Durch phylogenetische Analysen und umfangreiche taxonomische Charakterisierungen konnten zwei neue Actinomyceten-Arten, Saccharopolyspora cebuensis strain SPE 10-1T (Pimentel-Elardo et al. 2008a) und Streptomyces axinellae strain Pol001T (Pimentel-Elardo et al. 2008b) beschrieben werden. Des Weiteren sollten die Actinomyceten-Isolate auf die Produktion von Sekundär-Metaboliten hin untersucht werden. Die Substanzen wurden „bioassay-guided“ aufgereinigt und isoliert sowie deren Struktur mittels spektroskopischer Methoden aufgeklärt. Anschließend wurden die Substanzen ausführlichen Screening-Methoden unterzogen, um sie auf anti-infektive Wirkungen hin zu untersuchen. Zahlreiche interessante Verbindungen konnten so isoliert werden, u. a. die neuen Polyketide Cebulactam A1 und A2 (Pimentel-Elardo et al. 2008c); eine Familie von Tetromycin-Substanzen inklusive neuartiger Derivative; das Cyclodepsipeptid Valinomycin, Indolocarbazole Staurosporine, Diketopiperazine Cycloisoleucylprolyl und Butenolide. Die Verbindungen zeigten signifikante anti-parasitische und Protease-hemmende Aktivitäten. Das dritte Ziel dieser Arbeit war es, die für nicht-ribosomale Peptidsynthetasen (NRPS) und Polyketidsynthasen (PKS) kodierenden, biosynthetischen Gen-Cluster in den Actinomyceten-Isolaten zu identifizieren. Die Konstruktion von Genbanken sowie die Sequenzierung ausgewählter Cosmidklone lieferte erste Einblicke in das Stoffwechsel- und Biosynthesepotential ausgewählter Isolate. Beispielsweise konnte ein interessantes NRPS-System in Streptomyces sp. Stamm Aer003 identifiziert werden, welches in verschiedenen Schwammarten, einer Ascidienart sowie im Meerwasser gefunden wurde. Die Sequenzierung eines PKS-Genclusters aus Saccharopolyspora cebuensis strain SPE 10-1T ermöglicht die Voraussage des Cebulactam-Biosynthesewegs in dem 3-Amino-5-Hydroxybenzoesäure als Ausgangsprodukt dient, welches durch sukzessive Kondensationsschritte sowie Verlängerungen durch Methylmalonyl- und Zusatzdomänen zum endgültigen Polyketid führen. Zusammenfassend konnte in dieser Promotionsarbeit gezeigt werden, dass marine Schwämme mit diversen Vertretern aus verschiedenen Familien der Actinomyceten assoziiert sind. Die Bakterienisolate, von denen zwei neue Arten repräsentieren, produzierten mehrere chemische Substanzen mit interessanten anti-infektiven Eigenschaften. Des Weiteren konnte mit dieser Arbeit durch die Identifizierung von Biosynthese-Genclustern das Potential von Actinomyceten zur Produktion verwertbarer bioaktiver Substanzen bekräftigt und somit ein Beitrag zur Entdeckung neuer anti-infektiver Substanzen erbracht werden. KW - Meeresschwämme KW - Strahlenpilze KW - Sekundärmetabolit KW - Actinomyceten KW - Biosynthese-Genclustern KW - neuer anti-infektiver Substanzen KW - actinomycetes KW - marine sponges KW - anti-infective KW - biosynthetic gene clusters KW - secondary metabolites Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40463 ER - TY - THES A1 - Dunkel, Marcel T1 - Untersuchungen zur Translokation und Funktion von Tandem-Poren Kaliumkanälen der TPK-Familie aus Arabidopsis thaliana T1 - Targeting and function of Arabidopsis thaliana tandem pore potassium channels belonging to the TPK family N2 - • Die Modellpflanze der Pflanzenphysiologen, Arabidopsis thaliana, besitzt mindestens 15 verschiedene kaliumselektive Kanäle, von denen 5 der Strukturklasse der Tandemporen-Kaliumkanäle angehören und daher TPK-Kanäle genannt werden. • Tandemporenkanäle findet man nur bei eukaryontischen Organismen. Die pflanzlichen Tandemporen Kaliumkanäle haben einen gemeinsamen phylogenetischen Ursprung und unterscheiden sich von den Tierischen und denen der Pilze und Einzeller. Die pflanzlichen TPK-Kanäle lassen sich wiederum in die TPK1-Unterfamilie und die TPK2-Unterfamilie unterteilen. Die weitere Evolution der TPK2-Unterfamilie von A. thaliana, TPK2, TPK3, TPK4 und TPK5, lässt sich eindeutig auf bestimmte Duplikationsereignisse im Genom von A. thaliana und dessen Ahnen zurückführen. Auch der Ein-Poren Kaliumkanal KCO3 geht sehr wahrscheinlich auf die Duplikation des TPK2 und einer anschließenden Deletion und nicht auf einen der prokaryontischen Ein-Poren-Kaliumkanal-Prototypen zurück. • Vier der A. thaliana TPK-Kanäle (TPK1, 2, 3 und 5) lokalisieren in der Vakuolenmembran, während einer, TPK4, zum großen Teil im ER, aber auch in der Plasmamembran zu finden ist. Die Translokation des TPK1 folgt dem sekretorischen Pfad vom ER, durch den Golgi und möglichen intermediären Kompartimenten hin zur Membran der lytischen Vakuole. Von entscheidender Bedeutung ist dabei der zytoplasmatische Carboxy-Terminus (CT) des TPK1. Deletionsmutanten des TPK1 CT zeigen, dass die Translokation mindestens zwei Sortierungsschritten, am Ausgang des ER und des Golgi, unterliegt. Fehlt der CT komplett bleibt der Kanal im ER. Die Sortierungssignale des TPK1 CT konnten auf die EF-Hand Domäne I eingegrenzt werden. Anschließende Punktmutationen in diesem Bereich konnten zeigen, dass TPK1 in der eigentlich für die Ca2+ Bindung zuständigen Domäne ein di-azidisches ER-Export Motiv bestehend aus Asparaginsäure, Leucin und Glutaminsäure enthält. Andere Arbeiten legen nahe, dass der Mechanismus des ER-exports von TPK1 auf der Interaktion mit COPII Vesikelhüllproteinen beruht; TPK1 also in Vesikel sortiert wird, die sich am ER abschnüren und mit dem cis-Golgi fusionieren. Der Vergleich mit anderen pflanzlichen TPK Kanälen lässt vermuten, dass TPK1 Orthologe, nicht aber die A. thaliana Homologen ein di-azidisches ER-Exportmotiv besitzen. Die Translokation des TPK3 erwies sich dementsprechend als unabhängig von dessen CT. Weitere Experimente schließen außerdem eine Beteiligung der 14-3-3 Bindung an der Translokation aus. • TPK4 ist der einzige TPK der heterolog in Xenopus Oozyten funktionell exprimiert werden kann. Wie Mutationen an einem essentiellen Aspartat (Asp86, Asp200) in der Pore zeigten, sind beide tandem repetierten Porendomänen einer Kanaluntereinheiten an der Porenbildung beteiligt. Somit formt sich TPK4 ähnlich wie die tierischen TPK-Kanäle voraussichtlich aus zwei Untereinheiten. Ein Austausch der zweiten Porendomäne von TPK4 konnte zeigen, dass TPK2, TPK3 und TPK5, mit ihrer zweiten Porendomäne und TPK4 mit seiner ersten Porendomäne den TPK4 zu einem funktionellen Kaliumkanal komplementieren können. Da keine der TPK4 Eigenschaften, außer geringfügig die relative Permeabilität für Rb+, verändert wurde, kann man absehen, dass die homologen TPK2, TPK3 und TPK5 als instantan aktivierte, spannungsunabhängige Kaliumkanäle der Vakuolenmembran fungieren. Dazu kommt wahrscheinlich ähnlich wie bei TPK1 ein 14-3-3 und Ca2+ abhängiges Öffnen und Schließen. • Weiterführende elektrophysiologische Untersuchungen am TPK4 zeigten eine Beteiligung einer transmembranen Asparaginsäure (Asp110) an der Kaliumpermeation und der schwachen Einwärtsgleichrichtung. Der Aspartatrest ist in die wassergefüllte Aussparung der zytoplasmatischen Porenhälfte orientiert. Damit kann er über ionische Wechselwirkungen sowohl Kalium in der Pore konzentrieren als auch potentielle Kanalblocker wie Mg2+ oder Polyamine binden. Die Konservierung des Aspartats unter anderem bei TPK2, TPK3 und TPK5 deutet daraufhin, dass auch die vakuolären TPK-Kanäle eine Einwärtsgleichrichtung vermitteln, die auf einem spannungsabhängigen Block von zytoplasmatischer Seite basiert. • Im Gegensatz zum zytoplasmatischen Block ist das Schließen des TPK4 durch zytoplasmatische Ansäuerung spannungsunabhängig und ist daher von einer Protonierungsreaktion abhängig. Über zahlreiche Deletionen und Chimären des TPK4 wurde der Bereich, in dem sich pH-Sensor und pH-Tor befinden, auf den Bereich zwischen transmembranen und zytoplasmatischen Domänen eingegrenzt. Darüber hinaus fungieren Histidine nicht als pH-Sensor. N2 - • The model plant Arabidopsis harbours 15 genes encoding potassium selective channels. Five of them belong to the structural class of tandem-pore K+ channels and are therefore called TPK channels. • Blast searches revealed the occurrence of TPK channels in many eucaryots, but not in procaryots. Plant TPK channels cluster in a phylogenetic analysis and branch into a TPK1- and a TPK2-subfamily. The evolution Arabidopsis TPK2-subfamily members (TPK2, TPK3, TPK4, and TPK5) can be attributed to distinct large-scale duplication events in ancestral genomes. Further more phylogenetic analysis showed the relatedness of the one-pore potassium channel KCO3 to TPK2. • The trafficking of the four vacuolar membrane intrinsic TPK channels (TPK1, TPK2, TPK3, and TPK5) utilizes the secretory path, from the endoplasmic reticulum (ER), via Golgi apparatus and maybe intermediate compartments to the lytic vacuole. The carboxy terminus (CT) of TPK1 was critically involved in both ER and Golgi sorting steps. The minimal requirement for vacuolar localisation was the proximal CT up to the Ca2+-binding EF-hand I. Due to mutational analyses one of several di-acidic motifs consisting of aspartate, leucin, and glutamate (aa 296-298) could be identified as the essential ER-export motif. By this TPK1 likely interacts with the coat of COPII vesicles, which adopt the ER to Golgi transport. Like TPK1 the orthologs of the TPK1-subfamily, but not the Arabidopsis homologs, exhibit the same di-acidic motif. In agreement vacuolar trafficking of TPK3 was independent of its CT. • TPK4 is the solely plasma membrane integral AtTPK channel and thus its currents can be recorded at the plasma membrane of Xenopus leavis oocytes. Mutation of in plant TPK channels perfectly conserved pore aspartates (D86N; D200N) knock-out TPK4 channel function and suggest a dimeric assembly similar to that of animal tandem-pore channels. Employing TPK4 as matrix for the expression of the pore domains of the vacuolar TPKs in Xenopus oocytes, I could show the capability of TPK2, TPK3 and TPK5 to complement TPK4. Therefore these channels probably form instantaneous, voltage-independent and potassium selective channels in the vacuolar membrane. Existence of one 14-3-3 binding motif each and one EF-hand (except TPK5) implicates Ca2+ and 14-3-3 dependent activation of those channels like seen for TPK1. • Further combination of structural, mutational and electrophysiological analyses led to the identification of another pore aspartat (Asp 110) essential for the potassium permeation and responsible for the inward rectification. The charged side chain of this Asp 110 faces the water cavity and thus could concentrate