TY - JOUR A1 - Agranovsky, A. A. A1 - Dolya, V. V. A1 - Gorboulev, Valentin G. A1 - Kozlov, J. V. A1 - Atabekov, J. G. T1 - Aminoacylation of barley stripe mosaic virus RNA: polyadenylate-containing RNA has a 3'-terminal tyrosine-accepting structure N2 - Barley stripe mosaic virus (BSMV) RNA which was previously reported to contain poly(A) sequences (Agranovsky et al., 1978) can be specifically esterified with tyrosine in vitro in the presence of an aminoacyl-tRNA synthetase fraction from wheat embryos. All the three RNA components of the BSMV strain with a three-component genome (Norwich) and both RNA components of a two-component strain (Russian) can be tyrosylated. The poly(A)-containing (bound to oligo(dT)-cellulose) and poly(A)-deficient(not bound to oligo(dT)-cellulose) fractions of BSMV RNA display a similar amino acidaccepting ability. The nucleotide sequence which accepts tyrosine is coupled with the intact genomic polyadenylated BSMV RNA. The viral RNA isolated after sucrose density gradient centrifugation under drastic denaturing conditions retains its aminoacylating activity, which suggests that this activity is not due to the presence in a BSMV RNA preparation of a tyrosine tRNA associated with BSMV RNA. Inhibition of aminoacylation of the 3’-oxidized (treated with sodium metaperiodate) BSMV RNA suggests that the tyrosine-accepting structure is localized at the 3’ terminus of BSMV RNA molecules. It is shown that segments of different lengths obtained upon random fragmentation can be tyrosylated. The 3’-terminal (tyrosine-accepting) poly(A)+ segments can be isolated. The shortest segments of viral RNA capable of being aminoacylated [i.e., containing both tRNA-like structure and poly(A)] consists of approximately 150-200 nucleotides. The analysis of the oligonucleotides derived from individual BSMV RNA components labeled with 32P at the 3’ end revealed two types of 3’-terminal sequences different from poly(A). It is suggested that a poly(A) sequence is intercalated between a 3’-terminal tyrosineaccepting structure and the 5’-terminal portion of poly(A)+ BSMV RNA. Y1 - 1981 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-32566 ER - TY - THES A1 - Aichner, Christian T1 - Die Aminosäuren W355 und A359 des rOCT1 zeigen substratabhängige Mutationseffekte und ändern nach Mutation die Affinität des Transporters zu TBuA T1 - The amino acids W355 and A359 of rOCT1 show substrate-dependent mutation effects and change the affinity of the transporter to TBuA N2 - Die Aminosäuren W355 und A359 des rOCT1 zeigen substratabhängige Mutationseffekte und ändern nach Mutation die Affinität des Transporters zu TBuA N2 - The amino acids W355 and A359 of rOCT1 show substrate-dependent mutation effects and change the affinity of the transporter to TBuA KW - rOCT1 KW - W355 KW - W359 KW - OCT Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-114481 ER - TY - JOUR A1 - Aktas, Bertal H. A1 - Upcin, Berin A1 - Henke, Erik A1 - Padmasekar, Manju A1 - Qin, Xuebin A1 - Ergün, Süleyman T1 - The Best for the Most Important: Maintaining a Pristine Proteome in Stem and Progenitor Cells JF - Stem Cells International N2 - Pluripotent stem cells give rise to reproductively enabled offsprings by generating progressively lineage-restricted multipotent stem cells that would differentiate into lineage-committed stem and progenitor cells. These lineage-committed stem and progenitor cells give rise to all adult tissues and organs. Adult stem and progenitor cells are generated as part of the developmental program and play critical roles in tissue and organ maintenance and/or regeneration. The ability of pluripotent stem cells to self-renew, maintain pluripotency, and differentiate into a multicellular organism is highly dependent on sensing and integrating extracellular and extraorganismal cues. Proteins perform and integrate almost all cellular functions including signal transduction, regulation of gene expression, metabolism, and cell division and death. Therefore, maintenance of an appropriate mix of correctly folded proteins, a pristine proteome, is essential for proper stem cell function. The stem cells' proteome must be pristine because unfolded, misfolded, or otherwise damaged proteins would interfere with unlimited self-renewal, maintenance of pluripotency, differentiation into downstream lineages, and consequently with the development of properly functioning tissue and organs. Understanding how various stem cells generate and maintain a pristine proteome is therefore essential for exploiting their potential in regenerative medicine and possibly for the discovery of novel approaches for maintaining, propagating, and differentiating pluripotent, multipotent, and adult stem cells as well as induced pluripotent stem cells. In this review, we will summarize cellular networks used by various stem cells for generation and maintenance of a pristine proteome. We will also explore the coordination of these networks with one another and their integration with the gene regulatory and signaling networks. KW - Endoplasmic-Reticulum Stress KW - Heme-regulated inhibitor KW - Human Muse Cells KW - Transcription factor NRF1 KW - ER-Stress KW - Hematopoietic Stem KW - Quality-control KW - Messenger-RNAs KW - Neural Differentiation KW - Translation Initiation Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-227769 ER - TY - THES A1 - Al-Khatib, Mohammed T1 - Die pterygospinösen Strukturen beim Menschen und anderen Primaten T1 - The pterygospinous Structures in Human and other Primates N2 - Die pterygospinösen Strukturen zwischen Lamina lateralis des Processus pterygoideus und einer Spina ossis sphenoidalis können in unterschiedlicher Ausprägung vorliegen. Meist ist ein Ligamentum pterygospinosum, gelegentlich ein Arcus osseus oder ein Musculus pterygospinosus vorhanden. In einzelnen Fällen können mehrere Varianten parallel vorliegen. Die knöchernen Verbindengen kommen bei Altweltaffen immer vor, beim Menschen nur noch vereinzelt. Diese Strukturen können einen operativen lateralen Zugang zur Tiefe der Fossa infratemporalis behindern. Durch radiologische Methoden können präoperativ die pterygospinösen Strukturen dargestellt werden. N2 - The ptergyspinous complex is found as a muscle or a ligament or as an osseus arc between the lateral lamina of the ptergoid process and the sphenoid spina. Old world monkeys always have an osseus arc, in new world monkeys and human an osseus arc is only found in some cases. The pterygospinous structures can hinder a surgical lateral approach to the depth of the infratemporal fossa. Radiological methods can help to seek such bars before the surgical intervention. KW - pterygospinöse Strukturen KW - pterygospinöser Komplex KW - Musculus und Ligamentum pterygospinosus KW - pterygospinous complex KW - pterygoalar bars KW - pterygospinous muscle or ligament Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22163 ER - TY - THES A1 - Al-Zuraiqi, Yaser T1 - Die Rolle der residenten Stammzellen der Gefäßwand bei der Bildung der Mikroglia und Angiogenese im adulten Gehirn T1 - The role of vessel wall-resident stem cells in the generation of microglia and angiogenesis in the adult CNS N2 - The role of vessel wall-resident stem cells in the generation of microglia and angiogenisis in the adult CNS Das Zentralnervensystem (ZNS) wird kontinuierlich durch ein eigenes Immunsystem überwacht. Die Mikroglia sind ein wichtiger Vertreter dieses Immunsystems und ein besonderes Charakteristikum des ZNS. Für die Aufrechterhaltung der Hämostase im ZNS spielen die Mikroglia eine zentrale Rolle. Die Herkunft der Mikroglia war für lange Zeit Gegenstand der kontroversen wissenschaftlichen Diskussion. Zusammengefasst wurde deren Ursprung als hämatopoetisch, mesodermal und neuroektodermal beschrieben. Allerdings überwiegt derzeit die Meinung, dass die Mikroglia von Vorläuferzellen geliefert wird, die während der Embryonalentwicklung aus der Dottersackwand ins Gehirn migrieren, dort bis zum Erwachsenenalter persistieren und immer wieder zur Erneuerung der Mikroglia herangezogen werden. Wo genau im Hirngewebe derartige oder andere potenzielle Mikrogliavorläuferzellen im ZNS residieren, ist bis heute nicht abschließend geklärt. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass bereits die frisch präparierten Hirngefäße sowohl CD44+ als auch CD45+ Zellen in ihren Wänden aufweisen. Außerdem ließ sich beobachten, dass die CD44+ Zellen im BRA nach außen wanderten und sich zu Perizyten-ähnlichen und glatten Muskelzellen differenzierten. Diese Befunde ließen darauf schließen, dass die CD44+ Zellen mit diesen Eigenschaften das Potenzial haben, zur Gefäßneubildung beizutragen. Darüber hinaus konnten CD45+ Zellen in der Adventitia frisch isolierter Hirngefäße nachgewiesen werden, die im BRA teilweise für F4/80 und/oder Iba-1 positiv wurden. Dies wiederum lässt vermuten, dass aus der Wand der Hirngefäße Mikroglia- und Makrophagen-ähnliche Zellen generiert werden können. Es blieb jedoch offen, ob diese CD45+ Vorläuferzellen dauerhaft in der Adventitia der Hirngefäße residieren oder aber immer wieder durch im Blut zirkulierende Monozyten erneuert werden. Diese Frage zu klären, ist von klinischer Relevanz, bleibt jedoch zukünftigen Arbeiten überlassen. Das hier etablierte BRA könnte auch bei solchen Analysen hilfreich sein. N2 - The central nervous system (CNS) is continuously monitored by its own immune system. The microglia are an important representative of this immune system and a special feature of the CNS. The microglia play a critical role in the maintenance of hemostasis in the CNS. The origin of microglia has long been a subject of debate. In summary, their origin has been described as hematopoietic, mesodermal and neuroectodermal. However, it is currently believed that the progenitor cells of the microglia originate from the yolk sac wall, migrate during embryonic development into the brain and persist there until adulthood. In this thesis it could be shown: I. already in the vascular wall of the freshly prepared cerebral vessels exist CD44 + and CD45 + cells. In addition, it could be observed that the CD44 + cells in the BRA migrated to the outside and differentiated into pericyte-like and smooth muscle cells. This suggested that the CD44 + cells with these properties have the potential to contribute to angiogenesis. II. In addition, CD45 + cells were detected in the adventitia of freshly isolated cerebral vessels. in the BRA these were partly positive for F4 / 80 and / or Iba-1. This suggests that microglial and macrophage-like cells can be generated from the wall of the cerebral vessels. However, it remained unclear whether these CD45 + precursor cells reside permanently in the adventitia of the cerebral vessels or are renewed by circulating monocytes in the blood KW - Mikroglia KW - Angiogenese KW - Gefäßwand residente Stammzellen Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-188329 ER - TY - THES A1 - Andreska, Thomas T1 - Effects of dopamine on BDNF / TrkB mediated signaling and plasticity on cortico-striatal synapses T1 - Effekte von Dopamin auf BDNF / TrkB vermittelte Signalwege und Plastizität an cortico-striatalen Synapsen N2 - Progressive loss of voluntary movement control is the central symptom of Parkinson's disease (PD). Even today, we are not yet able to cure PD. This is mainly due to a lack of understanding the mechanisms of movement control, network activity and plasticity in motor circuits, in particular between the cerebral cortex and the striatum. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) has emerged as one of the most important factors for the development and survival of neurons, as well as for synaptic plasticity. It is thus an important target for the development of new therapeutic strategies against neurodegenerative diseases. Together with its receptor, the Tropomyosin receptor kinase B (TrkB), it is critically involved in development and function of the striatum. Nevertheless, little is known about the localization of BDNF within presynaptic terminals in the striatum, as well as the types of neurons that produce BDNF in the cerebral cortex. Furthermore, the influence of midbrain derived dopamine on the control of BDNF / TrkB interaction in striatal medium spiny neurons (MSNs) remains elusive so far. Dopamine, however, appears to play an important role, as its absence leads to drastic changes in striatal synaptic plasticity. This suggests that dopamine could regulate synaptic activity in the striatum via modulation of BDNF / TrkB function. To answer these questions, we have developed a sensitive and reliable protocol for the immunohistochemical detection of endogenous BDNF. We find that the majority of striatal BDNF is provided by glutamatergic, cortex derived afferents and not dopaminergic inputs from the midbrain. In fact, we found BDNF in cell bodies of neurons in layers II-III and V of the primary and secondary motor cortex as well as layer V of the somatosensory cortex. These are the brain areas that send dense projections to the dorsolateral striatum for control of voluntary movement. Furthermore, we could show that these projection neurons significantly downregulate the expression of BDNF during the juvenile development of mice between 3 and 12 weeks. In parallel, we found a modulatory effect of dopamine on the translocation of TrkB to the cell surface in postsynaptic striatal Medium Spiny Neurons (MSNs). In MSNs of the direct pathway (dMSNs), which express dopamine receptor 1 (DRD1), we observed the formation of TrkB aggregates in the 6-hydroxydopamine (6-OHDA) model of PD. This suggests that DRD1 activity controls TrkB surface expression in these neurons. In contrast, we found that DRD2 activation has opposite effects in MSNs of the indirect pathway (iMSNs). Activation of DRD2 promotes a rapid decrease in TrkB surface expression which was reversible and depended on cAMP. In parallel, stimulation of DRD2 led to induction of phospho-TrkB (pTrkB). This effect was significantly slower than the effect on TrkB surface expression and indicates that TrkB is transactivated by DRD2. Together, our data provide evidence that dopamine triggers dual modes of plasticity on striatal MSNs by acting on TrkB surface expression in DRD1 and DRD2 expressing MSNs. This surface expression of the receptor is crucial for the binding of BDNF, which is released from corticostriatal afferents. This leads to the induction of TrkB-mediated downstream signal transduction cascades and long-term potentiation (LTP). Therefore, the dopamine-mediated translocation of TrkB could be a mediator that modulates the balance between dopaminergic and glutamatergic signaling to allow synaptic plasticity in a spatiotemporal manner. This information and the fact that TrkB is segregated to persistent aggregates in PD could help to improve our understanding of voluntary movement control and to develop new therapeutic strategies beyond those focusing on dopaminergic supply. N2 - Der fortschreitende Verlust der willkürlichen Bewegungskontrolle ist ein zentrales Symptom der Parkinson-Krankheit (PD). Auch heute sind wir noch nicht in der Lage, PD zu heilen. Dafür verantwortlich ist hauptsächlich ein mangelndes Verständnis von Mechanismen der Bewegungskontrolle, Netzwerkaktivität und Plastizität in motorischen Schaltkreisen, insbesondere zwischen Hirnrinde und Striatum. Der neurotrophe Faktor BDNF ist einer der wichtigsten Faktoren für die Entwicklung und das Überleben von Neuronen sowie für synaptische Plastizität im zentralen Nervensystem. BDNF ist daher ein Target für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien gegen neurodegenerative Erkrankungen. Zusammen mit seinem Rezeptor, der Tropomyosin-Rezeptorkinase B (TrkB), ist BDNF maßgeblich an der Entwicklung und Funktion des Striatums beteiligt. Dennoch ist nur wenig bekannt, wo BDNF an Synapsen im Striatum lokalisiert ist, und wo BDNF in Neuronen der Hirnrinde synthetisiert wird. Außerdem ist der Einfluss von Dopamin aus dem Mittelhirn auf die Kontrolle der BDNF / TrkB-Interaktion in striatalen Medium-Spiny-Neuronen (MSNs) bisher unklar. Dopamin scheint jedoch eine wichtige Rolle zu spielen, da dessen Abwesenheit zu drastischen Veränderungen der striatalen Plastizität führt. Dopamin könnte synaptische Plastizität im Striatum über eine Modulation der BDNF / TrkB-Interaktion regulieren. Um diese Fragen beantworten zu können, haben wir ein sensitives und zuverlässiges Protokoll für den immunhistochemischen Nachweis von endogenem BDNF entwickelt. Wir fanden heraus, dass BDNF im Striatum vor allem in glutamatergen Synapsen von Projektion aus dem Kortex lokalisiert ist und nicht in Terminalen dopaminerger Neurone aus dem Mittelhirn. Tatsächlich fanden wir BDNF in den Zellkörpern von Neuronen in den Schichten II-III und V des primären und sekundären motorischen Kortex sowie Schicht V des somatosensorischen Kortex. Es sind jene Hirnareale, welche dichte Projektionen zum dorsolateralen Striatum senden und entscheidend an der Steuerung von willkürlichen Bewegungen beteiligt sind. Weiterhin konnten wir zeigen, dass eben jene Projektionsneurone die Bildung von BDNF während der juvenilen Entwicklung von Mäusen zwischen 3 und 12 Wochen signifikant herunter regulieren. In striatalen MSN fanden wir zudem einen modulatorischen Effekt von Dopamin auf die Translokation von TrkB zur Zelloberfläche. In MSNs des direkten Signalweges (dMSNs), welche Dopaminrezeptor 1 (DRD1) exprimieren, konnten wir die Bildung von TrkB-Aggregaten im 6-Hydroxydopamin (6-OHDA) - Rattenmodell der Parkinson Erkankung beobachten. Dies deutet darauf hin, dass die DRD1-Aktivität die TrkB-Oberflächenexpression in diesen Neuronen steuert. Im Gegensatz dazu fanden wir heraus, dass die DRD2-Aktivierung in MSNs des indirekten Signalweges (iMSNs) eine gegensätzliche Wirkung hat. Die Aktivierung von DRD2 führt zu einer schnellen Reduktion der TrkB-Oberflächenexpression, die reversibel und von cAMP abhängig