TY - THES A1 - Hugo, Julian T1 - ‘Signal-close-to-noise’ calcium activity reflects neuronal excitability T1 - ‘Signal-close-to-noise’ Kalziumaktivität als Ausdruck neuronaler Erregbarkeit N2 - Chronic pain conditions are a major reason for the utilization of the health care system. Inflammatory pain states can persist facilitated by peripheral sensitization of nociceptors. The voltage-gated sodium channel 1.9 (NaV1.9) is an important regulator of neuronal excitability and is involved in inflammation-induced pain hypersensitivity. Recently, oxidized 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol-3-phosphatidylcholine (OxPAPC) was identified as a mediator of acute inflammatory pain and persistent hyperalgesia, suggesting an involvement in proalgesic cascades and peripheral sensitization. Peripheral sensitization implies an increase in neuronal excitability. This thesis aims to characterize spontaneous calcium activity in neuronal compartments as a proxy to investigate neuronal excitability, making use of the computational tool Neural Activity Cubic (NA3). NA3 allows automated calcium activity event detection of signal-close-to-noise calcium activity and evaluation of neuronal activity states. Additionally, the influence of OxPAPC and NaV1.9 on the excitability of murine dorsal root ganglion (DRG) neurons and the effect of OxPAPC on the response of DRG neurons towards other inflammatory mediators (prostaglandin E2, histamine, and bradykinin) is investigated. Using calcium imaging, the presence of spontaneous calcium activity in murine DRG neurons was established. NA3 was used to quantify this spontaneous calcium activity, which revealed decreased activity counts in axons and somata of NaV1.9 knockout (KO) neurons compared to wildtype (WT). Incubation of WT DRG neurons with OxPAPC before calcium imaging did not show altered activity counts compared to controls. OxPAPC incubation also did not modify the response of DRG neurons treated with inflammatory mediators. However, the variance ratio computed by NA3 conclusively allowed to determine neuronal activity states. In conclusion, my findings indicate an important function of NaV1.9 in determining the neuronal excitability of DRG neurons in resting states. OxPAPC exposition does not influence neuronal excitability nor sensitizes neurons for other inflammatory mediators. This evidence reduces the primary mechanism of OxPAPC-induced hyperalgesia to acute effects. Importantly, it was possible to establish an approach for unbiased excitability quantification of DRG neurons by calcium activity event detection and calcium trace variance analysis by NA3. It was possible to show that signal-close-to-noise calcium activity reflects neuronal excitability states. N2 - Entzündliche Schmerzzustände können lange fortbestehen, was durch eine periphere Sensibilisierung von Nozizeptoren begünstigt wird. Der spannungsgesteuerte Natriumkanal 1.9 (NaV1.9) ist ein wichtiger Regulator neuronaler Erregbarkeit und ist nachweislich an entzündungsbedingter Schmerzüberempfindlichkeit beteiligt. Kürzlich wurde oxidiertes 1-Palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycerol-3-phosphatidylcholin (OxPAPC) als Mediator akuter Entzündungsschmerzen und anhaltender Hyperalgesie identifiziert, was auf eine Beteiligung an Mechanismen der peripheren Sensibilisierung hindeutet. Periphere Sensibilisierung setzt eine Erhöhung der neuronalen Erregbarkeit voraus. In dieser Arbeit soll neuronale spontane Kalziumaktivität charakterisiert werden, um Rückschlüsse auf die neuronale Erregbarkeit zu ziehen. Dazu wurde das Tool Neural Activity Cubic (NA3) eingesetzt, welches die automatisierte Detektion von „signal-close-to-noise“ Kalziumaktivitätsereignissen und die Bewertung neuronaler Aktivitätszustände erlaubt. Mittels NA3 wurde der Einfluss von OxPAPC und NaV1.9 auf die Erregbarkeit von murinen Spinalganglion (DRG)-Neuronen untersucht. Zusätzlich wurde die Reaktion von DRG-Neuronen auf weitere Entzündungsmediatoren (Prostaglandin E2, Histamin und Bradykinin) nach Inkubation mit OxPAPC beurteilt. Mittels Calcium-Imaging konnte spontane Kalziumaktivität in murinen DRG-Neuronen identifiziert werden. NA3 wurde verwendet, um diese spontane Kalziumaktivität zu quantifizieren. NaV1.9 Knockout-Neuronen (KO) zeigten signifikant Verringerte Kalziumaktivität im Vergleich Wildtyp (WT)-Neuronen. Die Inkubation von WT-Neuronen mit OxPAPC vor Calcium-Imaging resultierte in unveränderter Kalziumaktivität. Eine OxPAPC-Inkubation hatte ebenso keinen Einfluss auf die Reaktion von DRG-Neuronen, die mit einem Gemisch aus Entzündungsmediatoren stimuliert wurden. Die von NA3 berechnete „variance ratio“ ermöglichte jedoch eine eindeutige Bestimmung der neuronalen Aktivitätszustände. Zusammenfassend weisen meine Ergebnisse auf eine wichtige Funktion von NaV1.9 bei der Bestimmung der neuronalen Erregbarkeit von DRG-Neuronen im Ruhezustand hin. Eine Exposition mit OxPAPC beeinflusst allerdings weder die neuronale Erregbarkeit noch werden Neuronen für andere Entzündungsmediatoren sensibilisiert. Dies legt akute Effekte als primären Mechanismus der OxPAPC-induzierten Hyperalgesie nahe. Es war möglich, eine Methode für die unverzerrte Quantifizierung neuronaler Erregbarkeit von durch die Erkennung von Kalziumaktivitätsereignissen und die Varianzanalyse von Kalziumsignalen mit NA3 zu etablieren. Es konnte gezeigt werden, dass die „signal-close-to-noise“ Kalziumaktivität den Zustand der neuronalen Erregbarkeit widerspiegelt. KW - Entzündung KW - Schmerz KW - Natriumkanal KW - Erregbarkeit KW - Phospholipide KW - neuronal excitability KW - NaV1.9 KW - inflammatory pain KW - calcium activity Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-292605 ER - TY - THES A1 - Murali, Supriya T1 - Understanding the function of spontaneous blinks by investigating internally and externally directed processes T1 - Eine Untersuchung zur Funktion spontaner Lidschläge durch die Differenzierung von extern und intern gerichteten Prozessen N2 - Humans spontaneously blink several times a minute. These blinks are strongly modulated during various cognitive task. However, the precise function of blinking and the reason for their modulation has not been fully understood. In the present work, I investigated the function of spontaneous blinks through various perceptual and cognitive tasks. Previous research has revealed that blinks rates decrease during some tasks but increase during others. When trying to understand these seemingly contradictory results, I observed that blink reduction occurs when one engages with an external input. For instance, a decrease has been observed due to the onset of a stimulus, sensory input processing and attention towards sensory input. However, for activities that do not involve such an engagement, e.g. imagination, daydreaming or creativity, the blink rate has been shown to increase. To follow up on the proposed hypothesis, I distinguished tasks that involve the processing of an external stimulus and tasks that involve disengagement. In the first part of the project, I explored blinking during stimulus engagement. If the probability of blinking is low when engaging with the stimulus, then one should find a reduction in blinks specifically during the time period of processing but not during sensory input per se. To this end, in study 1, I tested the influence of task-relevant information duration on blink timing and additionally manipulated the overall sensory input using a visual and an auditory temporal simultaneity judgement task. The results showed that blinks were suppressed longer for longer periods of relevant information or in other words, blinks occurred at the end of relevant information processing for both the visual and the auditory modality. Since relevance is mediated through top-down processes, I argue that the reduction in blinks is a top-down driven suppression. In studies 2 and 3, I again investigated stimulus processing, but in this case, processing was triggered internally and not based on specific changes in the external input. To this end, I used bistable stimuli, in which the actual physical stimulus remains constant but their perception switches between different interpretations. Studies on the involvement of attention in such bistable perceptual changes indicate that the sensory input is reprocessed before the perceptual switch. The results revealed a reduction in eye blink rates before the report of perceptual switches. Importantly, I was able to decipher that the decrease was not caused by the perceptual switch or the behavioral response but likely started before the internal switch. Additionally, periods between a blink and a switch were longer than interblink intervals, indicating that blinks were followed by a period of stable percept. To conclude, the first part of the project revealed that there is a top-down driven blink suppression during the processing of an external stimulus. In the second part of the project, I extended the idea of blinks marking the disengagement from external processing and tested if blinking is associated with better performance during internally directed processes. Specifically, I investigated divergent thinking, an aspect of creativity, and the link between performance and blink rates as well as the effect of motor restriction. While I could show that motor restriction was the main factor influencing divergent thinking, the relationship between eye blink rates and creative output also depended on restriction. Results showed that higher blink rates were associated with better performance during free movement, but only between subjects. In other words, subjects who had overall higher blink rates scored better in the task, but when they were allowed to sit or walk freely. Within a single subject, trial with higher blink rates were not associated with better performance. Therefore, possibly, people who are able to disengage easily, as indicated by an overall high blink rate, perform better in divergent thinking tasks. However, the link between blink rate and internal tasks is not clear at this point. Indeed, a more complex measurement of blink behavior might be necessary to understand the relationship. In the final part of the project, I aimed to further understand the function of blinks through their neural correlates. I extracted the blink-related neural activity in the primary visual cortex (V1) of existing recordings of three rhesus monkeys during different sensory processing states. I analyzed spike related multi-unit responses, frequency dependent power changes, local field potentials and laminar distribution of activity while the animal watched a movie compared to when it was shown a blank screen. The results showed a difference in blink-related neural activity dependent on the processing state. This difference suggests a state dependent function of blinks. Taken altogether, the work presented in this thesis suggests that eye blinks have an important function during cognitive and perceptual processes. Blinks seem to facilitate a disengagement from the external world and are therefore suppressed during intended processing of external stimuli. N2 - Menschen blinzeln spontan mehrmals pro Minute. Während verschiedener kognitiver Aufgaben ist die Häufigkeit dieser Lidschläge sehr unterschiedlich. Jedoch ist die genaue Funktion des spontanen Lidschlags und der Grund für deren Modulation noch nicht vollständig verstanden. In der vorliegenden Arbeit habe ich die Funktion des spontanen Lidschlags durch verschiedene Aufgaben im Bereich der Wahrnehmung und Kognition untersucht. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Häufigkeit der Lidschläge bei einigen Aufgaben abnimmt, bei anderen jedoch zunimmt. Bei der Prüfung dieser scheinbar widersprüchlichen Ergebnisse beobachtete ich, dass die Reduzierung der Lidschlaghäufigkeit scheinbar immer bei der Beschäftigung mit externem Input auftritt. Zum Beispiel wurde eine Abnahme aufgrund des Beginns eines sensorischen Reizes, der Verarbeitung sensorischen Inputs und von Aufmerksamkeit auf sensorischen Input beschrieben. Für Aktivitäten ohne solch externes Engagement, z.B. Fantasie, Tagträume oder Kreativität, nimmt die Häufigkeit der Lidschläge zu. Um die vorgeschlagene Hypothese zu überprüfen, untersuchte ich explizit solche Aufgaben mit Verarbeitung eines externen Reizes und solchen mit einer Abgrenzung von externem Input. Im ersten Teil des Projekts untersuchte ich die Lidschläge während der Präsentation von externen Reizen. Falls die Wahrscheinlichkeit der Lidschläge an eine Reizverarbeitung gekoppelt ist, sollte man eine Verringerung der Lidschläge während des Verarbeitungszeitraums feststellen aber nicht während sensorischen Inputs an sich. Zu diesem Zweck habe ich in Studie 1 den Einfluss der aufgabenrelevanten Informationsdauer unabhängig vom gesamten sensorischen Input auf den Zeitpunkt des Lidschlags getestet. Dies geschah mit einer visuellen und einer auditiven Aufgabe zur zeitlichen Gleichzeitigkeitsbeurteilung. Die Ergebnisse zeigten, dass Lidschläge während Zeitfenster mit relevanten Informationen unterdrückt wurden, oder anders gesagt, Lidschläge traten am Ende der Informationsverarbeitung sowohl in der visuellen als auch auditorischen Modalität auf. Weil Relevanz durch Top-Down-Prozesse vermittelt wird, behaupte ich, dass die Verringerung der Lidschläge eine Top-Down-gesteuerte Unterdrückung ist. In den Studien 2 und 3 habe ich die Reizverarbeitung erneut untersucht, aber jetzt wurde die Verarbeitung intern ausgelöst und nicht auf Basis von spezifischen Änderungen im externen Input. Dazu habe ich bistabile Reize verwendet, bei denen der physikalische Reiz selber konstant bleibt, aber die Wahrnehmung zwischen verschiedenen Interpretationen wechselt. Studien über die Rolle der Aufmerksamkeit bei bistabilen Wahrnehmungsveränderungen zeigen, dass der sensorische Input vor dem Wahrnehmungswechsel erneut verarbeitet wird. Die Ergebnisse deckten eine Verringerung in der Häufigkeit der Lidschläge vor der Mitteilung über Wahrnehmungswechsel auf. Eine wichtige Erkenntnis hierbei war, dass diese Verringerung nicht durch den Wahrnehmungswechsel oder die Verhaltensreaktion verursacht wurde, sondern mit großer Wahrscheinlichkeit schon vor dem internen Wechsel anfing. Außerdem waren die Perioden zwischen einem Lidschlag und einem Wahrnehmungswechsel länger als die Intervalle zwischen den Lidschlägen, was darauf hinweist, dass einem Lidschlag eine Zeit stabiler Wahrnehmung folgt. Zusammenfassend zeigte der erste Teil des Projekts die Existenz einer Top-Down-gesteuerten Lidschlag-Unterdrückung während der Verarbeitung eines externen Stimulus. Die Idee dass Lidschläge eine Abgrenzung von der Verarbeitung externer Signale markieren habe ich im zweiten Teil des Projekts erweitert und getestet, ob blinzeln mit einer besseren Leistung während intern gesteuerter Prozesse verbunden ist. Insbesondere untersuchte ich divergentes Denken, ein Aspekt der Kreativität, und den Zusammenhang zwischen kreativer Leistung und Häufigkeit der Lidschläge sowie die Wirkung von motorischer Einschränkung. Ich konnte den Einfluss von motorischer Einschränkung auf divergentes Denken aufzeigen, jedoch auch dass die Beziehung zwischen Häufigkeit der Lidschläge und kreativem Output von der motorischen Einschränkung abhängig ist. Die Ergebnisse zeigten eine Verbindung zwischen höherer Lidschlaghäufigkeit und besseren Leistung bei freier Bewegung, jedoch nur innerhalb der Gruppe. Anders gesagt, Probanden mit insgesamt höherer Häufigkeit der Lidschläge erzielten bei der Aufgabe besser Resultate, aber nur wenn sie sich frei bewegen durften. Innerhalb eines Probanden waren Versuche mit höherer Häufigkeit der Lidschläge nicht mit einer besseren Leistung verbunden. Eine mögliche Interpretation ist, dass Menschen die sich insgesamt leichter von sensorischem Input abgrenzen, was möglicherweise durch eine insgesamt hohe Häufigkeit der Lidschläge angezeigt wird, bei divergenten Denkaufgaben besser abschneiden. Allerdings ist der Zusammenhang zwischen Häufigkeit der Lidschläge und internen Aufgaben an dieser Stelle noch nicht klar. Tatsächlich könnte eine komplexere Messung des Lidschlagverhaltens notwendig sein, um die Beziehung zu verstehen. Im letzten Teil des Projekts wollte ich die Funktion von Lidschlägen über ihre neuronalen Korrelate besser verstehen. Ich habe die lidschlagbezogene neuronale Aktivität im primären visuellen Kortex (V1) aus bestehenden Aufzeichnungen von drei Rhesusaffen bei verschiedenen Aufmerksamkeitsverarbeitungszuständen extrahiert. Die lidschlagbezogene Rate der Aktionspotentiale, die Multi-Unit-Aktivität, frequenzabhängige Aktivität, lokale Feldpotentiale und laminare Aktivitätsverteilung habe ich während zwei Versuchsbedingungen analysiert, das Anschauen eines Films und einer Pause vor einem leeren Bildschirm. Die Ergebnisse zeigten einen Unterschied in der lidschlagbezogenen neuronalen Aktivität in Abhängigkeit von der Versuchsbedingung und somit dem Verarbeitungszustand. Dieser Unterschied deutet eine zustandsabhängige Funktion der Lidschläge an. Insgesamt legt die in dieser Dissertation vorgestellte Arbeit nahe, dass Lidschläge eine wichtige Funktion in Kognition und Wahrnehmungsprozessen hat. Lidschläge scheinen eine Abgrenzung von der Außenwelt zu erleichtern und werden daher bei beabsichtigter Verarbeitung externer Reize unterdrückt. KW - Lidschlag KW - Kognition KW - Aufmerksamkeit KW - Wahrnehmung KW - spontaneous blinks KW - attention KW - perception Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-287473 ER - TY - THES A1 - Truongvan, Ngoc T1 - Understanding the dual specificity of UBA6 T1 - Einblick in die duale Spezifität von UBA6 N2 - Ubiquitylation is a protein post translational modification, in which ubiquitin is covalently attached to target protein substrates resulting in diverse cellular outcomes. Besides ubiquitin, various ubiquitin-like proteins including FAT10 exist, which are also conjugated to target proteins. The underlying modification mechanisms are conserved. In the initial step, ubiquitin or a ubiquitin-like protein is thioester-linked to a catalytic cysteine in the E1activating enzyme in an ATP-dependent manner. The respective protein modifier is then transferred to an E2 conjugating enzyme in a transthioesterification reaction. Finally, an E3 ubiquitin ligase E3 catalyzes the covalent attachment of the protein modifier to a substrate. In the case of ubiquitin, multiple ubiquitin molecules can be attached to a substrate in the form of either linear or branched polyubiquitin chains but also as single ubiquitin modifications. Depending on the nature of the ubiquitin chain, the substrates are destined to various cellular processes such as their targeted destruction by the proteasome but also non-degradative outcomes may occur. As stated above FAT10 is a ubiquitin-like protein modifier which typically targets proteins for proteasomal degradation. It consists of two ubiquitin-like