TY - THES A1 - Zipplies, Theresa Leonora T1 - Fluoreszenzmarkierte Nanogele auf Poly(glycidol)-Basis - Herstellung, Charakterisierung und deren Interaktion in vitro T1 - Fluorescent Poly(glycidol)-based Nanogels - Synthesis, characterization and their interactions in vitro N2 - Ziel dieser Arbeit war die Herstellung fluoreszent markierter Präpolymere sowie deren Optimierung, die kontrollierte und reproduzierbare Synthese von redox-sensitiven und nicht redox-sensitiven NG mit und ohne Fluoreszenzmarkierung in einem durchschnittlichen Partikelgrößenbereich von 150 – 300 nm und mit einer Konzentration > 10*10 Partikel/ml, die Charakterisierung der NG, ihre Untersuchung bezüglich ihrer Stabilität und des Assoziationsverhaltens zu BSA sowie die Erlangung von Erkenntnissen bezüglich des Aufnahmemechanismus der NG in Abhängigkeit vom Transportpeptid Tat. Abschließend kann zusammenfassend gesagt werden: 1. Das große Potential von PG-basierten NG für biologische bzw. medizinische Einsatzgebiete konnte weiter untermauert werden. 2. Das mit Cy5-Alkin markierte PG PG-SH-Cy5 erscheint aufgrund des relativ hohen erreichten Markierungsgrades bei der Herstellung als aussichtsreichster Kandidat für weitere Untersuchungen. Diese Umsetzung besitzt noch Optimierungspotentiale bezüglich einer Verringerung des Polymerverlusts bei der Aufarbeitung, des erreichbaren Markierungsgrades und der Markierungsausbeute. Möglichkeiten, dies zu erreichen, wurden diskutiert. 3. Klare Aussagen über den Einfluss des esterhaltigen bzw. esterfreien Ausgangspolymers PG-SH auf die Konzentration und die Partikelgröße konnten aufgrund einer nicht ausreichenden Datenlage nicht getroffen werden. 4. Die esterhaltigen PG-SH-Moleküle erscheinen aufgrund ihrer Labilität gegenüber Hydrolyse für die NP-Synthese weniger geeignet (geringere Stabilität). 5. Die Charakterisierung der aus den markierten und unmarkierten Ausgangspolymeren hergestellten NG, welche teilweise zusätzlich mit dem Transportpeptid Tat funktionalisiert wurden, erfolgte mittels NTA und zeigt für die meisten Spezies relativ schmale, gut definierte, monomodale Größenverteilungen mit einem Maximum um 100-200 nm im Bereich von ca. 40 – max. 400 nm mit Partikelkonzentrationen im Bereich von 1010 - 1011 Partikeln/ml. 6. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass der untersuchte, von PG-SH abgeleitete NP-Typ (z. B. NG_3, redox-sensitiv unmarkiert) aufgrund seiner Einheitlichkeit, Partikelgröße und der Reproduzierbarkeit der Herstellung als gut geeignet für den geplanten Einsatz in biologischen Systemen erscheint. Von den weiter derivatisierten NG erscheinen die folgenden aufgrund der oben geschilderten Kriterien als besonders geeignet für den geplanten Einsatz in biologischen Systemen und weiterer Untersuchungen wert: NG680_(TAT)_1-4 (redox-sensitiv, markiert), NGCy5_(TAT)_1 (redox-sensitiv, markiert), NG_MA_2 (nicht redox-sensitiv, unmarkiert), NGCy7_MA_1 (nicht redox-sensitiv, markiert). Aufgrund des relativ hohen erreichbaren Markierungsgrades bei der Markierung der Ausgangspolymere erscheinen die mit Cy5-markierten Verbindungen als besonders vorteilhaft. 7. Die esterfreien, redox-sensitiven NP erwiesen sich bei 14-tägiger Lagerung unter physiologischen Bedingungen als stabil. Ihre Konzentration nahm über 14 Tage um ca. 60 % vom Ausgangswert ab. Gleichzeitig nahm der Teilchendurchmesser während des Beobachtungszeitraums um ca. 25 % zu. Die Abnahme der Teilchenzahl ist - zumindest teilweise - durch eine Vergrößerung des mittleren Teilchendurchmessers und mögliche Adsorptionseffekte an die Gefäßwände des Versuchsaufbaus zu erklären. 8. Die Konzentration der esterfreien, nicht redox-sensitiven NP verringert sich bei 14-tägiger Inkubation unter physiologischen Bedingungen deutlich auf ca. 10 % des Ausgangswerts. Der mittlere Durchmesser der Partikel bleibt innerhalb des Untersuchungszeitraums innerhalb der Fehlergrenzen konstant. Die starke Abnahme der Partikelkonzentration ist wahrscheinlich auf die Hydrolyse des verwendeten esterhaltigen Crosslinkers PEGDA zurückzuführen. Desweiteren sind Adsorptionsphänomene an Oberflächen des Versuchsaufbaus nicht auszuschließen. Insgesamt hervorzuheben ist die wesentlich höhere Stabiliät der redox-sensitiven NP unter den Versuchsbedingungen. Diese Substanzklasse sollte daher weiter verfolgt werden. 9. Es wurde gezeigt, dass sowohl die NG, die das Aufnahmeprotein Tat enthalten, als auch die NG ohne Tat mit Fluoreszenz-markiertem BSA (8,3 µg/ml) wechselwirken und zusammen mit diesem bei der Zentrifugation abgeschieden werden. Über die Art der Wechselwirkung kann keine Aussage getroffen werden. 10. Durch in vitro Zellaufnahmeuntersuchungen an Hela-Zellen konnte gezeigt werden, dass die mit Tat funktionalisierten, redox-sensitiven, Fluoreszenz-markierten NP von den Zellen aufgenommen werden. Die Aufnahme erfolgt über eine deutlich erkennbare Vesikelbildung, die an der Plasmamembran verstärkt beobachtet werden kann. Im Gegensatz hierzu konnte bei den nicht mit Tat funktionalisierten NP keine vergleichbare in vitro Zellaufnahme beobachtet werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen insgesamt das große Potential der von Thiol-funktionalisierten PG abgeleiteten NG für die medizinische Forschung und zukünftige Anwendungen in der Diagnostik und Therapie. Es wird eine Reihe von Ansatzpunkten aufgezeigt, auf deren Basis weitere vertiefende Untersuchungen zur Charakterisierung und Optimierung sowie zu zukünftigen nutzbringenden Anwendungen vorgenommen werden sollten. N2 - Summary: Fluorescent Poly(glycidol)-based Nanogels - Synthesis, characterization and their interactions in vitro KW - Nanoparticles KW - Pharmaceutics KW - Nanopartikelcharakterisierung KW - Nanohydrogel KW - Polyglycidol KW - Nanoparticle Tracking Analysis KW - Fluoreszenzmarkierung Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-162645 ER - TY - THES A1 - Zimmermann, Sabine Annette T1 - Mechanisch stabile Magnesiumphosphatschäume und deren Zytokompatibilität T1 - Mechanically stable magnesium phosphate scaffolds and their cytocompatibility N2 - Magnesiumphosphatschäume nehmen auf Grund ihrer guten Resorbierbarkeit, unter physiologischen Bedingungen, einen immer größeren Stellenwert als Knochenersatzmaterial ein. Ein weiterer Vorteil ist der neutrale pH-Wert den das entstehende Material besitzt. Magnesiumphosphatschäume besitzen eine hochporöse offenporige Struktur um zum einen den Knochen nachzuahmen und zum anderen die Steuerung und Bildung von Knochengewebe zu ermöglichen. In der vorliegenden Arbeit wurden die mechanischen Eigenschaften als auch die Zytokompatibilität der hergestellten Schäume untersucht. Es wurden unterschiedliche Herstellungsverfahren genutzt um Magnesiumphosphatschäume zu erhalten. Zum einen das Replika- Verfahren, die dabei entstandenen Farringtonit Schäume (Mg3(PO4)2, Farringtonit) wurden zu Struvit ((NH4)Mg(PO4)•6H2O) umgewandelt bzw. mit PLGA infiltriert und auf ihre mechanische Eigenschaften hin untersucht. Zum anderen wurde ein proteinbasierter Schaumbildner verwendet. Die Zytokompatibilitätsprüfung wurde mit der Osteosarkomzelllinie MG-63 durchgeführt. Es erfolgte die Untersuchung der Zellproliferation und der Zellaktivität (WST). Zudem wurden Proben mittels Licht- und Elektronenmikroskopie analysiert. Die Feststellung der Proteinexpression erfolgte nach gelelektrophoretischer Auftrennung mittels Western Blot und PCR Analyse. N2 - Mg-phosphate ceramics have gained growing interest as bone replacement materials due to their ability to degrade under physiological conditions. Another advantage of these materials is the setting at neutral pH value since the powder as well as the liquid component are non acidic. In order to mimic cancellous bone and to promote tissue repair mechanisms a highly macroporous structure with open cells is desired to allow cell ingrowth. The mechanical properties and the cytocompatibility of newly developed scaffolds were analyzed in this study. Open porous magnesiumphosphate scaffolds were produced by the Replika-technique and by a protein based foam generating agent. Farringtonite scaffolds (Mg3(PO4)2, farringtonite) were modified by transformation to struvite ((NH4)Mg(PO4)•6H2O) or infiltrated with PLGA. Physical sample characterization was done. Cytocompatibility was tested using osteoblasts like cell line MG63. Cell number and cell activity (WST) were tested. The surface dependent expression of osteoblast specific proteins as well as an indicator for adhesion were tested. KW - Magnesiumphosphate KW - Magnesiumphosphatschäume Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-114055 ER - TY - THES A1 - Youssef, Almoatazbellah T1 - Fabrication of Micro-Engineered Scaffolds for Biomedical Application T1 - Fabrikation von Scaffolds mit optimierter Mikroarchitektur für biomedizinische Anwendungen N2 - Thermoplastic polymers have a history of decades of safe and effective use in the clinic as implantable medical devices. In recent years additive manufacturing (AM) saw increased clinical interest for the fabrication of customizable and implantable medical devices and training models using the patients’ own radiological data. However, approval from the various regulatory bodies remains a significant hurdle. A possible solution is to fabricate the AM scaffolds using materials and techniques with a clinical safety record, e.g. melt processing of polymers. Melt Electrowriting (MEW) is a novel, high resolution AM technique which uses thermoplastic polymers. MEW produces scaffolds with microscale fibers and precise fiber placement, allowing the control of the scaffold microarchitecture. Additionally, MEW can process medical-grade thermoplastic polymers, without the use of solvents paving the way for the production of medical devices for clinical applications. This pathway is investigated in this thesis, where the layout is designed to resemble the journey of a medical device produced via MEW from conception to early in vivo experiments. To do so, first, a brief history of the development of medical implants and the regenerative capability of the human body is given in Chapter 1. In Chapter 2, a review of the use of thermoplastic polymers in medicine, with a focus on poly(ε-caprolactone) (PCL), is illustrated, as this is the polymer used in the rest of the thesis. This review is followed by a comparison of the state of the art, regarding in vivo and clinical experiments, of three polymer melt AM technologies: melt-extrusion, selective laser sintering and MEW. The first two techniques already saw successful translation to the bedside, producing patient-specific, regulatory-approved AM implants. To follow in the footsteps of these two technologies, the MEW device parameters need to be optimized. The MEW process parameters and their interplay are further discussed in Chapter 3 focusing on the importance of a steady mass flow rate of the polymer during printing. MEW reaches a balance between polymer flow, the stabilizing electric field and moving collector to produce reproducible, high-resolution scaffolds. An imbalance creates phenomena like fiber pulsing or arcing which result in defective scaffolds and potential printer damage. Chapter 4 shows the use of X-ray microtomography (µCT) as a non-destructive method to characterize the pore-related features: total porosity and the pore size distribution. MEW scaffolds are three-dimensional (3D) constructs but have long been treated in the literature as two-dimensional (2D) ones and characterized mainly by microscopy, including stereo- and scanning electron microscopy, where pore size was simply reported as the distance between the fibers in a single layer. These methods, together with the trend of producing scaffolds with symmetrical pores in the 0/90° and 0/60/120° laydown patterns, disregarded the lateral connections between pores and the potential of MEW to be used for more complex 3D structures, mimicking the extracellular