ist. Außerdem führte die Stimulation von DRD2 zu einer Induktion von Phospho-TrkB (pTrkB). Dieser Effekt war deutlich langsamer als die Wirkung auf die TrkB-Oberflächenexpression und deutet auf eine Transaktivierung von TrkB über DRD2 hin. Insgesamt scheint Dopamin entgegengesetzte Plastizitätsmodi in striatalen MSNs auszulösen, indem es auf die TrkB-Oberflächenexpression in DRD1- und DRD2-exprimierenden MSNs einwirkt. Diese Oberflächenexpression des Rezeptors ist entscheidend für die Bindung von BDNF, welches aus kortiko-striatalen Afferenzen freigesetzt wird. Dies führt zur Induktion von TrkB-vermittelten-Signaltransduktionskaskaden und Langzeitpotenzierung (LTP). Daher könnte die dopamin-vermittelte Translokalisation von TrkB das Gleichgewicht zwischen dopaminergen und glutamatergen Signalen modulieren, um die synaptische Plastizität in einer räumlich-zeitlich abgestimmten Weise zu ermöglichen. Diese Information und die Tatsache, dass TrkB bei PD stabile Aggregate bildet, könnte dazu beitragen, unser Verständnis der willkürlichen Bewegungskontrolle zu verbessern und neue therapeutische Strategien zu entwickeln, die über jene hinausgehen, welche sich auf die dopaminerge Versorgung konzentrieren. KW - Brain-derived neurotrophic factor KW - Parkinson Krankheit KW - Plastizität KW - Motorisches Lernen KW - Basalganglien KW - Brain-derived neurotrophic factor KW - TrkB KW - Basal Ganglia KW - Motor learning KW - Parkinson's disease KW - Synaptic plasticity KW - Striatum KW - Medium spiny neurons KW - Cortico-striatal projection neurons Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-174317 ER - TY - JOUR A1 - Appelt-Menzel, Antje A1 - Cubukova, Alevtina A1 - Günther, Katharina A1 - Edenhofer, Frank A1 - Piontek, Jörg A1 - Krause, Gerd A1 - Stüber, Tanja A1 - Walles, Heike A1 - Neuhaus, Winfried A1 - Metzger, Marco T1 - Establishment of a Human Blood-Brain Barrier Co-culture Model Mimicking the Neurovascular Unit Using Induced Pluri- and Multipotent Stem Cells JF - Stem Cell Reports N2 - In vitro models of the human blood-brain barrier (BBB) are highly desirable for drug development. This study aims to analyze a set of ten different BBB culture models based on primary cells, human induced pluripotent stem cells (hiPSCs), and multipotent fetal neural stem cells (fNSCs). We systematically investigated the impact of astrocytes, pericytes, and NSCs on hiPSC-derived BBB endothelial cell function and gene expression. The quadruple culture models, based on these four cell types, achieved BBB characteristics including transendothelial electrical resistance (TEER) up to 2,500 Ω cm\(^{2}\) and distinct upregulation of typical BBB genes. A complex in vivo-like tight junction (TJ) network was detected by freeze-fracture and transmission electron microscopy. Treatment with claudin-specific TJ modulators caused TEER decrease, confirming the relevant role of claudin subtypes for paracellular tightness. Drug permeability tests with reference substances were performed and confirmed the suitability of the models for drug transport studies. KW - blood-brain barrier (BBB) model KW - human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) KW - multipotent fetal neural stem cells (fNSCs) KW - neurovascular unit in vitro Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-170982 VL - 8 IS - 4 ER - TY - THES A1 - Arbeiter, Anja Katrin T1 - Charakterisierung der Bindung des Stressproteins Alpha-B-Crystallin an kardiale Myofibrillen unter Ischämie T1 - Characterization of the binding of the stress protein Alpha-B-crystallin to cardiac myofibrils under ischemia N2 - Prolongierte Ischämieperioden des Herzens führen zu struktureller Schädigung der Kardiomyozyten, d.h. einer Desorganisation und Zerstörung des kontraktilen und plasmalemmalen Zytoskeletts, welche sich final durch Verlust an Kontraktilität und Ruptur der Plasmamembran manifestieren. Stressproteine können an die Komponenten des Zytoskelettes binden und durch Konformationsschutz der ischämischen Schädigung entgegenwirken. In vorangegangenen Untersuchungen wurde gezeigt, dass es unter Ischämie zu einer Translokation des konstitutiv in hoher Konzentration vorkommenden kardialen Stressproteins aB-Crystallin vom Zytosol an die Myofibrillen kommt. Dabei führen bereits kurzdauernde Ischämieperioden zu einer kompletten Umverteilung von aB-Crystallin in die Z/I-Region des Sarkomers. Es war das Ziel dieser Arbeit, diese Bindung von aB-Crystallin an Strukturproteine im Z/I-Banden Bereich näher zu charakterisieren und aB-Crystallin ultrastrukturell zu lokalisieren. Durch Immunogoldmarkierung konnte aB-Crystallin ultrastrukturell im Herzen unter globaler Ischämie in einer Linie parallel zur Z-Scheibe etwa in der Mitte der halben I-Bande lokalisiert werden. Diese Zone entspricht dem Bereich, der als N-Linie bezeichnet wird. In der Frage der in vivo-Bindungspartner von aB-Crystallin waren daher in erster Linie Komponenten der I-Bande, d.h. Aktin und Titin in Betracht zu ziehen. Z-Scheiben Proteine wie a-Actinin treten dagegen in den Hintergrund. Um Anhaltspunkte über die Bindungsstärke des Stressproteins aB-Crystallin an kardiale Myofibrillen unter Ischämie zu erhalten, wurden ischämische Myofibrillen aus dem Rattenherz mit hochmolaren Salzlösungen und chaotropen Substanzen behandelt. Dabei konnte eine sehr hohe Bindungsaffinität von aB-Crystallin an die Myofibrillen festgestellt werden. Die myofibrilläre Bindung zeigte sich resistent gegenüber 1M KCl, 1M NaSCN und 2M Harnstoff, erst 2M NaSCN und 4M Harnstoff, die eine Zerstörung der myofibrillären Integrität bewirken, vermögen die aB-Crystallin-Bindung zu lösen. Aktin dagegen ließ sich bereits durch 0,5M NaSCN-Lösung von den Myofibrillen extrahieren, Bedingungen, unter denen aB-Crystallin noch fest an die Myofibrillen gebunden blieb. Aktin scheidet somit als in vivo-Bindungspartner von aB-Crystallin aus. Dieses Ergebnis immunhistochemischer Untersuchungen konnte auch mit biochemischer Methodik (Immunreplikanalyse) verifiziert werden. Titin zeigte sich wie aB-Crystallin resistent gegenüber den meisten der oben aufgeführten Salzlösungen. Eine deutliche Extraktion von Titin aus den Myofibrillen konnte erst durch Behandlung mit 2M NaSCN sowie 4M Harnstofflösung beobachtet werden, das Extraktionsverhalten entsprach somit dem von aB-Crystallin. Einen Hinweis auf eine Assoziation von aB-Crystallin mit Titin lieferte der Nachweis von aB-Crystallin in isolierten Titinfraktionen aus ischämischen Herzen. Der direkte Beweis für eine aB-Crystallin-Titin-Interaktion konnte im Rahmen dieser Arbeit jedoch nicht erbracht werden. Bindungsstudien, die zwischen ausgewählten nativen, in vitro translatierten Titindomänen und aus der Linse isoliertem aB-Crystallin durchgeführt wurden, waren negativ. Dies ist möglicherweise dadurch bedingt, dass aB-Crystallin erst unter Ischämie mit Titin interagiert und in vitro Kofaktoren benötigt werden. Durch eine Bindung an I-Banden Abschnitte des Titinmoleküls könnte aB-Crystallin eine kardioprotektive Funktion erfüllen, indem es unter Ischämie stabilisierend auf das Filamentsystem einwirkt. N2 - Prolonged ischemic periods of the heart lead to structural damage of the cardiomyocytes, i.e. disorganization and destruction of the cellular cytoskeleton with final loss of contractility and rupture of the plasma membrane. Stress proteins can bind to components of the cellular cytoskeleton and play a protective role during various kinds of stresses. Previous studies showed a translocation of the cardiac stress protein áB crystallin from the cytosol, there occurring in constitutive high concentrations, to the myofibrils under ischemia. Already short ischemic periods lead to a complete translocation of áB crystallin into the Z/I region of the myofibrils. The purpose of the present study was to identify the localization of áB crystallin during ischemia at the ultrastructural level and to obtain further information about myofibrillar components that may serve as binding sites for áB crystallin during ischemia. Under global ischemia áB crystallin could be located by immunogold-labelling in the heart in a narrow zone of the I-band parallel to the Z-disk (area of the N2-line).The restriction of áB crystallin to this N2-line indicates binding of áB crystallin to either titin or components of actin filaments. Actin filaments and actin associated proteins such as tropomyosin or troponin complex are not likely candidates for áB crystallin binding because actin became completely extracted of the myofibrils after treatment of cryostat sections of ischemic rat myocardium with 0,5M NaSCN, conditions where áB crystallin and titin remained unchanged.The myofibrillaric binding of áB crystallin and titin resisted extraction with 1M KCl, 1M NaSCN and 2M urea, only 2M NaSCN and 4M urea, which cause a destruction of the myofibrillaric integrity, were able to disrupt the áB crystallin binding. These results of immunocytochemistry could be verified biochemically (immunoblotting). They