domains and is mainly expressed in cells of the human immune system. The reported involvement of FAT10 modifications in cancers and other diseases has caught the attention of the scientific community as an inhibition of the FAT10ylation process may provide avenues for novel therapeutic approaches. UBA6 is the E1 activating enzyme that resides at the apex of the FAT10 proteasomal degradation pathway. UBA6 not only recognizes FAT10 but can also activate ubiquitin as efficiently as the ubiquitin specific E1 UBA1. The dual specificity of UBA6 may complicate the inhibition FAT10ylation since targeting the active site of UBA6 will also inhibit the UBA6-catalyzed ubiquitin activation. Therefore, it is important to understand the underlying principles for the dual specificity of UBA6 prior to the development of compounds interfering with FAT10ylation. In this thesis important novel insights into the structure and function of UBA6 were derived by X-ray crystallography and biochemical methods. The first crystal structure of UBA6 reveals the multidomain architecture of this enzyme in atomic detail. The enzyme is composed of a rigid core including its active and inactive adenylation domains as well as a 4 helix bundle. Overall, the molecule adopts a “Y” shape architecture with the core at the base and the first and second catalytic half domains forming one arm of the “Y” and the ubiquitin fold domain constituting the other arm. While UBA6 shares the same domain architecture as UBA1, substantial differences were revealed by the crystal structure. In particular, the first catalytic half domain undergoes a significant shift to a position more distal from the core. This rigid body movement is assumed to generate room to accommodate the second ubiquitin-like domain of FAT10. Differences are also observed in a hydrophobic platform between the core and the first catalytic half domain and the adenylation active site in the core, which together from the binding sites for ubiquitin and FAT10. Site directed mutagenesis of key residues in these areas altered the UBA6-catalyzed activation of ubiquitin and FAT10. UBA6 variants were generated with the goal of trying to block the activation of FAT10 while still maintaining that of ubiquitin activation, in order to fully explain the dual specificity of UBA6. However, none of these mutations could block the activation of FAT10, while some of these UBA6 variants blocked ubiquitin activation. Preliminary inhibition assays with a group of E1 inhibitors belonging to the adenosyl sulfamate family demonstrated potent inhibition of FAT10ylation for two compounds. The dual specificity of UBA6 hence needs to be further examined by biochemical and structural methods. In particular, the structure of a complex between UBA6 and ubiquitin or FAT10 would provide key insights for further biochemical studies, ultimately allowing the targeted inhibition of the FAT10ylation machinery. N2 - Der Prozess der Ubiquitinierung stellt eine posttranslationale Modifikation dar, bei der das kleine Protein Ubiquitin kovalent an ein Zielprotein angehängt wird, was zu verschiedenen zellulären Effekten führt. Neben Ubiquitin existieren verschiedene ubiquitinähnliche Proteine, wie z.B. FAT10, die an Zielproteine angehängt werden können. Die der Modifikation zugrunde liegenenden Mechanismen der Proteinmodifikation sind konserviert. Im ersten Schritt wird Ubiquitin oder das ubiquitinähnliche Protein in einer ATP-abhängigen Reaktion kovalent an das katalytische Cystein des aktivierenden Enzyms (E1) gebunden. Danach wird es durch Transthioestherifizierung an ein konjugierendes Enzym (E2) übertagen und schließlich durch eine Ligase (E3) kovalent an das Substrat gehängt. Ubiquitin kann entweder einzeln oder in Form linearer oder verzweigter Ketten an ein Substrat angehängt werden, was wiederum zu verschiedenen funktionalen Konsequenzen wie dem Abbau das Proteins durch das Proteasom führen kann. Wie schon erwähnt ist FAT10 ein ubiquitinähliches Protein, das üblicherweise Zielproteine für den Abbau durch das Proteasom markiert. Es besteht aus zwei ubiquitinähnlichen Domänen und wird im Menschen hauptsächlich in Zellen des Immunsystems exprimiert. Die Beteiligung von FAT10 an der Entstehung von Krebs and anderen Krankheiten hat die Aufmerksamkeit der wissenschaftlichen Gemeinschaft erregt, da Inhibition des ‚FAT10ylation‘ Prozesses einen neuen therapeutischen Ansatz zur Behandlung dieser Krankheiten darstellen könnte. UBA6 fungiert hierbei als E1 s Enzym, das am Anfang des FAT10-abhängigen proteasomalen Abbaus steht. UBA6 aktiviert neben FAT10 auch Ubiquitin mit ähnlicher Effizienz wie das ubiquitinspezifische E1 UBA1. Diese Bispezifität von UBA6 könnte die Inhibition der FAT10ylierung erschweren, da die Inhibition der katalytischen UBA6 Aktivität gleichzeitig UBA6-abhängige Ubiquitinaktivierung behindern würde. Daher ist für die zukünfitge Entwicklung FAT10-spezifischer UBA6 Inhibitoren ein grundlegendes Verständnis der UBA6 Bispezifität unerlässlich. In dieser Dissertation wurden wichtige, neue Einsichten in die Struktur und Funktion von UBA6 durch Röntgenkristallographie und biochemische Methoden gewonnen. Die erste Kristallstruktur von UBA6 zeigt die Multidomänenarchitektur des Enzyms bei atomarer Auflösung. Das Protein besteht aus einem starren Kern, der sowohl seine aktive als auch inaktive Adenylierungsdomäne sowie ein 4-Helix Bündel enthält. Das Molekül nimmt eine an ein Y erinnnernde Form ein, in der der Kern die Basis, die erste und zweite katalytischen Halbdomänen einen Arm und die ubiquitinähnliche gefaltete Domäne den zweiten Arm darstellen. Zwar ähneln sich der Domänenaufbau von UBA6 und UBA1, jedoch zeigte die Kristallstruktur bedeutende Unterschiede zwischen den beiden auf. Speziell die erste katalytische Halbdomäne ist in UBA6 im Vergleich zu UBA1weiter vom Enzymkern entfernt. Diese ‚Bewegung‘ erlaubt wahrscheinlich die Platzierung der zweiten UBL-Domäne von FAT10. Weitere Unterschiede konnten auch in der hydrophoben Oberfläche zwischen Kern, erster katalytischer Halbdomäne und dem aktiven Zentrum für die Adenylierung im Kern beobachtet werden, die zusammen die Bindestelle für Ubiquitin und FAT10 bilden. Durch ortsgerichtete Mutagenese von Schlüsselpositionen in dieser Region kontte die UBA6-katalysierte Aktivierung von entweder Ubiquitin oder FAT10 unterbunden werden. Um die Bispezifität von UBA6 zu entschlüsseln wurden UBA6 Varianten mit dem Ziel erzeugt, die Aktivierung von FAT10 unter Aufrechterhaltung der von Ubiquitin zu blockieren. Obwohl keine dieser Mutationen die FAT10-Aktivierung unterband, verhinderten einige jedoch die Aktivierung von Ubiquitin. Vorläufige Inhibitionsexperimente mit E1-Inhibitoren aus der Adenosylsulfamat Klasse zeigten starke Inhibition der FAT10ylierung durch zwei Verbindungen. Die Bispezifität von UBA6 bedarf weiterer strukturbiologischer und biochemischer Untersuchungen. Vor allem Kristallstrukturen von UBA6 in FAT10 und Ubiquitin-gebundener Form würden wichtige Erkenntnisse für weiteregehende biochemische Untersuchungen und schließlich die gezielte Unterdrückung der FAT10ylierungsmaschinerie liefern. KW - Ubiquitylation KW - FAT10ylation KW - UBA6 KW - UBE2Z Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-244579 ER - TY - THES A1 - Masota, Nelson Enos T1 - The Search for Novel Effective Agents Against Multidrug-Resistant Enterobacteriaceae T1 - Die Suche nach neuen wirksamen Wirkstoffen gegen multiresistente Enterobacteriaceae N2 - This thesis aimed at searching for new effective agents against Multidrug-Resistant Enterobacteriaceae. This is necessitated by the urgent need for new and innovative antibacterial agents addressing the critical priority pathogens prescribed by the World Health Organization (WHO). Among the available means for antibiotics discovery and development, nature has long remained a proven, innovative, and highly reliable gateway to successful antibacterial agents. Nevertheless, numerous challenges surrounding this valuable source of antibiotics among other drugs are limiting the complete realization of its potential. These include the availability of good quality data on the highly potential natural sources, limitations in methods to prepare and screen crude extracts, bottlenecks in reproducing biological potentials observed in natural sources, as well as hurdles in isolation, purification, and characterization of natural compounds with diverse structural complexities. Through an extensive review of the literature, it was possible to prepare libraries of plant species and phytochemicals with reported high potentials against Escherichia coli and Klebsiella pneumnoniae. The libraries were profiled to highlight the existing patterns and relationships between the reported antibacterial activities and studied plants’ families and parts, the type of the extracting solvent, as well as phytochemicals’ classes, drug-likeness and selected parameters for enhanced accumulation within the Gram-negative bacteria. In addition, motivations, objectives, the role of traditional practices and other crucial experimental aspects in the screening of plant extracts for antibacterial activities were identified and discussed. Based on the implemented strict inclusion criteria, the created libraries grant speedy access to well-evaluated plant species and phytochemicals with potential antibacterial activities. This way, further studies in yet unexplored directions can be pursued from the indicated or related species and compounds. Moreover, the availability of compound libraries focusing on related bacterial species serves a great role in the ongoing efforts to develop the rules of antibiotics penetrability and accumulation, particularly among Gram-negative bacteria. Here, in addition to hunting for potential scaffolds from such libraries, detailed evaluations of large pool compounds with related antibacterial potential can grant a better understanding of structural features crucial for their penetration and accumulation. Based on the scarcity of compounds with broad structural diversity and activity against Gram-negative bacteria, the creation and updating of such libraries remain a laborious but important undertaking. A Pressurized Microwave Assisted Extraction (PMAE) method over a short duration and low-temperature conditions was developed and compared to the conventional cold maceration over a prolonged duration. This method aimed at addressing the key challenges associated with conventional extraction methods which require long extraction durations, and use more energy and solvents, in addition to larger quantities of plant materials. Furthermore, the method was intended to replace the common use of high temperatures in most of the current MAE applications. Interestingly, the yields of 16 of 18 plant samples under PMAE over 30 minutes were found to be within 91–139% of those obtained from the 24h extraction by maceration. Additionally, different levels of selectivity were observed upon an analytical comparison of the extracts obtained from the two methods. Although each method indicated selective extraction of higher quantities or additional types of certain phytochemicals, a slightly larger number of additional compounds were observed under maceration. The use of this method allows efficient extraction of a large number of samples while sparing heat-sensitive compounds and minimizing chances for cross-reactions between phytochemicals. Moreover, findings from another investigation highlighted the low likelihood of reproducing antibacterial activities previously reported among various plant species, identified the key drivers of poor reproducibility, and proposed possible measures to mitigate the challenge. The majority of extracts showed no activities up to the highest tested concentration of 1024 µg/mL. In the case of identical plant species, some activities were observed only in 15% of the extracts, in which the Minimum Inhibitory Concentrations (MICs) were 4 – 16-fold higher than those in previous reports. Evaluation of related plant species indicated better outcomes, whereby about 18% of the extracts showed activities in a range of 128–512 μg/mL, some of the activities being superior to those previously reported in related species. Furthermore, solubilizing plant crude extracts during the preparation of test solutions for Antibacterial Susceptibility Testing (AST) assays was outlined as a key challenge. In trying to address this challenge, some studies have used bacteria-toxic solvents or generally unacceptable concentrations of common solubilizing agents. Both approaches are liable to give false positive results. In line with this challenge, this study has underscored the suitability of acetone in the solubilization of crude plant extracts. Using acetone, better solubility profiles of crude plant extracts were observed compared to dimethyl sulfoxide (DMSO) at up to 10 %v/v. Based on lacking toxicity against many bacteria species at up to 25 %v/v, its use in the solubilization of poorly water-soluble extracts, particularly those from less polar solvents is advocated. In a subsequent study, four galloylglucoses were isolated from the leaves of Paeonia officinalis L., whereby the isolation of three of them from this source was reported for the first time. The isolation and characterization of these compounds were driven by the crucial need to continually fill the pre-clinical antibiotics pipeline using all available means. Application of the bioautography-guided isolation and a matrix of extractive, chromatographic, spectroscopic, and spectrometric techniques enabled the isolation of the compounds at high purity levels and the ascertainment of their chemical structures. Further, the compounds exhibited the Minimum Inhibitory Concentrations (MIC) in a range of 2–256 µg/mL against Multidrug-Resistant (MDR) strains of E. coli and K. pneumonia exhibiting diverse MDR phenotypes. In that, the antibacterial activities of three of the isolated compounds were reported for the first time. The observed in vitro activities of the compounds resonated with their in vivo potentials as determined using the Galleria mellonella larvae model. Additionally, the susceptibility of the MDR bacteria to the galloylglucoses was noted to vary depending on the nature of the resistance enzymes expressed by the MDR bacteria. In that, the bacteria expressing enzymes with higher content of aromatic amino acids and zero or positive net charges were generally more susceptible. Following these findings, a plausible hypothesis for the observed patterns was put forward. The generally challenging pharmacokinetic properties of galloylglucoses limit their further development into therapeutic agents. However, the compounds can replace or reduce the use of antibiotics in livestock keeping as well as in the treatment of septic wounds and topical or oral cavity infections, among other potential uses. Using nature-inspired approaches, a series of glucovanillin derivatives were prepared following feasible synthetic pathways which in most cases ensured good yields and high purity levels. Some of the prepared compounds showed MIC values in a range of 128 – 512 μg/mL against susceptible and MDR strains of Klebsiella pneumoniae, Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Vancomycin-Resistant Enterococcus faecium (VRE). These findings emphasize the previously reported essence of small molecular size, the presence of protonatable amino groups and halogen atoms, as well as an amphiphilic character, as crucial features for potential antibacterial agents. Due to the experienced limited success in the search for new antibacterial agents using purely synthetic means, pursuing semi-synthetic approaches as employed in this study are highly encouraged. This way, it is possible to explore broader chemical spaces around natural scaffolds while addressing their inherent limitations such as solubility, toxicity, and poor pharmacokinetic profiles. N2 - Ziel dieser Arbeit war die Suche nach neuen wirksamen Antiinfektiva gegen multiresistente Enterobacteriaceae. Grund dafür ist der dringende Bedarf an neuen und innovativen antibakteriellen Wirkstoffen gegen die von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) als vorrangig eingestuften Krankheitserreger. Unter den verfügbaren Methoden zur Entdeckung und Entwicklung von Antibiotika ist die Natur seit langem ein bewährtes, innovatives und äußerst zuverlässiges Mittel, um erfolgreich zu antibakteriellen Wirkstoffen zu gelangen. Dennoch stehen dieser wertvollen Quelle von Antibiotika und anderen Arzneimitteln zahlreiche Herausforderungen gegenüber, die die vollständige Ausschöpfung ihres Potenzials einschränken. Dazu gehören die Verfügbarkeit qualitativ hochwertiger Daten über die hochpotenten natürlichen Quellen, Einschränkungen bei den Methoden zur Herstellung und zum Screening von Rohextrakten, Engpässe bei der Reproduktion des in natürlichen Quellen beobachteten biologischen Potenzials sowie Hürden bei der Isolierung, Reinigung und Charakterisierung von Naturstoffen mit unterschiedlicher struktureller Komplexität. Mittels einer umfassenden Durchsicht der Literatur war es möglich, Bibliotheken mit Pflanzenarten und Phytochemikalien zu erstellen, die ein hohes Potenzial gegen Escherichia coli und Klebsiella pneumnonia aufweisen. Die Bibliotheken wurden profiliert, um die bestehenden Muster und Beziehungen zwischen den berichteten antibakteriellen Aktivitäten und den untersuchten Pflanzenfamilien und -teilen, der Art des Extraktionslösungsmittels sowie den Klassen der Phytochemikalien, der Wirkstoffähnlichkeit und ausgewählten Parametern für eine verstärkte Akkumulation in den gramnegativen Bakterien aufzuzeigen. Darüber hinaus wurden Motivationen, Ziele, die Rolle traditioneller Methoden und andere wichtige experimentelle Aspekte beim Screening von Pflanzenextrakten auf antibakterielle Aktivitäten identifiziert und diskutiert. Auf der Grundlage der strengen Aufnahmekriterien bieten die erstellten Bibliotheken einen schnellen Zugang zu gut bewerteten Pflanzenarten und Phytochemikalien mit potenziellen antibakteriellen Aktivitäten. Auf diese Weise können weitere Studien in noch unerforschten Richtungen mit den angegebenen oder ähnlichen Arten und Verbindungen durchgeführt werden. Darüber hinaus spielt die Verfügbarkeit von Substanzbibliotheken, die sich auf verwandte Bakterienarten konzentrieren, eine große Rolle bei den laufenden Bemühungen, die Regeln für die Penetration und Akkumulation von Antibiotika zu entwickeln, insbesondere bei gramnegativen Bakterien. Neben der Suche nach potenziellen Molekülgerüsten aus solchen Bibliotheken können detaillierte Bewertungen großer Pools von Verbindungen mit antibakteriellem Potenzial ein besseres Verständnis der strukturellen Merkmale ermöglichen, die für ihre Penetration und Akkumulation entscheidend sind. Da es kaum Verbindungen mit breiter struktureller Vielfalt und Aktivität gegen gramnegative Bakterien