matrix. Here we characterized scaffolds in the aforementioned symmetrical laydown patterns, along with the more complex 0/45/90/135° and 0/30/60/90/120/150° ones. A 2D pore size estimation was done first using stereomicroscopy, followed by and compared to µCT scanning. The scaffolds with symmetrical laydown patterns resulted in the predominance of one pore size, while those with more complex patterns had a broader distribution, which could be better shown by µCT scans. Moreover, in the symmetrical scaffolds, the size of 3D pores was not able to reach the value of the fiber spacing due to a flattening effect of the scaffold, where the thickness of the scaffold was less than the fiber spacing, further restricting the pore size distribution in such scaffolds. This method could be used for quality assurance of fabricated scaffolds prior to use in in vitro or in vivo experiments and would be important for a clinical translation. Chapter 5 illustrates a proof of principle subcutaneous implantation in vivo experiment. MEW scaffolds were already featured in small animal in vivo experiments, but to date, no analysis of the foreign body reaction (FBR) to such implants was performed. FBR is an immune reaction to implanted foreign materials, including medical devices, aimed at protecting the host from potential adverse effects and can interfere with the function of some medical implants. Medical-grade PCL was used to melt electrowrite scaffolds with 50 and 60 µm fiber spacing for the 0/90° and 0/60/120° laydown patterns, respectively. These implants were implanted subcutaneously in immunocompetent, outbred mice, with appropriate controls, and explanted after 2, 4, 7 and 14 days. A thorough characterization of the scaffolds before implantation was done, followed by a full histopathological analysis of the FBR to the implants after excision. The scaffolds, irrespective of their pore geometry, induced an extensive FBR in the form of accumulation of foreign body giant cells around the fiber walls, in a manner that almost occluded available pore spaces with little to no neovascularization. This reaction was not induced by the material itself, as the same reaction failed to develop in the PCL solid film controls. A discussion of the results was given with special regard to the literature available on flat surgical meshes, as well as other hydrogel-based porous scaffolds with similar pore sizes. Finally, a general summary of the thesis in Chapter 6 recapitulates the most important points with a focus on future directions for MEW. N2 - Thermoplastische Polymere werden seit Jahrzehnten erfolgreich in der Klinik eingesetzt und für die Herstellung von Medizinprodukten verwendet. Vorangetrieben durch das zunehmende klinische Interesse an additiven Fertigungsverfahren, z.B. zur Herstellung patientenspezifischer Trainingsmodelle und implantierbarer Medizinprodukte, rücken thermoplastische Materialien noch mehr in den Fokus der klinischen Forschung. Allerdings stellt die Marktzulassung durch die verschiedenen Gesundheitsbehörden eine große Hürde dar. Eine mögliche Lösung ist die Gerüstfabrikation mit Materialien und Verfahren, die bereits etablierte Sicherheitsstandards durchlaufen haben, z. B. die Schmelzverarbeitung der Polymere. Ein neuartiges und hochauflösendes additives Fertigungsverfahren, welches die Verarbeitung von Thermoplasten ermöglicht, ist Melt Electrowriting (MEW). Mittels MEW lassen sich Gerüste, die aus Fasern mit Durchmessern im Mikrometerbereich zusammengesetzt sind, herstellen. Neben der hohen Kontrolle über den Faserdurchmesser ermöglicht MEW auch eine genaue Ablage der Fasern und erlaubt dadurch, die Mikroarchitektur der Konstrukte vorzugeben. Zudem kann das Verfahren medizinisch zugelassene thermoplastische Polymere ohne die Verwendung von Lösungsmitteln verarbeiten und ist somit für die Herstellung medizinischer Produkte sehr relevant. Diese Relevanz sollte im Rahmen der vorliegenden Dissertation evaluiert werden, indem der Weg, den ein Medizinprodukt von der Konzeption bis hin zu in vivo Vorversuchen durchlaufen muss, anhand von Konstrukten, die mittels MEW hergestellt wurden, nachgeahmt wurde. Um eine Basis für das Verständnis dieses Prozesses zu schaffen, wird in Kapitel 1 erst die Geschichte der Entwicklung medizinischer Implantate zusammengefasst sowie ein Einblick in die regenerativen Fähigkeiten des menschlichen Körpers gegeben. Das zweite Kapitel befasst sich mit der Anwendung von thermoplastischen Polymeren im Bereich implantierbarer Medizinprodukte, wobei der Hauptfokus auf Poly(ε-caprolactone) (PCL) liegt, da dies der in der vorliegenden Arbeit verwendete Thermoplast ist. Es folgt ein Vergleich von in vivo sowie klinischen Versuchen dreier für die Biomedizin relevanten additiven Fertigungsverfahren, mit denen sich thermoplastische Polymere verarbeiten lassen: Die Mikro-Schmelzextrusion, das selektive Lasersintern und das MEW. Die ersten zwei Verfahren sind bereits erfolgreich in klinischen Anwendungen etabliert und ermöglichen die routinemäßige Herstellung von additiv gefertigten, patientenspezifischen, auf dem Markt zugelassenen Implantaten. Damit MEW in diese Fußstapfen treten kann, müssen die Prozessparameter und deren Zusammenspiel genau analysiert werden. Dieser Thematik widmet sich Kapitel 3, wobei die Untersuchung des Massendurchsatzes des Polymers während des Druckens diskutiert wird. Um den MEW-Prozess kontrollieren zu können, muss eine Balance zwischen Polymerdurchsatz, dem stabilisierenden elektrischen Feld und dem beweglichen Kollektor erreicht werden. Dies ist Grundlage für die reproduzierbare Herstellung hochaufgelöster Konstrukte. Ein Ungleichgewicht der Prozessparameter verursacht Phänomene wie Fiber Pulsing oder sogar elektrischen Durchschlag, welche zu defekten Konstrukten oder sogar zur Schädigung des Druckers führen können. Kapitel 4 zeigt die Anwendung der Röntgenmikrocomputertomographie (µCT) als eine zerstörungsfreie Charakterisierungsmethode für MEW-Konstrukte, die die Quantifizierung charakteristischer Eigenschaften wie der Porosität und der Porengrößenverteilung ermöglicht. MEW-Konstrukte wurden in der Literatur lange als zweidimensional behandelt und hauptsächlich durch mikroskopische Verfahren wie die Stereo- und Rasterelektronmikroskopie charakterisiert. Die zweidimensionale Porengröße wurde hauptsächlich durch die Bestimmung des Faserabstands definiert und daraus errechnet, mit einer Tendenz der Herstellung der Konstrukte mit symmetrischen Poren in 0/90° und 0/60/120° Ablagemustern. Da es sich bei den Konstrukten jedoch um dreidimensionale (3D) Fasergerüste handelt, wurden die seitlichen Verbindungen zwischen den Poren und das Potential der Anwendung des MEW für die Herstellung von komplexeren 3D-Strukturen, wie bei der extrazellulären Matrix mit interkonnektierenden Poren, vernachlässigt. Aus diesem Grund wurden in der vorliegenden Arbeit µCT-Scans verwendet, um die Porosität der Konstrukte besser wiedergeben zu können. Hierzu wurden verschiedene Ablagemuster mit symmetrischen Poren in 0/90° und 0/60/120° Mustern und komplexere Porenstrukturen durch Ablagen von 0/45/90/135° und 0/30/60/90/120/150° Geometrien hergestellt. Diese Konstrukte wurden dann mittels mikroskopischer und tomographischer Aufnahmen charakterisiert und die Ergebnisse miteinander verglichen. Es zeigte sich, dass symmetrische Ablagemuster zu Konstrukten mit der Prädominanz einer Porengröße geführt haben. Bei den komplexeren Strukturen ergab sich jedoch ein klarer Unterschied, weil die interkonnektierenden Poren nur mit Hilfe von µCT-Scans erfasst werden konnten. Dies zeigte sich durch eine breitere Porenverteilung bei der Auswertung der rekonstruierten Scans. Die Porengrößen in den Konstrukten mit den symmetrischen Mustern konnten aufgrund einer Verflachungswirkung nicht die des Faserabstands erreichen. Die Dicke der Konstrukte war geringer als der Faserabstand mit einer weiteren einschränkenden Wirkung auf die Porenverteilung in den symmetrischen Konstrukten. µCT kann deshalb für die Qualitätssicherung von medizinischen Produkten, die mittels MEW hergestellt wurden, eingesetzt werden. Da die Methode zerstörungsfrei ist, könnte sie auch vor in vitro oder in vivo Versuchen verwendet werden. Kapitel 5 präsentiert eine Machbarkeitsstudie eines subkutanen in vivo Implantationsversuchs. Aus der Literatur ist zwar bekannt, dass MEW-Konstrukte bereits in vivo in Kleintierversuchen verwendet wurden, eine Analyse der Fremdkörperreaktion (FKR) zu solchen Implantaten wurde bisher jedoch noch nicht durchgeführt. FKR ist eine Immunreaktion gegen fremde, implantierte Materialien, einschließlich medizinischer Geräte, um den Wirt vor potenziellen Nebenwirkungen zu schützen. Allerdings könnte sie die Funktion verschiedener medizinischer Implantate beeinträchtigen Um dieser Fragestellung nachzugehen, wurde im Rahmen der vorliegenden Dissertation PCL mittels MEW zu Konstrukten mit 50 und 60 µm Fiberabstand in 0/90° bzw. 0/60/120° Ablagemuster verarbeitet. Diese Konstrukte wurden subkutan in immunkompetente, fremdgezüchtete Mäuse mit entsprechenden Kontrollen implantiert und nach 2, 4, 7 und 14 Tagen explantiert. Vor der Implantation wurde die Konstrukte ausführlich charakterisiert, gefolgt von einer vollen histopathologischen Analyse des FKR. Unabhängig von der Porengeometrie haben die Konstrukte eine deutliche Immunreaktion im Sinne einer Ansammlung von Fremdkörperriesenzellen um die Fasern der Konstrukte hervorgerufen. Hierbei wurden die Poren fast komplett verschlossen, ohne dass es zu einer Neovaskularisation kam. Es konnte nachgewiesen werden, dass die deutliche Immunantwort nicht durch das Material hervorgerufen wurde, da sie bei der Implantation von dichtem PCL-Film nicht beobachtet wurde. Eine Diskussion der Ergebnisse erfolgte unter Berücksichtigung aktueller Literatur zu klinischen Versuchen von flachen chirurgischen Netzen sowie porösen Hydrogel-basierten Implantaten mit vergleichbarer Porengröße. Abschließend wird die Arbeit in Kapitel 6 zusammengefasst und die wichtigsten Punkte rekapituliert. Der Fokus des Kapitels liegt hierbei auf dem zukünftigen Potential des MEW als Fabrikationsmethode für medizinische Produkte. KW - melt electrowriting KW - medical device KW - biomaterials KW - subcutaneous implanation KW - x-ray micro computed tomography Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-235457 ER - TY - THES A1 - Wittmann, Katharina T1 - Adipose Tissue Engineering - Development of Volume-Stable 3-Dimensional Constructs and Approaches Towards Effective Vascularization T1 - Tissue Engineering von Fettgewebe - Generierung volumenstabiler 3-dimensionaler Fettgewebe-Konstrukte und Entwicklung effektiver Vaskularisierungsstrategien N2 - Adipose tissue defects and related pathologies still represent major challenges in reconstructive surgery. Based on to the paradigm ‘replace with alike’, adipose tissue is considered the ideal substitute material for damaged soft tissue [1-3]. Yet the transfer of autologous fat, particularly larger volumes, is confined by deficient and unpredictable long term results, as well as considerable operative morbidity at the donor and recipient site [4-6], calling for innovative treatment options to improve patient care. With the aim to achieve complete regeneration of soft tissue defects, adipose tissue engineering holds great promise to provide functional, biologically active adipose tissue equivalents. Here, especially long-term maintenance of volume and shape, as well as sufficient vascularization of engineered adipose tissue represent critical and unresolved challenges [7-9]. For adipose tissue engineering approaches to be successful, it is thus essential to generate constructs that retain their initial volume in vivo, as well as to ensure their rapid vascularization to support cell survival and differentiation for full tissue regeneration [9,10]. Therefore, it was the ultimate goal of this thesis to develop volume-stable 3D