and coordinate potassium in the pore as well as interact with cationic blockers like e.g. Mg2+ or polyamine. Again, conservation among the Arabidopsis TPK2-subfamily members suggests that the vacuolar TPKs (except TPK1) are regulated by cytoplasmic blockers and exhibit weak inward rectifiying properties, too. • In contrast to inward rectification current reduction due to cytoplasmic acidification is voltage-independent and thus likely protonation dependent. Due to chimera and deletion mutants of TPK4 the possible sites of the pH-Sensor as well as the gate could be narrowed down to a few residues in the transition zone of transmembrane and cytoplasmic domains, but the essential residues remain elusive. KW - Vakuole KW - Translokation KW - Endoplasmatisches Retikulum KW - Kaliumkanal KW - TPK KW - KCO KW - ER-Export KW - diazidisches Motiv KW - DEVC KW - particle bombardment KW - double electrode voltage clamp KW - targeting Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34743 ER - TY - THES A1 - Leide, Jana T1 - Cuticular Wax Biosynthesis of Lycopersicon esculentum and Its Impact on Transpiration Barrier Properties during Fruit Development T1 - Untersuchungen zur kutikulären Wachsbiosynthese und deren Bedeutung als Transpirationsbarriere während der Fruchtentwicklung von Lycopersicon esculentum N2 - Cuticular waxes cover all above-ground growing parts of plants. They provide the outermost contact zone between plants and their environment and play a pivotal role in limiting transpirational water loss across the plant surface. The complex mechanisms in cuticular wax biosynthesis conferring proper barrier function still remain to be elucidated. The present study focuses on biosynthetic pathways in wax formation, cuticular wax accumulation and composition and its impact on the epidermal barrier property of the intact system of the astomatous tomato fruit (Lycopersicon esculentum Mill.). Fruits of all developmental stages of the wild type cultivar MicroTom and its lecer6 mutant defective in a β-ketoacyl-CoA synthase involved in very-long-chain fatty acid elongation were analyzed. This 'reverse genetic' approach clarified the importance of the β-ketoacyl-CoA synthase LeCER6 for epidermal barrier property in vivo on the biochemical-analytical level, on the transcriptional level and, furthermore, on the physiological level comparatively between MicroTom wild type and MicroTom lecer6. Surfaces of MicroTom wild type and MicroTom lecer6 fruits showed similar patterns of quantitative wax accumulation, but differed considerably in the permeance for water. Qualitative analyses of the chemical composition of fruit cuticular waxes in the course of fruit development revealed the meaning of the β-ketoacyl-CoA synthase deficiency in the lecer6 mutant. Fruits of this mutant exhibited a distinct decrease in the proportion of n-alkanes of chain lengths > C28. Moreover, a concomitant increase in pentacyclic triterpenoids became discernible in the mature green fruit stage of the mutant. Since quantitative changes of the cutin matrix were not sufficient to affect transpiration barrier properties of the lecer6 mutant presumably the shift in cuticular wax biosynthesis of the lecer6 mutant is responsible for the observed increase of water permeance. In order to investigate the molecular basis of wax formation, a microarray experiment was established that allows the simultaneous and comprehensive analysis of the timing and abundance of transcriptional changes in MicroTom wild type and MicroTom lecer6. This microarray consists of 167 oligonucleotides corresponding to EST and gene sequences of tomato potentially participating in wax biosynthesis, wax modification, transport processes and stress responsiveness. These parameters were correlated with the course of fruit development. This comparison of gene expression patterns showed a variety of differential expressed transcripts encoding for example lipid transfer proteins and the dehydrin TAS14. On the basis of these findings, it can be proposed that diverse regulatory mechanisms like lipid transfer processes or osmotic stress response are affected by the LeCER6 deficiency, which is primarily accompanied by an impaired water barrier property of the fruit cuticle. This present study correlates the continuous increase of LeCer6 gene expression and the accumulation of very-long-chain n-alkanes within the cuticular waxes during the transition from the immature green to the early breaker fruit phase displaying a developmental regulation of the cuticular wax biosynthesis. Organ-specific wax biosynthesis resulted in different cuticular wax pattern in tomato fruits and leaves. Moreover, in contrast to the fruits, LeCER6-deficient leaves showed a significantly reduced wax accumulation, mainly due to a decrease of n-alkanes with chain lengths > C30, while the proportion of pentacyclic triterpenoids were not affected. Deduced from these biochemical-analytical data on tomato fruits and leaves LeCER6 was characterized as a key enzyme in VLCFA biosynthetic pathway responsible for cuticular wax accumulation. In silico analysis of the LeCER6 sequence revealed the presence of two putative transmembrane domains in the N-terminal position. In addition, highly conserved configurations of catalytic residues in the active site of the enzyme were observed, which are probably essential to its overall structure and function in the fatty acid elongation process. High sequence homology of LeCER6 to the very-long-chain condensing enzymes GhCER6 of Gossypium hirsutum L. and AtCER6 of Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. was found, which might be a good evidence for similar biochemical functions. Apart from developmental regulation of the cuticular wax biosynthesis, environmental factors influenced the cuticular wax coverage of tomato fruits. Mechanical removal of epicuticular fruit wax evoked large-scale modifications of the quantitative and qualitative wax composition, such as a reduction of aliphatic wax components, and therewith affected the cuticular water permeability. A subsequent regeneration event was included in the regular wax biosynthesis process and led to the compensation of the detached wax amounts and increased the water barrier properties of the cuticular membrane again. In contrast, water-limited conditions had only minor impact on alterations in cuticular wax biosynthesis and, consequently, on the permeance for water of tomato fruits. Floral organ fusion and conditional sterility, as observed in this study, are caused as pleiotropic effects in cell-cell signaling by the loss-of-function mutation in LeCER6. These findings corroborated the functional impact of LeCER6 on the epidermal integrity and are consistent with the current knowledge on eceriferum mutants of Arabidopsis. Investigations of phenotypic and biochemical characteristics of tomato fruits allowed a broader system-orientated perspective of the fruit development of MicroTom wild type and its lecer6 mutant. These analyses highlight more precisely alterations in the fruit surface area, fresh and dry weight, epidermal cell density, photosynthetic activity or glucose content in the course of fruit development. The differences between MicroTom wild type and MicroTom lecer6 characterize very well the large-scale consequences of the LeCER6 deficiency on the physiological status of tomato fruits. Moreover, the results clearly show a part of the genetic controlled network that governs tomato fruit metabolism and mediates extensive changes of the tomato fruit life cycle. The analyses of the stem scar tissue of the tomato fruit revealed a complex set of responses caused by the harvesting process in detail. Throughout storage of the tomato fruits barrier properties were attributed to the suberized stem scar tissue in regard to water loss limitation and reduction of the fungal infection rate. Thereby the endogenous level of abscisic acid was found to be involved in the molecular signaling pathway that regulates the de novo formation of this tissue. For the first time, the chemical composition and physiological importance could be correlated with molecular changes at the transcriptional level during suberization of the stem scar of tomato fruits. In conclusion, this work indicates a novel intact model system for an integrative functional approach for plant barrier properties that was successfully established and carefully studied. The results highlight correlations between wax biosynthesis, distribution of cuticular waxes, and its relevance on the transpirational water loss across the plant surface and, thus, promote the global understanding of plant cuticle biology. N2 - Kutikuläre Wachse bedecken alle oberirdischen Pflanzenteile und stellen somit die Kontaktzone zwischen Pflanzen und ihrer Umwelt dar. Zudem spielen sie eine entscheidende Rolle für den Schutz der Pflanzen vor unkontrolliertem Wasserverlust. Die komplexen Mechanismen der Wachsbiosynthese, die zur dieser Barrierefunktion beitragen, sind jedoch noch weitgehend unaufgeklärt. Die vorliegende Arbeit untersucht Biosynthesewege von kutikulären Wachsen, ihre chemische Beschaffenheit sowie deren funktionelle Bedeutung als Transpirationsbarriere an dem intakten System der astomatären Tomatenfrucht (Lycopersicon esculentum Mill.). Untersuchungen wurden dabei an Früchten unterschiedlicher Entwicklungsstadien des Tomatenkultivars MicroTom Wildtyp und dessen lecer6 Mutante durchgeführt. Die lecer6 Mutante ist durch einen genetisch determinierten Defekt in der β-Ketoacyl-CoA Synthase LeCER6 unfähig zur Verlängerung von sehr langkettigen Fettsäuren. Durch diesen 'reverse genetic' Ansatz wurde der Einfluss der β-Ketoacyl-CoA Synthase LeCER6 auf die Barrierefunktion der Epidermis zunächst in vivo auf der biochemisch-analytischen und physiologischen Ebene vergleichend zwischen MicroTom Wildtyp und MicroTom lecer6 analysiert. Daran schlossen sich Untersuchungen auf transkriptioneller Ebene an. Die den Früchten von MicroTom Wildtyp und der lecer6 Mutante aufgelagerten Wachse unterscheiden sich quantitativ nur wenig, weisen hingegen deutliche Unterschiede in der qualitativen Zusammensetzung und den Wasserleitwerten auf. Die Analyse der chemischen Zusammensetzung der kutikulären Wachse zeigte im Verlauf der Fruchtentwicklung, dass die Defizienz in der β-Ketoacyl-CoA Synthase LeCER6 eine Abnahme des n-Alkananteils in den Wachsen ab einer Kettenlängen > C28 bewirkt, was bereits im Stadium der