gibt, ist die Erstellung und Aktualisierung solcher Bibliotheken nach wie vor ein mühsames, aber wichtiges Unterfangen. Es wurde eine schnelle mikrowellenunterstützte Extraktionsmethode unter Druck (PMAE) und bei niedrigen Temperaturen entwickelt und mit der herkömmlichen Kaltmazeration mit längerer andauernd verglichen. Mit der PMAE-Methode sollten die wichtigsten Probleme herkömmlicher Extraktionsmethoden gelöst werden, die eine lange Extraktionsdauer erfordern, mehr Energie und Lösungsmittel verbrauchen und zudem größere Mengen an Pflanzenmaterial benötigen. Darüber hinaus sollte die Methode die übliche Verwendung hoher Temperaturen in den meisten der derzeitigen MAE-Anwendungen ersetzen. Interessanterweise lag die Ausbeute von 16 der 18 Pflanzenproben bei der 30-minütigen PMAE zwischen 91 und 139 % der jenigen, die bei der 24-stündigen Extraktion durch Mazeration erzielt wurde. Darüber hinaus wurden bei einem analytischen Vergleich der mit den beiden Methoden gewonnenen Extrakte unterschiedliche Selektivitätsgrade festgestellt. Obwohl jede Methode eine selektive Extraktion größere Mengen oder zusätzlicher Arten bestimmter Phytochemikalien anzeigte, wurde bei der Mazeration eine etwas größere Anzahl an Verbindungen beobachtet. Die Anwendung dieser PMAE-Methode ermöglicht eine effiziente Extraktion einer großen Anzahl von Proben, wobei hitzeempfindliche Verbindungen geschont werden und die Wahrscheinlichkeit von Kreuzreaktionen zwischen Phytochemikalien minimiert wird. Die weitere Untersuchung von Pflanzenextraktionen haben die geringe Reproduzierbarkeit von antibakteriellen Aktivitäten, die zuvor für verschiedene Pflanzenarten berichtet wurden, aufgedeckt, die Hauptursachen für die schlechte Reproduzierbarkeit identifiziert und mögliche Maßnahmen zur Minimierung dieser Herausforderung vorgeschlagen. Die Mehrheit der Extrakte zeigte bis zur höchsten getesteten Konzentration von 1024 µg/ml keine Aktivitäten. Bei identischen Pflanzenarten wurden nur bei 15 % der Extrakte gewisse Aktivitäten beobachtet, wobei die minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) um das Vier- bis 16-fache höher waren als in früheren Berichten. Die Auswertung verwandter Pflanzenarten zeigte geringfügig bessere Ergebnisse, wobei etwa lagen 18 % der Extrakte Aktivitäten in einem Bereich von 128-512 µg/ml aufwiesen; dabei einige der Aktivitäten über denen, die zuvor bei verwandten Arten berichtet wurden. Darüber hinaus wurde die Löslichkeit von Pflanzenrohextrakten bei der Herstellung von Testlösungen für die Bestimmung der Antimikrobischen Suszeptibilität (AST) als eine der größten Herausforderungen bezeichnet. Bei dem Versuch, diese Herausforderung zu bewältigen, wurden in einigen Studien bakterientoxische Lösungsmittel oder allgemein inakzeptable Konzentrationen gängiger Lösungsvermittler verwendet. Beide Ansätze können zu falsch-positiven Ergebnissen führen. Deshalb hat diese Studie die Eignung von Aceton für die Solubilisierung von Pflanzenrohextrakten unterstrichen. Bei Verwendung von Aceton wurden eine bessere Löslichkeit der Pflanzenrohextrakten im Vergleich zu Dimethylsulfoxid (DMSO) bei bis zu 10 % v/v beobachtet. Aufgrund der fehlenden Toxizität gegen viele Bakterienarten bei bis zu 25 % v/v wird die Verwendung von Aceton für die Solubilisierung schwer wasserlöslicher Extrakte, insbesondere solcher aus weniger polaren Lösungsmitteln, befürwortet. In der nachfolgenden Untersuchung wurden vier Galloylglucosen aus den Blättern von Paeonia officinalis L. isoliert, wobei von drei Substanzen aus dieser Quelle zum ersten Mal berichtet wurde. Die Isolierung und Charakterisierung dieser Verbindungen wurden durch die dringende Notwendigkeit vorangetrieben, die präklinische Antibiotika-Pipeline mit allen verfügbaren Methoden zu füllen. Die Anwendung der bioautographisch gesteuerten Isolierung und einer Matrix aus extraktiven, chromatographischen, spektroskopischen und spektrometrischen Techniken ermöglichte die Isolierung der Verbindungen mit hohem Reinheitsgrad und die Bestimmung ihrer chemischen Strukturen. Darüber hinaus wiesen die Verbindungen minimale Hemmkonzentrationen (MHK) in einem Bereich von 2-256 µg/ml gegen multiresistente (MDR) Stämme von E. coli und K. pneumonia auf, die verschiedene MDR-Phänotypen aufweisen. Über die antibakteriellen Aktivitäten von drei der isolierten Verbindungen wurde zum ersten Mal berichtet. Die beobachteten In-vitro-Aktivitäten der Verbindungen stimmten mit ihren In-vivo-Potenzialen überein, die anhand des Galleria mellonella-Larvenmodells ermittelt wurden. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Empfindlichkeit der MDR-Bakterien gegenüber den Galloylglucosen von der Art der von den MDR-Bakterien exprimierten Resistenzenzyme abhängt. So waren die Bakterien, die Enzyme mit einem höheren Gehalt an aromatischen Aminosäuren und null oder positiven Nettoladungen exprimieren, im Allgemeinen anfälliger. Nach diesen Erkenntnissen wurde eine plausible Hypothese für die beobachteten Muster aufgestellt. Die allgemein schwierigen pharmakokinetischen Eigenschaften von Galloylglucosen schränken ihre weitere Entwicklung als therapeutischen Wirkstoffen ein. Die Verbindungen können jedoch den Einsatz von Antibiotika in der Tierhaltung sowie bei der Behandlung von septischen Wunden und Infektionen der Haut oder der Mundhöhle ersetzen oder reduzieren, neben anderen potenziellen Anwendungen. Mit von der Natur inspirierten Ansätzen wurde eine Reihe von Glucovanillin-Derivaten synthetisch hergestellt. Einige der neuen Verbindungen wiesen MHK-Werte im Bereich von 128 - 512 μg/ml gegen empfindliche und MDR-Stämme von Klebsiella pneumoniae, Methicillin-resistentem Staphylococcus aureus (MRSA) und Vancomycin-resistentem Enterococcus faecium (VRE) auf. Diese Ergebnisse unterstreichen die bereits früher berichtete Bedeutung einer kleinen Molekülgröße, des Vorhandenseins protonierbarer Aminogruppen und Halogenatome sowie eines amphiphilen Charakters als entscheidende Merkmale für potenzielle antibakterielle Wirkstoffe. Da die Suche nach neuen antibakteriellen Wirkstoffen mit rein synthetischen Mitteln bisher nur begrenzt erfolgreich war, sind halbsynthetische Ansätze, wie sie in dieser Studie verwendet wurden, sehr zu empfehlen. Auf diese Weise ist es möglich, größere chemische Räume um natürliche Molekülgerüste herum zu erforschen und gleichzeitig deren inhärente Einschränkungen wie Löslichkeit, Toxizität und schlechte pharmakokinetische Profile zu überwinden. KW - Enterobacteriaceae KW - Pflanzen KW - Synthese KW - Multidrugresistant KW - Plant extracts KW - Isolation and Characterization KW - Microwave Assisted Extraction KW - Nature-Insipired Synthesis KW - Reproducibility challenges KW - Library of Phytochemicals KW - Library of plant species KW - Plants KW - Characterization KW - Synthesis Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-302632 ER - TY - THES A1 - Reil, Lucy Honor T1 - The role of WASH complex subunit Strumpellin in platelet function T1 - Die Rolle der WASH-Komplexuntereinheit Strumpellin in der Thrombozytenfunktion N2 - Strumpellin is a member of the highly conserved pentameric WASH complex, which stimulates the Arp2/3 complex on endosomes and induces the formation of a branched actin network. The WASH complex is involved in the formation and stabilisation of endosomal retrieval subdomains and transport carriers, into which selected proteins are packaged and subsequently transported to their respective cellular destination, e.g. the plasma membrane. Up until now, the role of Strumpellin in platelet function and endosomal trafficking has not been researched. In order to examine its role, a conditional knockout mouse line was generated, which specifically lacked Strumpellin in megakaryocytes and platelets. Conditional knockout of Strumpellin resulted in only a mild platelet phenotype. Loss of Strumpellin led to a decreased abundance of the αIIbβ3 integrin in platelets, including a reduced αIIbβ3 surface expression by approximately 20% and an impaired αIIbβ3 activation after platelet activation. The reduced surface expression of αIIbβ3 was also detected in megakaryocytes. The expression of other platelet surface glycoproteins was not affected. Platelet count, size and morphology remained unaltered. The reduction of αIIbβ3 expression in platelets resulted in a reduced fibrinogen binding capacity after platelet activation. However, fibrinogen uptake under resting conditions, although slightly delayed, as well as overall fibrinogen content in Strumpellin-deficient platelets were comparable to controls. Most notably, reduced αIIbβ3 expression did not lead to any platelet spreading and aggregation defects in vitro. Furthermore, reduced WASH1 protein levels were detected in the absence of Strumpellin. In conclusion, loss of Strumpellin does not impair platelet function, at least not in vitro. However, the data demonstrates that Strumpellin plays a role in selectively regulating αIIbβ3 surface expression. As a member of the WASH complex, Strumpellin may regulate αIIbβ3 recycling back to the platelet surface. Furthermore, residual WASH complex subunits may still assemble and partially function in the absence of Strumpellin, which could explain the only 20% decrease in αIIbβ3 surface expression. Nonetheless, the exact mechanism still remains unclear. N2 - Strumpellin ist Teil des hoch konservierten, pentameren WASH-Komplexes, der den Arp2/3-Komplex auf Endosomen aktiviert und somit die Bildung eines verzweigten Aktinnetzwerkes ermöglicht. Der WASH-Komplex beteiligt sich an der Bildung und Sta-bilisierung von endosomalen Retrieval-Subdomänen und Transportvesikel. In letztere werden Proteine verpackt und anschließend zu ihrem Bestimmungsort innerhalb der Zelle, z.B. der Zellmembran, transportiert. Die Rolle von Strumpellin in der Thrombozytenfunktion und im endosomalen Transport wurde bislang noch nicht untersucht. Hierfür wurde eine konditionale Knockout-Mauslinie generiert, die weder in Megakaryozyten noch in Thrombozyten Strumpellin aufwies. Der konditionale Knockout von Strumpellin hatte nur einen milden Thrombozytenphänotyp zur Folge. Der Verlust von Strumpellin resultierte in einem verminderten Gesamt-proteingehalt von αIIbβ3-Integrin in Thrombozyten, einschließlich einer ca. 20-prozentigen Reduktion der Oberflächenexpression von αIIbβ3 und einer verringerten αIIbβ3-Aktivierung nach Thrombozytenaktivierung. Die reduzierte Oberflächenexpression von αIIbβ3 konnte auch in Megakaryozyten nachgewiesen werden. Die Expression anderer Oberflächenglykoproteine war nicht betroffen. Thrombozytenzahl, -größe und -morphologie blieben unverändert. Die reduzierte αIIbβ3-Expression in Thrombozyten führte zu einer verminderten Fibrinogenbindungskapazität nach Thrombozytenaktivierung. Die Fibrinogenaufnahme unter ruhenden Bedingungen, trotz initialer Verzögerung, und der Gesamtproteingehalt von Fibrinogen waren hingegen vergleichbar mit Kontrollproben. Interessanterweise verursachte die reduzierte αIIbβ3-Expression keine in vitro Spreading- und Aggregationsdefekte der Thrombozyten. Ein verminderter WASH1-Proteingehalt konnte ebenfalls nachgewiesen werden. Abschließend lässt sich sagen, dass der Verlust von Strumpellin die Thrombozytenfunktion, zumindest in vitro, nicht beeinträchtigt. Die Daten zeigen jedoch, dass Strumpellin eine selektive Rolle in der Regulierung der αIIbβ3-Oberflächenexpression spielt. Als WASH-Komplexuntereinheit könnte Strumpellin möglicherweise das Recycling von αIIbβ3 zurück zur Thrombozytenoberfläche regulieren. Zudem könnten verbleibende WASH-Komplexuntereinheiten trotz fehlendem Strumpellin weiterhin einen funktions- fähigen Komplex bilden. Dies könnte unter anderem die nur 20-prozentige Reduktion der αIIbβ3 Oberflächenexpression erklären. Der genaue Mechanismus ist jedoch noch nicht bekannt. KW - Strumpellin KW - WASH complex KW - endosomal trafficking KW - alpha-IIb beta-3 KW - platelet Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-242077 ER - TY - THES A1 - Spitzel, Marlene T1 - The impact of inflammation, hypoxia, and vasculopathy on pain development in the α-galactosidase A mouse model of Morbus Fabry T1 - Der Einfluss von Inflammation, Hypoxie und Vaskulopathie auf die Schmerzentwicklung des Morbus Fabry-spezifischen α-Galaktosidase A Mausmodells N2 - Fabry disease (FD), an X-linked lysosomal storage disorder, is caused by variants in the gene α-galactosidase A (GLA). As a consequence, the encoded homonymous enzyme GLA is not produced in sufficient amount or does not function properly. Subsequently, globotriaosylceradmide (Gb3), the target substrate of GLA, starts accumulating in several cell types, especially neurons and endothelial cells. FD patients suffer from multiorgan symptoms including cardiomyopathy, nephropathy, stroke, and acral burning pain. It is suggested that the impact of pathological Gb3 accumulation, inflammatory and hypoxic processes, and vasculopathy are contributing to the specific FD pain phenotype. Thus, we investigated the role of inflammation, hypoxia, and vasculopathy on molecular level in dorsal root ganglia (DRG) of the GLA knockout (KO) mouse model. Further, we investigated pain-like characteristics of GLA KO mice at baseline (BS), after capsaicin administration, and after repeated enzyme replacement therapy (ERT) administration for a period of 1.5 years. Acquired data showed disturbances in immune response markers represented by downregulated inflammation-associated genes and lower numbers of CD206+ macrophages in DRG of GLA KO mice. Hypoxic mechanisms were active in DRG of GLA KO mice reflected by increased gene expression of hypoxia- and DNA damage-associated targets, higher numbers of hypoxia-inducible factor 1α-positive (HIF1α+) and carbonic anhydrase 9-positive (CA9+) neurons in DRG of GLA KO mice, and DRG neuronal HIF1α cytosolic-nuclear translocation in GLA KO mice. Vascularization in DRG of GLA KO mice was reduced including lower numbers of blood vessel branches and reduced total blood vessel length. Pain-like behavior of the GLA KO mouse model revealed no mechanical hypersensitivity at BS but age-dependent heat hyposensitivity, which developed also age-matched wild type (WT) mice. Capsaicin administration under isoflurane anesthesia did not elicit the development of nocifensive behavior in GLA KO mice after mechanical or heat stimulation. Repeated ERT administration did not show a clear effect in GLA KO mice in terms of restored heat hyposensitivity to BS paw withdrawal latencies. In summary, we demonstrated the impact of disturbed immune response markers, active hypoxic mechanisms, and reduced vascularization on molecular FD pathophysiology. N2 - Morbus Fabry (M. Fabry oder Fabry disease, FD) ist eine X-chromosomal vererbte, lysosomale Speichererkrankung, die durch Varianten im Gen α-Galaktosidase A (GLA) verursacht wird. Das durch GLA kodierte gleichnamige Enzym GLA kann somit nicht in ausreichender Menge produziert werden oder erhält nicht die volle Funktionalität. Als Folge akkumuliert das Glykosphingolipid Globotriaosylceramid (Gb3), welches das Zielsubstrat von GLA ist und durch dieses Enzym normalerweise abgebaut wird. Gb3 Akkumulationen sind in verschiedenen Zelltypen zu finden, jedoch bevorzugt in Neurone und Endothelzellen. FD-Patienten leiden unter Symptome, die verschiedene Organe betreffen, insbesondere Kardiomyopathien, Nephropathien, Schlaganfälle, und brennende Schmerzen in den Extremitäten. Es wird vermutet, dass neben dem pathologischen Einfluss der Gb3 Ablagerungen auch inflammatorische und hypoxische Prozesse und Vaskulopathien zum spezifischen FD-Schmerzphänotyps beitragen. Daher wurde die Rolle der Inflammation, Hypoxie und Vaskulopathie auf molekularer Ebene in Spinalganglien (dorsal root ganglion, DRG) eines FD-spezifischen GLA knockout (KO) Mausmodells untersucht. Des Weiteren wurde der Schmerz-ähnliche Phänotyp in GLA KO Mäusen unter nativen Bedingungen, nach Capsaicingabe und unter Enzymersatztherapie (enzyme replacement therapy, ERT) während einer Dauer von 1,5 Jahren untersucht. Unsere erhobenen Daten zeigten eine Beeinträchtigung von Faktoren der Immunantwort, die sich durch herunterregulierter Genexpression Inflammations-assoziierter Gene und einer geringeren Anzahl an CD206+ Makrophagen in DRG von GLA KO Mäusen nachweisen ließ. Zu aktiven Hypoxiemechanismen trugen eine hochregulierte Genexpression Hypoxie- und DNA-Schäden-assoziierter Gene, eine höhere Anzahl an hypoxia-inducible factor 1α-positiver (HIF1α+) und carbonic anhydrase 9-positiver (CA9+) Neurone in DRG von GLA KO Mäusen, und die DRG neuronale HIF1α Translokation zwischen Zytosol und Nukleus bei. Die Vaskularisierung der DRG in GLA KO Mäusen war reduziert zusätzlich zu der geringeren Anzahl an Blutgefäßverzweigungen und einer Reduzierung der gesamten Blutgefäßlänge. Die Untersuchungen des nativen Schmerz-ähnlichen Verhaltens der GLA KO Mäuse zeigte keine Entwicklung mechanischer Hypersensitivität, während sich eine Hitzehyposensitivität mit steigendem Alter der Tiere entwickelte, die sich auch in altersangepassten Wildtyp (WT) Mäusen zeigte. Eine Capsaicingabe unter Isoflurannarkose zeigte keine erhöhte Sensitivität der GLA KO Mäuse nach mechanischer oder Hitzestimulation. Wiederholte ERT-Gaben zeigten keine Verbesserung der Hitzehyposensitivität auf ein natives Niveau der Pfotenrückzuglatenz. Wir konnten den Einfluss beeinträchtigter Faktoren der Immunantwort, aktiver Hypoxieprozesse und reduzierter Vaskularisierung in DRG von GLA KO Mäusen auf die molekulare FD-Pathophysiologie zeigen. KW - Fabry disease KW - GLA KO mouse model KW - molecular mechanism KW - Fabry-Krankheit KW - Morbus Fabry Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-345794 ER - TY - THES A1 - Krenz, Bastian T1 - The immune-evasive potential of MYC in pancreatic ductal adenocarcinoma T1 - Das immunevasive Potential von MYC im Pankreaskarzinom N2 - Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is predominantly driven by mutations in KRAS and TP53. However, PDAC tumors display deregulated levels of MYC and are a paradigm example for MYC-driven and -addicted tumors. For many years MYC was described as a transcription factor that regulates a pleiotropic number of genes to drive proliferation. Recent work sheds a different light on MYC biology. First, changes in gene expression that come along with the activation of MYC are mild and MYC seems to act more as a factor that reduces stress and increases resilience towards challenges during transcription. Second, MYC is a strong driver of immune evasion in different entities. In this study we depleted MYC in murine PDAC cells and revealed the immune dependent regression of tumors in an orthotope transplant model, as well as the activation of the innate immune system using global expression analysis, immunoblotting and fCLIP. These experiments revealed that endogenous double-stranded RNA is binding as a viral mimicry to Toll-like receptor 3, causing activation of TBK1 and downstream activation