adipose tissue constructs and to identify applicable strategies for sufficient vascularization of engineered constructs. The feasibility of the investigated approaches was verified by translation from in vitro to in vivo as a critical step for the advancement of potential regenerative therapies. For the development of volume-stable constructs, the combination of two biomaterials with complementary properties was successfully implemented. In contrast to previous approaches in the field using mainly non-degradable solid structures for mechanical protection of developing adipose tissue [11-13], the combination of a cell-instructive hydrogel component with a biodegradable porous support structure of adequate texture was shown advantageous for the generation of volume-stable adipose tissue. Specifically, stable fibrin hydrogels previously developed in our group [14] served as cell carrier and supported the adipogenic development of adipose-derived stem cells (ASCs) as reflected by lipid accumulation and leptin secretion. Stable fibrin gels were thereby shown to be equally supportive of adipogenesis compared to commercial TissuCol hydrogels in vitro. Using ASCs as a safe source of autologous cells [15,16] added substantial practicability to the approach. To enhance the mechanical strength of the engineered constructs, porous biodegradable poly(ε caprolactone)-based polyurethane (PU) scaffolds were introduced as support structures and shown to exhibit adequately sized pores to host adipocytes as well as interconnectivity to allow coherent tissue formation and vascularization. Low wettability and impaired cell attachment indicated that PU scaffolds alone were insufficient in retaining cells within the pores, yet cytocompatibility and differentiation of ASCs were adequately demonstrated, rendering the PU scaffolds suitable as support structures for the generation of stable fibrin/PU composite constructs (Chapter 3). Volume-stable adipose tissue constructs were generated by seeding the pre-established stable fibrin/PU composites with ASCs. Investigation of size and weight in vitro revealed that composite constructs featured enhanced stability relative to stable fibrin gels alone. Comparing stable fibrin gels and TissuCol as hydrogel components, it was found that TissuCol gels were less resilient to degradation and contraction. Composite constructs were fully characterized, showing good cell viability of ASCs and strong adipogenic development as indicated by functional analysis via histological Oil Red O staining of lipid vacuoles, qRT-PCR analysis of prominent adipogenic markers (PPARγ, C/EBPα, GLUT4, aP2) and quantification of leptin secretion. In a pilot study in vivo, investigating the suitability of the constructs for transplantation, stable fibrin/PU composites provided with a vascular pedicle gave rise to areas of well-vascularized adipose tissue, contrasted by insufficient capillary formation and adipogenesis in constructs implanted without pedicle. The biomaterial combination of stable fibrin gels and porous biodegradable PU scaffolds was thereby shown highly suitable for the generation of volume-stable adipose tissue constructs in vivo, and in addition, the effectiveness of immediate vascularization upon implantation to support adipose tissue formation was demonstrated (Chapter 4). Further pursuing the objective to investigate adequate vascularization strategies for engineered adipose tissue, hypoxic preconditioning was conducted as a possible approach for in vitro prevascularization. In 2D culture experiments, analysis on the cellular level illustrated that the adipogenic potential of ASCs was reduced under hypoxic conditions when applied in the differentiation phase, irrespective of the oxygen tension encountered by the cells during expansion. Hypoxic treatment of ASCs in 3D constructs prepared from stable fibrin gels similarly resulted in reduced adipogenesis, whereas endothelial CD31 expression as well as enhanced leptin and vascular endothelial growth factor (VEGF) secretion indicated that hypoxic treatment indeed resulted in a pro-angiogenic response of ASCs. Especially the observed profound regulation of leptin production by hypoxia and the dual role of leptin as adipokine and angiogenic modulator were considered an interesting connection advocating further study. Having confirmed the hypothesis that hypoxia may generate a pro-angiogenic milieu inside ASC-seeded constructs, faster vessel ingrowth and improved vascularization as well as an enhanced tolerance of hypoxia-treated ASCs towards ischemic conditions upon implanatation may be expected, but remain to be verified in rodent models in vivo (Chapter 5). Having previously been utilized for bone and cartilage engineering [17-19], as well as for revascularization and wound healing applications [20-22], stromal-vascular fraction (SVF) cells were investigated as a novel cell source for adipose tissue engineering. Providing cells with adipogenic differentiation as well as vascularization potential, the SVF was applied with the specific aim to promote adipogenesis and vascularization in engineered constructs in vivo. With only basic in vitro investigations by Lin et al. addressing the SVF for adipose repair to date [23], the present work thoroughly investigated SVF cells for adipose tissue construct generation in vitro, and in particular, pioneered the application of these cells for adipose tissue engineering in vivo. Initial in vitro experiments compared SVF- and ASC-seeded stable fibrin constructs in different medium compositions employing preadipocyte (PGM-2) and endothelial cell culture medium (EGM-2). It was found that a 1:1 mixture of PGM-2 and EGM-2, as previously established for co-culture models of adipogenesis [24], efficiently maintained cells with adipogenic and endothelial potential in SVF-seeded constructs in short and long-term culture setups. Observations on the cellular level were supported by analysis of mRNA expression of characteristic adipogenic and endothelial markers. In preparation of the evaluation of SVF-seeded constructs under in vivo conditions, a whole mount staining (WMS) method, facilitating the 3D visualization of adipocytes and blood vessels, was successfully established and optimized using native adipose tissue as template (Chapter 6). In a subcutaneous nude mouse model, SVF cells were, for the first time in vivo, elucidated for their potential to support the functional assembly of vascularized adipose tissue. Investigating the effect of adipogenic precultivation of SVF-seeded stable fibrin constructs in vitro prior to implantation on the in vivo outcome, hormonal induction was shown beneficial in terms of adipocyte development, whereas a strong vascularization potential was observed when no adipogenic inducers were added. Via histological analysis, it was proven that the developed structures were of human origin and derived from the implanted cells. Applying SVF cells without precultivation in vitro but comparing two different fibrin carriers, namely stable fibrin and TissuCol gels, revealed that TissuCol profoundly supported adipose formation by SVF cells in vivo. This was contrasted by only minor SVF cell development and a strong reduction of cell numbers in stable fibrin gels implanted without precultivation. Histomorphometric analysis of adipocytes and capillary structures was conducted to verify the qualitative results, concluding that particularly SVF cells in TissuCol were highly suited for adipose regeneration in vivo. Employing the established WMS technique, the close interaction of mature adipocytes and blood vessels in TissuCol constructs was impressively shown and via species-specific human vimentin staining, the expected strong involvement of implanted SVF cells in the formation of coherent adipose tissue was confirmed (Chapter 7). With the development of biodegradable volume-stable adipose tissue constructs, the application of ASCs and SVF cells as two promising cell sources for functional adipose regeneration, as well as the thorough evaluation of strategies for construct vascularization in vitro and in vivo, this thesis provides valuable solutions to current challenges in adipose tissue engineering. The presented findings further open up new perspectives for innovative treatments to cure soft tissue defects and serve as a basis for directed approaches towards the generation of clinically applicable soft tissue substitutes. N2 - In der rekonstruktiven Chirurgie besteht ein ständig wachsender Bedarf an geeigneten Implantaten, um Weichteildefekte nach Tumorresektionen, Traumata, oder aufgrund von kongenitalen Missbildungen adäquat ersetzen zu können [1]. Hierbei stellt körpereigenes Fettgewebe als Weichteilersatz das ideale Substitutionsmaterial dar [2-4]. Derzeit angewandte Wiederherstellungsmethoden verwenden frei transplantierbare und gestielte Lappenplastiken aus autologem Fettgewebe oder greifen auf künstliche Kollagen- und Silikonimplantate zurück [5]. Diese Ansätze sind jedoch zum Teil mit gravierenden Nachteilen behaftet, wie Absorption und Nekrotisierung bei transplantiertem körpereigenem Fettgewebe, sowie Fremdkörperreaktionen und fibrotischen Verkapselungen bei Kollagen und Silikon. Insbesondere die Versorgung großvolumiger Defekte ist mit komplexen chirurgischen Eingriffen verbunden und geht häufig mit Komplikationen wie Infektionen, Narbenbildung und Volumenverlust, sowie Defiziten an der Hebe- und Empfängerstelle einher [1,5-8]. Es besteht daher ein großer Bedarf an innovativen Methoden und der Entwicklung neuer Materialien, die einen dauerhaften körpereigenen Weichteilersatz ermöglichen. Das interdisziplinäre Feld des Tissue Engineerings von Fettgewebe zielt auf die Entwicklung neuer Ansätze zur Regeneration von Weichteildefekten und der Bereitstellung von biologisch äquivalentem Gewebeersatz, vor allem für die Rekonstruktion großvolumiger Defekte. Verringerte Volumenstabilität und unzureichende Blutgefäßversorgung stellen jedoch auch bei durch Tissue Engineering hergestelltem Gewebe zentrale Limitationen dar [5,8,9]. Für die erfolgreiche Substitution von Weichteildefekten mit Methoden des Tissue Engineerings ist es daher essenziell, Gewebekonstrukte mit ausreichender Volumenstabilität bereitzustellen, um auch nach Implantation in vivo langfristig zu bestehen, sowie eine adäquate Blutgefäßversorgung zu gewährleisten, um Zellüberleben und Differenzierung für eine vollständige Geweberegeneration zu garantieren [5,10]. Folglich war es Ziel dieser Arbeit, volumenstabile Fettgewebekonstrukte zu entwickeln und neue Strategien zur Vaskularisierung der generierten Konstrukte zu evaluieren. Als wichtiger Schritt in Bezug auf eine potenzielle klinische Anwendbarkeit wurden außerdem vielversprechende In-vitro-Ansätze auf den In-vivo-Kontext in etablierten Mausmodellen übertragen. Für die Entwicklung volumenstabiler Fettgewebekonstrukte wurde die Kombination zweier Biomaterialien mit komplementären Eigenschaften verfolgt. So wurden für die Konstruktherstellung Fibrinhydrogele als Zellträger mit hochporösen bioabbaubaren Scaffolds als mechanische Schutzstrukturen kombiniert. Im Gegensatz zu bisherigen Ansätzen zur Verbesserung der Volumenstabilität, in denen hauptsächlich nicht abbaubare, rigide Gerüst- oder Hohlkörperstrukturen zum mechanischen Schutz des entstehenden Gewebes appliziert wurden [11-13], wurden hier ausschließlich bioabbaubare und Gewebe kompatible Materialien verwendet. Dabei konnte auf bereits zuvor entwickelte stabile Fibringele [14] zurückgegriffen werden, die in dieser Arbeit erstmals für das Fettgewebe Engineering als Zellträger für mesenchymale Stammzellen aus dem Fettgewebe (adipose-derived stem cells; ASCs) verwendet wurden. Mittels sich ergänzender Analysemethoden auf zellulärer (Oil Red O-Färbung) und molekularer Ebene (Leptin Sekretion; ELISA) konnte erfolgreich die adipogene Differenzierung der in den Fibringelen inkorporierten