indicate association of áB crystallin with titin the only remaining non-actin or actin-binding cytoskeletal component of I-bands outside Z-disks. Further evidence for binding of áB crystallin to titin was obtained by dot-blot assays in which biotinylated áB crystallin was demonstrated to bind to a titin-enriched fraction of pig myocardium immobilized on nitrocellulose. Furthermore this titin-enriched fraction was shown to copurify with áB crystallin. However dot-blot binding studies between several in-vitro translated titin domains and purified áB crystallin did not show any detectable binding. These negative results obtained by in vitro binding studies do not exclude interaction between titin fragments and áB crystallin in vivo. The absence of in vitro interaction is possibly due to a different three dimensional structure of the in vitro expressed titin fragments or to the absence of specific ischemia-induced cofactors. Binding of áB crystallin to titin during cardiac ischemia could serve to stabilize titin against denaturation and might provide an endogenous mechanism to delay ischemic damage by stabilizing this critical I-band region of titin with its elastic properties. KW - aB-Crystallin KW - Titin KW - Stressprotein KW - Ischämie KW - Myokard KW - aB-crystallin KW - titin KW - stress protein KW - ischemia KW - myocardium Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4337 ER - TY - JOUR A1 - Arndt, Andreas A1 - Hoffacker, Peter A1 - Zellmer, Konstantin A1 - Goecer, Oktay A1 - Recks, Mascha S. A1 - Kuerten, Stefanie T1 - Conventional Housing Conditions Attenuate the Development of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis JF - PLoS ONE N2 - BACKGROUND: The etiology of multiple sclerosis (MS) has remained unclear, but a causative contribution of factors outside the central nervous system (CNS) is conceivable. It was recently suggested that gut bacteria trigger the activation of CNS-reactive T cells and the development of demyelinative disease. METHODS: C57BL/6 (B6) mice were kept either under specific pathogen free or conventional housing conditions, immunized with the myelin basic protein (MBP)-proteolipid protein (PLP) fusion protein MP4 and the development of EAE was clinically monitored. The germinal center size of the Peyer's patches was determined by immunohistochemistry in addition to the level of total IgG secretion which was assessed by ELISPOT. ELISPOT assays were also used to measure MP4-specific T cell and B cell responses in the Peyer's patches and the spleen. Ear swelling assays were performed to determine the extent of delayed-type hypersensitivity reactions in specific pathogen free and conventionally housed mice. RESULTS: In B6 mice that were actively immunized with MP4 and kept under conventional housing conditions clinical disease was significantly attenuated compared to specific pathogen free mice. Conventionally housed mice displayed increased levels of IgG secretion in the Peyer's patches, while the germinal center formation in the gut and the MP4-specific TH17 response in the spleen were diminished after immunization. Accordingly, these mice displayed an attenuated delayed type hypersensitivity (DTH) reaction in ear swelling assays. CONCLUSIONS: The data corroborate the notion that housing conditions play a substantial role in the induction of murine EAE and suggest that the presence of gut bacteria might be associated with a decreased immune response to antigens of lower affinity. This concept could be of importance for MS and calls for caution when considering the therapeutic approach to treat patients with antibiotics." KW - B cells KW - secretion KW - multiple sclerosis KW - enzyme-linked immunoassays KW - Peyer's patches KW - gut bacteria KW - T cells KW - immune response Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119603 VL - 9 IS - 6 ER - TY - THES A1 - Arndt, Petra T1 - Klonierung und funktionelle Charakterisierung von organischen Kationentransportern aus der Rattenniere T1 - Cloning and functional characterization of organic cation transporters from rat kidney N2 - Der organische Kationentransport im proximalen Tubulus der Niere spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase der Körperflüssigkeiten und der Ausschleusung von toxischen organischen Kationen. Der Transport von organischen Kationen wird an der Bürstensaummembran durch den H+/organische Kationen-Austauscher vermittelt, während bei dem Transport von organischen Kationen an der basolateralen Membran das nach innen gerichtete negative Membranpotential eine treibende Kraft darstellt. Durch Expressionsklonierung wurde der erste organische Kationentransporter, rOCT1, aus der Rattenniere isoliert. Kurz darauf wurde im Rahmen dieser Arbeit ein zweiter organischer Kationentransporter ebenfalls aus der Ratenniere kloniert. rOCT2 besteht aus 593 Aminosäuren und besitzt 12 putative Transmembrandomänen. Zum funktionellen Vergleich zwischen rOCT1 und rOCT2 wurde das Oozytenexpressionssystem verwendet. In der vorliegenden Arbeit wurde ein pharmakologisches Profil von rOCT2 erstellt. Das Substratsprektrum von rOCT2 ist dem von rOCT1 sehr ähnlich. Die Affinitäten von rOCT2 gegenüber verschiedenen Substanzen wurden direkt mit denen von rOCT1 verglichen. Einerseits fanden wir bei einigen Substraten Unterschiede in den Km- und Vmax-Werten, aber andererseits auch viele Ähnlichkeiten zwischen beiden Transportern. Anionen (z. B. p-Aminohippurat) wurden als neue Gruppe von Inhibitoren für den durch rOCT1- und rOCT2-vermittelten Transport identifiziert. Die Potentialdifferenz ist die treibende Kraft des rOCT1- und rOCT2-vermittelten Transportes. Wir konnten potentialabhängige Veränderungen der Km-Werte von Cholin-induzierten Einwärtsströmen zeigen. Bei dem Austausch von Na+-Ionen gegen K+-Ionen im Reaktionspuffer wurde die Aufnahme von Cholin und MPP durch rOCT2 erniedrigt. Der bidirektionale Transport von MPP wurde gezeigt und trans-Stimulationsexperimente für MPP-Influx und MPP-Efflux durchgeführt, um die Asymmetrie des Transporters zu studieren. Darüberhinaus wurde in der vorliegenden Arbeit die Interaktion von verschiedenen Substraten mit rOCT1 und rOCT2 untersucht und ein kompetitver und nicht-kompetitiver Hemmtyp bei der TEA-Aufnahme gefunden. N2 - Organic cation transport in the renal tubule is an important physiological function for the maintenance of body fluid homeostasis and detoxification of harmful organic cations. In general, transport of organic cations in brush-border membranes is mediated by the H+/organic cation antiporter, whereas transport of organic cations in basolateral membranes is stimulated by the inside-negative membrane potential. By the expression cloning method, the organic cation transporter rOCT1, which is expressed in rat liver and kidney, was isolated. In 1996 another organic cation transporter from rat kidney, rOCT2, was isolated by homology cloning. rOCT2 was deduced to be a glycoprotein comprised of 593 amino acid residues with 12 putative transmembrane domains. To analyse the functional characteristics of rOCT2 in comparison with rOCT1 we utilized the Xenopus expression system. During this dissertation a pharmacological profile was made for rOCT2. The apparent substrate spectrum of rOCT2 was similar to that of rOCT1. Affinities of rOCT2 against several compounds were directly compared with those of rOCT1. We found differences in Km- and IC50-values for distinct substrates but also a lot of similarities between both transporters. Anions like p-aminohippuric acid were identified as a new group of inhibitors for rOCT1- and rOCT2-mediated transport. The potential difference is the driving force of transport mediated by rOCT1 and rOCT2. We showed the potential-dependent changes of Km-values of choline induced inward currents. Further when extracellular Na+ ions were replaced with K+ ions, the uptake of MPP and choline by rOCT2 was decreased. The bidirectional transport of MPP was shown and trans-sitmulation experiments for MPP influx and efflux were performed to study asymmetry of the transporter. The mechanism of interaction of several substrates with rOCT1 and rOCT2 were investigated and we found competitive and non-competitive inhibition of TEA uptake. KW - Ratte KW - Niere KW - Kation KW - Stofftransport KW - Molekularbiologie KW - rOCT1 KW - rOCT2 KW - proximaler Tubulus KW - Niere KW - Sekretion KW - Xenopus laevis KW - Oozyte KW - Transport KW - Inhibition KW - Homologieklonierung KW - rOCT1 KW - rOCT2 KW - proximal tubule KW - kidney KW - secretion KW - Xenopus laevis KW - oocyte KW - transport KW - inhibition KW - homology cloning Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-793 ER - TY - JOUR A1 - Artyukova, E. V. A1 - Gorboulev, Valentin G. A1 - Rodionova, N. P. A1 - Krylov, A. V. A1 - Atabekov, J. G. T1 - Comparative study of structural peculiarities and translation of potexvirus RNAs N2 - Structural peculiarities of the S'-end segments of genomic RNA were studied in F potato virus (F-PV) and white clover mosaic virus (WCMV). The methods of affinity chromatography on oligo(dT) cellulose and oligonucleotide mapping revealed a prolonged (up to 210 nucleotides) polyadenyl sequence at the 3'-end of F-PV RNA. A polyadenyl sequence is missing at the 3'end of WCMV RNA. A study of the translation products of WCMV and F-PV RNAs in a oe11-free protein-synthesizing system derived from rabbit reticulocytes showed that polypeptides electrophoretically comigrating with a structural protein of either virus were synthesized alongside high-molecular-weight polypeptides (M\(_r\)\(\approx\) 180-150 kdaltons). Y1 - 1985 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46985 ER - TY - JOUR A1 - Ascheid, David A1 - Baumann, Magdalena A1 - Funke, Caroline A1 - Volz, Julia A1 - Pinnecker, Jürgen A1 - Friedrich, Mike A1 - Höhn, Marie A1 - Nandigama, Rajender A1 - Ergün, Süleyman A1 - Nieswandt, Bernhard A1 - Heinze, Katrin G. A1 - Henke, Erik T1 - Image-based modeling of vascular organization to evaluate anti-angiogenic therapy JF - Biology Direct N2 - In tumor therapy anti-angiogenic approaches have the potential to increase the efficacy of a wide variety of subsequently or co-administered agents, possibly by improving or normalizing the defective tumor vasculature. Successful implementation of the concept of vascular normalization under anti-angiogenic therapy, however, mandates a detailed understanding of key characteristics and a respective scoring metric that defines an improved vasculature and thus a successful attempt. Here, we show that beyond commonly used parameters such as vessel patency and maturation, anti-angiogenic approaches largely benefit if the complex vascular network with its vessel interconnections is both qualitatively and quantitatively assessed. To gain such deeper insight the organization of vascular networks, we introduce a multi-parametric evaluation of high-resolution angiographic images based on light-sheet fluorescence microscopy images of tumors. We first could pinpoint key correlations between vessel length, straightness and diameter to describe the regular, functional and organized structure observed under physiological conditions. We found that vascular networks from experimental tumors diverted from those in healthy organs, demonstrating the dysfunctionality of the tumor vasculature not only on the level of the individual vessel but also in terms of inadequate organization into larger structures. These parameters proofed effective in scoring the degree of disorganization in different tumor entities, and more importantly in grading a potential reversal under treatment with therapeutic agents. The presented vascular network analysis will support vascular normalization assessment and future optimization of anti-angiogenic therapy. KW - vascular structure KW - cancer KW - tumor microenvironment KW - optical clearing KW - light sheet fluorescence microscopy KW - 3D image analysis Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-357242 VL - 18 ER - TY - CHAP A1 - Axelrod, V. D. A1 - Gorboulev, Valentin G. A1 - Kutateladze, T. V. A1 - Barciszewski, J. A1 - Bayev, A. A. T1 - The new approach to tRNA primary structure determination : the primary structure of valine tRNA\(^{Val}_{2b}\) N2 - The new combination of TLC and high voltage electrophoresis on cooling plate is described.We have applied this technique to study of primary structure of tRNA.Preliminary sequence of baker's yeast tRNA^Val_2b is described. New approach to preparation of large tRNA fragments is demonstrated. KW - RNS Y1 - 1976 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-50920 ER - TY - THES A1 - Bahr, Chris T1 - Untersuchungen zur Expression und subzellulären Lokalisation von Isoformen des Adaptorproteins Kanadaptin T1 - Expression and subcellular localization of isoforms of the adaptor protein kanadaptin N2 - Auf der Suche nach Bindeproteinen des renalen HCO3-/Cl- Anionenaustauschers 1 (renAE1) wurde 1998 von Chen et al. in der Maus das Protein Kanadaptin entdeckt. Immunzytochemisch ließ sich Kanadaptin in der Niere des Kaninchens nur im Zytoplasma des Sammelrohrepithels nachgewiesen. In renAE1-exprimierenden, säuresezernierenden Schaltzellen (A-Schaltzellen) beobachtete man eine zusätzlich vesikuläre Immunfluoreszenz. Eine Immunfluoreszenz der basolateralen Membran, wie sie für renAE1 typisch ist, wurde nicht entdeckt. Aufgrund der Tatsache, dass es sich bei den granulären Strukturen um renAE1-positive Vesikel handelte, wurde von Chen et al. postuliert, dass Kanadaptin am Transport von renAE1 zur basolateralen Plasmamembran säuresezernierender Schaltzellen beteiligt ist. Kanadaptin wurde wenige Jahre später in nicht renAE1-exprimierenden, kultivierten Zellen auch im Zellkern detektiert. Die nukleäre Translokation erfolgte abhängig von Importin a/b und von einer aminoterminalen Kernlokalisationssequenz (NLS). In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression von Kanadaptin detailiert untersucht. In allen uns zur Verfügung stehenden humanen Zelllinien (z. B. U-373, SW-480 und Hep-G2, A-431, MCF-7, PC-3) wurde Kanadaptin sowohl auf Protein- als auch auf Transkriptionsebene (RT-PCR) nachgewiesen. In Mäuseembryonen wurde Kanadaptin im Western-Blot erstmals am 9. Embryonaltag detektiert. An gefriergetrockneten Epon-Semidünnschnitten der Rattenniere wurde bei immunzytochemischen Untersuchungen überraschenderweise eine besonders starke Immunreaktivität in epithelialen Zellen des proximalen Tubulus gefunden, nicht aber im Sammelrohrepithel, einschließlich der renAE1-exprimierenden A-Schaltzellen. In allen Kanadaptin-positiven Zellen war die Immunfluoreszenz von granulärer Struktur. Eine nukleäre Immunreaktion, wie sie für kultivierte Zellen beschrieben wurde, ließ sich nicht beobachten. Mit Hilfe eines gegen die Cytochromoxidase Untereinheit I gerichteten Antikörpers konnten die granulären Strukturen als Mitochondrien identifiziert werden. Durch Änderung der Fixierungs- und Permeabilisierungsbedingungen konnte in kultivierten Zellen neben der nukleären Lokalisation Kanadaptin immunzytochemisch auch in Mitochondrien nachgewiesen werden. Immunelektronenmikroskopische Untersuchungen zeigten schließlich, dass Kanadaptin in Mitochondrien lokalisiert. Auch in Mitochondrien kultivierter Zellen und im Darmepithel der Ratte wurde Kanadaptin biochemisch nachgewiesen. Neben dem in verschiedenen Geweben/Zellen der Ratte und des Menschen detektierten Kanadaptin mit einem Molekulargewicht von 57 kD wurde aus retinsäure-behandelten menschlichen teratokarzinomen Hodenzellen (NT2/D1 Zellen) eine neue 89 kD-Isoform von Kanadaptin isoliert. Beide Kanadaptin-Isoformen sind stark homolog zueinander und besitzen eine fast identische Domänenstruktur. Gegenüber dem Kanadaptin der Maus enthält die menschliche Isoform jedoch eine aminoterminale Extension von 264 Aminosäuren sowie eine 25 Aminosäuren umfassende karboxyterminale Insertion. Innerhalb der aminoterminalen Extension konnte eine Gabelkopfdomäne (FHA-Domäne) identifiziert werden. FHA-Domänen sind phosphorylierungsabhängige Protein-Protein-Bindedomänen und finden sich hauptsächlich in nukleären Proteinen. Basierend auf diesen Erkenntnissen, lag der Fokus im zweiten Teil der Arbeit auf Untersuchungen zur subzellulären Lokalisation von humanem Kanadaptin, mit besonderer Berücksichtigung des FHA-Domänen-enthaltenen Aminoterminus. Hierzu wurde die humane Kanadaptin-cDNA aus retinsäurebehandelten NT2/D1-Zellen mit Hilfe der RT-PCR kloniert und in eukaryontische Expressionsvektoren inseriert. Subzelluläre Lokalisations-untersuchungen an transient transfektierten Zellen ergaben, dass die menschliche Isoform im Zellkern lokalisiert. Weitere Lokalisationsstudien zeigten, dass die nukleäre Akkumulation der Kanadaptin-Isoformen durch unterschiedliche NLSs reguliert wird. So zeigten frühere Untersuchungen, dass die Translokation vom Kanadaptin der Maus fast vollständig von der aminoterminalen NLS1 abhängig ist (Hübner et al., 2002). Im Gegensatz dazu war die nukleäre Lokalisation der humanen Kanadaptin-Isoform NLS1 unabhängig. Den größten Einfluß zeigte die karboxyterminale NLS2. Ein Grund dafür ist möglicherweise eine zusätzliche karboxyterminale Insertion, die die humane Kanadaptinisoform gegenüber dem Kanadaptin der Maus besitzt. Diese könnte dazu führen, dass die karboxyterminale NLS2 für die Kerntranslokationsmaschinerie besser zugänglich ist. Die Untersuchungen zeigten darüber hinaus, dass der FHA-Domäne enthaltene Aminoterminus möglicherweise an nukleäre Strukturen bindet. N2 - Mouse kanadaptin (mKan) has recently been identified as a cytoplasmic adaptor protein reported to bind to the kidney HCO3-/Cl- anion exchanger 1 (kAE1). Interestingly, mKan was found in the nucleus of cultured cells. Nuclear translocation of mKan depends on a nuclear localization signal (NLS) and is mediated by members of the importin family. In this study we have shown by Western-blot analysis and RT-PCR that kanadaptin is expressed