of a proimmunogenic transcription program. The regression of tumors upon depletion of MYC is dependent on this pathway since the knockout of TBK1 prevents regression of tumors after depletion of MYC. We can summarize this study in three main findings: First, the dominant and most important function of MYC in tumors is not to drive proliferation but to promote immune evasion and prevent immune-dependent regression of tumors. Second, cells monitor defects or delay in splicing and RNA processing and activate the immune system to clear cells that face problems with co-transcriptional processing. Third, MYC suppresses the activation of the cell-intrinsic innate immune system and shields highly proliferating cells from the recognition by the immune system. To translate this into a therapeutically approach, we replaced the shRNA mediated depletion of MYC by treatment with cardiac glycosides. Upon treatment with cardiac glycosides tumor cells reduce uptake of nutrients, causing a downregulation of MYC translation, inhibition of proliferation, glycolysis and lactate secretion. Lactate is a major reason for immune evasion in solid tumors since it dampens, amongst others, cytotoxic T cells and promotes regulatory T cells. Treatment of mice with cardiac glycosides causes a complete and immune-dependent remission of PDAC tumors in vivo, pointing out that cardiac glycosides have strong proimmunogenic, anti-cancer effects. More detailed analyses will be needed to dissect the full mechanism how cardiac glycosides act on MYC translation and immune evasion in PDAC tumors. N2 - Pankreaskarzinome entwickeln sich in den meisten Fällen durch die Mutation von KRAS und TP53. Nichtsdestotrotz weisen Pankreaskarzinome sehr hohe, deregulierte Level des MYC Proteins auf und sind exemplarisch für Tumore, deren Wachstum abhängig von MYC ist. Für lange Zeit wurde MYC als Transkriptionsfaktor beschrieben, der vor allem Gene aktiviert, die für die Proliferation von Zellen notwendig sind. Die jüngste Forschung wirft jedoch ein anderes Bild auf die Biologie von MYC. Zum einen sind die transkriptionellen Veränderung nach Aktivierung von MYC mild und vieles deutet darauf hin, dass die Funktion von MYC zum einen in der Reduktion von transkriptionellem Stress liegt. Zum anderen verhindert MYC die Erkennung von Tumorzellen durch das Immunsystem. In dieser Studie wurde MYC in murinen Pankreaskarzinomzellen depletiert und die immunabhängige Regression der Tumore in einem orthotopen Transplantationsmodel untersucht. Die Aktivierung der zell-intrinsischen Immunantwort wurde mittels globaler Expressionsanalyse, Immunoblots und fCLIP Experimenten untersucht. Diese Experimente haben gezeigt, dass endogene doppel-strängige RNAs als virales Mimikry an Toll-like Rezeptor 3 binden, worauf TBK1 phosphoryliert und ein pro-immunogenes Transkriptionsprogram aktiviert wird. Die Deletion von TBK1 konnte beweisen werden, dass die Regression der Tumore von diesem Signalweg abhängig ist. Die Ergebnisse der Studie lassen sich in drei zentrale Erkenntnisse zusammenfassen: Erstens ist die prä-dominante Funktion von MYC in Tumoren in vivo nicht die Proliferation der Zellen zu fördern, sondern zu verhindern, dass der Tumor vom Immunsystem erkannt und bekämpft wird. Zweitens überwachen Zellen das richtige Prozessieren von RNA und aktivieren bei Bedarf das Immunsystem um defekte Zellen zu entfernen. Drittens unterdrückt MYC die Aktivierung dieses zell-intrinsischen Signalweges und schirmt den Tumor dadurch vom Immunsystem ab. Um diese Ergebnisse in einen translationalen Ansatz zu überführen, haben wir die shRNA vermittelte Depletion von MYC durch die Behandlung mit Herzglykosiden ersetzt, die die Aufnahme von Nährstoffen reduzieren, Proliferation einschränken, die Translation des MYC Proteins stoppen und Glykolyse und Laktatsekretion herunterfahren. Laktat hat starke immunsuppressive Eigenschaften in soliden Tumoren, da es zytotoxische T Zellen erschöpft und regulatorische T Zellen aktiviert. Die Behandlung von Mäusen mit Herzglykosiden führte in Abhängigkeit vom Immunsystem zur kompletten Remission der Tumore, auch wenn noch weitere Forschung notwendig ist, um die exakten Zusammenhänge besser zu verstehen. KW - immune evasion KW - pancreatic cancer KW - innate immunity KW - TLR3 KW - Bauchspeicheldrüsenkrebs KW - Myc Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-325903 ER - TY - THES A1 - Bergmann Borges, Alyssa T1 - The endo-lysosomal system of \(Trypanosoma\) \(brucei\): insights from a protist cell model T1 - Das Endo-lysosomale System von \(Trypanosoma\) \(brucei\): Erkenntnisse aus einem Protisten-Zellmodell N2 - Most of the studies in cell biology primarily focus on models from the opisthokont group of eukaryotes. However, opisthokonts do not encompass the full diversity of eukaryotes. Thus, it is necessary to broaden the research focus to other organisms to gain a comprehensive understanding of basic cellular processes shared across the tree of life. In this sense, Trypanosoma brucei, a unicellular eukaryote, emerges as a viable alternative. The collaborative efforts in genome sequencing and protein tagging over the past two decades have significantly expanded our knowledge on this organism and have provided valuable tools to facilitate a more detailed analysis of this parasite. Nevertheless, numerous questions still remain. The survival of T. brucei within the mammalian host is intricately linked to the endo-lysosomal system, which plays a critical role in surface glycoprotein recycling, antibody clearance, and plasma membrane homeostasis. However, the dynamics of the duplication of the endo-lysosomal system during T. brucei proliferation and its potential relationship with plasma membrane growth remain poorly understood. Thus, as the primary objective, this thesis explores the endo-lysosomal system of T. brucei in the context of the cell cycle, providing insights on cell surface growth, endosome duplication, and clathrin recruitment. In addition, the study revisits ferritin endocytosis to provide quantitative data on the involvement of TbRab proteins (TbRab5A, TbRab7, and TbRab11) and the different endosomal subpopulations (early, late, and recycling endosomes, respectively) in the transport of this fluid-phase marker. Notably, while these subpopulations function as distinct compartments, different TbRabs can be found within the same region or structure, suggesting a potential physical connection between the endosomal subpopulations. The potential physical connection of endosomes is further explored within the context of the cell cycle and, finally, the duplication and morphological plasticity of the lysosome are also investigated. Overall, these findings provide insights into the dynamics of plasma membrane growth and the coordinated duplication of the endo-lysosomal system during T. brucei proliferation. The early duplication of endosomes suggests their potential involvement in plasma membrane growth, while the late duplication of the lysosome indicates a reduced role in this process. The recruitment of clathrin and TbRab GTPases to the site of endosome formation supports the assumption that the newly formed endosomal system is active during cell division and, consequently, indicates its potential role in plasma membrane homeostasis. Furthermore, considering the vast diversity within the Trypanosoma genus, which includes ~500 described species, the macroevolution of the group was investigated using the combined information of the 18S rRNA gene sequence and structure. The sequence-structure analysis of T. brucei and other 42 trypanosome species was conducted in the context of the diversity of Trypanosomatida, the order in which trypanosomes are placed. An additional analysis focused on Trypanosoma highlighted key aspects of the group’s macroevolution. To explore these aspects further, additional trypanosome species were included, and the changes in the Trypanosoma tree topology were analyzed. The sequence-structure phylogeny confirmed the independent evolutionary history of the human pathogens T. brucei and Trypanosoma cruzi, while also providing insights into the evolution of the Aquatic clade, paraphyly of groups, and species classification into subgenera. N2 - Die meisten Studien in der Zellbiologie konzentrieren sich in erster Linie auf Modelle aus der Opisthokont-Gruppe der Eukaryonten. Die Opisthokonten umfassen jedoch nicht die gesamte Vielfalt der Eukaryonten. Daher ist es notwendig, den Forschungsschwerpunkt auf andere Organismen auszuweiten, um ein umfassendes Verständnis grundlegender zellulärer Prozesse zu erlangen, die im gesamten Lebensbaum vorkommen. In diesem Sinne stellt Trypanosoma brucei, ein einzelliger Eukaryote, eine brauchbare Alternative dar. Die gemeinsamen Anstrengungen bei der Genomsequenzierung und der Markierung von Proteinen in den letzten zwei Jahrzehnten haben unser Wissen über diesen Organismus erheblich erweitert und wertvolle Instrumente für eine detailliertere Analyse dieses Parasiten bereitgestellt. Dennoch bleiben noch zahlreiche Fragen offen. Das Überleben von T. brucei im Säugetierwirt ist eng mit dem endo-lysosomalen System verknüpft, das eine entscheidende Rolle beim Recycling von Oberflächenglykoproteinen, der Antikörper-Clearance und der Homöostase der Plasmamembran spielt. Die Dynamik der Verdoppelung des endo-lysosomalen Systems während der Vermehrung von T. brucei und seine mögliche Beziehung zum Wachstum der Plasmamembran sind jedoch noch wenig bekannt. In dieser Arbeit wird daher das endo-lysosomale System von T. brucei im Kontext des Zellzyklus untersucht, um Erkenntnisse über das Wachstum der Zelloberfläche, die Verdopplung der Endosomen und die Clathrin-Rekrutierung zu gewinnen. Darüber hinaus wird in der Studie die Ferritin-Endozytose erneut untersucht, um quantitative Daten über die Beteiligung der TbRab-Proteine (TbRab5A, TbRab7 und TbRab11) und der verschiedenen endosomalen Subpopulationen (frühe, späte bzw. Recycling-Endosomen) am Transport dieses Flüssigphasenmarkers zu erhalten. Bemerkenswert ist, dass diese Subpopulationen zwar als unterschiedliche Kompartimente fungieren, aber verschiedene TbRabs in derselben Region oder Struktur gefunden werden können, was auf eine mögliche physische Verbindung zwischen den endosomalen Subpopulationen hindeutet. Die potenzielle physikalische Verbindung von Endosomen wird im Zusammenhang mit dem Zellzyklus weiter erforscht, und schließlich werden auch die Verdopplung und die morphologische Plastizität des Lysosoms untersucht. Insgesamt bieten diese Ergebnisse Einblicke in die Dynamik des Plasmamembranwachstums und die koordinierte Verdopplung des endo-lysosomalen Systems während der Proliferation von T. brucei. Die frühe Verdoppelung der Endosomen deutet auf ihre mögliche Beteiligung am Plasmamembranwachstum hin, während die späte Verdoppelung der Lysosomen auf eine geringere Rolle in diesem Prozess hindeutet. Die Rekrutierung von Clathrin- und TbRab-GTPasen an der Stelle der Endosomenbildung unterstützt die Annahme, dass das neu gebildete endosomale System während der Zellteilung aktiv ist, und deutet folglich auf seine potenzielle Rolle bei der Homöostase der Plasmamembran hin. In Anbetracht der enormen Vielfalt innerhalb der Gattung Trypanosoma, die etwa 500 beschriebene Arten umfasst, wurde die Makroevolution der Gruppe anhand der kombinierten Informationen der 18S rRNA-Gensequenz und Struktur untersucht. Die Sequenz-Struktur-Analyse von T. brucei und anderen 42 Trypanosomen-Arten wurde im Zusammenhang mit der Vielfalt der Trypanosomatida, der Ordnung, in die Trypanosomen eingeordnet werden, durchgeführt. Eine zusätzliche Analyse, die sich auf Trypanosoma konzentrierte, hob Schlüsselaspekte der Makroevolution dieser Gruppe hervor. Um diese Aspekte weiter zu erforschen, wurden zusätzliche Trypanosomenarten einbezogen und die Veränderungen in der Topologie des Trypanosoma-Baums analysiert. Die Sequenz-Struktur-Phylogenie bestätigte die unabhängige Evolutionsgeschichte der humanen Krankheitserreger T. brucei und Trypanosoma cruzi, während sie gleichzeitig Einblicke in die Evolution der aquatischen Klade, die Paraphylie von Gruppen und die Klassifizierung der Arten in Untergattungen lieferte. KW - 18S rRNA KW - Endocytose KW - Zellzyklus KW - Phylogenie KW - Endocytosis KW - Cell cycle KW - Trypanosoma KW - Phylogeny KW - Sequence-Structure KW - Endosomes KW - Lysosome Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-329248 ER - TY - THES A1 - Akhrif, Atae T1 - The BOLD Signal is more than a Brain Activation Index T1 - Das BOLD Signal ist mehr als ein Maß für Hirnaktivierung N2 - In the recent years, translational studies comparing imaging data of animals and humans have gained increasing scientific interests with crucial findings stemming from both, human and animal work. In order to harmonize statistical analyses of data from different species and to optimize the transfer of knowledge between them, shared data acquisition protocols and combined statistical approaches have to be identified. Following this idea, methods of data analysis, which have until now mainly been used to model neural responses of electrophysiological recordings from rodent data, were applied on human hemodynamic responses (i.e. Blood-Oxygen-Level- Dependent BOLD signal) as measured via functional magnetic resonance imaging (fMRI). At the example of two attention and impulsivity networks, timing dynamics and amplitude of the fMRI signal were determined (study 1). Study 2 described the same parameters frequency-specifically, and in study 3, the complexity of neural processing was quantified in terms of fractality. Determined parameters were compared with regard to the subjects’ task performance / impulsivity to validate findings with regard to reports of the current scientific debate. In a general discussion, overlapping as well as additional information of methodological approaches were discussed with regard to its potential for biomarkers in the context of neuropsychiatric disorders. N2 - In den letzten Jahren haben translationale Studien, in denen Befunde von Tieren und Menschen direkt verglichen werden, zunehmend an wissenschaftlichem Interesse gewonnen. Um statistische Analysen von Daten verschiedener Spezies zu harmonisieren und somit den Wissenstransfer zu optimieren, müssen gemeinsame Datenerfassungsprotokolle sowie kombinierte statistische Ansätze identifiziert werden. Diesem Gedanken folgend werden in dieser Arbeit Methoden der Datenanalyse, die bisher hauptsächlich zur Modellierung neuronaler Antworten aus elektrophysiologischer Aufzeichnungen bei Nagetierdaten verwendet wurden, auf hämodynamische Antworten (d.h. Blood-Oxygen-Level-Dependent BOLD-Signal), welche mittels funktionaler Magnetresonanztomo-graphie (fMRT) gemessen werden, im Menschen angewendet. Am Beispiel zweier Aufmerksamkeits- und Impulsivitätsnetzwerke wurden der zeitliche Verlauf und Amplitude des fMRI-Signals bestimmt (Studie 1). In Studie 2 wurden die gleichen Parameter frequenzspezifisch ausgewertet, und in Studie 3 wurde die Komplexität neuronaler Verarbeitung anhand von Fraktalität quantifiziert. Die ermittelten Parameter wurden hinsichtlich der Task Performance / Impulsivität der Probanden verglichen, um die Ergebnisse im Kontext von Befunden aus der aktuellen wissenschaftlichen Debatte zu validieren. In einer allgemeinen Diskussion wurden sowohl überlappende als auch zusätzliche Informationen zu methodischen Ansätzen hinsichtlich ihres Potenzials für Biomarker im Zusammenhang mit neuropsychiatrischen Erkrankungen diskutiert. KW - BOLD signal KW - functional neuroimaging KW - fMRI time series KW - funktionelle Kernspintomographie Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-322879 N1 - Dieses Dokument wurde aus Datenschutzgründen - ohne inhaltliche Änderungen - erneut veröffentlicht. Die ursprüngliche Veröffentlichung war am 08.07.2020 ER - TY - THES A1 - Siminski, Niklas T1 - Temporal predictability of threat: Evaluation of differential involvement of amygdala and BNST, and relevance for therapy response prediction in spider phobia T1 - Zeitliche Vorhersagbarkeit von Bedrohung: Evaluation der unterschiedlichen Aktivierung von Amygdala und BNST sowie die Relevanz für die Vorhersagbarkeit von Therapieerfolg bei der Spinnenphobie N2 - Predictability of threat is one of the key modulators of neural activity in fear and anxiety-related threat processes and there is a considerable number of studies focusing on the exact contribution of centromedial amygdala and Bed nucleus of stria terminalis (BNST) in animals as well as in humans. In this research field, some studies already investigated the differential involvement of both areas during temporally predictable and unpredictable threat processes in humans. However, these studies showed several limitations e.g. small sample size, no predictable threat conditions, no separation of anticipation and confrontation processes, which should be addressed in future studies. Furthermore, evidence for group-based inter-individual differences of amygdala and BNST activity during predictable and unpredictable threat processes have not been studied extensively. Several studies suggest a relevant role of the amygdala and BNST activity in phobic processes in patients with specific phobia, but no study so far has investigated the exact contribution of centromedial amygdala (CM) and BNST during temporally predictable and unpredictable threat processes in specific phobia. This thesis consisted of three studies and aimed to evaluate the exact contribution of CM and BNST during temporally predictable and unpredictable threat anticipation and confrontation with the use of an optimized functional magnetic resonance imaging (fMRI) paradigm, which aimed to solve methodological limitations of recent studies. Study 1 used a large sample of healthy participants who were grouped based on NPSR1 genotype, and study 2 and study 3 used a sample of patients with spider phobia. In sum, the results of all three studies indicated, that BNST is more relevant for anticipation processes as compared to the CM. Contrary, during the confrontation phase the CM displays a greater relevance for threat confrontation processes. In recent years, various studies have investigated the extent to which treatment success can be predicted in patients with anxiety disorders based on pre-treatment fMRI activity. Therefore, this was investigated for the first time in study 3 in patients with spider phobia during temporally predictable and unpredictable threat processes. Results indicated that independent of temporal predictability lower anterior cingulate cortex (ACC) activity during threat anticipation and engaged BNST during threat confrontation might be benefitting factors for successful therapy response in spider phobia. N2 - Die Vorhersagbarkeit der Bedrohung ist einer der wichtigsten Modulatoren der neuronalen Aktivität bei angst- und furchtbezogenen Bedrohungsprozessen, und es