ASCs nachgewiesen werden. Im Vergleich zu kommerziell erhältlichem Fibrin (TissuCol, Baxter) zeigten ASCs in den stabilen Fibringelen eine mit TissuCol vergleichbare, gute adipogene Differenzierbarkeit. Durch die Verwendung von ASCs als sichere und autologe Zellquelle [15,16] für die Konstruktherstellung wurde zudem die potenzielle klinische Anwendbarkeit der generierten Zell-Biomaterial-Konstrukte erhöht. Zur Verbesserung der Volumenstabilität wurden bioabbaubare Poly(ε caprolacton)-basierte Polyurethan-Scaffolds als zusätzliche Gerüststruktur evaluiert. Aufgrund ihrer hohen Porosität und Interkonnektivität stellten sich die Scaffolds als besonders geeignet für die Differenzierung von Adipozyten sowie für die Generierung von kohärentem Fettgewebe heraus. Bei direkter Besiedelung mit ASCs wiesen die PU-Scaffolds zwar eine geringe Zelladhäsion und inhomogene Zellverteilung auf, die adipogene Differenzierung der Zellen war jedoch nicht beeinträchtigt. Daraufhin wurde die Generierung von Fibrin/PU Kompositkonstrukten durch Kombination der PU-Scaffolds mit den zuvor untersuchten stabilen Fibringelen angestrebt (Kapitel 3). Durch Zusammenführung der stabilen Fibringele als Zellträger für ASCs mit den PU Scaffolds als zusätzlicher Gerüststruktur konnten in folgenden Arbeiten erfolgreich homogene und mechanisch stabile Fettgewebekonstrukte hergestellt werden. Die detaillierte Evaluation von Größe und Gewicht zeigte, dass in den Kompositkonstrukten durch die zusätzliche poröse PU-Scaffoldstruktur eine erhöhte Stabilität im Vergleich zu den stabilen Fibringelen als alleinigem Zellträger erreicht werden konnte. Der Vergleich der stabilen Fibringele mit TissuCol als Hydrogelkomponente zeigte, dass TissuCol-Gele unter In vitro Kulturbedingungen stärker kontrahierten und schneller abgebaut wurden. Die in den Kompositkonstrukten inkorporierten ASCs zeigten gute Viabilität sowie deutliche adipogene Differenzierung auf histologischer (Oil Red O-Färbung) als auch auf molekularer Ebene (qRT-PCR; ELISA). In einer In-vivo-Pilotstudie wurden die Kompositkonstrukte auf ihre Transplantierbarkeit hin überprüft und durch mikrochirurgische Insertion eines Durchflussgefäßes bei der Implantation unmittelbar vaskularisiert. In stabilen Fibrin/PU Konstrukten mit integriertem Gefäßstiel wurde so die Entwicklung von vaskularisiertem Fettgewebe im Vergleich zu ungestielten Konstrukten entschieden verbessert. Mittels der erfolgreichen In-vivo-Implantation der Kompositkonstrukte konnte die Anwendbarkeit der Biomaterialkombination aus stabilem Fibrin und porösen PU Scaffolds für die Generierung volumenstabiler Fettgewebekonstrukte demonstriert und gleichzeitig der positive Effekt einer direkten Vaskularisierung durch Integration eines Gefäßstiels gezeigt werden (Kapitel 4). Im Rahmen der weiteren Evaluation potenzieller Vaskularisierungsstrategien wurden im Anschluss Ansätze zur Prävaskularisierung in vitro untersucht. Hierbei stellte die hypoxische Vorkultur von mittels Tissue Engineering generierten Fettgewebekonstrukten einen möglichen Ansatz zur Schaffung eines pro-angiogenen, vaskularisierungsfördernden Milieus innerhalb der Konstrukte dar. Ebenso von Interesse waren in diesem Zusammenhang die Auswirkungen von Hypoxie auf die adipogene Differenzierung von ASCs. Erste Versuche im 2D-Kulturformat mit ASCs zeigten, dass das adipogene Potenzial der Zellen unter Hypoxie in der Differenzierungsphase stark vermindert war, wobei der während der Expansionsphase der Zellen bestehende Sauerstoffpartialdruck keinen Einfluss auf die Fettentwicklung hatte. Auch in 3D-Konstrukten basierend auf stabilen Fibringelen konnte eine verringerte adipogene Differenzierung von ASCs unter hypoxischer Kultur nachgewiesen werden, dabei wurden im Gegenzug endotheliale Marker (CD31) und pro angiogene Wachstumsfaktoren, wie z.B. vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF), aber auch das Adipokin Leptin, stark hochreguliert. Insbesondere die deutliche Veränderung der Leptinsekretion unter hypoxischen Kulturbedingungen und die duale Rolle von Leptin als adipogener und pro-angiogener Faktor ergeben interessante Perspektiven für weiterführende Untersuchungen. Basierend auf den gezeigten Ergebnissen konnte insgesamt bestätigt werden, dass die hypoxische Vorkultur in vitro zur Entstehung eines pro angiogenen und potenziell vaskularisierungsfördernden Milieus beitragen kann. Es gilt nun in Folgestudien das Potenzial der hypoxischen Vorkultur zur Verbesserung der Vaskularisierung in vivo, sowie eine erhöhte Toleranz der implantierten Zellen gegenüber hypoxischen Bedingungen nach der Implantation in etablierten In-vivo-Mausmodellen zu verifizieren (Kapitel 5). Ein weiterer Ansatz zur Generierung von vaskularisiertem Fettgewebe in vitro und in vivo wurde durch den Einsatz der stromalen-vaskulären Fraktion (SVF) als neue Zellquelle für das Fettgewebe-Engineering verfolgt. Bisher wurde die SVF hauptsächlich für das Tissue Engineering von Knochen- und Knorpelgewebe [17-19] oder für Vaskularisierungs- und Wundheilungsansätze [20-22] untersucht. In der SVF enthalten sind sowohl Fettvorläuferzellen als auch Endothelzellen, Perizyten, Fibroblasten und Immunzellen [8]. Durch Verwendung dieses heterogenen Zellgemisches sollte die simultane Entwicklung von Fettzellen und vaskulären Strukturen erreicht werden, und damit eine schnellere und effizientere Fettgewebeentwicklung in vivo. Da sich bisher nur eine In-vitro-Studie explizit dem Tissue Engineering von Fettgewebe mit SVF-Zellen widmet [23], wurden in dieser Arbeit SVF-besiedelte Fettgewebekonstrukte basierend auf Fibringelen als Zellträger zunächst umfassend in vitro charakterisiert und erstmals die Fettgewebeentwicklung der Zellen im Mausmodell in vivo untersucht. In vorbereitenden In-vitro-Arbeiten wurden SVF-besiedelte stabile Fibringele mit den bisher verwendeten ASC-basierten Konstrukten verglichen. Dabei wurde zunächst die adipogene und endotheliale Differenzierbarkeit der SVF in unterschiedlichen Zellkulturmedien untersucht. Eine 1:1-Mischung aus Präadipozytenmedium (PGM-2) und Endothelzellmedium (EGM-2), die zuvor schon für Kokulturexperimente von ASCs und Endothelzellen verwendet worden war [24], stellte sich als besonders geeignet für die Kurz- und Langzeitkultur der SVF in stabilen Fibringelen heraus. Umfassende histologische Untersuchungen zeigten, dass mit Hilfe dieser Medienkomposition insbesondere das adipogene und endotheliale Differenzierungspotenzial der verschiedenen Zelltypen in der SVF innerhalb der generierten 3D-Konstrukte erhalten werden kann. Die auf zellulärer Ebene gewonnenen Erkenntnisse konnten mittels qRT-PCR-Analyse von adipogenen und endothelialen Markern (PPARγ, aP2, CD31) auf mRNA-Ebene bestätigt werden. Um in Zukunft die In-vivo-Untersuchung der generierten Fettgewebekonstrukte zu erleichtern, sowie eine strukturelle Analyse des Gewebeverbands und insbesondere die Interaktion von Adipozyten und Blutgefäßen zu ermöglichen, wurde zusätzlich eine 3D-Färbetechnik (Whole Mount Staining), zunächst unter Verwendung von nativem humanem Fettgewebe, etabliert (Kapitel 6). In einer anschließenden umfassenden Studie in immundefizienten Nacktmäusen (NMRI Foxn1nu/Foxn1nu) wurden SVF-Zellen zum ersten Mal in vivo für das Engineering von vaskularisiertem Fettgewebe untersucht. Hierbei wurden sowohl der Effekt der In vitro Vorkultur der SVF-basierten Konstrukte als auch der Einfluss des Trägermaterials auf die Gewebeentwicklung in vivo evaluiert. Die adipogene Vorkultur der SVF-besiedelten Konstrukte in vitro über einen Zeitraum von 7 Tagen vor Implantation wirkte sich positiv auf die Fettdifferenzierung in vivo aus, wohingegen die Vorkultur unter nicht-induzierten Bedingungen ohne adipogene Induktion verstärkt zur Bildung von vaskulären Strukturen führte. Durch Spezies-spezifische Färbung gegen humanes Vimentin konnte gezeigt werden, dass die beobachteten Strukturen humanen Ursprungs waren und daher von den implantierten SVF-Zellen stammten. Der Einfluss des Trägermaterials auf die Gewebebildung in vivo wurde durch Besiedelung stabiler Fibringele und TissuCol-Gele mit SVF-Zellen verglichen. Die Konstrukte wurden ohne In-vitro-Vorkultur direkt nach der Herstellung implantiert. Hier zeigte sich in stabilen Fibringelen nach 4 Wochen in vivo keine nennenswerte Gewebeentwicklung, wobei auch der Anteil an humanen Zellen innerhalb der Konstrukte zum Zeitpunkt der Explantation stark verringert war. Im Gegensatz dazu konnte in TissuCol-Gelen die Entwicklung von kohärentem und maturem Fettgewebe nachgewiesen werden von dem große Teile humanen Ursprungs waren. Die histologischen Ergebnisse wurden mittels histomorphometrischer Quantifizierung von Adipozyten und Blutgefäßstrukturen verifiziert, wodurch das herausragende Potenzial der SVF für das Fettgewebe-Engineering in vivo nochmals verdeutlicht wurde. Unter Verwendung der zuvor etablierten 3D-Färbetechnik (Whole Mount Staining) konnten anschließend Adipozyten und Blutgefäße innerhalb des entstandenen kohärenten Gewebeverbands in TissuCol-Gelen visualisiert werden. Mit Hilfe einer humanspezifischen Färbung in 3D konnte zusätzlich die weitreichende Beteiligung der implantierten SVF Zellen bei der Gewebeentwicklung nachgewiesen werden (Kapitel 7). Die in der Dissertation entwickelten bioabbaubaren volumenstabilen Fettgewebekonstrukte, die Untersuchung von ASCs und SVF-Zellen als vielversprechende regenerative Zellquellen für die Generierung funktioneller Konstrukte, sowie die Evaluation unterschiedlicher Vaskularisierungsstrategien in vitro und in vivo leisten einen wichtigen Beitrag zu neuen und innovativen Ansätzen im Bereich des Tissue Engineerings von Fettgewebe. Die Ergebnisse stellen eine Grundlage für die zielgerichtete Entwicklung regenerativer Implantate dar und eröffnen neue Perspektiven für die Generierung klinisch anwendbarer Fettgewebekonstrukte als Weichteilersatz. KW - Tissue Engineering KW - Fettgewebe KW - Tissue Engineering KW - Adipose Tissue KW - Vascularization KW - Fibrin Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107196 ER - TY - THES A1 - Witteler, Charlotte Marie T1 - Untersuchung des zellbiologischen Verhaltens von Fibroblasten in modifizierten Gelatine-Methacrylat basierten Harzen für den volumetrischen Biodruck T1 - Investigation of the cell biological behavior of fibroblasts in modified gelatin-methacrylate based resins for volumetric bioprinting N2 - Was vor einigen Jahren undenkbar erschien, könnte zukünftig möglich sein: Krankes Gewebe mit Gesundem ersetzen, das in vitro mit modernsten Biofabrikationstechniken hergestellt wird. Dabei werden bisherige Grenzen überschritten: Während lichtbasierte Biodruckverfahren wie die Zwei-Photonen-Polymerisation Auflösungen bis in den Nanometerbereich erzielen, ermöglicht der Volumetrische Biodruck (VB) den Druck zentimetergroßer Konstrukte in wenigen Sekunden. Diese Geschwindigkeiten erweisen sich unter Biodruckverfahren als konkurrenzlos und werden erreicht, da das Bioharz nicht konsekutiv, sondern zugleich vernetzt wird. Einschränkend gilt bislang nur der Mangel an geeigneten Bioharzen für den VB. Daher beschäftigt sich vorliegende Arbeit mit der Charakterisierung und Modifikation eines dafür geeigneten Bioharzes: Gelatine-Methacrylat (GelMA). Dank seiner Zusammensetzung ähnelt das etablierte Hydrogelsystem der Extratrazellularmatrix: Der Gelatine-Anteil ermöglicht Biokompatibilität und Bioaktivität durch zelladhäsive sowie degradierbare Aminosäure-Sequenzen. Zugleich können durch photovernetzbare Methacryloyl-Substituenten Konstrukte mit einer Formstabilität bei 37 °C erzeugt werden. Zunächst wurde das Bioharz zellbiologisch charakterisiert, indem mit der embryonalen Mausfibroblasten-Zelllinie NIH-3T3 beladene GelMA-Zylinder gegossen, photopolymerisiert und kultiviert wurden. Im Verlauf einer Woche wurde die Zytokompatibilität der Gele anhand der Proliferationsfähigkeit (PicoGreen-Assay), des Metabolismus (CCK-8-Assay) und der Vitalität (Live/Dead-Assay) der Zellen beurteilt. Dabei wurden Polymerkonzentrationen von 6 – 8 % sowie GelMA-Harze zweier verschiedener Molekulargewichte verglichen. Alle hergestellten Gele erwiesen sich als zytokompatibel, 6 % ige Gele ließen im Inneren jedoch zusätzlich eine beginnende Zellspreizung zu und ein niedriges GelMA-Molekulargewicht verstärkte die gemessene Proliferation. Die sich anschließende mechanische und physikalische Charakterisierung belegte, dass höher konzentrierte Gele einen größeren E-Modul aufwiesen und damit steifer waren. Eine Modifikation der Gele mit Fibronektin beeinflusste die Zellverträglichkeit weder positiv noch negativ und die Zugabe von Kollagen war wegen Entmischungseffekten nicht bewertbar. Es liegt die Vermutung nah, dass eine weitere Reduktion der Polymerkonzentration und damit Verringerung der Gelsteifigkeit der Schlüssel für mehr Zellspreizung und -wachstum ist. Da jedoch die Druckbarkeit des Bioharzes die weitere Senkung des GelMA-Gehalts limitiert, sollten zunächst Methoden entwickelt werden, welche die Netzwerkdichte des GelMAs anderweitig herabsetzen. N2 - What seemed unthinkable a few years ago could be possible in the future: replacing diseased tissue with healthy tissue produced in vitro using the latest biofabrication techniques. Previous limits are being exceeded: While light-based bioprinting processes such as two-photon polymerization achieve resolutions down to the nanometer range, volumetric bioprinting (VB) makes it possible to print centimeter-sized constructs in just a few seconds. These speeds are unrivaled among bioprinting processes and are achieved because the bioresin is not cross-linked consecutively but simultaneously. The only limitation to date is the lack of suitable bioresins for VB. Therefore, the present work deals with the characterization and modification of a suitable bioresin: gelatine methacrylate (GelMA). Thanks to its composition, the established hydrogel system is similar to the extracellular matrix: The gelatine component enables biocompatibility and bioactivity through cell-adhesive as well as degradable amino acid sequences. At the same time, photo-crosslinkable methacryloyl substituents can be used to produce constructs with dimensional stability at 37 °C. First, the bioresin was characterized cell biologically by casting, photopolymerizing and culturing GelMA cylinders loaded with the embryonic mouse fibroblast cell line NIH-3T3. Over the course of a week, the cytocompatibility of the gels was assessed based on proliferation capacity (PicoGreen assay), metabolism (CCK-8 assay) and viability (Live/Dead assay) of the cells. Polymer concentrations of 6 - 8 % and GelMA resins of two different molecular weights were compared. All gels produced were found to be cytocompatible, however, 6 % gels additionally allowed incipient cell spreading inside and a low GelMA molecular weight increased the measured proliferation. The subsequent mechanical and physical characterization showed that gels with higher concentration had a higher modulus of elasticity and were therefore stiffer. Modifications of the gels with fibronectin had neither a positive nor negative effect on cell compatibility and the addition of collagen could not be evaluated due to segregation effects. It is reasonable to assume that further reduction in polymer concentration and thus a reduction in gel stiffness is the key to more cell spreading and growth. However, since the printability of the bioresin limits further reduction of the GelMA content, methods should first be developed to reduce the network density of the GelMA in other ways. KW - 3D Bioprinting KW - Fibroblast KW - Gelatine KW - Polymer-Gel KW - GelMA KW - Bioharz KW - Volumetrischer Biodruck KW - Polymergehalt KW - Modifikation Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-349460 ER - TY - THES A1 - Wistlich, Laura T1 - NCO-sP(EO-stat-PO) as functional additive for biomaterials’ development T1 - NCO-sP(EO-stat-PO) als funktionale Additive für die Entwicklung von Biomaterialien N2 - The aim of this thesis was the application of the functional prepolymer NCO-sP(EO-stat-PO) for the development of new biomaterials. First, the influence of the star-shaped polymers on the mechanical properties of biocements and bone adhesives was investigated. 3-armed star-shaped macromers were used as an additive for a mineral bone cement, and the influence on the mechanical properties was studied. Additionally, a previously developed bone adhesive was examined regarding cytocompatibility. The second topic was the examination of novel functionalization steps which were performed on the surface of electrospun fibers modified with NCO-sP(EO-stat-PO). This established method of functionalizing electrospun meshes was advanced regarding the modification with proteins which was then demonstrated in a biological application. Two different kinds of antibodies were immobilized on the fiber surface in a consecutive manner and the influence of these proteins on the cell behavior was investigated. The final topic involved the quantification of surface-bound peptide sequences. By functionalization of the peptides with the UV-reactive molecule 2-mercaptopyridine it was possible to quantify this compound via UV measurements by cleavage of disulfide bridges and indirectly draw conclusions about the number of immobilized peptides. In the field of mineral biocements and bone adhesives, NCO-sP(EO-stat-PO) was able to influence the setting behavior and mechanical performance of mineral bone cements based on calcium phosphate chemistry. The addition of NCO-sP(EO-stat-PO) resulted in a pseudo-ductile fracture behavior due to the formation of a hydrogel network in the cement, which was then mineralized by nanosized hydroxyapatite crystals following cement setting. Accordingly, a commercially available aluminum silicate cement from civil engineering could be modified. In addition, it could be shown that the use of NCO-sP(EO-stat-PO) is beneficial for adjusting specific material properties of bone adhesives. Here, the crosslinking behavior of the prepolymer in an aqueous medium was exploited to form an interpenetrating network (IPN) together with a photochemically curing poly(ethylene glycol) dimethacrylate (PEGDMA) matrix. This could be used for the development of a bone adhesive with an improved adhesion to bone in a wet environment. The developed bone adhesive was further investigated in terms of possible influences of the initiator systems. In addition, the material system was tested for cytocompatibility by using different cell lines. Moreover, the preparation of electrospun fiber meshes via solution electrospinning consisting of poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) as a backbone polymer and NCO-sP(EO-stat-PO) as functional additive is an established method for the application of the meshes as a replacement of the native extracellular matrix (ECM). In general, these fibers reveal diameters in the nanometer range, are protein and cell repellent due to the hydrophilic properties of the prepolymer and show a specific biofunctionalization by immobilization of peptide sequences. Here, the isocyanate groups presented on the fiber surface after electrospinning were used to carry out various functionalization steps, while retaining the properties of protein and cell repellency. The modification of the electrospun fibers involved the immobilization of analogs or antagonists of tumor necrosis factor (TNF) and the indirect detection of these by interaction with a light-producing enzyme. Here, a multimodal modification of the fiber surface with RGD to mediate cell adhesion and two different antibodies could be achieved. After culturing the cell line HT1080, the pro- or anti-inflammatory response of cells could be detected by IL-8 specific ELISA measurements. Furthermore, the quantification of molecules on the surface of electrospun fibers was investigated. It was tested whether the detection by means of super-resolution microscopy would be possible. Therefore, experiments were performed with short amino acid sequences such as RGD for quantification by fluorescence microscopy. Based on earlier results, in which a UV-spectrometrically active molecule was used to detect the quantification of RGD, it was shown that short peptides can also be quantified in a small scale on flat functional substrates (2D) such as NCO-sP(EO-stat-PO) hydrogel coatings, and modified electrospun fibers produced from PLGA and NCO-sP(EO-stat-PO) (3D). In addition, a collagen sequence was used to prove that a successful quantification can be carried out as well for longer peptide chains. These studies have revealed that NCO-sP(EO-stat-PO) can serve as a functional additive for many applications and should be considered for further studies on the development of novel biomaterials. The rapid crosslinking reaction, the resulting hydrogel formation and the biocompatibility are to be mentioned as positive properties, which makes the prepolymer interesting for future applications. N2 - Ziel der Arbeit war die Anwendung der funktionalen Präpolymere NCO-sP(EO-stat-PO) für die Entwicklung von neuen Biomaterialien. Als erstes wurde untersucht, welchen Einfluss die sternförmigen Polymere auf die mechanischen Eigenschaften von Biozementen und Knochenadhäsiven haben. Beispielsweise wurden 3-armige Macromere als Additive für einen mineralischen Knochenzement verwendet und dessen mechanische Eigenschaften untersucht. Außerdem wurde ein kürzlich entwickelter NCO-sP(EO-stat-PO) haltiger Knochenklebers auf Zytokompatibilität getestet. Ein zweites Kapitel beinhaltete die Modifikation von elektrogesponnenen Polymerfasern mit NCO-sP(EO-stat-PO) basierend auf einer etablierten Methode. Es wurde untersucht, welche weiteren Funktionalisierungen auf solchen Oberflächen vorgenommen werden können. Diese Modifizierungsschritte wurden in einer biologischen Anwendung demonstriert, indem verschiedene Antikörper aufeinanderfolgend auf der Faseroberfläche gebunden wurden. Der Einfluss dieser Proteine auf das Verhalten von Zellen auf diesen Oberflächen wurde untersucht. Als letztes wurde die Quantifizierung von oberflächengebundenen Peptidsequenzen demonstriert. Mittels Funktionalisierung der Peptide mit dem UV-reaktiven Molekül 2-Mercaptopyridin konnte durch Spaltung von Disulfidbrücken diese Verbindung UV-metrisch quantifiziert und indirekt Rückschlüsse auf die Anzahl der immobilisierten Peptide gezogen werden. Durch den Zusatz von NCO-sP(EO-stat-PO) konnten das Abbindeverhalten und die mechanischen Eigenschaften von mineralischen Calciumphosphat-Knochenzementen moduliert werden. Der Zusatz von 3-armigem, sternförmigem NCO-sP(EO-stat-PO) führte dabei zu einem pseudoduktilen Bruchverhalten durch Bildung eines Hydrogelnetzwerks im Zement, das anschließend durch die Zementreaktion mit nanoskaligem Hydroxylapatit mineralisiert wurde. Im Bereich mineralischer Knochenzemente und Adhäsive konnte gezeigt werden, dass NCO-sP(EO-stat-PO) zur Einstellung der Eigenschaften verwendet werden kann. Hierbei wurde dessen Quervernetzungsverhalten im wässrigen Medium ausgenutzt, um mit einer photochemisch härtenden Polyethylenglykoldimethakrylat (PEGDMA) Matrix interpenetrierende Netzwerke (IPNs) zu bilden. Diese konnten für die Entwicklung eines Knochenklebers mit verbesserter Haftung auf Knochen im feuchten Milieu genutzt werden. Das kürzlich entwickelte Knochenadhäsiv wurde im Hinblick auf den Einfluss des Initiatorsystems untersucht. Außerdem wurde die Zytokompatibilität des Materials anhand verschiedener Zelltypen getestet. Die Herstellung von elektrogesponnenen Faservliesen mittels Solution Electrospinning aus Polylactid-co-Glycolid (PLGA) als Gerüst-bildendem Polymer und NCO-sP(EO-stat-PO) als funktionalem Additiv ist eine etablierte Methode, um diese Vliese zur Nachbildung nativer Extrazellulär-Matrix anzuwenden. Die Fasern weisen einen Durchmesser im Nanometer-Bereich