reifen grünen Früchte zu erkennen ist. Die in der lecer6 Mutante vermehrt eingelagerten pentazyklischen Triterpenoide können die Transpirationsbarriereeigenschaft der aliphatischen n-Alkane nicht adäquat ersetzen. Ein möglicher Einfluss der ebenso untersuchten Kutinmatrix der Tomatenfrucht konnte ausgeschlossen werden. Für eine umfangreiche Genexpressionsanalyse von MicroTom Wildtyp und MicroTom lecer6 wurde ein microarray Experiment konzipiert, welches 167 Oligonukleotide umfasst entsprechend zu bekannten EST- und Gensequenzen der Tomate, die möglicherweise an der Wachsbiosynthese, Wachsmodifikation, relevanten Transportprozessen oder Stressreaktionen beteiligt sind. Der Vergleich der Genexpression zwischen Wildtyp und der lecer6 Mutante zeigte eine Vielzahl von differentiell expremierten Transkripten unter anderem Lipidtransferproteine und das Dehydrin TAS14. Anhand derer kann davon ausgegangen werden, dass der Verlust der LeCER6 Funktion unterschiedliche regulative Mechanismen beeinflusst, wie zum Beispiel Lipidtransportprozesse und Reaktionen des osmotischen Stresses, die mit einer Schwächung der kutikulären Transpirationsbarriere der Fruchtepidermis einhergehen. Die vorliegende Studie belegt zudem erstmals einen Zusammenhang zwischen der Steigerung der LeCer6 Genexpression, der nur geringfügig zeitverzögerten Anreicherung sehr langkettiger n-Alkane in den kutikulären Wachsen und der daraus resultierenden Barriereleistungsfähigkeit. Ebenso wird eine Regulation der kutikulären Wachsbiosynthese in Abhängigkeit von den jeweiligen Stadien der Fruchtentwicklung veranschaulicht. Der organspezifische Vergleich der kutikulären Wachsbiosynthese zeigte, dass sich die Wachsmuster von Früchten und Blättern der Tomatenpflanzen deutlich voneinander unterscheiden. Die Wachsakkumulation auf der Blätterepidermis ist durch die LeCER6-Defizienz hauptsächlich im Anteil sehr langkettiger n-Alkane > C30 signifikant herabgesenkt, während der Gehalt an pentazyklischen Triterpenoiden jedoch nicht, so wie in den Früchten der lecer6 Mutante beobachtet, ansteigt. Aufgrund dieser Untersuchungen der Tomatenfrüchte und -blätter konnte LeCER6 als ein Schlüsselenzym für die Verlängerung sehr langkettiger Fettsäurederivate innerhalb der kutikulären Wachsbiosynthese funktionell charakterisiert werden. Anhand von vergleichenden in silico Sequenzanalysen mit den Fettsäurenelongasen GhCER6 aus Gossypium hirsutum L. und AtCER6 aus Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. konnten sowohl zwei mögliche transmembrane Proteindomänen im N-terminalen Bereich als auch hochkonservierte Bereiche im katalytischen Zentrum des LeCER6-Enzyms lokalisiert werden, die vermutlich zur funktionellen Struktur des Enzyms beitragen. Neben der bereits angeführten entwicklungsabhängigen Regulation der Wachsbiosynthese beeinflussen auch Umweltstressoren die kutikuläre Wachsauflage der Tomatenfrüchte. Ein mechanisches Entfernen der epikutikulären Wachse führt zu einer beträchtlichen Reduktion der aliphatischen Wachsbestandteile, welche maßgeblich die Barriereeigenschaft der Kutikulamembran bestimmen. Die einsetzende Regeneration der manipulierten Wachsoberfläche führt zu einer vollständigen Kompensation der entfernten Wachskomponenten, so dass die Tomatenfrüchte in nur kurzer Zeit wieder eine dem Reifestadium entsprechende normale Verteilung der kutikulären Wachse aufweisen. Im Gegensatz dazu führt Wassermangel nur zu sehr geringfügigen qualitativen und quantitativen Veränderungen der kutikulären Wachsschicht und folglich des Wasserleitwertes der Tomatenfrüchte. Die hier dokumentierte Organfusion der Blüte und die eingeschränkte Sterilität der Tomatenpflanzen wurden als pleiotrope Effekte der lecer6 Mutation auf die Zell-Zell-Kommunikation charakterisiert, was der funktionellen Bedeutung von LeCER6 für die Epidermisintegrität entspricht und mit Beobachtungen an eceriferum Mutanten in Arabidopsis übereinstimmt. Die kombinierte Untersuchung phänotypischer und biochemischer Merkmale der Tomatenfrucht erlaubt eine breitere, systemorientierte Gegenüberstellung der Fruchtentwicklung von MicroTom Wildtyp und MicroTom lecer6. Dabei werden durch die Analysen von Größe, Frisch- und Trockengewicht, Dichte der Epidermiszellen, Photosyntheseaktivität und Glukosegehalt der Früchte die Unterschiede zwischen MicroTom Wildtyp und der lecer6 Mutante deutlich aufgezeigt. Die LeCER6-Defizienz der Mutante führt dabei zu weitreichenden Veränderungen im physiologischen Status der Frucht. Diese Ergebnisse spiegeln somit einen Teil des physiologischen Netzwerkes wider, welches weitreichende sekundäre Veränderungen im Lebenszyklus der Tomatenfrucht vermittelt. Das Stielnarbengewebe der Tomatenfrucht wird infolge der Verletzung durch den Ernteprozess gebildet. Basierend auf der de novo Suberinbiosynthese kann diesem Gewebe eine wichtige Barrierefunktion sowohl zur Einschränkung des unkontrollierten Wasserverlustes als auch zur Verringerung der Infektionsrate durch einen pilzlichen Erreger während der Lagerung von Tomatenfrüchten beigemessen werden. Eine Beteiligung der endogenen Abscisinsäure an dem der Bildung des suberinisierten Gewebes der Fruchtstielnarbe zugrunde liegendem, molekularen Signalweg konnte nachgewiesen werden. Zusammenfassend dokumentiert diese Arbeit erstmalig detaillierte Studien im Hinblick auf pflanzliche Barriereeigenschaften an einem intakten Modellsystem. Die präsentierten Ergebnisse zu molekularen Untersuchungen der Wachsbiosynthese und qualitative and quantitative Analysen der Wachsakkumulation werden im Zusammenhang des Schutzes der Pflanzenoberfläche gegen Wasserverlust durch Transpiration diskutiert und bieten somit neue Erkenntnisse über die pflanzliche Kutikula. KW - Wachs KW - Kutikula KW - Tomate KW - Fruchtbildung KW - Transpiration KW - wax KW - cuticle KW - tomato KW - fruit KW - transpiration Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34526 ER - TY - THES A1 - Förstner, Konrad Ulrich T1 - Computational analysis of metagenomic data: delineation of compositional features and screens for desirable enzymes T1 - Computergestützte Analyse von Metagenomedate: Beschreibung von kompositionellen Eigenschaften und Suchen nach gewünschten Enzymen N2 - The topic of my doctorial research was the computational analysis of metagenomic data. A metagenome comprises the genomic information from all the microorganisms within a certain environment. The currently available metagenomic data sets cover only parts of these usually huge metagenomes due to the high technical and financial effort of such sequencing endeavors. During my thesis I developed bioinformatic tools and applied them to analyse genomic features of different metagenomic data sets and to search for enzymes of importance for biotechnology or pharmaceutical applications in those sequence collections. In these studies nine metagenomic projects (with up to 41 subsamples) were analysed. These samples originated from diverse environments like farm soil, acid mine drainage, microbial mats on whale bones, marine water, fresh water, water treatment sludges and the human gut flora. Additionally, data sets of conventionally retrieved sequence data were taken into account and compared with each other N2 - Das Thema meiner Doktorarbeit war die bioinformatische Analyse von metagenomischen Sequenzdaten. Ein Metagenom umfasst die genomische Information aller Mikroorganismen eines Biotops. Die bisher durchgeführten metagenomische Projekte sequenzierten auf Grund des technischen und finanziellen Aufwands einer solchen Unternehmung nur kleine Teile dieser im allgemeinen sehr großen Metagenome. Im Zuge meiner Doktorarbeit, die auf solchen Sequenzierungprojekten aufbaut, wurden bioinformatische Werkzeuge entwickelt und angewandt um genomische Eigenschaften verschiedener metagenomische Datensätze zu analysieren und um biotechnologisch und pharmakologisch relevante Enzyme exemplarisch in diesen Datensätzen zu suchen. In den Analysen wurden neun publizierte, metagenomische Projektedatensammlungen (teilweise mit bis zu 41 Subproben) untersucht. Die Probem stammen von zahlreichen unterschiedlichen Habitaten wie Farmerde, sauerer Minendrainage, dem mikrobiellen Belag auf Walknochen, Meerwasser, Süßwasser, Abwasseraufbereitungssschlamm und der menschlichen Darmu flora. Zusätzlich wurden in den meisten Analysen konventionell gewonnene Sequenzdaten vergleichend hinzugezogen und analysiert. KW - Bioinformatik KW - Metagenomomanalyse KW - GC-Wert KW - Enyzme KW - PKS KW - NHase KW - Nitrilase KW - Metagenomics KW - GC-value KW - enzymes KW - PKS KW - NHase KW - Nitrilase Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-33577 ER - TY - THES A1 - Hirsche, Jörg T1 - Metabole Regulation von Pollenentwicklung und Pollenkeimung durch Zucker T1 - Metabolic regulation of pollen development and pollen germination by sugars N2 - Invertasen spielen eine zentrale Rolle im Metabolismus der Pflanzen und werden über eine Vielzahl von Faktoren in ihrer Regulation beeinflusst. Invertasen mit pH-Optimum im sauren Bereich liegen dabei als vakuoläre und zellwandgebundene Isoformen einer Genfamilie in den Pflanzen vor. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zum ersten Mal 9 putative Invertasen aus der Nutzpflanze Brassica napus, sowie 4 weitere putative Mitglieder der bereits bekannten Tabakinvertasenfamilie isoliert und Expressionsprofile für die neu klonierten Invertasen erstellt. Symplastisch isolierte Zellen, wie z. B. Pollen und Pollenschläuche, sind auf die Expression zellwandgebundener Invertasen besonders angewiesen, da sie Kohlen-hydrate primär in Form von Fructose und Glucose aufnehmen, die über die Invertasen-vermittelte Spaltung aus Saccharose gebildet werden. An Tabak hatten Goetz et al. (2001) gezeigt, dass eine Inhibierung dieser pollen¬spezi¬fischen Invertaseaktivität zu männlich sterilen Pflanzen führt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde nachgewiesen, dass durch Inhibierung der Zellwandinvertase¬aktivität mittels Antisense-Technik oder Expression des proteinogenen Invertase-Inhbitors AtC/VIF2 auch männlich sterile Arabidopsis-Pflanzen generiert werden können. Ein Aktivitätsvergleich der Invertase-promotoren von Nin88 aus Tabak und AtcwINV2 aus Arabidopsis im jeweiligen homo- und heterologen System zeigte jedoch, dass der Einsatz dieser pollenspezifischen Promotoren zur Erzeugung männlich steriler Pflanzen über Familiengrenzen hinweg nicht möglich ist. Neben ihrer Funktion als Energieträger stellen Kohlenhydrate auch Signalmoleküle dar, die in die Regulation zentraler Prozesse der Pflanzen eingreifen. Anhand von Keimungsanalysen mit Arabidopsis-Pollen wurde festgestellt, dass Hexokinase-unabhängige Signalingwege involviert sein müssen, um ein Auskeimen der Pollen zu ermöglichen. Dabei kann die Hexokinase-vermittelte Inhibition der Pollenkeimung vermutlich durch die Beteiligung anderer Signaling-Wege aufgehoben werden. Es wurde außerdem die zuckerabhängige Ausbildung blasenartiger Strukturen an Arabidopsis-Pollen nachgewiesen, die vermutlich durch einen Zucker-spezifischen Abbruch des Pollenschlauchwachstums gebildet werden. N2 - Invertases with acid pH-optimum play a central role in plant metabolism and are regulated by numerous biotic and abiotic factors. They consist of vacuolar and extracellular isoforms of a gene family in plants. For the first time 9 putative members of the invertase family of Brassica napus, as well as 4 additional putative tobacco acid invertases were cloned in this work and expression profiles were analysed. Symplastically isolated cells, like pollen and pollen tubes, in particular depend on the expression of extracellular invertases, since they prefer the uptake of glucose and fructose. These hexoses are generated by the invertase-mediated cleavage of sucrose. Goetz et al. (2001) have shown on tobacco that inhibition of the pollen specific invertase activity lead to male sterile plants. In this work it was shown that inhibition of cell wall invertase activity via antisense technology or expression of the proteinaceous invertase inhbitor AtC/VIF2 also causes male sterility in Arabidopsis thaliana. Comparison of the promoter activities of the invertases Nin88 (tobacco) and AtcwINV2 (Arabidopsis) in the corresponding homo- and heterologous systems revealed that the use of these pollen specific promoters for generating male sterile plants is not possible in diverse plant families. Besides their function as energy source, carbohydrates are signaling molecules that influcence regulation of central processes in the plants. On the basis of germination assays with Arabidopsis pollen, it was shown that hexokinase-independent signaling pathways must be involved to permit normal pollen germination. In this context, hexokinase-mediated inhibition of pollen germination might be overrode by the involvement of other signaling pathways. In addition, the sugar-dependent generation of bubble-like structures at Arabidopsis pollen was demonstrated, which might be caused by the sugar-specific interruption of pollen tube growth. KW - Pollen KW - Ackerschmalwand KW - Invertase KW - Tabak KW - Raps KW - Sink-Source-Relation KW - Pollenschlauch KW - Signaling KW - Hexokinase KW - Pollenkeimung KW - Invertase-Inhibitor KW - männliche Sterilität KW - Zucker-Signaling KW - Promotoraktivität KW - pollen germination KW - pollen tube KW - sugar signaling KW - male sterility KW - promoter activity Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29654 ER - TY - THES A1 - Anschütz, Uta T1 - Physiologie und Biophysik der pflanzlichen Glutamatrezeptoren T1 - Physiology and biophysics of plant glutamate receptors N2 - In vorausgegangenen Experimenten unseres Labors war bereits gezeigt worden, dass die Applikation von Glutamat zur transienten Erhöhung der cytosolischen Calciumkonzentration sowie zu einer Depolarisation der Plasmamembran von Mesophyllzellen führt. Pharmakologische Studien weisen auf mögliche Orthologe tierischer ionotroper Glutamatrezeptoren (iGLuRs) hin. Ziel dieser Arbeit war eine vertiefte molekulare und funktionelle Analyse der Glutamatrezeptoren (GLRs) aus Arabidopsis thaliana. Dabei konnten folgende Erkenntnisse gewonnen werden: i. Zugabe von extrazellulärem Glutamat in Kombination mit Glycin führt in Abhängigkeit der extrazellulären ATP-Konzentration (eATP) zu einer transienten Erhöhung der Calciumkonzentration in Mesophyllzellen. ii. Die Reaktion von Mesophyllprotoplasten auf die Applikation von Glutamat und Glycin ist im Vergleich zum intakten Blatt stark reduziert, kann jedoch in Gegenwart von eATP oder Glucose signifikant gesteigert werden. iii. Diese Responsibilität von Mesophyllprotoplasten ist zum Zeitpunkt des Einsetzens der Zellwandsynthese (48h) am höchsten. iv. In Patch-Clamp Experimenten führt die photolytische Freisetzung von extrazellulärem caged-Glutamat bei 34 % der gemessenen A. thaliana Mesophyllprotoplasten zu einem verstärkten Kationentransport über die Plasmamembran. Dieser Kationenstrom kann durch gleichzeitige Anwesenheit von extrazellulärem ATP noch verstärkt werden und ist durch einen Desensitivierungsprozess gekennzeichnet. Die Empfindlichkeit dieser Ströme gegenüber Antagonisten tierischer iGluRs stellt eine Verbindung zu der Genfamilie der AtGLRs dar. v. Coexpressionexperimente ausgewählter AtGLRs geben erste Hinweise auf eine Homo- bzw. eine Heteromerbildung von AtGLR1.1 und AtGLR1.4. Aufgrund fehlender Kanalaktivität konnten einzelne, in Oozyten exprimierte AtGLRs bislang nicht funktionell charakterisiert werden. vi. Studien zur transienten und stabilen Überexpression im homologen Expressionssystem zeigen einen cytotoxischen Effekt bei funktioneller Überexpression ausgewählter AtGLRs. vii. Die Analyse der Stellung des Glutamatrezeptors 3.4 in kälteregulierten Signalnetzwerken via Microarrays weist auf ein überlappendes Aufgabenspektrum der Familie der AtGLRs hin. viii. Im Rahmen von Microarray Transkriptionsanalysen an der glr3.4-1 Mutante konnte ein bisher nicht charakterisiertes, co-reguliertes Protein identifiziert werden. Dieses Protein ist durch den Besitz einer transmembranen Region sowie einer ATP-Bindedomäne charakterisiert und könnte einen möglichen Regulator des AtGLR3.4-Kanals darstellen. ix. Die Überprüfung einer möglichen Beteiligung der pflanzlichen Glutamatrezeptoren an der Generierung der glutamatabhängigen Ca2+-Signale sowie die Suche nach Regulatoren bzw. fehlenden Untereinheiten erfolgte mithilfe Mutanten-„Sreenings“. Die Analyse der bis dato identifizierten, Glutamat-insensitiven Mutanten konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht abgeschlossen werden. N2 - Preliminary work has shown that glutamate application results in a transient increase of cytosolic calcium and leads to a depolarisation of the plasma membrane potential in Arabidopsis mesophyll cells. Pharmacological studies indicate that orthologs of mammalian ionotropic glutamate receptors (iGLuRs), members of the AtGLR family, participate in this process. Aim of this work was to analyse the molecular and functional properties of Arabidopsis thaliana glutamate receptors (GLRs). During the course of this work the following results were obtained: i. The extracellular application of glutamate in combination with glycine leads to a transient rise in cytosolic calcium concentration in Arabidopsis mesophyll cells which was strongly enhanced in the presence of extracellular ATP (eATP). ii. The response of mesophyll protoplasts upon an application of glutamate and glycine was strongly reduced in comparison to intact leaves, but was increased significantly in the presence of eATP or glucose. iii. This response peaked out at the inset of cell wall synthesis i.e. after 48 hours. iv. After a photolytic release of caged-glutamate the probability of observing glutamate-activated cation currents across the plasmamembrane was about 34 % of all measured A. thaliana. mesophyll protoplasts. The observed cationic currents could be further stimulated in the presence of eATP and were characterized by desensitization. The responsiveness of these currents to antagonists of mammalian iGluRs constitutes a connection to the gene family of the AtGLRs. v. Coexpression-experiments of selected AtGLRs provide a first indication to a homo- and heteromerization of AtGLR1.1 and AtGLR1.4. Due to channel inactivity of individual AtGLRs expressed in oocytes, a functional characterization, however, was not possible so far. vi. Transient and stable overexpression in homologous expression systems indicated a cytotoxic effect, when individual AtGLR were functionally overexpressed. vii. Analysis of AtGLR3.4 function in cold-induced signal transduction networks via microarrays point to overlapping tasks among members of the glutamate-receptor-family. viii. The microarray-transcript-analysis of the glr3.4-1 mutant resulted in the identification of a not yet characterized, co-regulated gene. The deduced protein contains a putative signal peptide, a single transmembrane region, as well as an ATP-binding domain and could represent a putative regulator of the AtGLR3.4-channel. ix. Participation of plant glutamate receptors in generating glutamate-dependent calcium signals as well as the search for novel regulators was carried out by using an EMS-based mutant-screening procedure. The analysis of the so far identified, glutamate-insensitive mutants could not be completed within this thesis. KW - Glutamate KW - Glutamatrezeptor KW - GLR KW - Arabidopsis KW - eATP KW - caged glutamate KW - GLR KW - Arabidopsis KW - eATP KW - caged glutamate Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29438 ER - TY - THES A1 - Qiu, Liyan T1 - Structural and functional analysis of crossveinless 2 / BMP-2 /Chordin interaction N2 - No abstract available KW - structure KW - protein KW - BMP Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29249 ER - TY - THES A1 - Marten, Holger T1 - Rolle und Regulation von Anionenkanälen während der Stomabewegung als Reaktion auf Licht, CO2 und Wasserstress T1 - Role and regulation of anion channels during stomatal movements in response to light, CO2 and water stress N2 - Die Stomata in der Epidermis von Pflanzen sind Poren, die den Gasaustausch mit der Atmosphäre regulieren. Die Öffnungsweite der Stomata kann verändert werden, was eine Optimierung der CO2 Aufnahme für die Photosynthese ermöglicht und gleichzeitig den Wasserverlust durch Transpiration minimiert. Um diese Funktion zu erfüllen, können Stomata verschiedene Stimuli wie Wasserstress (durch Abscisinsäure), Licht und CO2 wahrnehmen. Die oben genannten Reize führen dann zu einer Aufnahme oder Abgabe von osmotisch aktiven Substanzen in zwei Schließzellen, welche die Stomaöffnung kontrollieren. Die Rezeptoren zur Wahrnehmung dieser Stimuli, die intrazellulären Signalwege und die beteiligten Ionentransportproteine in den Schließzellen sind nur lückenhaft bekannt. In dieser Arbeit lag ein Hauptaugenmerk auf der Rolle von Anionenkanälen der