gibt eine beträchtliche Anzahl von Studien, die sich mit der unterschiedlichen Beteiligung der zentromedialen Amygdala (CM) und des Bed nucleus of stria terminalis (BNST) während dieser Prozesse sowohl bei Tieren als auch beim Menschen beschäftigen. In diesem Forschungsfeld untersuchten bereits einige Studien die exakte Beteiligung beider Areale während zeitlich vorhersehbarer und unvorhersehbarer Bedrohungsprozesse beim Menschen. Diese Studien wiesen jedoch einige Limitationen auf (z.B. geringe Stichprobengröße, keine vorhersagbaren Bedrohungsbedingungen, gemeinsame Analyse der Aktivierung über Antizipations- und Konfrontationsphasen hinweg), die in zukünftigen Studien verbessert werden sollten. Zudem gibt es bisher wenige Studien, welche die unterschiedliche Beteiligung der Amygdala und des BNST während Bedrohungsprozessen auf Grundlage gruppenbasierter inter-individueller Unterschiede untersucht haben. Mehrere Studien deuten auf eine erhöhte Aktivierung sowohl der Amygdala als auch des BNST während phobischer Angstprozesse bei Patient*Innen mit einer spezifischen Phobie hin. Allerdings hat bisher jedoch noch keine Studie die Aktivierung der CM und des BNST während zeitlich vorhersagbarer und unvorhersagbarer phobischer Bedrohungsprozesse bei Patient*Innen direkt verglichen. Unter Verwendung eines optimierten funktionelle Magnetresonanztomographie (fMRT)-Paradigmas, das darauf abzielte, methodische Probleme der bisherigen Studien zu lösen, wurde in dieser Arbeit die unterschiedliche Aktivierung von CM und BNST während zeitlich vorhersehbarer und unvorhersehbarer Bedrohungsantizipation und -konfrontation in einer großen Stichprobe gesunder Teilnehmer, die anhand des NPSR1-Genotyps gruppiert wurden (Studie 1), und Patient*Innen mit einer Spinnenphobie untersucht (Studie 2 und Studie 3). In Summe zeigten die Ergebnisse aller drei Studien, dass im Vergleich zur CM der BNST für Antizipationsprozesse relevanter ist. Hingegen zeigte die CM in der Konfrontationsphase mit einer Bedrohung eine größere Aktivierung als der BNST. In den letzten Jahren haben verschiedene Studien untersucht, inwieweit der Behandlungserfolg bei Patient*Innen mit einer Angststörung anhand der fMRT-Aktivität vor der Behandlung vorhergesagt werden kann. Daher wurde in Studie 3 dies erstmals bei Patient*Innen mit einer Spinnenphobie während zeitlich vorhersehbarer und unvorhersehbarer Bedrohungsprozesse untersucht. Die Ergebnisse deuteten darauf hin, dass eine geringere Aktivität im anterioren cingulären Cortex (ACC) während phobischen Antizipationsprozessen und eine höhere Aktivierung im BNST während der Konfrontation mit phobischen Stimuli günstige Faktoren für den Therapieerfolg bei Spinnenphobie sein könnten. KW - Amygdala KW - fMRI KW - Angststörung KW - Temporal predictability KW - fmri activity KW - amygdala KW - Bed nucleus of stria terminalis KW - spider phobia KW - Corpus amygdaloideum KW - Funktionelle Kernspintomografie Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-246643 ER - TY - THES A1 - Ben-Kraiem, Adel T1 - Temporal characterization of the blood nerve barrier and specialized pro resolving mediators as therapeutic targets in neuropathy T1 - Zeitliche Charakterisierung der Funktion der Blut-Nerven-Schranke und der entzündungsauflösenden Lipide als Targets bei Neuropathie N2 - Abstract Neuropathic pain affects 6.9 to 10% of the general population, arises from lesion or disease of the somatosensory nervous system and is still challenging to treat. Indeed, current treatments efficacy are relatively low and present strong side effects. To that extent, identifying new targets and developing new treatment strategies constitute a priority. The blood nerve barrier consists of the endoneurial micro-blood vessels and the perineurium sealed by tight junctions constituted of tight junction proteins such claudin-5 and claudin-1. As the functional blood nerve barrier allows nerve tissue protection from external elements and maintains homeostasis, a destabilization or a disruption leads to infiltration of immunocytes promoting neuroinflammation and increased inflammatory mediators that can sensitize nociceptors and enhance pain. Thus resealing the blood nerve barrier in case of neuropathic pain could be a possible treatment strategy. Specialised proresolving mediators such lipoxin A4 and resolvin D1 are small lipids that bind to receptors such the formylpeptide recptor 2 (FPR2) and resolve inflammation. Specially resolvin D1 as anti-inflammatory and analgesic properties. Thus using resolvin D1 or eventually other specialized proresolving mediators in neuropathic pain could reseal the blood nerve barrier and resolve neuropathic pain. The present work aimed to characterize the blood nerve barrier in a preclinical model of diabetic polyneuropathy and nerve injury (chronic constriction injury) and to identify specialized proresolving mediators that seal the blood nerve barrier and thereby alleviate neuropathic pain. In diabetic polyneuropathy, the blood nerve barrier is permeable only to small molecules, which is due to the loss of claudin-1 in the perineurium and a reduced number of blood vessel- associated macrophages. Interestingly, blood nerve barrier permeability did not occur until four to eight weeks after diabetes induction, whereas mechanical hyperalgesia was measurable as early as two weeks. This suggests a pain-maintaining rather than a pain-triggering role of the blood nerve barrier. In case of chronic constriction injury, a resolution process of both mechanical and thermal hyperalgesia occurs between three to six weeks after injury. Here, the blood nerve barrier is permeable to both small and large molecules from the beginning. The pain recovery process occurs primarily in parallel with the sealing of the endoneurial barrier to large molecules such as fibrinogen from the plasma and its degradation. Perineurium is still permeable nine weeks after injury. Metabolomic analyses show that especially precursors of Resolvin D1 as well as its receptor FPR2, are upregulated at the beginning of pain resolution. Application of resolvin D1 loaded nanoparticles or agonists of FPR2 at the injury site before the onset of pain resolution accelerates the process and fibrinogen is no longer detectable in the endoneurium. Depending on the nerve damage, the blood nerve barrier is affected to varying degrees. Direct mechanical trauma and the accompanying inflammation lead to a more pronounced and long-lasting permeability - independent hyperalgesia. Possibly permeability, at least for small molecules, is important for prolonged reparative processes. In the nerve, permeability of capillaries in particular depends not only on tight junctions but also on other cells: in addition to macrophages, pericytes could also have a sealing effect. Endoneurial fibrinogen triggers pain; the exact mechanism remains to be investigated. Resolvin-containing nanoparticles were particularly effective and could be used locally as they contain endogenous substances in non- toxic particles. N2 - Neuropathische Schmerzen betreffen 6,9 bis 10 % der Allgemeinbevölkerung. Sie entstehen durch eine Verletzung oder Erkrankung des somatosensorischen Nervensystems und deren Behandlung ist eine Herausforderung. Die derzeitigen Behandlungen sind relativ unwirksam und haben starke Nebenwirkungen. Insofern sind die Identifizierung neuer Angriffspunkte und die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien besonders wichtig. Die Blut-Nerven-Schranke besteht aus den endoneuralen Kapillaren und dem Perineurium, die beide durch Tight Junctions versiegelt werden. Letztere werden aus Tight Junction-Proteinen wie Claudin-5 und -1 gebildet. Da die Blut-Nerven-Schranke das Nervengewebe vor äußeren Einflüssen schützt und die Homöostase aufrechterhält, führt eine Öffnung zur Diffusion von potential algetischen Mediatoren und Infiltration von Immunzellen. Dieser Prozess fördert Neuroinflammation und sensibilisiert Nozizeptoren und verstärkt letztendlich die Schmerzen. Daher könnte die Abdichtung der Blut-Nerven-Schranke bei neuropathischen Schmerzen eine mögliche Behandlung darstellen. „Specialised proresolving mediators“, wie Lipoxin A4 und Resolvin D1, sind kleine Lipide, die an Rezeptoren wie der Formlypeptid 2 Rezeptor (FPR2) binden und Entzündungsprozesse auflösen. Insbesondere Resolvin D1 hat nicht nur entzündungshemmende und schmerzlindernde Eigenschaften, sondern wirkt auch barriereabdichtend in Lungenepithelzellen. Der Einsatz von Resolvin D1 oder möglicherweise anderer „specialised proresolving mediators“ bei neuropathischen Schmerzen könnte also die Blut-Nerven-Schranke wieder abdichten und neuropathische Schmerzen lindern. In der vorliegenden Arbeit sollte die Blut-Nerven-Schranke in einem präklinischen Modell der diabetischen Polyneuropathie und einer Nervenverletzung („chronic constriction injury“) charakterisiert und „specialised proresolving mediators“ identifiziert werden, die die Blut-Nerven-Schranke abdichten und damit neuropathische Schmerzen lindern. Bei der diabetischen Polyneuropathie ist die Blut-Nerven-Schranke nur für kleine Moleküle durchlässig, was auf den Verlust von Claudin-1 im Perineurium und eine geringere Anzahl von gefäßassoziierten Makrophagen zurückzuführen ist. Interessanterweise tritt die Durchlässigkeit der Blut-Nerven-Schranke erst vier bis acht Wochen nach der Diabetesinduktion auf, während die mechanische Hyperalgesie bereits nach zwei Wochen messbar ist. Dies spricht eher für eine schmerzunterhaltende als für eine schmerzauslösende Rolle der Blut-Nerven-Schranke. Bei chronic constriction injury bilden sich die mechanische und thermische Hyperalgesie im Zeitraum von drei bis sechs Wochen nach der Verletzung zurück. Hier ist der Blut-Nerven-Schranke von Anfang an sowohl für kleine als auch für große Moleküle durchlässig. Der Schmerzrückbildungsprozess findet vor allem parallel zur Abdichtung der endoneurialen Barriere für große Moleküle wie Fibrinogen aus dem Plasma und dessen Abbau statt. Das Perineurium ist neun Wochen nach der Verletzung noch durchlässig. Metabolomanalysen zeigen, dass insbesondere Vorläufer von Resolvin D1 sowie die entsprechenden Rezeptoren wie FPR2, zu Beginn der Schmerzrückbildung hochreguliert sind. Applikation von Resolvin D1 Nanopartikeln bzw. Agonisten des FPR2 an der Verletzungsstelle vor dem Beginn der Schmerzauflösung beschleunigt sich den Prozess und Fibrinogen ist nicht mehr endoneurial nachweisbar. Zusammenfassend ist je nach Art der Nervenschädigung die Blut-Nervenschranke unterschiedlich stark betroffen. Ein direktes mechanisches Trauma und die begleitende Inflammation führen im Gegensatz zur metabolisch-toxischen Schädigung zu einer ausgeprägteren und langanhaltenden Durchlässigkeit. Gerade bei einer Nervenläsion sind verschiedene Bereiche (Ort der Nervendurchtrennung und distale Regenerationsbereiche) unterschiedlich betroffen von der Schädigung und der Reparatur. Insofern ist Hyperalgesie nur teilweise davon beeinflusst. Möglicherweise ist die Durchlässigkeit zumindest für kleine Moleküle für längerdauernde Reparaturvorgänge wichtig. Die Permeabilität der Kapillaren ist im Nerven nicht nur von den Tight Junctions sondern auch von anderen Zellen abhängig: neben gefäßassoziierten Makrophagen könnten auch Perizyten abdichtend wirken. Endoneuriales Fibrinogen löst Schmerzen aus, der genaue Mechanismus muss noch untersucht werden. Resolvinhaltige Nanopartikeln waren besonders effektiv und könnten lokal gut eingesetzt werden, da sie körpereigene Substanzen in nichttoxischen Partikeln enthalten. KW - Neuropathic pain KW - neuropaticher Schmerz KW - Specialized pro resolving mediators KW - Diabetic painful neuropathy KW - Traumatic neuropathy KW - Blood nerve barrier Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-320797 ER - TY - THES A1 - Forster, André T1 - Targeting Temporally Stable Vulnerability Factors in the Prediction of Long-Term Courses of Depression: Diagnostic Considerations and Therapeutic Protocols Based on Transcranial Ultrasonic Neuromodulation of Endophenotypes T1 - Untersuchung Zeitlich Stabiler Vulnerabilitätsfaktoren für die Vorhersage Langfristiger Depressionsverläufe: Diagnostische Erwägungen und Therapeutische Protokolle auf der Grundlage Transkranieller Ultraschall-Neuromodulation von Endophänotypen N2 - Depressive disorders represent one of the main sources for the loss of healthy years of life. One of the reasons for this circumstance is the recurrent course of these disorders, which can be interrupted by current therapeutic approaches, especially in the shortterm, but seem to be maintained at least in part in the long-term. Subsequently, on one hand, this thesis deals with methodological measurement issues in the longitudinal prediction of depressive courses. On the other hand, it addresses two currently discussed neuroscience-based treatment approaches, which are investigated experimentally in a basic-psychological manner and reviewed in the light of their potential to translate results to the application in patient care. These two approaches each address potential mechanisms that may negatively impact long-term disease trajectories: First, stable endophenotypes for vulnerability factors that could regain control over the organism and reactivate maladaptive experiences, or behaviors with increasing temporal distance from therapeutic methods are focused on. In the studies presented, these were influenced by a recently rediscovered method of neuromodulation (transcranial low-intensity focused ultrasound) which is discussed in light of its unique capability to address even deepest, subcortical regions at a high spatial resolution. Lastly, as a second approach, an experimental design for the use of reconsolidation interference is presented, which could provide a first insight into the applicability of corresponding protocols in the field of depressive disorders and thus contribute to the modification, instead of inhibition, of already mentioned endophenotypes. In sum, methodological considerations for monitoring and predicting long-term courses of depression are deducted before two approaches are discussed that could potentially exert positive influences on the recurrent nature of depressive symptoms on their own, in combination with each other, or as augmentation for existing therapeutic procedures. N2 - Depressive Erkrankungen stellen eine der Hauptquellen für das Einbußen gesunder Lebensjahre dar. Einer der Gründe für diesen Umstand liegt im rezidivierenden Verlauf dieser Erkrankungen, der auch durch bisherige Therapieansätze vor allem kurzfristig unterbrochen werden kann, jedoch langfristig zumindest in Teilen erhalten zu bleiben scheint. Daran anschließend befasst sich die hier vorgelegte Thesis zum einen mit der Messproblematik longitudinaler Vorhersagen depressiver Verläufe und zum anderen mit zwei aktuell diskutierten neurowissenschaftlich begründeten Behandlungsansätzen, die experimentellgrundlagenpsychologisch aufgearbeitet und im Lichte eines translationalen Ansatz hin zur Anwendung in realen Patientensituationen erörtert werden. Die beiden genannten Ansätze adressieren dabei jeweils Mechanismen, die sich negativ auf langfristige Krankheitsverläufe auswirken können: Zunächst werden hier stabile Endophänotypen für Vulnerabilitätsfaktoren, die mit zunehmendem zeitlichem Abstand zu Therapiemethoden erneut Kontrolle über den Organismus gewinnen und maladaptives Erleben und Verhalten reaktivieren könnten, in den Fokus gestellt. Diese wurden in den hier vorgestellten Studien mit einer vor wenigen Jahren wiederentdeckten Methode der Neuromodulation (transkranieller, niedrigintensiver, fokussierter Ultraschall) beeinflusst und vor dem Hintergrund der einzigartigen Möglichkeit dieser Technik, auch tiefste, subkortikale Regionen bei hoher räumlicher Auflösungsfähigkeit adressieren zu können, diskutiert. Zuletzt wird ergänzend, als zweiter Ansatz, ein experimentelles Design zur Nutzung der Rekonsolidierungsbeeinflussung vorgestellt, das erste Informationen über die Anwendbarkeit entsprechender Protokolle im Bereich der depressiven Erkrankungen liefern und somit zur Veränderung, Anstelle von Inhibition bereits genannter Endophänotypen beitragen könnte. Zusammengenommen ergeben sich hieraus zunächst allgemeine methodische Überlegungen für das Überwachen und Vorhersagen langfristiger Verläufe der Depressionen, aber auch zwei Ansätze, die für sich genommen, in Kombination miteinander oder auch als Augmentation für bestehende Therapieverfahren, potentiell positive Einflüsse auf die rezidivierende Natur dieser Diagnosegruppe haben könnten. KW - Depression KW - Diagnostik KW - Nervenstimulation KW - Verwundbarkeit KW - Ultraschall KW - Neuromodulation KW - Endophänotypen KW - Rekonsolidierung Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-279065 ER - TY - THES A1 - Badr, Mohammad Mamdouh Abdelwareth Mohammad T1 - Targeting Regulatory T Cells by CD28 Superagonistic Antibodies Mitigates Neurodegeneration in the A53T-alpha-Synuclein Parkinson’s Disease Mouse Model T1 - Aktivierung Regulatorischer T-Zellen durch die Superagonistische CD28 Antikörper mindert die Neurodegeneration im A53T-alpha-Synuclein Parkinsonkrankheitsmausmodell N2 - Parkinson’s disease (PD) is the second most common neurodegenerative disease with still no cure available. The prominent feature of PD is the loss of dopaminergic neurons at the Substantia nigra (SN). Genetic and environmental insults affecting the SNCA gene encoding the alpha-Synuclein (alpha-Syn) protein result into an aberrant form of the protein with higher propensity towards oligomerization becoming part of insoluble inclusions called Lewy Bodies (LB). LB impart cytotoxicity leading to neurodegeneration, activate resident microglia and escape to the periphery where they get captured by dendritic cells and presented to naïve T cells. Proliferating effector T lymphocytes invade the brain releasing proinflammatory cytokines and performing a cytotoxic effect on neurons. In this study, we examine the hypothesis that the expansion of regulatory T cells (Treg) could exert an anti-inflammatory effect that averts neurodegeneration in the AAV1/2-A53T-alpha-Syn mouse model for PD. Mice brains were transfected by a unilateral stereotaxic injection at the SN region with a chimeric Adeno-Associated Viral vector of serotypes 1 and 2 (AAV1/2) carrying the A53T-mutated human SNCA gene encoding the readily aggregating aberrant alpha-Syn (AAV1/2-A53T-alpha-Syn). One week after injection, mice were treated with the CD28 superagonistic antibody (CD28SA), known to significantly expand the Treg population. Mice were then analyzed by behavioral analysis using the Rotarod performance test and the Cylinder test. The impact of CD28SA on the immune system was examined by flow cytometry. The integrity of the nigrostriatal system was assessed by stereological quantification of Tyrosine hydroxylase (TH)-stained dopaminergic neurons in SN and optical density measurements