auf, sind proteinabweisend durch die hydrophilen Eigenschaften des Präpolymers und können durch Immobilisierung von Peptidsequenzen spezifisch biofunktionalisiert werden. Hierbei wurden die Isocyanate auf der Faseroberfläche genutzt, um verschiedenste Funktionalisierungsschritte unter Beibehaltung der protein- und zellabweisenden Eigenschaften auszuführen. Die Modifizierung der elektrogesponnenen Fasern beinhaltete die Immobilisierung von Analoga oder Antagonisten des Tumornekrosefaktors (TNF) sowie den indirekten Nachweis über eine Lichtreaktion. Hierbei konnte eine multimodale Modifizierung der Faseroberfläche mit RGD-Sequenzen zur Vermittlung der Zelladhäsion und zwei verschiedenen Antikörpern erreicht werden. Nach Kultivierung der Zelllinie HT1080 konnte die pro- oder antiinflammatorische Antwort der Zellen mittels IL-8 spezifischem ELISA nachgewiesen werden. Eine weitere Fragestellung war der Quantifizierung von Molekülen auf der Oberfläche von elektrogesponnen Fasern gewidmet. Es wurde getestet, ob ein Nachweis mittels hochauflösender Mikroskopie möglich ist. Hierzu wurden RGD-Sequenzen zur fluoreszenzmikroskopischen Quantifizierung verwendet. Basierend auf früheren Ergebnissen, bei denen für die Quantifizierung von RGD ein UV-aktives Molekül genutzt wurde, konnte gezeigt werden, dass sich kurze Peptide auch im kleinen Maßstab auf flachen Substraten (2D) wie Hydrogel-Beschichtungen aus NCO-sP(EO-stat-PO) als auch auf elektrogesponnenen Fasern aus PLGA und NCO-sP(EO-stat-PO) (3D) quantifizieren lassen. Außerdem wurde eine Kollagen-Sequenz als längere Peptidkette herangezogen, um auch hier eine erfolgreiche Quantifizierung zu beweisen. Es konnte gezeigt werden, dass NCO-sP(EO-stat-PO) als funktionales Additiv für viele Anwendungen dienen kann und für weitere Untersuchungen zur Entwicklung von Biomaterialien berücksichtigt werden sollte. Die schnelle Quervernetzungsreaktion, die resultierende Hydrogelbildung und die Biokompatibilität sind als positive Eigenschaften zu nennen, die das Präpolymer für zukünftige Anwendungen interessant macht. KW - Sternpolymere KW - Funktionalisierung KW - Isocyanate KW - surface functionalization KW - biomaterials KW - chemical crosslinking KW - bioceramics KW - electrospun fibers KW - Oberflächenfunktionalisierung KW - funktionale Präpolymere KW - Modifikation von Biokeramiken KW - Funktionalisierung von elektrogesponnenen Fasern Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-178365 ER - TY - THES A1 - Wimmer, Katharina T1 - Analyse der Osteoklastendifferenzierung auf elektrochemisch abgeschiedenen strontiumdotierten Struvitschichten T1 - Differentiation of osteoclastic cells on electrochemically deposited strontium substituted struvite coatings N2 - Bei der Implantatversorgung von Patienten mit Osteoporose besteht weiterhin eine hohe Komplikationsrate vor allem durch aseptische Prothesenlockerungen. Eine vielversprechende Möglichkeit diese zu minimieren stellt eine Funktionalisierung der Implantate mit Strontium dar. Ziel der vorliegenden Arbeit war es dabei die Wirkung lokal verfügbaren Strontiums auf osteoklastäre und osteoblastäre Zellen zu untersuchen. Mittels elektrochemischer Abscheidung erfolgte die Beschichtung von Titanproben mit strontiumdotiertem Struvit, wobei sieben verschiedene Dotierkonzentrationen zwischen 6 µg und 487 µg Strontium pro Probe hergestellt wurden. Die Untersuchungen an osteoklastären RAW 264.7 Zellen erfolgten mittels Bestimmung von Zellzahl und -aktivität, verschiedener mikroskopischer Methoden sowie auf genetischer Ebene. Osteoblastäre MG63-Zellen wurden orientierend anhand von Zellzahl und Zellaktivität untersucht. Zellbiologisch konnte ein hemmender Einfluss von Strontium auf Differenzierung sowie Proliferation und Aktivität osteoklastärer Zellen gezeigt werden. Die Dotierkonzentration mit den günstigsten Eigenschaften war unter vorliegenden Versuchsbedingungen 487 µg Strontium pro Probe, da sich hierbei zudem eine erhaltene ostoblastäre Proliferation und Aktivität zeigte. N2 - Aseptic loosening of implants is still an issue especially for patients with osteoporosis. In order to minimize the risk of implant failure the functionalisation of implant surfaces with strontium is a promising technique. The aim of the present study was to investigate the effect of locally availible strontium on osteoclastic and osteoblastic cells. Electrochemically assisted deposition was used to provide strontium substituted struvite coatings on titanium surfaces. The strontium concentration ranged from 6 µg to 487 µg per sample. Growth of osteoclastic cells was investigated by the determination of cell number and cellular activity, as well as microscopical and transcriptional level studies. Osteoblasts were studied by determining cell number and cell activity. A general suppressing influence of strontium was observed on the differentiation and activity of osteoclasts. The most favourable properties were found for the highest strontium concentration under investigation, because additionally cell proliferation and activity of osteoblasts was not significantly affected. KW - Osteoblast KW - Strontium KW - Struvit KW - Galvanische Abscheidung KW - Osteoklastendifferenzierung KW - strontiumdotierte Struvitschichten Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-191417 ER - TY - THES A1 - Wiesbeck, Christina T1 - Fabrication and characterization of NCO-sP(EO-stat-PO)- crosslinked and functionalized electrospun gelatin scaffolds for tissue engineering applications T1 - Herstellung und Charakterisierung von elektrogesponnenen Nanofasern aus Gelatine und NCO-sP(EO-stat-PO) für Tissue Engineering Anwendungen N2 - In Tissue Engineering, scaffolds composed of natural polymers often show a distinct lack in stability. The natural polymer gelatin is highly fragile under physiological conditions, nevertheless displaying a broad variety of favorable properties. The aim of this study was to fabricate electrospun gelatin nanofibers, in situ functionalized and stabilized during the spinning process with highly reactive star polymer NCO-sP(EO-stat-PO) (“sPEG”). A spinning protocol for homogenous, non-beaded, 500 to 1000 nm thick nanofibers from different ratios of gelatin and sPEG was successfully established. Fibers were subsequently characterized and tested with SEM imaging, tensile tests, water incubation, FTIR, EDX, and cell culture. It was shown that adding sPEG during the spinning process leads to an increase in visible fiber crosslinking, mechanical stability, and stability in water. The nanofibers were further shown to be biocompatible in cell culture with RAW 264.7 macrophages. N2 - Tissue Engineering Scaffolds aus natürlichen Polymeren zeigen häufig mangelnde Stabilität, insbesondere unter physiologischen Bedingungen. Das natürliche Polymer Gelatine besitzt einige sehr vorteilhafte Eigenschaften für die Anwendung bei der Produktion künstlicher Körpergewebe. Beim Einsatz im menschlichen Organismus ist die Gelatine durch ihre Wasserlöslichkeit höchst fragil. Das Ziel dieser Arbeit war die Herstellung von Nanofaser-Scaffolds aus Gelatine mittels Elektrospinning und deren in situ Stabilisierung durch das Sternpolymer NCO-sP(EO-stat-PO) („sPEG“). Zunächst wurde ein Spinningprotokoll zur Fabrikation homogener, glatter, 500 bis 1000 nm dicker Nanofasern in verschiedenen Verhältnissen von Gelatine und sPEG erarbeitet. Mittels REM Bildgebung, Zugversuchen, Wasserinkubationsversuchen, FTIR, EDX und Zellkultur wurden die Fasern untersucht und charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass die Zugabe von sPEG während des Spinningprozesses zu einer sichtbaren Quervernetzung der Fasern, sowie zu einem Anstieg der mechanischen Festigkeit und der Wasserstabilität führt. Des Weiteren wurde die Biokompatibilität der Nanofasern in der Zellkultur mit RAW 264.7 Makrophagen belegt. KW - Tissue Engineering KW - Electrospinning KW - Gelatine KW - Polyethylenglykole KW - NCO-sP(EO-stat-PO) KW - sPEG KW - starPEG Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-190988 ER - TY - JOUR A1 - Wieland, Annalena A1 - Strissel, Pamela L. A1 - Schorle, Hannah A1 - Bakirci, Ezgi A1 - Janzen, Dieter A1 - Beckmann, Matthias W. A1 - Eckstein, Markus A1 - Dalton, Paul D. A1 - Strick, Reiner T1 - Brain and breast cancer cells with PTEN loss of function reveal enhanced durotaxis and RHOB dependent amoeboid migration utilizing 3D scaffolds and aligned microfiber tracts JF - Cancers N2 - Background: Glioblastoma multiforme (GBM) and metastatic triple-negative breast cancer (TNBC) with PTEN mutations often lead to brain dissemination with poor patient outcome, thus new therapeutic targets are needed. To understand signaling, controlling the dynamics and mechanics of brain tumor cell migration, we implemented GBM and TNBC cell lines and designed 3D aligned microfibers and scaffolds mimicking brain structures. Methods: 3D microfibers and scaffolds were printed using melt electrowriting. GBM and TNBC cell lines with opposing PTEN genotypes were analyzed with RHO-ROCK-PTEN inhibitors and PTEN rescue using live-cell imaging. RNA-sequencing and qPCR of tumor cells in 3D with microfibers were performed, while scanning electron microscopy and confocal microscopy addressed cell morphology. Results: In contrast to the PTEN wildtype, GBM and TNBC cells with PTEN loss of function yielded enhanced durotaxis, topotaxis, adhesion, amoeboid migration on 3D microfibers and significant high RHOB expression. Functional studies concerning RHOB-ROCK-PTEN signaling confirmed the essential role for the above cellular processes. Conclusions: This study demonstrates a significant role of the PTEN genotype and RHOB expression for durotaxis, adhesion and migration dependent on 3D. GBM and TNBC cells with PTEN loss of function have an affinity for stiff brain structures promoting metastasis. 3D microfibers represent an important tool to model brain metastasizing tumor cells, where RHO-inhibitors could play an essential role for improved therapy. KW - 3D tumor model KW - 3D microfiber KW - amoeboid cell migration KW - brain cancer KW - breast cancer KW - PTEN KW - RHO KW - ROCK KW - durotaxis KW - topotaxis Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-248443 SN - 2072-6694 VL - 13 IS - 20 ER - TY - THES A1 - Wettstein, Lars T1 - Elektrochemische Abscheidung von Bruschitschichten auf Titan in Gegenwart von Kristallisationsinhibitoren zur Steuerung von Kristallitgröße und biologischer Reaktion T1 - Brushite coatings on titanium by electrochemical deposition in the presence of crystallization inhibitors to control of crystallite size and biological reaction N2 - Es erfolgte eine elektrochemische Abscheidung von Bruschitschichten auf Titan in Gegenwart von Kristallisationsinhibitoren. Dabei wurden die Kristallisationsinhibitoren Zitronensäure, treta-Natriumdiphosphat-Decahydrat und Phytinsäure verwendet und die entstandenen Schichten mit denen ohne Inhibitorzugabe verglichen. Um das Ausmaß der Inhibierung zu verifizieren, wurde die Masse aller Schichten gemessen, welche für die Inhibition mit Zitronensäure und Phytinsäure abnahm und für Natriumdiphosphat zunahm. Die kristallographische Zusammensetzung der mit und ohne Inhibierung abgeschiedenen Schichten wurde mit Hilfe der Röntgendiffraktometrie bestimmt und zeigte, dass sich reine Bruschitschichten mit unterschiedlichem amorphem Anteil abschieden. Die daraus entstandenen Werte lieferten zugleich die Informationen über die einzelnen Kristallitgrößen innerhalb der Schichten. Über den Einfluss der Inhibitoren auf die Schichtmorphologie gaben rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen weiteren Aufschluss. Die Inhibition verursachte teils mit Rissen durchzogene Schichten, deren Kristallformationen sich von Standardelektrolyt unterschieden. Ausgewählte Proben wurden unter verschiedenen Bedingungen desinfiziert bzw. sterilisiert und nachfolgend erneut gewogen und mittels Röntgendiffraktogrammetrie