Plasmamembran bei Stomabewegungen, sowie auf den Signalwegen welche diese Kanäle steuern. Die Aktivität der Anionenkanäle wurde mit der DEVC (Double Electrode Voltage Clamp) Einstich-Methode in Schließzellen in der intakten Pflanze gemessen, kombiniert mit Calcium Imaging durch den Ca2+ Indikator Farbstoff FURA2. Stomaschlussreaktionen werden durch Abscisinsäure (ABA), CO2 und Dunkelheit induziert und bei allen drei Stimuli konnten wir in Nicotiana tabacum eine Aktivierung von Anionenkanälen beobachten. Das führt zu Anionenefflux aus den Schließzellen und einer Depolarisation der Plasmamembran, was wiederum Kalium-Efflux-Kanäle spannungsabhängig aktiviert. Der resultierende Verlust osmotisch aktiver Teilchen führt dann zu Turgorabnahme der Schließzellen und Stomaschluss. Das zeitliche Muster der Anionenkanalaktivität bei dem Stomaschluss, ausgelöst durch CO2, Dunkelheit und ABA war bei allen Reizen ähnlich. Es zeigte sich eine charakteristische transiente starke und darauf folgende schwächere Anionenkanalaktivität. Dieses konservierte Muster lässt Überschneidungen bei der Signaltransduktion der verschiedenen Stimuli vermuten. Die gesteigerte Aktivität der Anionenkanäle während der Reaktion auf ABA und Dunkelheit wurde in ungefähr der Hälfte der Antworten von einem Anstieg der zytosolischen Ca2+ Konzentration begleitet. Bei beiden Stimuli scheinen somit Ca2+ abhängig und unabhängig Signale intrazellulär weitergeleitet zu werden. Allerdings war der Effekt der Ca2+ Signale auf die Aktivität der Anionenkanäle bei den beiden Stimuli unterschiedlich. Eine zytosolisch erhöhte Ca2+ Konzentration konnte bei Antworten auf ABA nicht mit einer erhöhten Anionenkanalaktivität in Verbindung gebracht werden, bei Dunkelheit hingegen wurde die Aktivität der Anionenkanäle in Anwesenheit von Ca2+ gesteigert. Die wichtige Rolle von Anionenkanälen beim Stomaschluss lässt vermuten, dass ihre Deaktivierung eine Vorraussetzung für eine Stomaöffnung ist. Blaulicht führt bei niedrigen Photonen-Fluss Raten zu Stomaöffnung und sollte daher Anionenkanäle inhibieren. Übereinstimmend damit konnten wir tatsächlich zeigen, dass Blaulicht in Schließzellen von Vicia faba und Arabidopsis thaliana Anionenkanäle deaktiviert. Diese Deaktivierung ist von den Phototropin-Blaulichtrezeptoren abhängig, da die Deaktivierung der Anionenkanäle in Arabidopsis thaliana phot1/phot2 Doppelmutanten nicht beobachtet werden konnte. Neben einer Blaulicht spezifischen Antwort öffnen Stomata auch in Antwort auf photosynthetisch aktive Strahlung (PAR). Die PAR Wahrnehmung scheint zu einem wesentlichen Teil über Veränderungen der interzellulären CO2 Konzentration, ausgelöst durch die Photosyntheseaktivität des Mesophylls, stattzufinden (Roelfsema et al., 2002). In Übereinstimmung mit dieser Hypothese konnten wir in Schließzellen in Albino Blattarealen von Chlorophytum comosum und gebleichten Vicia faba keine Reaktion auf PAR beobachten, obwohl Schließzellen von Chlorophytum comosum in Albino Bereichen funktionierende Chloroplasten besitzen. Die Rolle von CO2 bei der PAR Antwort haben wir des Weiteren in NtMPK4 antisense Pflanzen untersucht. Stomata von NtMPK4 antisense Pflanzen haben nicht auf Änderungen in der atmosphärischen CO2 Konzentration reagiert und zeigten eine stark reduzierte Antwort auf PAR. Diese Ergebnisse bestätigen die wichtige Rolle der intrazellulären CO2 Konzentration bei der PAR Antwort, sie zeigen aber auch, dass es anscheinend zusätzlich zu CO2 noch ein weiteres PAR abhängiges Signal für Stomaöffnung gibt. N2 - Stomata in the epidermis of plants are pores, which regulate the gas exchange with the atmosphere. The aperture of these stomata can be altered and thus enable the plant to optimize the uptake of CO2 for photosynthesis, while minimizing loss of water via transpiration. To fulfil this function, stomata are able to sense several stimuli like water stress (through abscisic acid), light and CO2. The mentioned stimuli can induce accumulation in or release of osmotically active substances from two guard cells that control the stomatal aperture. The receptors for perception of these stimuli, the intracellular signal transduction pathways and the involved ion transporters of the guard cells are only partially resolved. This work focuses on the role of plasma membrane anion channels during stomatal movements and the signal transduction pathways that controls these channels. The activity of the anion channels was studied with the DEVC (double electrode voltage clamp) impalement method, in combination with FURA2 based calcium imaging in guard cells located in intact plants. Closure of stomata is induced by abscisic acid (ABA), CO2 and darkness and all these stimuli were found to activate anion channels in Nicotiana tabacum. This response not only leads to an anion efflux from the guard cells, but also causes depolarization of the plasma membrane, which in turn activates voltage dependent potassium efflux channels. As a result, osmotically active particles are lost, causing a decrease of the guard cell turgor and stomatal closure. The timing of anion channel activation in response to CO2, darkness and ABA displayed a similar pattern for all three stimuli. It was characterized by a transient strong-, followed by a steady low activity of anion channels. This conserved pattern suggests conserved steps in the signal transduction pathways of these stimuli. The activation of anion channels in response to ABA and darkness was in approximately half of the responses accompanied by an increase in the cytosolic Ca2+ concentration. This suggests that ABA and darkness are transmitted through Ca2+-dependent as well as Ca2+-independent signalling pathways. However, the effect of Ca2+ signals on the degree on anion channel activity differed for both stimuli. During ABA responses, an increase in the cytosolic Ca2+ concentration could not be linked to enhanced anion channel activity, but Ca2+ signals were related to large anion currents in responses to darkness. The important role of anion channels for inducing stomatal closure suggests that their deactivation is a prerequisite for stomatal opening. Blue light provokes stomatal opening, at low photon flux densities, and thus should inhibit anion channels in guard cells. We were able to show that blue light indeed deactivates anion channels in Vicia faba and Arabidopsis thaliana. This response depends on phototropin blue light receptors, because it was not observed in Arabidopsis thaliana phot1/phot2 double mutants. In addition to a blue light-specific response, stomata open in response to photosynthetically active radiation (PAR). The perception of PAR seems to depend mainly on a decrease of the intercellular CO2 concentration, which is caused by photosynthetic activity of the mesophyll (Roelfsema et al., 2002). In agree with this proposed mechanism, we observed no response to PAR in guard cells located in albino leaf areas of Chlorophytum comosum and bleached Vicia faba, even though guard cells of Chlorophytum comosum in albino areas contain functional chloroplasts. We further studied the role of CO2 in the PAR response with NtMPK4 antisense plants. Stomata of NtMPK4 silenced plants did not respond to changes in the atmospheric CO2 concentration and showed a strongly reduced response to PAR. These data thus confirms the important role of intracellular CO2 in the PAR response, but also point to an additional PAR dependent signal for stomatal opening. KW - Elektrophysiologie KW - Ionenkanal KW - Abscisinsäure KW - Phototropine KW - Schließzellen KW - CO2 Reaktion KW - Phototropins KW - Guard Cells KW - CO2 Response KW - Abscisic Acid Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29349 ER - TY - GEN A1 - Rostás, Michael A1 - Ruf, Daniel A1 - Zabka, Vanessa A1 - Hildebrandt, Ulrich T1 - Plant surface wax affects parasitoid's response to host footprints N2 - The plant surface is the substrate upon which herbivorous insects and natural enemies meet and thus represents the stage for interactions between the three trophic levels. Plant surfaces are covered by an epicuticular wax layer which is highly variable depending on species, cultivar or plant part. Differences in wax chemistry may modulate ecological interactions. We explored whether caterpillars of Spodoptera frugiperda, when walking over a plant surface, leave a chemical trail (kairomones) that can be detected by the parasitoid Cotesia marginiventris. Chemistry and micromorphology of cuticular waxes of two barley eceriferum wax mutants (cer-za.126, cer-yp.949) and wild type cv. Bonus (wt) were assessed. The plants were then used to investigate potential surface effects on the detectability of caterpillar kairomones. Here we provide evidence that C. marginiventris responds to chemical footprints of its host. Parasitoids were able to detect the kairomone on wild type plants and on both cer mutants but the response to cer-yp.949 (reduced wax, high aldehyde fraction) was less pronounced. Experiments with caterpillar-treated wt and mutant leaves offered simultaneously, confirmed this observation: no difference in wasp response was found when wt was tested against cer-za.126 (reduced wax, wt-like chemical composition) but wt was significantly more attractive than cer-yp.949. This demonstrates for the first time that the wax layer can modulate the detectability of host kairomones. KW - Brackwespen KW - Wirtsfindung KW - Gerste KW - Mutante KW - Pflanzenwachs Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29201 ER - TY - THES A1 - Efetova, Marina T1 - Molekulare Mechanismen einer wechselseitigen Kontrolle der Arabidopsis-Agrobacterium-Interaktion T1 - Bidirectional control of Arabidopsis-Agrobacteria interactions; an analysis of underlying molecular mechansisms. N2 - Phytohormone sind wichtige Signalmoleküle bei der durch Agrobacterium tumefaciens vermittelten Tumorgenese. Zum einen sind sie direkt am onkogenen Prozess beteiligt, indem sie die Proliferation von transformierten Zellen fördern und physiologische Anpassungen im entstehenden Tumor steuern. Auf der anderen Seite vermitteln Phytohormone aber auch Abwehrreaktionen der Pflanze als Folge eines Befalls mit onkogenen Pathogenen. Um diese verschiedenen Wirkungen der Phytohormone während der Tumorgenese besser zu verstehen, wurde die Genexpression durch Microarrays zu unterschiedlichen Zeitpunken dieses Prozesses an der Modellpflanze Arabidopsis thaliana charakterisiert und die Rolle ausgewählter Phytohormone, wie Abscisinsäure, Salizylsäure, Jasmonsäure, Ethylen und H2O2 durch Mutanten in entsprechenden Signalwegen funktionell untersucht. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass die bekannten Pathogenabwehrwege bei Befall durch onkogene Agrobacterien mit einer zeitlichen Verzögerung aktiviert werden. Diese Verzögerung wird wahrscheinlich durch das vom Bakterium abgegebene Auxin reguliert, und somit könnte dieses Auxin die Integration der T-DNA indirekt fördern. Sind die pflanzlichen Abwehrmechanismen jedoch vor dem Transformationsprozess aktiviert, wie z.B. in cpr5–Mutanten, kann die T-DNA nicht integrieren und es entsteht kein Tumor. Beim Wildtyp akkumulieren in Folge der T-DNA Integration mit Pathogenabwehr assoziierte Signalmoleküle, wie H2O2, Ethylen und Salizylsäure, nicht aber Jasmonsäure. Die Analyse des Tumorwachstums an Mutanten mit unterschiedlichen Defekten in diesen Signalwegen zeigte jedoch, daß Ethylen und Salizylsäure keinen Einfluß auf das Tumorwachstum haben. Vielmehr regulieren Ethylen und H2O2 morphologische Anpassungen und Adaptationen an Trockenstress in Tumoren. Die von Agrobacterium tumefaciens induzierten Tumore beziehen außer Nährstoffe, vor allem Wasser von der Wirtspflanze. Das Fehlen einer intakten Epidermis oder Kutikula führt allerdings zu unkontrolliertem Wasserverlust. Da aber weder der Tumor noch die Pflanze welken, muss eine Trockenstressadaptation stattzufinden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Phytohormone Abscisinsäure (ABA) und Ethylen an diesem Prozess beteiligt sind. Zum einen regulieren sie die Akkumulation von Osmoregulatoren, sowie Suberineinlagerungen in den äußeren Zellschichten des Tumors, wodurch eine dem Periderm ähnliche Schutzschicht entsteht. Diese Suberinisierung wird im Tumor wahrschein-lich von ABA induziert, wie Experimente an Arabidopsis Wurzeln belegten. Die Microarray-Analysen ergaben, dass im Tumor ein spezielles Muster an ABA- und Trockenstress-induzierten Markergene exprimiert wird, sowie einigen Aquaporinen, die den erhöhten Wasserbedarf des Tumors regulieren könnten. Das verminderte Tumorwachstum an abi- and aba-Mutanten belegt die Bedeutung von ABA-Signalen für die Homeostase des Wasser-haushalts im Tumor. N2 - Phytohormones are important signaling molecules involved in Agrobacterium tumefaciens mediated tumor development. On the one hand, they are directly involved in the infection process by supporting proliferation of transformed plant cells and mediating physiological adaptations of the developing tumor. On the other hand, phytohormones also mediate defense responses of the host plant upon bacterial infection. In order to get further insight into these supplementary roles of phytohormones during tumor development, microarray techniques have been used to analyze changes in gene expression of Arabidosis thaliana upon infection with Agrobacterium tumefaciens at distinct time points during tumor development. The functional relevance of selected phytohormones, e.g. abscisic acid, salicylic acid, jasmonic acid, ethylene and H2O2 was analyzed by the use of Arabidopsis mutants with defects in the respective signaling pathways. This work suggests a delayed activation of the well known defence response pathways to take place upon infection by agrobacteria. This delay is most likely mediated by auxin, which is synthesized and secreted by the bacteria. Hence, auxin indirectly promotes T-DNA integration by causing delay of the plant´s defence responses. However, if pathogen defence is active before agrobacterial infection, e.g. in cpr5 mutant plants, T-DNA integration is prevented and tumor growth cannot be observed. Signaling molecules associated with defence responses, e.g. H2O2, ethylene and salicylic acid, but not jasmonic acid accumulate due to T-DNA integration in wild type plants. However, Arabidopsis mutants with defects along the ethylene or salicylic acid signalling pathways revealed wild type like tumor development neglecting their involvement in tumor associated defence responses. Rather, this work supports the hypothesis that ethylene and H2O2 are involved in regulating tumor morphology and drought stress adaptations. Crown gall tumours induced by Agrobacterium tumefaciens represent a sink that is provided with nutrients and water by the host plant. The lack of an intact epidermis or cuticle results in uncontrolled loss of water. However, neither the tumor nor the host plant display wilting. This phenomenon points to drought stress adaptations in both, tumours and the host plant. In order to understand the protecting molecular mechanisms against desiccation, the gene expression pattern of Arabidopsis thaliana tumors was compared with the profile of stress metabolites: Arabidopsis tumors accumulated high amounts of ABA, the ethylene precursor ACC, osmoprotectants and form a suberized periderm-like layer. Suberization of the outer tumor cell layers most likely is mediated by ABA since external application of ABA induced suberization of Arabidopsis roots. However, the expression level of the classical marker genes, known to respond to drought stress and/or ABA, was lower in tumors. Instead another set of drought and/or ABA-inducible genes, was higher transcribed. Elevated transcription of several ABA-dependent aquaporin genes might indicate that ABA controls the water balance of the tumor. The retarded tumor growth on abi and aba mutant plants underlined the importance of a tumor-specific ABA signaling pathway. Taken together, we propose that ABA is an important signal for protection of tumors against desiccation and thus supports tumor development. KW - Agrobacterium tumefaciens KW - Arabidopsis KW - Phytohormone KW - Pathogenabwehr KW - Trockenstress KW - Agrobacterium KW - crown gall KW - defence response KW - innate immunity KW - dehydration Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28475 ER - TY - THES A1 - Kraich, Michael T1 - Strukturelle und funktionelle Untersuchungen der Interaktion zwischen Ligand und Rezeptor im Interleukin-4- und Interleukin-13-System T1 - Structural and functional studies of the interaction between ligand and receptor in the interleukin-4 and interleukin-13 system N2 - Interleukin-4 (IL-4) und Interleukin-13 (IL-13) sind bedeutende Regulatorproteine des Immunsystems. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und dem Verlauf von allergischen Erkrankungen, wie z.B. Asthma. Um ihre Signale in die Zielzelle zu transduzieren, kann von beiden Zytokinen der gleiche Zelloberflächenrezeptor verwendet werden, wodurch sich die überlappenden, biologischen Funktionen erklären lassen. Dieser gemeinsam genutzte Rezeptor ist aus den beiden Untereinheiten IL-4Ralpha; und IL-13Ralpha1 aufgebaut. Da IL-4 und IL-13 auf Aminosäureebene nur etwa 25% Sequenzidentität besitzen und stark unterschiedliche Affinitäten zu den beiden Rezeptorketten besitzen, stellt sich die Frage, durch welchen molekularen Erkennungsmechanismus, die Affinität und die Spezifität der Ligand-Rezeptor-Interaktion unabhängig voneinander reguliert werden kann. In dieser Arbeit gelang es, rekombinante Expressions- und Aufreinigungsstrategien für IL-13 und die extrazellulären Domänen der Rezeptorketten IL-13Ralpha1 und IL-13Ralpha2 zu entwickeln. Dadurch war es mögliche, eine breite Mutations-/Interaktionsanalyse der IL-13Ralpha1-Kette durchzuführen.Es konnte gezeigt werden, dass die N-terminale FnIII-ähnliche Domäne von IL-13Ralpha1 sowohl an der Bindung von IL-13 als auch an der Interaktion mit IL-4 beteiligt ist. Im funktionellen Bindeepitop der IL-13Ralpha1-Kette wurden die Aminosäurereste Arg84, Phe253 und Tyr321 als Hauptbindungsdeterminanten für die Interaktion mit IL-13 identifiziert. Durch die Interaktionsstudien der IL-13Ralpha1-Varianten mit IL-4 wurde gezeigt, dass diese Hauptbindungsdeterminanten auch für die niederaffine Bindung von IL-4 von größter Bedeutung sind. Die funktionellen Bindeepitope für IL-4 und IL-13 auf der IL-13Ralpha1-Kette sind nahezu identisch und überlappen in einem großen Bereich. Aufgrund der Ergebnisse aus der Mutagenesestudie war es möglich, ein Strukturmodell der extrazellulären Domäne der IL-13Ralpha1-Kette zu erstellen. Darin wird eine neuartige Orientierung der N-terminalen FnIII-Domäne und deren Beteiligung an der Ligandeninteraktion dargestellt. Mit Hilfe des Strukturmodells gelang es, neue Aminosäurerest auf der Oberfläche von IL-13 zu identifizieren, die an der Bindung zu IL-13Ralpha1 beteiligt sind, was die Relevanz des Strukturmodells weiter unterstreicht. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurde versucht, den molekularen Mechanismus aufzuklären, durch den es den superagonistischen IL-4-Varianten T13D und F82D gelingt, mit dreifach höherer Affinität an die IL-4Ralpha-Kette zu binden, als wildtypischer Ligand. Durch strukturelle und funktionelle Untersuchungen wurde gezeigt, dass der Affinitätssteigerung ein indirekter Mechanismus zugrunde liegt, bei dem eine Konformationsänderung und die Fixierung der Arg85-Seitenkette von IL-4 zur Ausbildung von zusätzlichen Ligand-Rezeptor-Interaktionen führt. Das Bindeepitop zwischen IL-4 und der IL-4Ralpha-Kette besitzt eine modulare Architektur aus drei unabhängig voneinander agierenden Interaktionsclustern. Bei der Interaktion von wildtypischem IL-4 mit IL-4Ralpha tragen nur zwei dieser Cluster in signifikanter Weise zur freien Bindeenergie bei. Im Falle der superagonistischen IL-4-Varianten ist jedoch auch das dritte Cluster an der Generierung von zusätzlicher, freier Bindeenergie beteiligt, wodurch die Affinität zwischen Ligand und Rezeptor erhöht wird. Damit stellt der modulare Aufbau der Interaktionsfläche zwischen IL-4 und der IL-4Ralpha-Kette möglicherweise einen Mechanismus dar, über den Proteine die Affinität von Wechselwirkungen über einen großen Bereicht variieren können, ohne dabei Spezifität einzubüssen. Da IL-4 und IL-13 als interessante Zielmoleküle für die Therapie von allergischen und asthmatischen Erkrankungen erkannt worden sind, können die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Informationen über den Bindemechanismus und die Einblicke in den molekularen Charakter der Interaktion zwischen den beiden Zytokinen und ihren spezifischen Rezeptorketten dabei helfen, neuartige und hoch spezifische, inhibitorische Moleküle zu entwickeln. N2 - Interleukin-4 (IL-4) and Interleukin-13 (IL-13) are important regulatory proteins of the immune system. They play a key role in the development and the progression of