of TH-stained striatum. The mechanism of action of CD28SA was analyzed by treating PD mice alternatively with a Treg adoptive transfer, while CD28SA effect on levels of neurotrophic factors was quantified by ELISA. We observed an expansion of Treg by FACS analyses three days after CD28SA treatment, demonstrating target engagement. CD28SA treatment of AAV1/2-A53T-alpha-Syn mice provided neuroprotection evident through elevated numbers of dopaminergic neurons in the SN and higher optical density of TH-staining in the striatum, in CD28SA-treated mice compared to PBS-treated control mice, and that was reflected in an enhanced performance in behavioral studies. Additionally, brain infiltration of proinflammatory activated T lymphocytes (CD4+CD69+ and CD8+CD69+ cells), that were obvious in PBS-treated AAV1/2-A53T-alpha-Syn control mice, was augmented in PD mice receiving CD28SA. The alternative treatment with Treg adoptive transfer did replicate the beneficial effects of CD28SA indicating that Treg expansion is the main effector mechanism by which it exerts its neuroprotective effect. CD28SA treatment of PD mice led to an increase of GDNF and BDNF in some brain structures that was not observed in untreated mice. We conclude that in the AAV1/2-A53T-alpha-Syn PD mouse model, CD28SA suppresses proinflammation, reverses behavioral deficits and is neuroprotective on SN dopaminergic cells. N2 - Die Parkinson-Krankheit (PD) ist die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung, für die es noch keine Heilung gibt. Das herausragende Merkmal von PD ist der Verlust von dopaminergen Neuronen an der Substantia nigra (SN). Genetische und umweltbedingte Schäden, die das SNCA-Gen betreffen, das für das alpha-Synuclein (alpha-Syn)-Protein kodiert, führen zu einer abweichenden Form des Proteins mit einer höheren Neigung zur Oligomerisierung, die Teil von unlöslichen Einschlüssen wird, die Lewy Bodies (LB) genannt werden. LB verleihen Zytotoxizität, die zu Neurodegeneration führt, aktivieren residente Mikroglia und entweichen in die Peripherie, wo sie von dendritischen Zellen eingefangen und naiven T-Zellen präsentiert werden. Proliferierende Effektor-T-Lymphozyten dringen in das Gehirn ein, setzen proinflammatorische Zytokine frei und üben eine zytotoxische Wirkung auf Neuronen aus. In dieser Studie untersuchen wir die Hypothese, dass die Expansion regulatorischer T-Zellen (Treg) einen entzündungshemmenden Effekt ausüben könnte, der die Neurodegeneration im AAV1/2-A53T-alpha-Syn-Mausmodell für PD verhindert. Mäusegehirne wurden durch eine unilaterale stereotaktische Injektion in die SN-Region mit einem chimären Adeno-Assoziierten viralen Vektor der Serotypen 1 und 2 (AAV1/2) transfiziert, der das A53T-mutierte humane SNCA-Gen trägt, das für das leicht aggregierende aberrante alpha-Syn (AAV1/ 2-A53T-alpha-Syn). Eine Woche nach der Injektion wurden die Mäuse mit dem superagonistischen CD28-Antikörper (CD28SA) behandelt, von dem bekannt ist, dass er die Treg-Population signifikant vergrößert. Mäuse wurden dann durch Verhaltensanalyse unter Verwendung des Rotarod-Leistungstests und des Zylindertests analysiert. Der Einfluss von CD28SA auf das Immunsystem wurde mittels Durchflusszytometrie untersucht. Die Integrität des nigrostriatalen Systems wurde durch stereologische Quantifizierung von Tyrosinhydroxylase (TH)-gefärbten dopaminergen Neuronen in SN und Messungen der optischen Dichte von TH-gefärbtem Striatum bewertet. Der Wirkungsmechanismus von CD28SA wurde analysiert, indem PD-Mäuse alternativ mit einem adoptiven Treg-Transfer behandelt wurden, während die Wirkung von CD28SA auf die Spiegel neurotropher Faktoren durch ELISA quantifiziert wurde. Wir beobachteten eine Expansion von Treg Zellen durch FACS-Analysen drei Tage nach der CD28SA-Behandlung, was ein biologisches Ansprechen der Treg auf CD28SA. Die CD28SA-Behandlung von AAV1/2-A53T-alpha-Syn-Mäusen lieferte bei CD28SA-behandelten Mäusen im Vergleich zu PBS-behandelten Kontrollmäusen eine Neuroprotektion, die durch eine erhöhte Anzahl von dopaminergen Neuronen im SN und eine höhere optische Dichte der TH-Färbung im Striatum ersichtlich ist. und das spiegelte sich in einer verbesserten Leistung in Verhaltensstudien wider. Darüber hinaus wurde die Hirninfiltration von proinflammatorisch aktivierten T-Lymphozyten (CD4+CD69+- und CD8+CD69+-Zellen), die bei PBS-behandelten AAV1/2-A53T-alpha-Syn-Kontrollmäusen offensichtlich war, bei PD-Mäusen, die CD28SA erhielten, verstärkt. Die alternative Behandlung mit dem adoptiven Treg-Transfer replizierte die vorteilhaften Wirkungen von CD28SA, was darauf hindeutet, dass die Treg-Expansion der Haupteffektormechanismus ist, durch den es seine neuroprotektive Wirkung ausübt. Die CD28SA-Behandlung von PD-Mäusen führte zu einem Anstieg von GDNF und BDNF in einigen Gehirnstrukturen, der bei unbehandelten Mäusen nicht beobachtet wurde. Wir schlussfolgern, dass CD28SA im AAV1/2-A53T-alpha-Syn-PD-Mausmodell die Entzündungshemmung unterdrückt, Verhaltensdefizite umkehrt und auf SN-dopaminergen Zellen neuroprotektiv ist. KW - Parkinson-Krankheit KW - Regulatorischer T-Lymphozyt KW - Parkinson's disease KW - Regulatory T Cells KW - CD28 Superagonist KW - Neurodegeneration Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-289544 ER - TY - THES A1 - Fuhr, Viktoria T1 - Target Identification and Validation in Ibrutinib-treated Mantle Cell Lymphoma T1 - Target-Identifizierung und Validierung im Ibrutinib-behandelten Mantelzell-Lymphom N2 - Ibrutinib serves as an efficient second-line therapy in relapsed/refractory mantle cell lymphoma. However, resistance to the BTK inhibitor results in a poor prognosis for patients. Since the mechanisms leading to resistance in initially responding tumor cells are poorly understood, this work aimed to decipher acquired features in ibrutinib-surviving cells of a sensitive mantle cell lymphoma cell line and evaluate these potential therapeutic targets in ibrutinib-treated mantle cell lymphoma. Time-resolved single-cell RNA sequencing was performed to track the transcriptomic evolution of REC-1 cells across 6 and 48 hours of treatment. Single-cell analysis uncovered a subpopulation of REC-1 with potentially greater aggressiveness and survival advantage by benefiting from interaction with the tumor microenvironment. Upregulation of B-cell receptor genes, elevated surface antigen expression of CD52 and metabolic rewiring to higher dependence on oxidative phosphorylation were identified as further potential resistance features of ibrutinib-surviving cells. RNA sequencing after prolonged incubation corroborated the increase in CD52 and oxidative phosphorylation as dominant characteristics of the cells surviving the 4-day treatment, highlighting their potential as therapeutic targets in combination with ibrutinib treatment. Concomitant use of ibrutinib and the oxidative phosphorylation inhibitor IACS-010759 increased toxicity compared to ibrutinib monotherapy due to higher apoptosis and greater inhibition of proliferation. For anti-CD52 therapy, a consecutive approach with ibrutinib pretreatment followed by incubation of surviving cells with a CD52 monoclonal antibody and human serum yielded a synergistic effect, as ibrutinib-surviving mantle cell lymphoma cells were rapidly depleted by complement-dependent cytotoxicity. Regarding the effects on primary tumor cells from mantle cell lymphoma patients, ibrutinib induced upregulation of CD52 in some cases, and increased toxicity of anti-CD52 therapy was observed in ibrutinib-sensitive patient samples after pretreatment with the BTK inhibitor. The likely favorable in vivo efficacy of an anti-CD52 therapy might therefore be restricted to a subgroup of mantle cell lymphoma patients, also in view of the associated side effects. Given the need for new therapeutic options in mantle cell lymphoma to overcome resistance to ibrutinib, this work highlights the potentially beneficial use of an oxidative phosphorylation inhibitor as add-on therapy. In addition, the findings suggest to further assess the value of anti-CD52 therapy as consolidation to ibrutinib in ibrutinib-sensitive patients with elevated CD52 surface levels on tumor cells to target resistant clones and minimize risk of minimal residual disease and relapse. N2 - Ibrutinib dient als wirkungsvolle Zweitlinientherapie beim rezidivierten/refraktären Mantelzell-Lymphom. Jedoch führt eine Resistenz gegen den BTK-Inhibitor zu einer schlechten Prognose für die Patienten. Da die Mechanismen, die zur Resistenz in initial ansprechenden Tumorzellen führen, nur unzureichend bekannt sind, hatte diese Arbeit zum Ziel, erworbene Eigenschaften in Ibrutinib-überlebenden Zellen einer sensitiven Mantelzell-Lymphom Zelllinie aufzudecken und darauf basierende therapeutische Ansätze im Ibrutinib-behandelten Mantelzell-Lymphom zu evaluieren. Eine Einzelzell-RNA-Sequenzierung wurde durchgeführt, um die Entwicklung des Transkriptoms der REC-1 Zellen über eine Behandlung von 6 und 48 Stunden zu verfolgen. Die Einzelzellanalyse offenbarte eine Subpopulation der REC-1 Zelllinie, die möglicherweise eine größere Aggressivität und einen Überlebensvorteil aufwies, da sie von der Interaktion mit dem Tumormikromilieu profitieren könnte. Die Hochregulation von B-Zell Rezeptor Genen, erhöhte Oberflächenantigenexpression von CD52 und eine Umstellung des Metabolismus auf eine stärkere Abhängigkeit von der oxidativen Phosphorylierung wurden als weitere mögliche Resistenzeigenschaften der Ibrutinib-überlebenden Zellen identifiziert. Eine RNA-Sequenzierung nach längerer Inkubation bestätigte den Anstieg von CD52 und oxidativer Phosphorylierung als dominante Merkmale der Zellen, die die 4-tägige Behandlung überlebten, was ihr Potential als therapeutische Ansatzpunkte in Kombination mit einer Ibrutinib Therapie hervorhob. Die gleichzeitige Anwendung von Ibrutinib und dem Inhibitor der oxidativen Phosphorylierung, IACS-010759, erhöhte die Toxizität im Vergleich zur Ibrutinib-Monotherapie aufgrund einer gesteigerten Apoptose und einer stärkeren Hemmung der Proliferation. Bei der Anti-CD52-Therapie erzielte der konsekutive Ansatz mit Ibrutinib-Vorbehandlung und anschließender Inkubation der überlebenden Zellen mit einem monoklonalen CD52-Antikörper und humanem Serum einen synergistischen Effekt, da die unter Ibrutinib überlebenden Zellen schnell durch die komplementabhängige Zytotoxizität eliminiert wurden. Hinsichtlich der Auswirkungen auf primäre Tumorzellen von Mantelzell-Lymphom-Patienten führte Ibrutinib in manchen Fällen zu einer Hochregulierung von CD52, und in Ibrutinib-empfindlichen Patientenproben wurde nach Vorbehandlung mit dem BTK-Inhibitor eine erhöhte Toxizität der Anti-CD52-Therapie beobachtet. Die wahrscheinlich günstige In-vivo-Wirkung einer Anti-CD52-Therapie könnte daher auf eine Subgruppe von Mantelzell-Lymphom Patienten beschränkt sein, auch im Hinblick auf die damit verbundenen Nebenwirkungen. Angesichts des Bedarfs an neuen therapeutischen Optionen beim Mantelzell-Lymphom zur Überwindung der Ibrutinib-Resistenz unterstreicht diese Arbeit den potentiell vorteilhaften Einsatz eines Inhibitors der oxidativen Phosphorylierung als Zusatztherapie. Darüber hinaus legen die Ergebnisse nahe, den Nutzen einer Anti-CD52-Therapie als Konsolidierung zu Ibrutinib bei Ibrutinib-empfindlichen Patienten mit erhöhter CD52 Oberflächenexpression auf Tumorzellen näher zu untersuchen, um resistente Klone zu beseitigen und das Risiko einer minimalen Resterkrankung und eines Rückfalls zu minimieren. KW - B-Zell-Lymphom KW - Therapieresistenz KW - Mantle cell lymphoma KW - Ibrutinib Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-310595 ER - TY - THES A1 - Erbacher, Christoph T1 - Systemic and local mechanisms of small fiber pathology in female patients with fibromyalgia syndrome T1 - Systemische und lokale Mechanismen der Kleinfaserpathologie bei Patientinnen mit Fibromyalgie Syndrom N2 - Fibromyalgia syndrome (FMS) is a largely heterogeneous chronic pain syndrome of unclear pathophysiology, which lacks objective diagnostics and specific treatment. An immune-related shift towards a pro-inflammatory profile is discussed at a systemic level. Small fiber pathology (SFP) and local participation of non-neuronal skin cells like keratinocytes in cutaneous nociception are potential peripheral contributors. Small RNAs, particularly microRNAs (miRs) and newly described tRNA fragments (tRFs) act as posttranscriptional key regulators of gene expression and may modulate systemic and peripheral cell pathways. On cellular level, the exact mechanisms of keratinocyte-intraepidermal nerve fiber (IENF) interaction in the skin are insufficiently understood. Via small RNA sequencing and quantitative real-time PCR, we investigated miR and tRF signatures in whole blood cells and skin biopsy-derived keratinocytes of female FMS patients versus healthy controls. We applied gene target prediction analysis to uncover underlying cellular pathways affected by dysregulated small RNAs. Altered FMS small RNAs from blood were compared with their expression in disease controls, i.e. Parkinson`s patients and patients with major depression and chronic pain. Association of SFP with small RNAs was investigated via correlation with clinical parameter. To explore keratinocyte-nerve fiber interactions with high relevance for SFP and cutaneous nociception, we adapted a super-resolution array tomography (srAT) approach and expansion microscopy (ExM) for human skin samples. Further, we created a fully human 2D co-culture model of primary keratinocytes and induced pluripotent stem cell derived sensory neurons. Blood miR deregulation indicated systemic modulation of immune processes exerted by CholinomiRs and by miRs targeting the FoxO signaling pathway. Short sized tRFs were associated with mRNA metabolism and splicing. This supports the hypothesis of an inflammatory/autoimmunity component in FMS. Expression of blood small RNAs in FMS were discriminative against disease controls, highlighting their potential as objective biomarker. Blood small RNAs were predominantly upregulated and correlations between miR and clinical parameter reflected rather pain in general than SFP. In FMS keratinocytes, a downregulation of miRs and tRFs was evident. Pathways for adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK), adherens junction, and focal adhesion were predicted to be affected by miRs, while tRFs may influence proliferation, migration, and cell growth. Similar to blood miRs, altered miRs in keratinocytes correlated mostly with widespread pain and pain severity parameter. TRFs were partially associated with more severe IENF loss. Small RNAs in FMS keratinocytes may modulate pathways that define how keratinocytes interact with each other and with IENF. These interactions include nerve fiber ensheathment, a conserved epithelial mechanism, which we visualize in human epidermis and a fully human co-culture model. Additionally, we revealed plaques of connexin 43, a pore forming protein involved in intercellular communication, at keratinocyte- nerve fiber contact sites. Objective quantification of these morphological findings in FMS and other diseases with SFP may inherit diagnostic value similar to IENF density. We provide evidence for distinct miR and tRF signatures in FMS with implications for systemic immune regulation and local cell-cell interaction pathways. In the periphery we explored novel keratinocyte-nerve fiber interactions relevant for SFP and cutaneous nociception. N2 - Das Fibromyalgie Syndrom (FMS) umfasst ein sehr heterogenes chronisches Schmerzsyndrom mit ungeklärter Pathophysiologie, ohne objektive Diagnostik und gezielt wirkende Behandlungsmöglichkeiten. Auf systemischer Ebene wird eine entzündungsfördernde Verschiebung von Immunprozessen diskutiert. In der Peripherie stellen die Kleinfaserpathologie (SFP) und Beteiligungen nicht-neuronaler Hautzellen, beispielsweise Keratinozyten, an kutaner Nozizeption potenziell beitragende Faktoren dar. Kleine RNAs, vor allem microRNAs (miRs) und die kürzlich beschriebenen tRNA Fragmente (tRFs) agieren als posttranskriptionelle Schlüsselregulatoren der Genexpression und könnten daher systemische und periphere Zellprozesse modulieren. Die genauen zellulären Mechanismen bei der Interaktion von Keratinozyten mit intraepidermalen Nervenfasern (IENF) in der Haut sind nur unzureichend verstanden. Mittels Sequenzierung von kleinen RNAs und quantitativer Real-Time PCR untersuchten wir miR und tRF Signaturen in Vollblutzellen und in durch Hautbiopsie gewonnene Keratinozyten von FMS Patientinnen im Vergleich zu gesunden weiblichen Kontrollen. Um zugrundeliegende Zellprozesswege aufzudecken, die von der Deregulierung kleiner RNAs betroffen sind, verwendeten wir Vorhersageprogramme für regulierte Gene. In FMS verändert vorliegende kleine RNAs im Blut verglichen wir mit ihrer Expression in Krankheitskontrollen, d.h. Parkinson Patientinnen und Patientinnen mit schwerer Depression und chronischem Schmerz. Die Beziehung zwischen SFP und kleinen RNAs wurde mittels der Korrelation mit klinischen Parametern untersucht. Zur Erforschung von Keratinozyten-Nervenfaser Interaktionen, mit großer Relevanz für SFP und kutane Nozizeption, adaptierten wir eine superauflösende Array-Tomographie (srAT) Methodik und Expansionsmikroskopie (ExM) für humane Hautproben. Außerdem entwickelten wir ein rein humanes 2D Ko-Kultur Zellmodell, bestehend aus primären Keratinozyten und sensiblen Neuronen, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen generiert wurden. MiR Deregulierungen in Blut wiesen auf systemische Modulierung von Immunprozessen hin, ausgeübt durch CholinomiRs und miRs, die auf den FoxO Signalweg einwirken. Die tRFs mit kurzer Fragmentlänge waren mit mRNA Metabolismus und Splicing verknüpft. Diese Ergebnisse unterbauen die Hypothese einer entzündungsfördernden/autoimmunen Komponente in FMS. Die Expression kleiner RNAs aus FMS Blut war unterschiedlich zu Krankheitskontrollen, was ihr Potenzial als objektive Biomarker hervorhebt. Kleine RNAs im Blut waren überwiegend erhöht exprimiert und Korrelation zwischen miRs und klinischen Parametern spiegelten eher Schmerzen im Allgemeinen wider als SFP. In Keratinozyten von FMS Patientinnen war eine Herunterregulierung von miRs und tRFs ersichtlich. Der Signalweg der Adenosinmonophosphat aktivierten Proteinkinase (AMPK), sowie Adherens Junction und Fokale Adhäsion waren prognostiziere Prozesse unter Einfluss von miRs. Ähnlich wie bei den Blut miRs, korrelierten veränderte miRs in Keratinozyten vor allem mit der Verbreitung des Schmerzes über den Körper und der Schmerzintensität. TRFs waren teilweise mit einem höheren Verlust an IENF verknüpft. Kleine RNAs in Keratinozyten von FMS Patientinnen könnten jene Prozesse modulieren, die festlegen, wie Keratinozyten miteinander und mit IENF interagieren. Diese Interaktionen beinhalten den konservierten Mechanismus der Nervenfaserumhüllung, den wir in humaner Epidermis