und Rasterelektronenmikroskopie analysiert. Nach der Desinfektion entstanden reine Bruschitschichten, die an Masse verloren aber trotzdem die typischen Kristallformationen zeigten. Die Sterilisation führte zur Umwandlung von Bruschit in Monetit und Hydroxylapatit. Des Weiteren wurde die biologische Reaktion der Schichten auf humane fötale Osteoblasten-Zelllinien zur Überprüfung der Zellverträglichkeit ermittelt. Die entstandenen Ergebnisse waren nicht verwertbar und enthielt sehr hohe Standardabweichungen. N2 - Brushite coatings were deposited on titanium by electrochemical deposition in the presence of various crystallization inhibitors such as citric acid, treta-sodium diphosphate decahydrate and phytic acid. The resulting layers were compared with those without inhibitor addition. To verify the extent of inhibition, the mass of all layers was measured, which decreased for inhibition with citric acid and phytic acid and increased for sodium diphosphate. The crystallographic composition of the layers deposited with and without inhibition was determined by X-ray diffraction and showed pure brushite caotings with different amorphous content. The resulting values also provided information about the individual crystallite sizes within the layers. Scanning electron microscope images provided further information about the influence of the inhibitors of the layer morphology. The inhibition caused layers partly interspersed with cracks, whose crystal formations differed from the standard electrolyte. Selected samples were disinfected or sterilized under various conditions and subsequently reweighed and analyzed by X-ray diffraction and scanning electron microscopy. After disinfection, pure brushite caotings were formed, which lost mass but still showed the typical crystal formations. Sterilization led to the transformation of brushite into monetite and hydroxyapatite. Furthermore, the biological response of the layers to human fetal osteoblast cell lines was determined to test cell compatibility. The results obtained were not usable and contained very high standard deviations. KW - Elektrochemische Abscheidung KW - Bruschitbeschichtung KW - Inhibition KW - electrochemical deposition KW - brushite coating Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-217502 ER - TY - JOUR A1 - Weissenberger, Manuel A1 - Weissenberger, Manuela H. A1 - Wagenbrenner, Mike A1 - Heinz, Tizian A1 - Reboredo, Jenny A1 - Holzapfel, Boris M. A1 - Rudert, Maximilian A1 - Groll, Jürgen A1 - Evans, Christopher H. A1 - Steinert, Andre F. T1 - Different types of cartilage neotissue fabricated from collagen hydrogels and mesenchymal stromal cells via SOX9, TGFB1 or BMP2 gene transfer JF - PLoS One N2 - Objective As native cartilage consists of different phenotypical zones, this study aims to fabricate different types of neocartilage constructs from collagen hydrogels and human mesenchymal stromal cells (MSCs) genetically modified to express different chondrogenic factors. Design Human MSCs derived from bone-marrow of osteoarthritis (OA) hips were genetically modified using adenoviral vectors encoding sex-determining region Y-type high-mobility-group-box (SOX)9,transforming growth factor beta (TGFB) 1or bone morphogenetic protein (BMP) 2cDNA, placed in type I collagen hydrogels and maintained in serum-free chondrogenic media for three weeks. Control constructs contained unmodified MSCs or MSCs expressing GFP. The respective constructs were analyzed histologically, immunohistochemically, biochemically, and by qRT-PCR for chondrogenesis and hypertrophy. Results Chondrogenesis in MSCs was consistently and strongly induced in collagen I hydrogels by the transgenesSOX9,TGFB1andBMP2as evidenced by positive staining for proteoglycans, chondroitin-4-sulfate (CS4) and collagen (COL) type II, increased levels of glycosaminoglycan (GAG) synthesis, and expression of mRNAs associated with chondrogenesis. The control groups were entirely non-chondrogenic. The levels of hypertrophy, as judged by expression of alkaline phosphatase (ALP) and COL X on both the protein and mRNA levels revealed different stages of hypertrophy within the chondrogenic groups (BMP2>TGFB1>SOX9). Conclusions Different types of neocartilage with varying levels of hypertrophy could be generated from human MSCs in collagen hydrogels by transfer of genes encoding the chondrogenic factorsSOX9,TGFB1andBMP2. This technology may be harnessed for regeneration of specific zones of native cartilage upon damage. KW - stem cells KW - in vitro KW - chondrogenic differentiation KW - repair KW - chondrocytes KW - transplantation KW - stimulation KW - scaffolds KW - defects KW - therapy Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-230494 VL - 15 IS - 8 ER - TY - JOUR A1 - Weissenberger, M. A1 - Weissenberger, M. H. A1 - Gilbert, F. A1 - Groll, J. A1 - Evans, C. H. A1 - Steinert, A. F. T1 - Reduced hypertrophy in vitro after chondrogenic differentiation of adult human mesenchymal stem cells following adenoviral SOX9 gene delivery JF - BMC Musculoskeletal Disorders N2 - Background Mesenchymal stem cell (MSC) based-treatments of cartilage injury are promising but impaired by high levels of hypertrophy after chondrogenic induction with several bone morphogenetic protein superfamily members (BMPs). As an alternative, this study investigates the chondrogenic induction of MSCs via adenoviral gene-delivery of the transcription factor SOX9 alone or in combination with other inducers, and comparatively explores the levels of hypertrophy and end stage differentiation in a pellet culture system in vitro. Methods First generation adenoviral vectors encoding SOX9, TGFB1 or IGF1 were used alone or in combination to transduce human bone marrow-derived MSCs at 5 x 10\(^2\) infectious particles/cell. Thereafter cells were placed in aggregates and maintained for three weeks in chondrogenic medium. Transgene expression was determined at the protein level (ELISA/Western blot), and aggregates were analysed histologically, immunohistochemically, biochemically and by RT-PCR for chondrogenesis and hypertrophy. Results SOX9 cDNA was superior to that encoding TGFB1, the typical gold standard, as an inducer of chondrogenesis in primary MSCs as evidenced by improved lacuna formation, proteoglycan and collagen type II staining, increased levels of GAG synthesis, and expression of mRNAs associated with chondrogenesis. Moreover, SOX9 modified aggregates showed a markedly lower tendency to progress towards hypertrophy, as judged by expression of the hypertrophy markers alkaline phosphatase, and collagen type X at the mRNA and protein levels. Conclusion Adenoviral SOX9 gene transfer induces chondrogenic differentiation of human primary MSCs in pellet culture more effectively than TGFB1 gene transfer with lower levels of chondrocyte hypertrophy after 3 weeks of in vitro culture. Such technology might enable the formation of more stable hyaline cartilage repair tissues in vivo. KW - Mesenchymal stem cell KW - Cartilage KW - SOX9 KW - Gene therapy KW - Chondrogenesis KW - Hypertrophy KW - Adenovirus KW - Bone marrow Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-229232 VL - 20 ER - TY - JOUR A1 - Weis, Matthias A1 - Shan, Junwen A1 - Kuhlmann, Matthias A1 - Jungst, Tomasz A1 - Tessmar, Jörg A1 - Groll, Jürgen T1 - Evaluation of hydrogels based on oxidized hyaluronic acid for bioprinting JF - Gels N2 - In this study, we evaluate hydrogels based on oxidized hyaluronic acid, cross-linked with adipic acid dihydrazide, for their suitability as bioinks for 3D bioprinting. Aldehyde containing hyaluronic acid (AHA) is synthesized and cross-linked via Schiff Base chemistry with bifunctional adipic acid dihydrazide (ADH) to form a mechanically stable hydrogel with good printability. Mechanical and rheological properties of the printed and casted hydrogels are tunable depending on the concentrations of AHA and ADH cross-linkers. KW - biofabrication KW - bioprinting KW - hyaluronic acid Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-197600 SN - 2310-2861 VL - 4 IS - 4 ER - TY - JOUR A1 - Weigl, Franziska A1 - Blum, Carina A1 - Sancho, Ana A1 - Groll, Jürgen T1 - Correlative Analysis of Intra– Versus Extracellular Cell Detachment Events via the Alignment of Optical Imaging and Detachment Force Quantification JF - Advanced Materials Technologies N2 - In recent decades, hybrid characterization systems have become pillars in the study of cellular biomechanics. Especially, Atomic Force Microscopy (AFM) is combined with a variety of optical microscopy techniques to discover new aspects of cell adhesion. AFM, however, is limited to the early-stage of cell adhesion, so that the forces of mature cell contacts cannot be addressed. Even though the invention of Fluidic Force Microscopy (FluidFM) overcomes these limitations by combining the precise force-control of AFM with microfluidics, the correlative investigation of detachment forces arising from spread mammalian cells has been barely achieved. Here, a novel multifunctional device integrating Fluorescence Microscopy (FL) into FluidFM technology (FL-FluidFM) is introduced, enabling real-time optical tracking of entire cell detachment processes in parallel to the undisturbed acquisition of force-distance curves. This setup, thus, allows for entailing two pieces of information at once. As proof-of-principle experiment, this method is applied to fluorescently labeled rat embryonic fibroblast (REF52) cells, demonstrating a precise matching between identified force-jumps and visualized cellular unbinding steps. This study, thus, presents a novel characterization tool for the correlated evaluation of mature cell adhesion, which has great relevance, for instance, in the development of biomaterials or the fight against diseases such as cancer. KW - Fluorescence Microscopy KW - FluidFM technology KW - detachment force quantification Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-318544 SN - 2365-709X VL - 7 IS - 11 ER - TY - THES A1 - Weigl, Franziska T1 - Correlation of FluidFM® Technology and Fluorescence Microscopy for the Visualization of Cellular Detachment Steps T1 - Korrelation der FluidFM® Technologie und Fluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung von zellulären Ablöseschritten N2 - This thesis aimed the development of a correlated device which combines FluidFM® with Fluorescence Microscopy (FL) (FL-FluidFM®) and enables the simultaneous quantification of adhesion forces and fluorescent visualization of mature cells. The implementation of a PIFOC was crucial to achieve a high-resolution as well as a stable but dynamic focus level. The functionality of SCFS after hardware modification was verified by comparing two force-curves, both showing the typical force progression and measured with the optimized and conventional hardware, respectively. Then, the integration of FL was examined by detaching fluorescently labeled REF52 cells. The fluorescence illumination of the cytoskeleton showed the expected characteristic force profile and no evidence of interference effects. Afterwards a corresponding correlative data analysis was addressed including manual force step fitting, the identification of visualized cellular unbinding, and a time-dependent correlation. This procedure revealed a link between the area of cytoskeletal unbinding and force-jumps. This was followed by a comparison of the detachment characteristics of intercellular connected HUVECs and individual REF52 cells. HUVECs showed maximum detachment forces in the same order of magnitude as the ones of single REF52 cells. This contrasted with the expected strong cohesiveness of endothelial cells and indicated a lack of cell-cell contact formation. The latter was confirmed by a comparison of HUVECs, primary HBMVECs, and immortalized EA.hy926 cells fluorescently labeled for two marker proteins of intercellular junctions. This unveiled that both the previous