in all cultured cells tested (e. g. U-373, SW-480 and Hep-G2, A-431, MCF-7, PC-3). Expression of kanadaptin was also detected by Western-blot analysis early in embryonic development. In the kidney of the rat the most intense immunofluorescence for kanadaptin was found in cells of the proximal tubule. Immunostaining revealed strong signals for kanadaptin in association with mitochondria. However, nuclear staining, as it has been described for cultured cells, was not observed. In order to reveal mitochondrial localization of kanadaptin in cultured cells, the protocol for permeabilization was changed. Dependent on the type of the protocol used for fixation/permeabilization of cultured cells kanadaptin was found either in nuclei or in mitochondria. That kanadaptin is not simply attached to the mitochondrial surface was demonstrated by immunoelectron microscopy, which showed intra-mitochondrial localization of kanadaptin. Apart from the immunocytochemical studies, mitochondrial localization of kanadaptin was additionally demonstrated by immunoblotting of mitochondrial fractions obtained from cultured cells an epithelial cells of rat intestine. Recently, a new 85 kD isoform of mKan was isolated from retinoic acid (RA) treated human teratocarcinoma cells (NT2/D1 cells). HumKan and mKan display a conserved domain structure. Additionally, humKan contains an amino-terminal extension of 264 amino acids. This extension harbours a forkhead associated (FHA) domain. FHA domains are diverse protein-protein interaction modules known to be involved in nuclear signalling and DNA binding. This prompted us to isolate the cDNA encoding humKan from RA-induced NT2/D1 cells by RT-PCR and to assess its subcellular distribution in cultured cells, using full-length humKan with or without green fluorescent protein (GFP) as a fusion tag, as well as truncation derivatives thereof. We found full-length humKan with and without GFP-tag to be exclusively nuclear. Additionally, the studies revealed, that nuclear accumulation of humKan differs from that of mKan. While nuclear accumulation of mKan is dependent on the aminoterminal NLS, NLS1, nuclear translocation of humKan seems to occure through the carboxy-terminal NLS, NLS2. Beside the amino-terminal extension, humKan additionally contains a carboxy-terminal insertion of 25 amino acids near NLS2, which could possibly account for the differences of NLS-dependent nuclear translocation of humKan vs. mKan. The subcellular localization studies also revealed that the FHA-Domain containing amino-terminus of humKan may contain a nuclear retention sequence. KW - Kanadaptin KW - Genexpression KW - kanadaptin KW - renAE1 KW - Retinsäure KW - teratokarzinome Zellen KW - FHA-Domäne KW - kanadaptin KW - kAE1 KW - retinoic acid KW - teratocarcinoma cells KW - FHA domain Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5310 ER - TY - THES A1 - Bail, Kathrin T1 - Der Effekt von Fingolimod auf die B-Zell-Distribution und -Aggregation in einem chronischen Mausmodell der Multiplen Sklerose T1 - Differential effects of FTY720 on B-cell distribution and aggregation in a chronic mouse model of multiple sclerosis N2 - Hintergrund - Die Multiple Sklerose (MS) ist bis heute eine nur teilweise verstandene Autoimmunerkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS). Das Tiermodell der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) ermöglicht die Erforschung von Teilaspekten der Pathogenese der MS und kann zur Etablierung von Therapeutika herangezogen werden. Die MP4-abhängige EAE ermöglicht als Mausmodell die gezielte Erforschung der Rolle der B-Zelle als Akteur in der Pathogenese der MS. Diese Dissertation untersuchte den Effekt des S1P1-Rezeptor-Modulators FTY720 (Fingolimod) auf die Immunantwort der autoreaktiven B-Zellen in der Peripherie sowie im ZNS. Methoden - MP4-immunisierte Mäuse erhielten 50 Tage nach dem EAE-Krankheitsbeginn oral appliziertes FTY720 über einen Zeitraum von 30 Tagen. Die Tiere wurden nach dem Auftreten der Krankheitssymptome täglich klinisch evaluiert. Die MP4-spezifische B-Zell-Immunantwort und die MP4-spezifische humorale Immunreaktion wurden mittels ELISPOT und ELISA ausgewertet. Die Verteilung der T- und B-Zell-Anteile im peripheren Blut der Mäuse sowie die Aufteilung der B-Zell-Subsets in der Milz wurden mittels Durchflusszytometrie quantifiziert. Mittels Immunhistochemie wurden die B- und T-Zell-Ansammlungen im ZNS der Mäuse hinsichtlich ihrer Entwicklung in tertiär lymphatische Organe (TLOs) untersucht. Ergebnisse - In diesem Versuchsaufbau zeigte FTY720 keine signifikante Verbesserung des klinischen Krankheitsverlaufes der Tiere. Der Anteil von T-Zellen im peripheren Blut der Mäuse war unter der Therapie mit FTY720 signifikant reduziert, während die Anzahl an B-Zellen nicht-signifikant beeinflusst wurde. Bei der Untersuchung der B-Zell-Subtypen in der Milz fiel zunächst ein erhöhter Anteil an B220+-B-Zellen auf, während die Verteilung der weiteren Subsets nicht-signifikant verändert war. Unter der Therapie mit FTY720 zeigte sich keine Reduktion bereits etablierter B-Zell-Aggregate im ZNS, allerdings ist eine inhibierte Entwicklung in TLOs zu diskutieren. Zusammenfassung - Diese Arbeit impliziert unterschiedliche Effekte von FTY720 auf die B-Zellen in einem B-Zell-abhängigen chronischen Mausmodell der MS. N2 - Background Multiple sclerosis (MS) has remained a partially understood autoimmune disease of the central nervous system (CNS). Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) triggered in animals is commonly used to study the pathogenesis of MS and to establish therapeutic agents. MP4-induced EAE represents a murine model of MS that allows targeted research on B cells, which have been a much-discussed protagonist in MS pathogenesis. This study investigates the effect of the S1P1 receptor modulator FTY720 (fingolimod) on the autoreactive B cell response as well as on the B cell distribution both in the periphery and the CNS. Methods Oral FTY720 application for a duration of 30 days was initiated in MP4-immunized mice 50 days after EAE onset. After immunization, clinical symptoms were monitored daily. The MP4-specific B cell and antibody response were studied using ELISPOT and ELISA. The distribution of peripheral B and T cells in the blood as well as B cell subsets in the spleen was evaluated by flow cytometry. The formation of B cell aggregates in the CNS and their development into tertiary lymphoid organs (TLOs) was studied by histology and immunohistochemistry. Results In this study, FTY720 did not significantly alter clinical EAE. Peripheral T cell numbers in the blood appeared to be significantly reduced after FTY720 treatment while the percentage of B cells were only slightly diminished. Evaluation of the B cell subsets in the spleen revealed a significantly higher percentage of B220+ B cells in FTY720-treated mice, whereas other B cell subtypes remained unaffected. Furthermore, there was no effect on already developed B cell aggregates in the CNS after FTY720 application, however treatment seemed to affect the evolution of B cell aggregates into TLOs. Conclusions This study implies differential effects of FTY720 treatment on the B cell compartment in a chronic B cell-dependent model of MS. KW - Multiple Sklerose KW - B-Zelle KW - Tiermodell KW - Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis KW - EAE KW - Fingolimod KW - FTY720 KW - MP4-EAE Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-269282 ER - TY - JOUR A1 - Bail, Kathrin A1 - Notz, Quirin A1 - Rovituso, Damiano M. A1 - Schampel, Andrea A1 - Wunsch, Marie A1 - Koeniger, Tobias A1 - Schropp, Verena A1 - Bharti, Richa A1 - Scholz, Claus-Juergen A1 - Foerstner, Konrad U. A1 - Kleinschnitz, Christoph A1 - Kuerten, Stefanie T1 - Differential effects of FTY720 on the B cell compartment in a mouse model of multiple sclerosis. JF - Journal of Neuroinflammation N2 - Background: MP4-induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a mouse model of multiple sclerosis (MS), which enables targeted research on B cells, currently much discussed protagonists in MS pathogenesis. Here, we used this model to study the impact of the S1P1 receptor modulator FTY720 (fingolimod) on the autoreactive B cell and antibody response both in the periphery and the central nervous system (CNS). Methods: MP4-immunized mice were treated orally with FTY720 for 30 days at the peak of disease or 50 days after EAE onset. The subsequent disease course was monitored and the MP4-specific B cell/antibody response was measured by ELISPOT and ELISA. RNA sequencing was performed to determine any effects on B cell-relevant gene expression. S1P\(_{1}\) receptor expression by peripheral T and B cells, B cell subset distribution in the spleen and B cell infiltration into the CNS were studied by flow cytometry. The formation of B cell aggregates and of tertiary lymphoid organs (TLOs) was evaluated by histology and immunohistochemistry. Potential direct effects of