und einem komplett humanen Ko-Kultur Modell auflösen konnten. Zusätzlich zeigten wir Anhäufungen von Connexin 43, einem an interzellulärer Kommunikation beteiligten porenformenden Protein, an Keratinozyten-Nervenfaser Kontaktstellen. Eine objektive Quantifizierung dieser morphologischen Befunde in FMS und weiteren Erkrankungen mit SFP könnte einen diagnostischen Wert vergleichbar mit dem der IENF Dichte innehaben. Wir liefern Belege für klare miR und tRF Signaturen in FMS mit Bedeutung für systemische Immunregulation und lokale Zell-Zell Interaktionsprozesse. In der Peripherie erkundeten wir neueartige Keratinozyten-Nervenfaser Interaktionen relevant für SFP und kutane Nozizeption. KW - Fibromyalgiesyndrom KW - Small RNA KW - Keratinozyt KW - Mikroskopie KW - Fibromyalgia syndrome KW - small RNA expression KW - super-resolution microscopy KW - Fibromyalgie Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-290203 ER - TY - THES A1 - Hofmann, Julian T1 - Synthesis of Sterubin, Flavonoid Hybrids, and Curcumin Bioisosteres and Characterization of their Neuroprotective Effects T1 - Synthese von Sterubin, Flavonoid Hybriden und Curcumin Bioisosteren und Charakterisierung ihrer neuroprotektiven Effekte N2 - Alzheimer´s disease (AD) is a neurodegenerative disease and the most common form of dementia with still no preventive or curative treatment. Besides several risk factors, age is one of the major risks for AD and with an aging society, there is an urgent need for disease modifying agents. The strategy to address only one target within the intertwined network of AD failed so far. Natural products especially the phytochemical flavonoids, which are poly-phenolic natural products, have shown great potential as disease modifying agents against neurodegenerative disorders like Alzheimer´s disease (AD) with activities even in vivo. Flavonoids are produced by many plants and the native Californian plant Eriodictyon californicum is particularly rich in flavonoids. One of the major flavonoids of E. californicum is sterubin, a very potent agent against oxidative stress and inflammation, two hallmarks and drivers of AD and neurodegeneration. Herein, racemic sterubin was synthesized and separated into its pure (R)- and (S)-enantiomer by chiral HPLC. The pure enantiomers showed comparable neuroprotection in vitro with no significant differences. The stereoisomers were configurationally stable in methanol, but fast racemization was observed in culture medium. Moreover, the activity of sterubin was investigated in vivo, in an AD mouse model. Sterubin showed a significant positive impact on short- and long-term memory at low dosages. A promising concept for the increase of activity of single flavonoids is hybridization with aromatic acids like cinnamic or ferulic acids. Hybridization of the natural products taxifolin and silibinin with cinnamic acid led to an overadditive effect of these compounds in phenotypic screening assays related to neurodegeneration and AD. Because there are more potent agents as taxifolin or silibinin, the hybrids were further developed, and different flavonoid cinnamic acid hybrids were synthesized. The connection between flavonoids and cinnamic acid was achieved by an amide instead of a labile ester to improve the stability towards hydrolysis to gain better “druggability” of the compounds. To investigate the oxidation state of the C-ring of the flavonoid part, the dehydro analogues of the respective hybrids were also synthesized. The compounds show neuroprotection against oxytosis, ferroptosis and ATP-depletion in the murine hippocampal cell line HT22. While no overall trend within the flavanones compared to the flavones could be assigned, the taxifolin and the quercetin derivative were the most active compounds in course of all assays. The quercetin derivate even shows greater activity than the taxifolin derivate in every assay. As desired no hydrolysis product was found in cellular uptake experiments after 4h, whereas different metabolites were found. The last part of this work focused on synthetic bioisoteres of the natural product curcumin. Due to the drawbacks of curcumin and flavonoids arising from poor pharmacokinetics, rapid metabolism and sometimes instability in aqueous medium, we have examined the biological activity of azobenzene compounds designed as bioisoteres of curcumin, carrying the pharmacophoric catechol group of flavonoids. These bioisosteres exceeded their parent compounds in counteracting intracellular oxidative stress, neuroinflammation and amyloid-beta aggregation. By incorporating an azobenzene moiety and the isosteric behaviour to the natural parent compounds, these compounds may act as molecular tools for further investigation towards the molecular mode of action of natural products. N2 - Die Alzheimersche Krankheit ist eine neurodegenerative Erkrankung und die häufigste Form der Demenz, für die es noch keine präventive oder kurative Behandlung gibt. Neben mehreren Risikofaktoren ist das Alter eines der Hauptrisiken für die Krankheit und in einer alternden Gesellschaft besteht ein dringender Bedarf an Mitteln zum Stoppen oder Heilen der Krankheit. Die Strategie, nur ein Ziel innerhalb des verflochtenen Netzwerks der Pathogenese von AD zu adressieren, ist bisher gescheitert. Naturstoffe, insbesondere die sekundären Pflanzenmetabolite Flavonoide, bei denen es sich um polyphenolische Naturstoffe handelt, haben ein großes Potenzial zum Eindämmen von neurodegenerativen Erkrankungen. Zahlreiche Studien, in vitro und auch in vivo, legen eine Wirksamkeit dieser Stoffe nahe. Flavonoide werden von vielen Pflanzen produziert und die kalifornische Pflanze Eriodictyon californicum ist besonders reich an Flavonoiden. Eines der wichtigsten Flavonoide von E. californicum ist Sterubin, ein sehr potenter Wirkstoff gegen oxidativen Stress und Entzündungen, zwei Treiber der Alzheimerschen Erkrankung und Neurodegeneration. In dieser Arbeit wurde racemisches Sterubin synthetisiert und durch chirale HPLC in das reine (R)- beziehungsweise (S)-Enantiomer getrennt. Die reinen Enantiomere zeigten in vitro eine vergleichbare neuroprotektive Aktivität ohne signifikante Unterschiede. Die Stereoisomere waren in Methanol konfigurativ stabil, in Zellkulturmedium wurde jedoch schnelle Racemisierung beobachtet. Darüber hinaus wurde die Aktivität von Sterubin in vivo in einem Alzheimer-Mausmodell untersucht. Sterubin zeigte bei niedrigen Dosierungen einen signifikanten positiven Einfluss auf das Kurz- und Langzeitgedächtnis. Ein vielversprechendes Konzept zur Aktivitätssteigerung einzelner Flavonoide ist die Hybridisierung mit aromatischen Säuren wie Zimt- oder Ferulasäure. Die Hybridisierung der Naturstoffe Taxifolin und Silibinin mit Zimtsäure führte zu einer überadditiven Wirkung dieser Verbindungen in phänotypischen Screening-Assays im Zusammenhang mit Neurodegeneration und Alzheimer. Da es potentere Moleküle als Taxifolin oder Silibinin gibt, wurden die Hybride weiterentwickelt und verschiedene Flavonoid-Zimtsäure-Hybride synthetisiert. Die Verbindung zwischen dem Flavonoid und der Zimtsäure wurde durch ein Amid anstelle eines labilen Esters geknüpft, um die Stabilität gegenüber Hydrolyse zu verbessern. Um die Oxidationsstufe des C-Rings des Flavonoidteils zu untersuchen, wurden auch die Dehydro-Analoga der jeweiligen Hybride synthetisiert. Die Verbindungen zeigten Neuroprotektion gegen Oxytose, Ferroptose und dem Verlust von ATP in der murinen Hippocampus-Zelllinie HT22. Während kein allgemeiner Trend zur besseren Wirksamkeit der Flavanone gegenüber den Flavonen festzustellen war, waren das Taxifolin und das Querzetin-Derivat die aktivsten Verbindungen in allen Assays. Das Querzetin-Derivat zeigt in jedemAssay sogar eine höhere Aktivität als das Taxifolin-Derivat. Wie erwartet wurde in zellulären Aufnahmeexperimenten nach 4 h kein Hydrolyseprodukt gefunden, wohingegen verschiedene Metabolite gefunden wurden. Der letzte Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit synthetischen Bioisosteren des Naturstoffs Curcumin. Aufgrund der Nachteile von Curcumin und Flavonoiden, die aus einer schlechten Pharmakokinetik, einem schnellen Metabolismus und manchmal einer Instabilität in wässrigem Medium resultieren, wurde die biologische Aktivität von Azobenzolverbindungen untersucht, die als Bioisostere von Curcumin konzipiert sind und die pharmakophore Catecholgruppe der Flavonoide tragen. Diese Bioisostere übertrafen ihre Stammverbindungen in der Protektion gegen intrazellulären oxidativen Stress, Neuroinflammation und der anti-aggregativen Eigenschaften gegen Amyloid-Beta. Durch den Einbau einer Azobenzoleinheit und das isostere Verhalten zu den natürlichen Stammverbindungen könnten diese Verbindungen als molekulare Werkzeuge für die weitere Untersuchung der molekularen Wirkungsweise von Naturstoffen dienen. KW - Organische Synthese KW - Flavonoids KW - Alzheimerkrankheit KW - Naturstoff KW - Hybrid-Molecules KW - Neuroprotection Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-266641 ER - TY - THES A1 - Nordblom, Noah Frieder T1 - Synthese und Evaluation von Gephyrinsonden für hochauflösende Mikroskopieverfahren T1 - Synthesis and Evaluation of Super Resolution Compatible Gephyrin Probes N2 - This decade saw the development of new high-end light microscopy approaches. These technologies are increasingly used to expand our understanding of cellular function and the molecular mechanisms of life and disease. The precision of state-of-the-art super resolution microscopy is limited by the properties of the applied fluorescent label. Here I describe the synthesis and evaluation of new functional fluorescent probes that specifically stain gephyrin, universal marker of the neuronal inhibitory post-synapse. Selected probe precursor peptides were synthesised using solid phase peptide synthesis and conjugated with selected super resolution capable fluorescent dyes. Identity and purity were defined using chromatography and mass spectrometric methods. To probe the target specificity of the resulting probe variants in cellular context, a high-throughput assay was established. The established semi-automated and parallel workflow was used for the evaluation of three selected probes by defining their co-localization with the expressed fluorescent target protein. My work provided NN1Dc and established the probe as a visualisation tool for essentially background-free visualisation of the synaptic marker protein gephyrin in a cellular context. Furthermore, NN1DA became part of a toolbox for studying the inhibitory synapse ultrastructure and brain connectivity and turned out useful for the development of a label-free, high-throughput protein interaction quantification assay. N2 - Neuentwickelte, hochauflösende Fluoreszenzmikroskopieverfahren sind prinzipiell geeignet, molekulare Mechanismen und zelluläre Vorgänge im niedrigen Nanometerbereich aufzulösen. Die maximal erreichbare Auflösung wird unter anderem von der eingesetzten Fluoreszenzmarkierung beeinflusst. In dieser Arbeit beschreibe ich die Synthese neuartiger, funktioneller, fluoreszierender Proben und evaluiere deren Eigenschaft Gephyrin, einen universalen Marker der neuronalen inhibitorischen Postsynapse, zu visualisieren. Hierzu wurden Peptide mittels Festphasenpeptidsyntese hergestellt und mit fluoreszierenden Farbstoffen konjugiert, die für hochauflösende Mikroskopieverfahren geeignet sind. Der Syntheseerfolg und die Reinheit der Stoffe wurde mittels massenspektrometrischer und chromatographischer Methoden bestimmt. In einem Hochdurchsatzverfahren wurden die Proben in einem zellulären Kontext untersucht, spezifisch Gephyrin zu markieren. In einem semi-automatisierten, parallelen Verfahren wurden drei ausgewählte Proben synthetisiert und deren Kolokalisation mit dem fluoreszierenden Zielprotein in transfizierten HEK-Zellen untersucht. Aus dieser Arbeit ist NN1DC hervorgegangen, eine peptidische Sonde zur Visualisierung von Gephyrin. Diese Probe weist verbesserte Färbeeigenschaften wie eine höhere Spezifität und Sensitivität, verglichen mit bisher bekannten peptidischen Gephyrinsonden, auf. Darüber hinaus kann NN1DA als hochaffiner Binder von Gephyrin zur Entwicklung neuer gephyrinbindender Moleküle in einem high-througput Verfahren genutzt werden. KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Peptidsynthese KW - Gephyrin KW - Inhibitorische Synapse KW - Fluorescence microscopy KW - Solid-phase peptide synthesis KW - Affinity probe KW - Inhibitory synapse Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-302300 ER - TY - THES A1 - Saulin, Anne Christin T1 - Sustainability of empathy as driver for prosocial behavior and social closeness: insights from computational modelling and functional magnetic resonance imaging T1 - Nachhaltigkeit von Empathie als Motiv für prosoziales Verhalten und soziale Nähe: Erkenntnisse auf Grundlage von computational modelling und funktioneller Magnetresonanztomographie N2 - Empathy, the act of sharing another person’s affective state, is a ubiquitous driver for helping others and feeling close to them. These experiences are integral parts of human behavior and society. The studies presented in this dissertation aimed to investigate the sustainability and stability of social closeness and prosocial decision-making driven by empathy and other social motives. In this vein, four studies were conducted in which behavioral and neural indicators of empathy sustainability were identified using model-based functional magnetic resonance imaging (fMRI). Applying reinforcement learning, drift-diffusion modelling (DDM), and fMRI, the first two studies were designed to investigate the formation and sustainability of empathy-related social closeness (study 1) and examined how sustainably empathy led to prosocial behavior (study 2). Using DDM and fMRI, the last two studies investigated how empathy combined with reciprocity, the social norm to return a favor, on the one hand and empathy combined with the motive of outcome maximization on the other hand altered the behavioral and neural social decision process. The results showed that empathy-related social closeness and prosocial decision tendencies persisted even if empathy was rarely reinforced. The sustainability of these empathy effects was related to recalibration of the empathy-related social closeness learning signal (study 1) and the maintenance of a prosocial decision bias (study 2). The findings of study 3 showed that empathy boosted the processing of reciprocity-based social decisions, but not vice versa. Study 4 revealed that empathy-related decisions were modulated by the motive of outcome maximization, depending on individual differences in state empathy. Together, the studies strongly support the concept of empathy as a sustainable driver of social closeness and prosocial behavior. N2 - Empathie, das Teilen des Affekts einer anderen Person, ist eine allgegenwärtige Motivation, anderen Menschen zu helfen und sich ihnen nahe zu fühlen. Diese Erfahrungen sind wesentliche Bestandteile menschlichen Verhaltens und zentral für unsere Gesellschaft. Die vorliegende Dissertation setzte sich zum Ziel, die Nachhaltigkeit und Stabilität sozialer Nähe sowie prosozialem Entscheidungsverhalten basierend auf Empathie und anderen sozialen Motiven zu beleuchten. In den vier Studien wurden das Verhalten und neuronale Indikatoren für die Nachhaltigkeit von Empathie mit modellbasierter funktioneller Magnetresonanztomographie (fMRT) untersucht. Unter Verwendung von Verstärkungslernmodellen, Drift-Diffusionsmodellen (DDM) und fMRT untersuchten die ersten zwei Studien den zeitlichen Verlauf von empathiebasierter sozialer Nähe und prosozialem Verhalten. Mit Hilfe von DDM und fMRT wurde in den abschließenden Studien untersucht, wie Empathie in Kombination mit Reziprozität, der sozialen Norm, Gefallen zurückzuzahlen, und Empathie in Kombination mit dem Motiv der Gewinnmaximierung den verhaltensbezogenen und neuronalen sozialen Entscheidungsprozess verändert. Die Ergebnisse zeigten, dass empathiebasierte soziale Nähe und prosoziale Entscheidungstendenzen selbst dann fortbestanden wenn Empathie nur noch selten verstärkt wurde. Die Nachhaltigkeit dieser Effekte hing mit der Rekalibrierung des empathiebasierten Lernsignals für soziale Nähe (Studie 1) und dem Aufrechterhalten eines prosozialen Entscheidungsbias zusammen (Studie 2). Die Ergebnisse von Studie 3 zeigten, dass Empathie reziprozitätsbasierte soziale Entscheidungen stärkt, aber nicht umgekehrt. Studie 4 zeigte, dass empathiebasierte soziale Entscheidungen durch das Motiv der Gewinnmaximierung vereinfacht werden können. Zusammengefasst unterstützen die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation nachdrücklich das Konzept von Empathie als nachhaltige Triebkraft für soziale Nähe und prosoziales Verhalten. KW - Einfühlung KW - Bestärkendes Lernen KW - Modellierung KW - Funktionelle Kernspintomografie KW - Prosoziales Verhalten KW - drift-diffusion model KW - reciprocity KW - anterior insula KW - temporo-parietal junction KW - inferior frontal gyrus Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-305550 ER - TY - THES A1 - Değirmenci [née Pölloth], Laura T1 - Sugar perception and sugar receptor function in the honeybee (\(Apis\) \(mellifera\)) T1 - Zuckerwahrnehmung und Zuckerrezeptorfunktion in der Honigbiene (\(Apis\) \(mellifera\)) N2 - In the eusocial insect honeybee (Apis mellifera), many sterile worker bees live together with a reproductive queen in a colony. All tasks of the colony are performed by the workers, undergoing age-dependent division of labor. Beginning as hive bees, they take on tasks inside the hive such as cleaning or the producing of larval food, later developing into foragers. With that, the perception of sweetness plays a crucial role for all honeybees whether they are sitting on the honey stores in the hive or foraging for food. Their ability to sense sweetness is undoubtedly necessary to develop and evaluate food sources. Many of the behavioral decisions in honeybees are based on sugar perception, either on an individual level for ingestion, or for social behavior such as the impulse to collect or process nectar. In this context, honeybees show a complex spectrum of abilities to perceive sweetness on many levels. They are able to perceive at least seven types of sugars and decide to collect them for the colony. Further, they seem to distinguish between these sugars or at least show clear preferences when collecting them. Additionally, the perception of sugar is not rigid in honeybees. For instance, their responsiveness towards sugar changes during the transition from in-hive bees (e.g. nurses) to foraging and is linked to the division of labor. Other direct or immediate factors changing responsiveness to sugars are stress, starvation or underlying factors, such as genotype. Interestingly, the complexity in their sugar perception is in stark contrast to the fact that honeybees seem to