allergic diseases like asthma. For signal transduction into the target cell, both cytokines can use an identical cell surface receptor, which is an explanation for many overlapping biological functions of IL-4 and IL-13. This common receptor consists of the two subunits IL-4Ralpha and IL-13Ralpha1. Because IL-4 and IL-13 share only 25% sequence identity on the amino acid sequence level and because they show very different affinities to the two receptor chains, the question has to be raised, by which molecular recognition mechanism it is possible to regulate affinity and specificity of the ligand-receptor-interaction independently. In the course of this work recombinant expression and purification strategies for IL-13 and the extracellular domains of IL-13Ralpha1 and IL-13Ralpha2 were established. Therefore it was possible to perform a broad mutagenesis and interaction analysis of the IL-13Ralpha1 chain. It was shown, that the N-terminal FnIII-like domain of IL-13Ralpha1 participates in the binding of IL-13 as well as in the interaction with IL-4. As part of the functional epitope the amino acid residues Arg84, Phe253 and Tyr321 were identified to be main binding determinants for the interaction with IL-13. By carrying out interaction studies with IL-4 it could be demonstrated, that the same residues are also from great importance for the low affinity binding of IL-4. The functional epitopes for the binding of IL-4 and IL-13 are almost identical and are overlapping in a large area. Due to the results of the mutagenesis study it was possible to generate a structural model of the extracellular domain of the IL-13Ralpha1 chain. A key feature of this model is the novel orientation of the N-terminal FnIII-like domain and its involvement in ligand binding. According to the modelled structure new residues in IL-13 could be identified, that participate in the interaction with the IL-13Ralpha1. This further underlines the relevance of the shown structural model of the extracellulardomain of the IL-13Ralpha1 chain. In a different part of this work it was tried to elucidate the molecular mechanism, which enables the super-agonistic IL-4 variants T13D and F82D bind IL-4Ralpha with three times higher affinity than wildtype IL-4. With the help of structural und functional analysis it could be shown, that an indirect mechanism leads to the gain of affinity. A conformational change in and the fixation of the Arg85 side chain in IL-4 result in the formation of additional interactions between ligand and receptor. The binding interface between IL-4 and IL-4Ralpha exhibits a modular architecture consisting of three independently acting interaction clusters. For the binding of wild-type IL-4 to the IL-4Ralpha chain only two of the three clusters contribute a significant amount to the overall free binding energy. In the case of the super-agonistic IL-4 variants all three interaction clusters are used to generate additional free binding energy and to increase the affinity between ligand and receptor. Therefore the modular design of the IL-4/IL-4Ralpha interaction interface probably represents a mechanism, which enables proteins to alter the affinity of interactions over a broad range without loosing specificity. Because IL-4 and IL-13 were discovered as promising targets for the therapy of allergic and asthmatic diseases, the acquired information about the binding mechanism and the molecular characteristics of the interaction between the cytokines IL-4 and IL-13 and their specific receptor chains may help to design novel and highly specific inhibitory molecules. KW - Renaturierung KW - Ligand KW - Biochemie KW - Interleukin 4 KW - Interleukin 13 KW - Interaktion KW - Rezeptor KW - Immunologie KW - Allergie KW - Allerg KW - Proteinbiochemie KW - BIAcore KW - Oberflächenplasmonresonanz (SPR) KW - Strukturbiologie KW - interleukin-4 KW - interleukin-13 KW - protein interaction KW - BIAcore KW - structural biology Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27655 ER - TY - THES A1 - Konrad, Kai Robert T1 - Untersuchung zu den frühen ABA-induzierten elektrischen Reaktionen in Schließzellen von Vicia faba T1 - Investigation of the early ABA-induced electric responses of Vicia faba guard cells N2 - Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Perzeption und frühe Signaltransduktion des Phytohormons ABA in Schließzellprotoplasten von Vicia faba mittels der Patch-Clamp-Technik untersucht. Es wurde entdeckt, dass der ABA-Signaltransduktionskette zur Aktivierung von Plasmamembran-ständigen Anionenkanälen voraussichtlich eine Proteinkinase beinhaltet und durch eine cytosolische ABA-Perzeption ausgelöst wird. Die durch ABA-bewirkte Anionenkanal-Aktivierung verursacht in Schließzellen eine Plasmamembran-Depolarisation. Basierend auf der ABA-induzierten Schließzellen-Depolarisation wurde zudem eine Methode etabliert, um mit dem Spannungs-sensitiven Farbstoff DiBAC4(3) in Populationen von intakten Vicia faba-Schließzellprotoplasten Membranpotential-Änderungen zu quantifizieren. N2 - Within the framework of this dissertation the perception and early signal transduction chain of the phytohormon ABA was investigated with the Patch-Clamp-technique in Vicia faba guard cell protoplasts. It was discovered that the ABA-signalling chain to activate plasma-membrane anion channels likely implied a protein kinase and was triggered through a cytosolic ABA-perception. The ABA-induced anion channel activation leads to plasma membrane depolarization. Based on the ABA-evoked depolarization response a method was developed to monitor and quantify membrane potential changes in populations of Vicia faba guard cell protoplasts with the voltage-sensitive dye DiBAC4(3). KW - Schließzelle KW - Membranpotenzial KW - Anionentranslokator KW - Ackerbohne KW - Abscisinsäure KW - DiBAC4(3) KW - guard cell KW - anion channel KW - membrane potential KW - abscisic acid KW - DiBAC4(3) Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27216 ER - TY - JOUR A1 - Rostás, Michael A1 - Eggert, Katharina T1 - Ontogenetic and spatio-temporal patterns of induced volatiles in Glycine max in the light of the optimal defence hypothesis N2 - Plants attacked by herbivorous insects emit a blend of volatile compounds that serve as important host location cues for parasitoid wasps. Variability in the released blend may exist on the whole-plant and within-plant level and can affect the foraging efficiency of parasitoids. We comprehensively assessed the kinetics of herbivore-induced volatiles in soybean in the context of growth stage, plant organ, leaf age, and direction of signal transport. The observed patterns were used to test the predictions of the optimal defence hypothesis (OD). We found that plants in the vegetative stage emitted 10-fold more volatiles per biomass than reproductive plants and young leaves emitted >2.6 times more volatiles than old leaves. Systemic induction in single leaves was stronger and faster by one day in acropetal than in basipetal direction while no systemic induction was found in pods. Herbivore-damaged leaves had a 200-fold higher release rate than pods. To some extent these findings support the OD: i) indirect defence levels were increased in response to herbivory and ii) young leaves, which are more valuable, emitted more volatiles. However, the fact that reproductive structures emitted no constitutive or very few inducible volatiles is in seeming contrast to the OD predictions. We argue that in case of volatile emission the OD can only partially explain the patterns of defence allocation due to the peculiarity that volatiles act as signals not as toxins or repellents. KW - Chemische Ökologie KW - Pflanzeninhaltsstoff KW - Verteidigung KW - Pflanzenfressende Insekten KW - Indirekte Abwehr KW - Sojabohne KW - Spodoptera frugiperda KW - Tritrophische Interaktionen KW - indirect plant defence KW - soybean KW - Spodoptera frugiperda KW - tritrophic interactions Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26991 ER - TY - THES A1 - Zabka, Vanessa T1 - The Plasticity of Barley (Hordeum vulgare) Leaf Wax Characteristics and their Effects on Early Events in the Powdery Mildew Fungus (Blumeria graminis f.sp. hordei): Interactive Adaptations at the Physiological and the Molecular Level T1 - Die Plastizität von Blattwachsen der Gerste (Hordeum vulgare) und deren Effekte auf initiale Ereignisse der Mehltaukrankheit (Blumeria graminis f.sp. hordei): wechselseitige Anpassungen auf physiologischer und molekularer Ebene N2 - In order to test the effects of environmental factors on different characteristics of plant leaf waxes, barley plants (Hordeum vulgare) were abiotically stress treated (exposure to darkness, heavy metal, high salt concentrations and drought), and biotically stressed by the infection with powdery mildew (Blumeria graminis f.sp. hordei; Bgh). Different wax parameters like amount, chemical composition, and micromorphology of epicuticular wax crystals, were investigated. Etiolated leaves of barley showed distinctly reduced wax amounts and modifications in their relative composition. The alterations of these wax parameters might be a result of a developmental delay, which could have been caused by a decreased availability of energy for cellular processes, due to lack of light. Cadmium exposure led to a 1.5-fold increase of wax amount, while chemical composition was unaffected. In drought- and salt-stressed plants, all investigated leaf wax parameters remained unaltered. In each of the abiotic treatments, the microstructure of epicuticular wax crystals, formed as typical platelets, was not modified. Even after 6d infection with powdery mildew (Bgh), neither locally nor systemically enforced modifications of wax features were revealed. The analyzed leave surfaces, resulting from these four abiotic and the biotic treatment (phenotypic approach), were compared to altered leaf surfaces’ characteristics of 18 analyzed eceriferum (cer-) wax mutants (genotypic approach). Within the screening, 5 mutants were selected which distinctly differed from the wild-type in wax amount, portions of epi- and intracuticular wax fraction, relative chemical composition, crystal morphology, and surface wettability (hydrophobicity). Apart from quantitative and qualitative effects on the leaf waxes, environmentally enforced modifications in cuticular waxes might be reflected in molecular processes of wax biogenesis. Therefore, a barley wax-microarray was established. 