FTY720 on B cell aggregation were studied in vitro. Results: FTY720 significantly attenuated clinical EAE when treatment was initiated at the peak of EAE. While there was a significant reduction in the number of T cells in the blood after FTY720 treatment, B cells were only slightly diminished. Yet, there was evidence for the modulation of B cell receptor-mediated signaling upon FTY720 treatment. In addition, we detected a significant increase in the percentage of B220\(^{+}\) B cells in the spleen both in acute and chronic EAE. Whereas acute treatment completely abrogated B cell aggregate formation in the CNS, the numbers of infiltrating B cells and plasma cells were comparable between vehicle- and FTY720-treated mice. In addition, there was no effect on already developed aggregates in chronic EAE. In vitro B cell aggregation assays suggested the absence of a direct effect of FTY720 on B cell aggregation. However, FTY720 impacted the evolution of B cell aggregates into TLOs. Conclusions: The data suggest differential effects of FTY720 on the B cell compartment in MP4-induced EAE. KW - B cells KW - EAE KW - FTY720 KW - fingolimod KW - multiple sclerosis KW - TLO Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-157869 VL - 14 IS - 148 ER - TY - THES A1 - Baumer, Yvonne T1 - Die Rolle und Mechanismen der GTPasen Rac 1 und Rho A in der Regulation der Endothelbarriere T1 - The role of Rho GTPases Rac 1 and Rho A in endothelial barrier function N2 - Endothelzellen kleiden als einschichtiger Zellverband das Innere der Blutgefäße aus und wirken als Barriere zwischen Blut und Interstitium. Entzündungen und Erkrankungen wie Lungenödem oder Arteriosklerose sind gekennzeichnet durch einen Zusammenbruch der Endothelbarriere. Erste Untersuchungen deuten auf eine bedeutende Rolle der GTPasen der Rho-Familie mit den Hauptvertretern Rho A, Rac 1 und Cdc42 als Regulatoren der Endothelbarriere hin. Bezüglich der Regulation der Endothelbarriereintegrität werden den GTPasen Rho A und Rac 1 meist antagonistische Funktionen zugeschrieben. In einem ersten Teil dieser Dissertation wurde daher die Funktion der Rho-GTPasen Rho A, Rac 1 und Cdc42 für die Endothelbarriere in verschiedenen Endothelien untersucht. Hierzu wurden drei mikrovaskuläre Endothelzelltypen verschiedenen Ursprungs sowie makrovaskuläre Endothelzellen der Pulmonalarterie mit GTPase-aktivierenden oder inaktivierenden bakteriellen Toxinen behandelt. Die Aktivierung von Rho A resultierte in allen Endothelzelltypen mit Ausnahme der mikrovaskulären myokardialen Endothelzellen in einem Zusammenbruch der Endothelbarriere. Die Aktivierung von Rac 1 und Cdc42 führte in allen Endothelzellarten zu einer Barrierestabilisierung. Darüber hinaus konnte in fast allen Endothelzelltypen durch pharmakologische Inhibition der Rho-Kinase eine Stabilisierung der Endothelbarriere induziert werden. Die Inaktivierung aller GTPasen sowie die alleinige Inaktivierung von Rac 1 führte zu einem kompletten Zusammenbruch der Endothelbarriere in vitro. Zudem ergaben in vivo-Experimente an perfundierten Rattenmesenterien eine gesteigerte Permeabilität nach Inaktivierung von Rho A, Rac 1 und Cdc42. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die cAMP-vermittelte Stabilisierung der Endothelbarriere genauer charakterisiert und dabei der Einfluss gesteigerter cAMP-Spiegel auf die Aktivität von Rho-GTPasen in humanen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen untersucht. Hierbei wurde die cAMP-Konzentration zum einen durch den Einsatz einer Kombination aus dem Adenylatzyklase-Aktivator Forskolin und dem Phosphodiesterase 4-Inhibitor Rolipram und zum anderen durch das cAMP-Analogon 8-pCPT-2’-O-Me-cAMP (O-Me-cAMP) gesteigert. O-Me-cAMP stellt hierbei einen selektiven Aktivator des cAMP nachgeschalteten Epac/Rap 1-Signalweges dar, wohingegen Forskolin/Rolipram durch die generelle cAMP-Steigerung zusätzlich die durch Proteinkinase A (PKA) vermittelten Signalwege stimuliert. Messungen des transendothelialen elektrischen Widerstandes zeigten nach cAMP-Anstieg in beiden Fällen eine Barrierestabilisierung, die mit den Effekten einer Aktivierung von Rac 1 vergleichbar waren. Dies ging mit Veränderungen der Organisation und der Morphologie von Zell-Zell-Kontakten einher. Zusätzlich kam es nach cAMP-Steigerung zu einer gesteigerten Rac 1-Aktivierung ohne Beeinflussung der Rho A-Aktivität. Darüber hinaus zeigten Endothelzellen nach cAMP-Anstieg die Bildung eines corticalen Aktinrings und verminderte Stressfaserbildung, was typische Indizien einer Aktivierung von Rac 1 sind. Um die Rolle von Rac 1 näher zu untersuchen, wurden Rac 1-Inhibitionsstudien durchgeführt. Die pharmakologische Inhibition der Rac 1-Aktivität resultierte in einer verminderten Endothelbarriereintegrität. Für beide cAMP-steigernden Mediatoren kann nach Kombinationsstudien angenommen werden, dass die durch cAMP-Steigerung vermittelten barrierestabilisierenden Effekte durch Rac 1 vermittelt zu sein scheinen. Somit kann aus den Untersuchungen des zweiten Teils dieser Arbeit geschlussfolgert werden, dass cAMP eine gesteigerte Endothelbarrierefunktion sowohl über PKA- als auch über Epac/Rap 1-abhängige Rac 1-Aktivierung vermittelt. Um die Rolle der Rho-GTPasen und von cAMP während einer Barrieredestabilisierung zu untersuchen, wurde im dritten Teil Thrombin als barrieredestabilisierender physiologischer Mediator in humanen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen genutzt. Thrombin-Gabe führte zu einem reversiblen Zusammenbruch der Endothelbarriere. Zu diesen Zeitpunkten kam es zu einer signifikanten Inhibition von Rac 1 und einer deutlichen Aktivierung von Rho A. Erst nach 15 min fielen die gesamtzellulären cAMP-Spiegel ab. Innerhalb von 60 min erholte sich die Endothelbarriere und Rac 1- bzw. Rho A-Aktivitäten sowie der cAMP-Spiegel erreichten wieder ihr Ausgangsniveau. Vorinkubation der Endothelzellen mit beiden cAMP-steigernden Mediatoren inhibierte den Thrombin-induzierten Barriere-zusammenbruch ebenso wie die Thrombin-vermittelten Veränderungen der Rac 1- und Rho A-Aktivitäten. Auch in diesem Zusammenhang durchgeführte Rac 1-Inhibitionsstudien deuten darauf hin, dass die Hemmung der Thrombineffekte durch cAMP-Steigerung u.a. durch Aktivierung von Rac 1 vermittelt wird. N2 - Endothelial cells build a monolayer coating the inner surface of blood vessels and thereby form a dynamic barrier between plasma and interstitial space. Impaired endothelial barrier function can result in vascular diseases such as edema, atherosclerosis and inflammation. Small GTPases of the Rho family such as Rho A, Rac 1 and Cdc42 are well known regulators of endothelial barrier integrity. It is generally believed that Rho A and Rac 1 regulate endothelial barrier functions in antagonistic manner. According to this concept, Rho A destabilizes barrier integrity whereas Rac 1 enhances endothelial barrier properties. In a first step we investigated the role of Rho A, Rac 1 and Cdc42 in endothelial barrier regulation in four different types of endothelial cells. Microvascular endothelial cells of different origin (myocardium, mesentery and dermis) and macrovascular endothelial cells from pulmonary artery were treated with bacterial toxins to specifically activate or inactivate Rho GTPases. Effects on endothelial barrier functions were revealed by immunfluorescence microscopy, measurement of transendothelial electrical resistance and FITC-dextran flux as well as by quantification of VE-cadherin-mediated adhesion using laser tweezers. Activation of Rho A resulted in break-down of endothelial barrier functions in all endothelial cell types except microvascular myocardial endothelial cells. Activation of Rac 1 and Cdc42 as well as pharmacological inhibition of Rho kinase stabilized endothelial barrier function in all endothelial cell types. Moreover, inactivation of all three GTPases as well as inactivation of Rac 1 alone resulted in endothelial barrier-breakdown in all endothelial cell types. From these data we conclude that Rac 1 is a highly important regulator required for maintenance of endothelial barrier function. In the second part of the study, we characterized the role of Rho GTPases in cAMP-mediated barrier stabilizing effects in microvascular endothelium. Therefore, we analyzed cAMP-induced effects on transendothelial electrical resistance, Rho GTPase activity and cell junction morphology in human dermal microvascular endothelial cells. To increase intracellular cAMP levels we used the cAMP-analogue 8-pCPT-2’-O-Me-cAMP (O-Me-cAMP) or combined treatment with adenylat cyclase-stimulating agent forskolin together with phosphodiesterase 4 inhibitor rolipram. In this approach O-Me-cAMP is used to selectively activate the Epac/Rap 1 pathway whereas forskolin/rolipram-induced increase of cAMP triggers both protein kinase A (PKA)- and Epac/Rap 1-dependent mechanisms. Measurement of transendothelial electrical resistance revealed barrier stabilizing effects of both Epac/Rap 1 and