have only three predicted sugar receptors. In this work, we were able to characterize the three known sugar receptors (AmGr1, AmGr2 and AmGr3) of the honeybee fully and comprehensively in oocytes (Manuscript II, Chapter 3 and Manuscript III, Chapter 4). We could show that AmGr1 is a broad sugar receptor reacting to sucrose, glucose, maltose, melezitose and trehalose (which is the honeybees’ main blood sugar), but not fructose. AmGr2 acts as its co-receptor altering AmGr1’s specificity, AmGr3 is a specific fructose receptor and we proved the heterodimerization of all receptors. With my studies, I was able to reproduce and compare the ligand specificity of the sugar receptors in vivo by generating receptor mutants with CRISPR/Cas9. With this thesis, I was able to define AmGr1 and AmGr3 as the honeybees’ basis receptors already capable to detect all sugars of its known taste spectrum. In the expression analysis of my doctoral thesis (Manuscript I, Chapter 2) I demonstrated that both basis receptors are expressed in the antennae and the brain of nurse bees and foragers. This thesis assumes that AmGr3 (like the Drosophila homologue) functions as a sensor for fructose, which might be the satiety signal, while AmGr1 can sense trehalose as the main blood sugar in the brain. Both receptors show a reduced expression in the brain of foragers when compared with nurse bees. These results may reflect the higher concentrated diet of nurse bees in the hive. The higher number of receptors in the brain may allow nurse bees to perceive hunger earlier and to consume the food their sitting on. Forager bees have to be more persistent to hunger, when they are foraging, and food is not so accessible. The findings of reduced expression of the fructose receptor AmGr3 in the antennae of nurse bees are congruent with my other result that nurse bees are also less responsive to fructose at the antennae when compared to foragers (Manuscript I, Chapter 2). This is possible, since nurse bees sit more likely on ripe honey which contains not only higher levels of sugars but also monosaccharides (such as fructose), while foragers have to evaluate less-concentrated nectar. My investigations of the expression of AmGr1 in the antennae of honeybees found no differences between nurse bees and foragers, although foragers are more responsive to the respective sugar sucrose (Manuscript I, Chapter 2). Considering my finding that AmGr2 is the co-receptor of AmGr1, it can be assumed that AmGr1 and the mediated sucrose taste might not be directly controlled by its expression, but indirectly by its co-receptor. My thesis therefore clearly shows that sugar perception is associated with division of labor in honeybees and appears to be directly or indirectly regulated via expression. The comparison with a characterization study using other bee breeds and thus an alternative protein sequence of AmGr1 shows that co-expression of different AmGr1 versions with AmGr2 alters the sugar response differently. Therefore, this thesis provides first important indications that alternative splicing could also represent an important regulatory mechanism for sugar perception in honeybees. Further, I found out that the bitter compound quinine lowers the reward quality in learning experiments for honeybees (Manuscript IV, Chapter 5). So far, no bitter receptor has been found in the genome of honeybees and this thesis strongly assumes that bitter substances such as quinine inhibit sugar receptors in honeybees. With this finding, my work includes other molecules as possible regulatory mechanism in the honeybee sugar perception as well. We showed that the inhibitory effect is lower for fructose compared to sucrose. Considering that sugar signals might be processed as differently attractive in honeybees, this thesis concludes that the sugar receptor inhibition via quinine in honeybees might depend on the receptor (or its co-receptor), is concentration-dependent and based on the salience or attractiveness and concentration of the sugar present. With my thesis, I was able to expand the knowledge on honeybee’s sugar perception and formulate a complex, comprehensive overview. Thereby, I demonstrated the multidimensional mechanism that regulates the sugar receptors and thus the sugar perception of honeybees. With this work, I defined AmGr1 and AmGr3 as the basis of sugar perception and enlarged these components to the co-receptor AmGr2 and the possible splice variants of AmGr1. I further demonstrated how those sugar receptor components function, interact and that they are clearly involved in the division of labor in honeybees. In summary, my thesis describes the mechanisms that enable honeybees to perceive sugar in a complex way, even though they inhere a limited number of sugar receptors. My data strongly suggest that honeybees overall might not only differentiate sugars and their diet by their general sweetness (as expected with only one main sugar receptor). The found sugar receptor mechanisms and their interplay further suggest that honeybees might be able to discriminate directly between monosaccharides and disaccharides or sugar molecules and with that their diet (honey and nectar). N2 - Beim dem eusozialen Insekt Honigbiene (Apis mellifera) leben tausende sterile Arbeitsbienen zusammen mit einer fortpflanzungsfähigen Königin in einem Volk. Alle Aufgaben in der Kolonie werden von diesen Arbeiterinnen erledigt, während sie eine altersabhängige Arbeitsteilung durchlaufen. Als Stockbienen beginnend übernehmen sie Aufgaben im Stock wie die Reinigung oder die Produktion von Larvenfutter und entwickeln sich später zu Sammlerinnen. Das Wahrnehmung von Süße spielt für alle Honigbienen eine entscheidende Rolle, egal ob sie auf den Honigvorräten im Stock sitzen oder nach Nahrung suchen. Ihre Fähigkeit Süße zu wahrzunehmen ist zweifellos notwendig, um Nahrungsquellen zu identifizieren und zu bewerten. Viele der Verhaltensentscheidungen bei Honigbienen basieren auf ihrer Zuckerwahrnehmung, entweder auf individueller Ebene für die Nahrungsaufnahme oder für soziales Verhalten wie beispielsweise das Sammeln oder Verarbeiten von Nektar. Honigbienen zeigen auf vielen Ebenen ein komplexes Spektrum bei der Wahrnehmung von Süße. Sie können mindestens sieben Zuckerarten wahrnehmen und sammeln diese für ihren Stock. Darüber hinaus scheinen sie zwischen diesen Zuckern unterscheiden zu können oder zeigen zumindest klare Präferenzen beim Sammeln. Außerdem ist die Zuckerwahrnehmung bei Honigbienen nicht starr. Ihre Zuckerwahrnehmung ändert sich, wenn sie von einer Stockbiene (z. B. Ammen) zum Nahrungssammeln außerhalb des Stockes übergehen, und ist somit mit ihrer Arbeitsteilung verbunden. Andere direkte oder unmittelbare Faktoren, die die Reaktion auf Zucker verändern, sind Stress, Hunger oder zugrunde liegende Faktoren wie der Genotyp. Interessanterweise steht die Komplexität der Zuckerwahrnehmung in starkem Kontrast zu der Tatsache, dass Honigbienen bisher anscheinend nur drei mögliche Zuckerrezeptoren haben. In dieser Arbeit konnten wir die drei bekannten Honigbienenzuckerrezeptoren (AmGr1, AmGr2 und AmGr3) in Xenopus-Oozyten vollständig und umfassend charakterisieren (Manuscript II, Chapter 3 und Manuscript III, Chapter 4). Wir konnten zeigen, dass AmGr1 ein breitdetektierender Zuckerrezeptor ist, der auf Saccharose, Glukose, Maltose, Melezitose und Trehalose (der Hauptblutzucker bei Honigbienen), aber nicht auf Fruktose reagiert. AmGr2 fungiert als ein Co-Rezeptor, der die Spezifität von AmGr1 verändert. AmGr3 ist ein spezifischer Fruktoserezeptor und wir haben die Heterodimerisierung der Rezeptoren überprüft. Mit meinen Studien konnte ich die gefundene Ligandenspezifität der Zuckerrezeptoren in vivo reproduzieren und vergleichen, indem ich Rezeptormutanten mit CRISPR/Cas9 generierte. Dabei konnte ich AmGr1 und AmGr3 als die Basisrezeptoren von Honigbienen definieren, die bereits alle Zucker ihres bekannten Geschmacksspektrums detektieren können. In der Expressionsanalyse meiner Doktorarbeit (Manuscript I, Chapter 2) konnte ich zeigen, dass beide Basisrezeptoren in den Antennen und im Gehirn von Ammenbienen und Sammlerinnen exprimiert werden. Diese Arbeit geht davon aus, dass AmGr3 (wie das Homologe in Drosophila) als Sensor für Fruktose fungiert, die das Sättigungssignal sein könnte, während AmGr1 Trehalose als Hauptblutzucker im Gehirn wahrnehmen kann. Beide Rezeptoren zeigen eine reduzierte Expression im Gehirn von Sammlerinnen im Vergleich zu Ammenbienen. Diese Ergebnisse könnten die höher konzentrierte Ernährung der Ammenbienen im Stock widerspiegeln. Die höhere Anzahl an Rezeptoren im Gehirn könnte es den Ammenbienen ermöglichen frühzeitiger Hunger wahrzunehmen und die Nahrung, auf der sie sitzen aufzunehmen. Sammelbienen dagegen müssen beim Sammeln und dem reduzierten Nahrungsangebot ausdauernder sein. Die gemessene reduzierte Expression des Fruktoserezeptors AmGr3 in den Antennen von Ammenbienen entsprechen meinen anderen Ergebnissen, wonach Ammenbienen im Vergleich zu Sammelbienen an den Antennen auch weniger empfindlich auf Fruktose reagieren (Manuscript I, Chapter 2). Dies ist möglich, da Ammenbienen eher auf reifem Honig sitzen, der nicht nur einen höheren Zuckergehalt, sondern auch vermehrt Monosaccharide (wie Fructose) enthält, während Sammelbienen weniger konzentrierten Nektar bewerten müssen. Meine Untersuchungen zur Expression von AmGr1 in den Antennen von Honigbienen ergaben keine Unterschiede zwischen Ammenbienen und Sammlerinnen, obwohl Sammlerinnen empfindlicher auf den entsprechenden Zucker Saccharose reagieren. Angesichts unserer Ergebnisse, dass AmGr2 der Co-Rezeptor von AmGr1 ist, kann die Hypothese aufgestellt werden, dass AmGr1 und der vermittelte Saccharose-Geschmack möglicherweise nicht direkt durch seine Expression, sondern indirekt durch seinen Co-Rezeptor reguliert werden. Meine Dissertation zeigt somit deutlich, dass die Zuckerwahrnehmung bei Honigbienen mit Arbeitsteilung verbunden ist und direkt oder indirekt über die Expression geregelt zu werden scheint. Der Vergleich mit einer anderen Charakterisierungsstudie, durchgeführt an anderen Bienenrassen und damit einer alternativen Proteinsequenz von AmGr1, zeigt, dass die Co-Expression verschiedener AmGr1-Varianten mit AmGr2 die Zuckerantwort unterschiedlich verändert. Daher liefert diese Arbeit erste wichtige Hinweise darauf, dass alternatives Spleißen auch bei Honigbienen einen wichtigen Regulationsmechanismus für die Zuckerwahrnehmung darstellen könnte. Des Weiteren habe ich herausgefunden, dass der Bitterstoff Chinin die Qualität der Belohnung in Lernexperimenten für Honigbienen senkt (Manuscript IV, Chapter 5). Bisher wurde kein Bitterrezeptor im Genom von Honigbienen gefunden und diese Arbeit deutet darauf hin, dass Bitterstoffe wie Chinin Zuckerrezeptoren in Honigbienen hemmen. Mit dieser Erkenntnis schließt meine Dissertation auch andere Moleküle als mögliche Regulationsmechanismen in die Zuckerwahrnehmung der Honigbiene ein. Wir haben gezeigt, dass die hemmende Wirkung bei Fruktose im Vergleich zu Saccharose geringer ist. Unter der Berücksichtigung, dass Zuckersignale bei Honigbienen möglicherweise unterschiedlich attraktiv verarbeitet werden, kommt meine Arbeit zu dem Schluss, dass die Hemmung der Zuckerrezeptoren durch Chinin bei Honigbienen abhängig ist von der verwendeten Konzentration, der Bedeutung bzw. Attraktivität des Zuckers und seiner Konzentration. Mit meiner Doktorarbeit konnte ich das Wissen über die Zuckerwahrnehmung der Honigbiene insgesamt erweitern und einen komplexen, umfassenden Überblick formulieren. Ich konnte den mehrdimensionalen Mechanismus aufzeigen, der die Zuckerrezeptoren und damit die Zuckerwahrnehmung von Honigbienen reguliert. Ich konnte AmGr1 und AmGr3 als Basis der Zuckerwahrnehmung definieren und diese Komponenten auf den Co-Rezeptor AmGr2 und die möglichen Spleißvarianten von AmGr1 erweitern. Ich habe außerdem gezeigt, wie diese Zuckerrezeptorkomponenten funktionieren, interagieren, und dass sie eindeutig an der Arbeitsteilung bei Honigbienen beteiligt sind. Zusammenfassend beschreibt meine Dissertation die Mechanismen, die es Honigbienen ermöglichen, Zucker auf komplexe Weise wahrzunehmen, selbst wenn sie eine begrenzte Anzahl von Zuckerrezeptoren besitzen. Meine Daten deuten stark darauf hin, dass Honigbienen Zucker und ihre Nahrung nicht nur aufgrund ihrer generellen Süße unterscheiden können (wie dies mit nur einem Hauptzuckerrezeptor zu erwarten wäre). Die gefundenen Zuckerrezeptormechanismen und deren Zusammenspiel legen nahe, dass Honigbienen möglicherweise direkt zwischen Monosacchariden und Disacchariden bzw. Zuckermolekülen und damit zwischen ihrer Nahrung (Honig und Nektar) unterscheiden können. KW - Biene KW - Apis mellifera KW - responsiveness KW - honeybee KW - sugar receptor KW - sugar perception (fructose, sucrose) KW - AmGr1, AmGr2, AmGr3 KW - PER KW - division of labor KW - CRISPR/Cas9 KW - bitter taste Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-321873 ER - TY - THES A1 - Schurr, Yvonne T1 - Studies on the role of cytoskeletal-regulatory and -crosslinking proteins in platelet function T1 - Studien zur Rolle von Zytoskelett-regulierenden und -vernetzenden Proteinen in der Thrombozytenfunktion N2 - Cytoskeletal reorganization in platelets is highly regulated and important for proper platelet function during activation and aggregation at sites of vascular injury. In this thesis, the role of three different cytoskeletal-regulatory and -crosslinking proteins was studied in platelet physiology using megakaryocyte- and platelet-specific knockout mice. The generation of branched actin filaments is regulated by nucleation promoting factors (NPF) and the Arp2/3 complex. (1.) The WAVE complex is a NPF, which upregulates the Arp2/3 complex activity at the plasma membrane. As shown in this thesis, the loss of the WAVE complex subunit Cyfip1 in mice did not alter platelet production and had only a minor impact on platelet activation. However, Cyfip1 played an essential role for branching of actin filaments and consequently for lamellipodia formation in vitro. The importance of lamellipodia for thrombus formation and stability has been controversially discussed. Cyfip1-deficient platelets were able to form a stable thrombus ex vivo and in vivo and a hemostatic plug comparable to controls. Moreover, Cyfip1-deficient mice maintained vascular integrity at the site of inflammation. These data show that platelet lamellipodia formation is not required for hemostatic function and pathophysiological thrombus formation. (2.) The WASH complex is another NPF, which mediates actin filament polymerization on endosomal vesicles via the Arp2/3 complex. Loss of the WASH complex subunit Strumpellin led to a decreased protein abundance of the WASH protein and to a 20% reduction in integrin αIIbβ3 surface expression on platelets and megakaryocytes, whereas the expression of other surface receptors as well as the platelet count, size, ex vivo thrombus formation and bleeding time remained unaltered. These data point to a distinct role of Strumpellin in maintaining integrin αIIbβ3 expression and provide new insights into regulatory mechanisms of platelet integrins. (3.) MACF1 has been described as a cytoskeletal crosslinker of microtubules and F-actin. However, MACF1-deficient mice displayed no alterations in platelet production, activation, thrombus formation and hemostatic function. Further, no compensatory up- or downregulation of other proteins could be found that contain an F-actin- and a microtubule-binding domain. These data indicate that MACF1 is dispensable for platelet biogenesis, activation and thrombus formation. Nevertheless, functional redundancy among different proteins mediating the cytoskeletal crosstalk may exist. N2 - Sowohl bei der Thrombozytenproduktion als auch bei der Thrombozytenaktivierung nach einer Gefäßverletzung findet eine schnelle Umstrukturierung des Zytoskeletts statt, bei der Zytoskelett-regulierenden Proteine eine wichtige Rolle spielen. In dieser Dissertation wurde die Rolle von drei verschiedenen Zytoskelett-regulierenden und vernetzenden Proteinen in der Thrombozytenphysiologie mittels Megakaryozyten- und Thrombozyten-spezifischen knockout Mäusen untersucht. Die Bildung von verzweigten Aktinfilamenten wird durch Nucleation promoting factors (NPF) und den Arp2/3-Komplex gesteuert. (1.) Der WAVE-Komplex ist ein NPF der die Aktivität des Arp2/3-Komplexes an der Plasmamembran reguliert. Wie in dieser Arbeit gezeigt, hatte die Defizienz der WAVE-Komplex-Untereinheit Cyfip1 keinen Einfluss auf die Thrombozytenproduktion und nur einen geringen Einfluss auf die Thrombozytenaktivierung. Cyfip1 spielte jedoch eine wesentliche Rolle für die Verzweigung von Aktinfilamenten und folglich für die in vitro Bildung von Lamellipodien. Die Bedeutung der Lamellipodienausbildung in Thrombozyten für die Thrombusbildung und –stabilität wurde bisher kontrovers diskutiert. Thrombozyten von Cyfip1-defizienten Mäusen bildeten ex vivo und in vivo einen stabilen Thrombus und einen hämostatischen Blutpfropfen, vergleichbar zu Thrombozyten von Kontrollmäusen. Darüber hinaus konnten Cyfip1-defiziente Mäuse die Gefäßintegrität am Ort der Entzündung aufrechterhalten. Diese Daten zeigen, dass die Ausbildung von Lamellipodien sowohl für die hämostatische Funktion als auch für die pathologische Thrombusbildung nicht erforderlich ist. (2.) Der WASH-Komplex ist ein weiterer NPF, der die Polymerisation von Aktinfilamenten an endosomalen Vesikeln über den Arp2/3-Komplex vermittelt. Die Defizienz der WASH-Komplexuntereinheit Strumpellin führte zu einer verringerten WASH- Proteinkonzentration und resultierte in einer Abnahme der Oberflächenexpression des αIIbβ3-Integrins um 20 %, wohingegen die Expression anderer Oberflächenrezeptoren sowie die Thrombozytenzahl, -größe, ex vivo Thrombusbildung und die Blutungszeit unverändert blieb. Diese Daten weisen auf eine wichtige Rolle von Strumpellin bei der Aufrechterhaltung der αIIbβ3-Integrin Expression hin und liefern neue Erkenntnisse über Regulationsmechanismen von Integrinen in Thrombozyten. (3.) MACF1 wurde aufgrund seiner Interaktion mit Mikrotubuli- und Aktinfilamenten als Zytoskelett-vernetzendes Protein beschrieben. Bei MACF1-defizienten Mäusen wurden jedoch keine Veränderungen bei der Thrombozytenproduktion, Aktivierung, Thrombusbildung und der hämostatischen Funktion festgestellt. Des Weiteren wurde keine kompensatorische Hoch- oder Herunterregulation anderer Proteine gefunden, welche ebenfalls eine F-Aktin- und eine Mikrotubuli-Bindungsdomäne besitzen. Diese Daten deuten darauf hin, dass MACF1 keine essentiellen Funktionen in Thrombozyten übernimmt. Nichtsdestotrotz besteht möglicherweise eine funktionelle Redundanz zwischen verschiedenen Proteinen, die Zytoskelett-vernetzende Interaktionen vermitteln. KW - Cytoskeleton KW - Platelet KW - Zellskelett Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-218924 ER -