254 genes were selected, which are putatively involved in processes of de novo fatty acid biosynthesis, fatty acid elongation, and modification, and which are supposed to take part in lipid-trafficking between cell compartments, and transport of wax components to the outer cell surface. The regulations within the expression pattern evoked by the respective treatments were correlated with the corresponding analytical wax data, and the observed molecular effects of a 3d powdery mildew infection were compared with succeeding fungal morphogenesis. Etiolation and cadmium exposition pointed to transcriptional modifications in the de novo fatty acid synthesis, and in the screened, transport-related mechanisms, which correlate with respective alterations in surface wax characteristics. Moderate changes in the gene expression pattern, evoked by drought- and salinity-stress, might give hints for evolved adaptations in barley to such common habitat stresses. Theinvasion of powdery mildew into the epidermal host cells was reflected in the regulation of several genes. Beside other functions, these genes take part in pathogen defense, and intracellular component transport, or they encode transcription factors. The different modifications within the molecular responses evoked by the investigated abiotic treatments, and the effects of powdery mildew infection representing a biotic stressor, were compared between the different treatments. In order to test the potential impact of different wax parameters on Bgh, conidia germination and differentiation was comparably investigated on leaf surfaces of abiotically stressed wild-type and cer-mutants, isolated cuticles, and further artificial surfaces. The rates of conidial development were similar on each of the leaf surfaces resulting from the abiotic treatments, while a significant reduction of the germination and differentiation success was revealed for the wax mutant cer-yp.949. Compared to the wild-type, developmental rates on isolated cuticles and extracted leaf waxes of the mutant cer-yp.949 indicated a modified embedding of cuticular waxes, and a possibly changed three-dimensional structure of the cer-yp.949 cuticle, which might explain the reduced conidial developmental rates on leaf surfaces of this particular mutant. Experiments with Bgh conidia on mechanically de-waxed leaf surfaces (selective mechanical removal of the epicuticular leaf waxes with glue-like gum arabic, followed by an extraction of the intracuticular wax portion with chloroform) demonstrated the importance of the wax coverage for the germination and differentiation of the fungal conidia. On all dewaxed leaf surfaces, except those of cer-yp.949, the differentiation success of the germlings was significantly reduced, by about 20% (“wax-effect”). This result was verified through an artificial system with increased conidia developmental rates on glass slides covered with extracted leaf waxes. Further comparative tests with the major components of barley leaf wax, hexacosanol and hexacosanal, showed that the germination and differentiation of powdery mildew conidia not only depends on the different chemistry, but is also influenced by the respective surface hydrophobicity. Compared to hexacosanol, on hexacosanal coated glass surfaces, higher germination and differentiation rates were achieved, which correlated with increased levels of surface hydrophobicity. Developmental rates of conidia on hydrophobic foils demonstrated that hydrophobicity, as a sole surface factor, may stimulate the conidial germination and differentiation processes. Moreover, the survival of conidia on artificial surfaces is determined by additional surface derived factors, e.g. the availability of water, and a pervadable matrix. N2 - Abiotische und biotische Umweltfaktoren können sowohl die Struktur als auch die chemischen Eigenschaften pflanzlicher Oberflächenwachse beeinflussen. In der vorliegenden Studie wurde vergleichend untersucht, inwiefern sich verschiedene Parameter von Gersten (Hordeum vulgare) Blattwachsen, wie deren Menge, chemische Zusammensetzung und die Morphologie epikutikulärer Wachskristalle unter dem Einfluss unterschiedlicher abiotischer Stressoren (Wachstum in Dunkelheit, Schwermetallbelastung, erhöhte Salzkonzentrationen, Trockenheit) und eines biotischen Stressors, dem Befall von Gerstenmehltau (Blumeria graminis fsp. hordei; Bgh), verändern können. Die Aufzucht ohne natürliches Licht führte zu etiolierten Blättern, die deutlich reduzierte Wachsmengen und quantitative Veränderungen in der Zusammensetzung einzelner Wachskomponenten zeigten. Die Veränderung dieser Wachscharakteristika könnte das Resultat einer pflanzlichen Entwicklungsverzögerung darstellen, die auf den Mangel an Licht, und damit einem Mangel an Energie für die zelluläre Triebkraft zurückzuführen ist. Cadmium-Belastung führte zu einer 1.5-fach erhöhten Wachsauflage der Versuchspflanzen bei unveränderter Chemie. Unter Trocken- und Salzstress zeigten sich keine Veränderungen der untersuchten Wachsparameter. Die plättchenförmige Kristallstruktur der epikutikulären Wachse blieb in jeder der untersuchten abiotischen Behandlungen unverändert. Um Auswirkungen von biotischem Stress auf die Wachsauflage zu testen, wurde eine Infektion mit Gerstenmehltau (Bgh) vorgenommen. Nach sechstägiger Pilzinfektion konnten hierbei weder lokale, noch systemische Veränderungen der unterschiedlichen Wachsparameter der Gerstenblätter detektiert werden. Zusätzlich zu solchen Blattoberflächen, die aus den vier abiotischen und der biotischen Behandlung resultierten (phänotypischer Ansatz), wurden die Oberflächenwachse von 18 cer-Wachsmutanten untersucht (genotypischer Ansatz). Hieraus wurden diejenigen fünf Mutanten ausgewählt, die die stärksten Abweichungen an Wachsmengen, Mengenverteilung zwischen epi- und intrakutikulärer Wachsfraktion und/ oder Anteilen der Einzelkomponenten, der Morphologie der epikutikulären Wachskristalle, und somit auch in der davon abhängenden Oberflächenbenetzbarkeit (Hydrophobizität) gegenüber dem Wildtyp aufwiesen. Um zu überprüfen, inwiefern sich die Modifizierung der Oberflächenwachse durch Umweltfaktoren in den zugrunde liegenden molekularen Prozessen der Wachsbiosynthese widerspiegelt, wurde ein Gerstenwachs-Microarray etabliert. Eine Auswahl von 254 Genen wurde zusammengestellt, denen potentiell Funktionen in der Fettsäurebiosynthese, Kettenverlängerung von Fettsäuren und deren Modifikation zu Wachskomponenten, sowie im Transport von Lipid- und Wachskomponenten zwischen den Zellkompartimenten zukommen. Die Veränderung der Expression einzelner Gene während der abiotischen Stress-Behandlungen wurde mit den Daten der Wachsanalyse dieser Behandlungen korreliert, sowie der Einfluss einer dreitägigen Mehltauinfektion auf molekulare Prozesse der Wirtspflanze mit der Pilzmorphogenese kombiniert. Hinweise auf transkriptionelle Veränderungen in der de novo Fettsäuresynthese und den untersuchten Transportmechanismen, die mit den Veränderungen der Oberflächenwachse korrelieren, waren insbesondere unter Cadmiumstress und durch Etiolierung zu verzeichnen. Die durch Trocken- und Salzstress verursachten, moderaten Veränderungen im Expressionsmuster untersuchter Gene könnten auf eine erworbene Toleranz von Gerste gegenüber solcher Art von Umweltstress hinweisen. Das Eindringen des Pilzes in die Epidermis spiegelte sich in zahlreichen Genregulierungen wider, die besonders der Pathogenabwehr und dem intrazellulären Komponententransport dienen, oder Transkriptionsfaktoren codieren. Der Einfluss der untersuchten abiotischen Faktoren und der Pilzbefall als biotischer Stressor lösten unterschiedliche Modifikationen der molekularen Antworten aus, die miteinander verglichen wurden. Um zu klären welche Wachsparameter die Auskeimung und Differenzierung der Konidien von B. graminis beeinflussen, wurden alle analysierten Blattoberflächen (abiotisch gestresster Wildtyp und cer-Mutanten) und weitere artifizielle Oberflächen in Biotests eingesetzt. Auf allen Blattoberflächen des abiotisch behandelten Wildtyps war die Konidienentwicklung gleichermaßen erfolgreich, während sich innerhalb des genotypischen Ansatzes eine signifikante Reduktion des Keimungs- und Differenzierungserfolgs auf Blättern der Mutante cer-yp.949 zeigte. Durch vergleichende Untersuchungen mit isolierten Kutikeln und extrahierten Blattwachsen von Wildtyp und der Mutante cer-yp.949 konnte gezeigt werden, dass der herabgesetzte Entwicklungserfolg der Konidien auf Blättern der Mutante cer-yp.949 auf eine modifizierte Einbettung der Wachse und eine veränderte dreidimensionale Struktur der cer-yp.949 Kutikula zurückzuführen sein könnte. Untersuchungen zur Entwicklung von Konidien auf sukzessiv entwachsten Blattoberflächen von Wildtyp und Mutanten (zunächst mechanisches Abheben der epikutikulären Wachskristalle durch Gummi arabicum, gefolgt von einer Extraktion der intrakutikulären Wachse mit Chloroform) zeigte die Bedeutung des Vorhandenseins von Wachs für die Auskeimung und Differenzierung der Konidien. Mit Ausnahme der Mutante cer-yp.949 wurde der Differenzierungserfolg der Konidien auf allen Blattflächen durch Wachsextraktion signifikant um ca. 20% reduziert („Wachseffekt“). Durch die Beschichtung von Glasobjektträgern mit extrahierten Blattwachsen konnte dieses Ergebnis auf ein artifizielles System übertragen und bestätigt werden. Zusätzliche Tests mit den Hauptkomponenten der Gerstenwachse Hexacosanol und Hexacosanal zeigten, dass Auskeimung und Differenzierung von Mehltau-Konidien von der unterschiedlichen Chemie, und auch von der Hydrophobizität der Oberfläche beeinflusst werden. Im Vergleich mit Hexacosanol zeigten Hexacosanal beschichtete Glasoberflächen sowohl den größten Keimungs- und Differenzierungserfolg, als auch die höchste Hydrophobizität. Entwicklungsraten auf hydrophoben Folien bestätigten, dass allein die Hydrophobizität der Oberfläche die Auskeimung und die Differenzierung der Konidien stimulieren kann. Das Überleben der Konidien auf artifiziellen Oberflächen wird darüber hinaus durch weitere Faktoren wie Wasserverfügbarkeit und eine durchdringbare Matrix bestimmt. KW - Mehltau KW - Gerstenkrankheit KW - Konidie KW - Keimung KW - Morphogenese KW - Wachs KW - Microarray KW - Differentielle Genexpression KW - powdery mildew desease KW - conidial differentiation KW - leaf wax analysis KW - microarray KW - wax biosynthesis KW - gene expression Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26402 ER -