PKA signaling pathways. Barrier stabilization was accompanied by changes in cell junction morphology and both O-Me-cAMP and forskolin/rolipram treatment strongly activated Rac 1 without affecting Rho A activity. Moreover, endothelial cells displayed changes in actin distribution and cortactin localization typical for activation of Rac 1. To investigate the role of Rac 1 activation in cAMP-mediated barrier stabilization we performed Rac 1 inhibition studies. Pharmacological inhibition of Rac 1 activity decreased transendothelial electrical resistance which was accompanied by formation of intercellular gaps. Under these conditions the efficacy of increased cAMP to stabilize endothelial barrier functions was reduced and O-Me-cAMP had no effect. This indicates that barrier-stabilizing effects of cAMP are at least in part mediated by Rac 1-dependent mechanisms which are induced via PKA and Epac/Rap 1 signaling. Next, to address the importance of cAMP and of Rac 1 under conditions of impaired endothelial barrier integrity we used the physiological permeability-increasing mediator thrombin. Thrombin induced a transient breakdown of endothelial barrier function accompanied by increased stress fiber and gap formation in human dermal microvascular endothelial cells. Rac 1 was significantly inactivated whereas Rho A was strongly activated 5 and 15 min after thrombin treatment. Additionally, cAMP levels were decreased. After 60 min Rac 1 and Rho A activity as well as cAMP levels reached baseline values and endothelial barrier function was restored. Increase of cAMP completely blocked endothelial barrier breakdown and largely prevented thrombin-mediated effects on Rac 1 and Rho A activity indicating that reduction of cAMP was the primary mechanism causing the thrombin response. When Rac 1 was inactivated in parallel, both O-Me-cAMP and forskolin/Rolipram were not effective to prevent thrombin-induced endothelial barrier breakdown. KW - Endothelbarriere Rho-GTPasen KW - Rac 1 KW - Rho A KW - Endothelbarriere KW - Rho-GTPasen KW - Rac 1 KW - Rho A KW - Endothel KW - endothelial barrier KW - Rho GTPases KW - Rho A KW - Rac 1 KW - thrombin Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-33471 ER - TY - JOUR A1 - Behera, Ananyaashree A1 - Jain, Preeti A1 - Ganguli, Geetanjali A1 - Biswas, Mainak A1 - Padhi, Avinash A1 - Pattanaik, Kali Prasad A1 - Nayak, Barsa A1 - Ergün, Süleyman A1 - Hagens, Kristine A1 - Redinger, Natalja A1 - Saqib, Mohd A1 - Mishra, Bibhuti B. A1 - Schaible, Ulrich E. A1 - Karnati, Srikanth A1 - Sonawane, Avinash T1 - Mycobacterium tuberculosis acetyltransferase suppresses oxidative stress by inducing peroxisome formation in macrophages JF - International Journal of Molecular Sciences N2 - Mycobacterium tuberculosis (Mtb) inhibits host oxidative stress responses facilitating its survival in macrophages; however, the underlying molecular mechanisms are poorly understood. Here, we identified a Mtb acetyltransferase (Rv3034c) as a novel counter actor of macrophage oxidative stress responses by inducing peroxisome formation. An inducible Rv3034c deletion mutant of Mtb failed to induce peroxisome biogenesis, expression of the peroxisomal β-oxidation pathway intermediates (ACOX1, ACAA1, MFP2) in macrophages, resulting in reduced intracellular survival compared to the parental strain. This reduced virulence phenotype was rescued by repletion of Rv3034c. Peroxisome induction depended on the interaction between Rv3034c and the macrophage mannose receptor (MR). Interaction between Rv3034c and MR induced expression of the peroxisomal biogenesis proteins PEX5p, PEX13p, PEX14p, PEX11β, PEX19p, the peroxisomal membrane lipid transporter ABCD3, and catalase. Expression of PEX14p and ABCD3 was also enhanced in lungs from Mtb aerosol-infected mice. This is the first report that peroxisome-mediated control of ROS balance is essential for innate immune responses to Mtb but can be counteracted by the mycobacterial acetyltransferase Rv3034c. Thus, peroxisomes represent interesting targets for host-directed therapeutics to tuberculosis. KW - peroxisome KW - Rv3034c KW - acetyltransferase KW - macrophages KW - oxidative stress KW - Mycobacterium tuberculosis Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-284080 SN - 1422-0067 VL - 23 IS - 5 ER - TY - THES A1 - Bergert, Maria Pamela T1 - Zelluläre und quantitative Verteilung von Glutamattransportern im Kleinhirn der Maus während der postnatalen Ontogenese T1 - Cellular and quantitative distribution of glutamate transporters in the murine cerebellum during postnatal ontogenesis N2 - Zelluläre und quantitative Verteilung von Glutamattransportern im Kleinhirn der Maus während der postnatalen Ontogenese N2 - Cellular and quantitative distribution of glutamate transporters in the murine cerebellum during postnatal ontogenesis KW - Glutamattransporter KW - Kleinhirn KW - Maus KW - Ontogenese KW - Verteilung KW - glutamate transporters KW - cerebellum KW - mouse KW - ontogenesis KW - distribution Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76689 ER - TY - THES A1 - Beyer, Astrid T1 - Expression von Glutamattransportern in der Retina des Menschen und der Ratte und im Nervus opticus der Ratte T1 - Expression of glutamate transporters in human and rat retina and rat optic nerve N2 - L-Glutamat ist der hauptsächliche exzitatorische Transmitter in der Vertebratenretina und spielt eine zentrale Rolle bei der Transmission wesentlicher Neurone in der Retina (z.B. Photorezeptor-, Bipolar- und Ganglienzellen). Das bei der Transmission freigesetzte Glutamat wird aus dem Extrazellularraum durch mindestens fünf verschiedene Glutamattransporter entfernt (zur Beendigung des Transmittersignals und zur Vermeidung einer neurotoxischen Anreicherung von Glutamat), die unterschiedlich verteilt in Neuronen und Gliazellen (vor allem Müller-Zellen) vorkommen. Die zelluläre Verteilung dieser Transporter wurde bisher hauptsächlich nur mit immuncytochemischen Methoden untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde nicht-radioaktive in situ Hybridisierung (ISH) unter Verwendung komplementärer RNA-Sonden eingesetzt, um die Zelltypen in der Retina und zusätzlich im N. opticus der Ratte zu identifizieren, welche die Glutamattransporter GLT1, GLT1-Variante (GLT1v), GLAST und EAAC1 exprimieren. Die Ergebnisse der ISH wurden mit immuncytochemischen Daten verglichen, wobei affinitätsgereinigte Antikörper gegen Transporterpeptide verwendet wurden. Bei den immuncytochemischen Untersuchungen wurde aus Vergleichsgründen die menschliche Retina einbezogen. Die Untersuchungen haben ergeben, dass in der Retina der Ratte GLT1v und EAAC1 in verschiedenen Zelltypen (Photorezeptor-, Bipolar-, Horizontal-, Amakrin-, Ganglien- und Müller-Zellen) gleichzeitig exprimiert werden, während GLAST nur in Müller-Zellen und Astrozyten vorkommt. Im N. opticus der Ratte werden GLT1v und EAAC1 vor allem in Oligodendrozyten und GLAST hauptsächlich in Astrozyten exprimiert. GLT1 konnte weder in der Retina, noch im N. opticus nachgewiesen werden. Die Untersuchungen an der menschlichen Retina ergaben eine der Rattenretina ähnliche zelluläre Verteilung der Glutamattransporter. N2 - l-Glutamate is the major excitatory transmitter in the vertebrate retina and plays a central role in the transmission of the various retinal neurons. Glutamate is removed from the extracellular space by at least five different glutamate transporters. The cellular distribution of these has been studied so far mainly using immunocytochemistry. In the present study non-radioactive in situ hybridisation using complementary RNA probes was applied in order to identify the cell types of rat retina and optic nerve expressing generic GLT1, GLT1 variant (GLT1v or GLT1B), GLAST and EAAC1. The results were compared with immunocytochemical data achieved using affinity-purified antibodies against transporter peptides. In the immunohistochemical studies the human retina was included. The study showed that in the rat retina GLT1v and EAAC1 were coexpressed in various cell types, i.e. photoreceptor, bipolar, horizontal, amacrine, ganglion and Muller cells, whereas GLAST was only detected in Muller cells and astrocytes. In the rat optic nerve GLT1v and EAAC1 were preferentially expressed in oligodendrocytes, whereas GLAST was revealed to be present mainly in astrocytes. Generic GLT1 could not be detected in the retina or optic nerve. The cellular distribution of glutamate transporters (only immunocytochemistry) in the human retina was very similar to that of the rat retina. Remarkable results of our studies were that generic GLT1 was not detectable in the rat (and human) retina and that GLT1v and EAAC1 were demonstrable in most cell types of the retina (including photoreceptor cells and their terminals). KW - Glutamattransporter KW - Retina KW - Nervus Opticus KW - Ratte KW - Glutamate transporters KW - retina KW - optic nerve KW - rat Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-10119 ER -