cultivation duration and the cell type have a major impact on the development of intercellular junctions. In summary, the correlative FL FluidFM® represents a powerful novel approach, which enables a truly contemporaneous performance and, thus, has the potential to reveal new insights into the mechanobiological properties of cell adhesion. N2 - Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines korrelierten Gerätes, das FluidFM® mit Fluoreszenzmikroskopie (FL) kombiniert (FL-FluidFM®) und die gleichzeitige Quantifizierung von Adhäsionskräften und Fluoreszenzvisualisierung ausgereifter Zellen ermöglicht. Die Implementierung eines PIFOC war entscheidend, um eine hohe Auflösung sowie ein stabiles, aber dynamisches Fokusniveau zu erreichen. Die Funktionalität der SCFS nach der Hardwaremodifikation wurde durch den Vergleich zweier Kraftkurven verifiziert, die beide den typischen Kraftverlauf zeigten und jeweils mit der optimierten bzw. konventionellen Hardware gemessen wurden. Anschließend wurde die Integration von FL durch das Ablösen fluoreszenzmarkierter REF52-Zellen untersucht. Unter Fluoreszenzbeleuchtung des Zytoskeletts zeigte sich das erwartete charakteristische Kraftprofil und kein Hinweis auf Störeffekte. Anschließend wurde eine entsprechende korrelative Datenanalyse durchgeführt, die eine manuelle Kraftstufenanpassung, die Identifizierung der visualisierten zellulären Ablösung und eine zeitabhängige Korrelation umfasste. Dieses Verfahren ergab einen Zusammenhang zwischen dem Bereich der Zytoskelett-Ablösung und den Kraftsprüngen. Es folgte ein Vergleich der Ablösungseigenschaften von interzellulär verbundenen HUVECs und einzelnen REF52-Zellen. HUVECs zeigten maximale Ablösekräfte in der gleichen Größenordnung wie die von einzelnen REF52-Zellen. Dies stand im Gegensatz zu der erwarteten starken Kohäsion von Endothelzellen und deutete auf eine fehlende Zell-Zell-Kontaktbildung hin. Letzteres wurde durch einen Vergleich von HUVECs, primären HBMVECs und immortalisierten EA.hy926-Zellen bestätigt, die für zwei Markerproteine für interzelluläre Verbindungen fluoreszierend markiert wurden. Dabei zeigte sich, dass sowohl die vorherige Kultivierungsdauer als auch der Zelltyp einen großen Einfluss auf die Entwicklung von interzellulären Verbindungen haben. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das korrelative FL-FluidFM® einen leistungsstarken neuen Ansatz darstellt, der eine korrelative Durchführung ermöglicht und somit das Potenzial hat, neue Erkenntnisse über die mechanobiologischen Eigenschaften der Zelladhäsion zu liefern KW - Correlative microscopy KW - FluidFM KW - Fluorescence Microscopy KW - Cell adhesion KW - Korrelative Mikroskopie Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-298763 ER - TY - JOUR A1 - Weigand, Annika A1 - Boos, Anja M. A1 - Tasbihi, Kereshmeh A1 - Beier, Justus P. A1 - Dalton, Paul D. A1 - Schrauder, Michael A1 - Horch, Raymund E. A1 - Beckmann, Matthias W. A1 - Strissel, Pamela L. A1 - Strick, Reiner T1 - Selective isolation and characterization of primary cells from normal breast and tumors reveal plasticity of adipose derived stem cells JF - Breast Cancer Research N2 - Background There is a need to establish more cell lines from breast tumors in contrast to immortalized cell lines from metastatic effusions in order to represent the primary tumor and not principally metastatic biology of breast cancer. This investigation describes the simultaneous isolation, characterization, growth and function of primary mammary epithelial cells (MEC), mesenchymal cells (MES) and adipose derived stem cells (ADSC) from four normal breasts, one inflammatory and one triple-negative ductal breast tumors. Methods A total of 17 cell lines were established and gene expression was analyzed for MEC and MES (n = 42) and ADSC (n = 48) and MUC1, pan-KRT, CD90 and GATA-3 by immunofluorescence. DNA fingerprinting to track cell line identity was performed between original primary tissues and isolates. Functional studies included ADSC differentiation, tumor MES and MEC invasion co-cultured with ADSC-conditioned media (CM) and MES adhesion and growth on 3D-printed scaffolds. Results Comparative analysis showed higher gene expression of EPCAM, CD49f, CDH1 and KRTs for normal MEC lines; MES lines e.g. Vimentin, CD10, ACTA2 and MMP9; and ADSC lines e.g. CD105, CD90, CDH2 and CDH11. Compared to the mean of all four normal breast cell lines, both breast tumor cell lines demonstrated significantly lower ADSC marker gene expression, but higher expression of mesenchymal and invasion gene markers like SNAI1 and MMP2. When compared with four normal ADSC differentiated lineages, both tumor ADSC showed impaired osteogenic and chondrogenic but enhanced adipogenic differentiation and endothelial-like structures, possibly due to high PDGFRB and CD34. Addressing a functional role for overproduction of adipocytes, we initiated 3D-invasion studies including different cell types from the same patient. CM from ADSC differentiating into adipocytes induced tumor MEC 3D-invasion via EMT and amoeboid phenotypes. Normal MES breast cells adhered and proliferated on 3D-printed scaffolds containing 20 fibers, but not on 2.5D-printed scaffolds with single fiber layers, important for tissue engineering. Conclusion Expression analyses confirmed successful simultaneous cell isolations of three different phenotypes from normal and tumor primary breast tissues. Our cell culture studies support that breast-tumor environment differentially regulates tumor ADSC plasticity as well as cell invasion and demonstrates applications for regenerative medicine. KW - Normal breast KW - Breast cancer KW - Stem cells plasticity KW - Primary cell lines KW - Tissue engineering Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-164759 VL - 18 IS - 32 ER - TY - THES A1 - Weichhold, Jan Lukas T1 - Injectable calcium phosphate-based bone replacement cements T1 - Injizierbare calciumphosphat-basierte Knochenersatzzemente N2 - The human body has very good self-healing capabilities for numerous different injuries to a variety of different tissues. This includes the main human mechanical framework, the skeleton. The skeleton is limited in its healing without additional aid by medicine mostly by the defect size. When the defect reaches a size above 2.5 cm the regeneration of the defect ends up faulty. Here is where implants, defect fillers and other support approaches developed in medicine can help the body to heal the big defect still successfully. Usually sturdy implants (auto-/allo-/xenogenic) are implanted in the defect to bridge the distance, but for auto- and allogenic implants a suitable donor site must be found and for all sources the implant needs to be shaped into the defect specific site to ensure a perfect fit, the best support and good healing. This shaping is very time consuming and prone to error, already in the planning phase. The use of a material that is moldable and sets in the desired shape shortly after applying negates these disadvantages. Cementitious materials offer exactly this property by being in a pasty stage after the powder and liquid components have been mixed and the subsequently hardening to a solid implant. These properties also enable the extrusion, and therefore may also enable the injection, of the cement via a syringe in a minimal invasive approach. To enable a good injection of the cement modifications are necessary. This work aimed to modify commonly used calcium phosphate-based cement systems based on α-TCP (apatitic) and β-TCP (brushitic). These have been modified with sodium phytate and phytic acid, respectively. Additionally, the α-TCP system has been modified with sodium pyrophosphate, in a second study, to create a storable aqueous paste that can be activated once needed with a highly concentrated sodium orthophosphate solution. The powder phase of the α-TCP cement system consisted of nine parts α-TCP and one part CDHA. These were prepared to have different particle sizes and therefore enable a better powder flowability through the bimodal size distribution. α-TCP had a main particle size of 20 μm and CDHA of 2.6 μm. The modification with sodium phytate led to an adsorption of phytate ions on the surface of the α-TCP particles, where they started to form complexes with the Ca2+ ions in the solution. This adsorption had two effects. The first was to make the calcium ions unavailable, preventing supersaturation and ultimately the precipitation of CDHA what would lead to the cement hardening. The second was the increase of the absolute value of the surface charge, zeta potential, of the powder in the cement paste. Here a decrease from +3 mV to -40 mV could be measured. A strong value for the zeta potential leads to a higher repulsion of similarly charged particles and therefore prevents powder agglomeration and clogging on the nozzle during injection. These two modifications (bimodal particles size distribution and phytic acid) lead to a significant increase in the paste injectability. The unmodified paste was injectable for 30 % only, where all modified pastes were practically fully injectable ~90 % (the residual paste remained in the nozzle, while the syringe plunger already reached the end of the syringe). A very similar observation could be made for the β-TCP system. This system was modified with phytic acid. The zeta potential was decreased even stronger from -10 ± 1.5 mV to -71.5 ± 12 mV. The adsorption of the phytate ions and subsequent formation of chelate complexes with the newly dissolved Ca2+ ions also showed a retarding effect in the cements setting reaction. Where the unmodified cement was not measurable in the rheometer, as the reaction was faster than the measurement setup (~1.5 min), the modified cements showed a transition through the gel point between 3-6 min. This means the pastes stayed between 2 and 4 times longer viscous than without the modification. Like with the first cement system also here the effects of the phytate addition showed its beneficial influence in the injectability measurement. The unmodified cement was not injectable at all, due to the same issue already encountered at the rheology measurements, but all modified pastes were fully injectable for at least 5 min (lowest phytate concentration) and at least 10 min (all other concentrations) after the mixing of powder and liquid. The main goal of the last modification with sodium pyrophosphate was to create a paste that was stable in aqueous environment without setting until the activation takes place, but it should still show good injectability as this was the desired way of application after activation. Like before also the zeta potential changed after the addition of pyrophosphate. It could be lowered from -22 ± 2mV down to -61 to -68 ± 4mV (depending on the pyrophosphate concentration). The pastes were stored in airtight containers at room temperature and checked for their phase composition over 14 days. The unmodified paste showed a beginning phase conversion to hydroxyapatite between 7 and 14 days. All other pastes were still stable and unreacted. The pastes were activated with a high concentrated (30 wt%) sodium orthophosphate solution. After the activation the pastes were checked for their injectability and showed an increase from -57 ± 11% for the unmodified paste to -89 ± 3% (practically fully injectable as described earlier) for the best modified paste (PP005). It can be concluded that the goal of enabling full injection of conventional calcium phosphate bone cement systems was reached. Additional work produced a storage stable paste that still ensures full injectability. Subsequent work already used the storable paste and modified it with hyaluronic acid to create an ink for 3D extrusion printing. The first two cement systems have also already been investigated in cell culture for their influence on osteoblasts and osteoclasts. The next steps would have to go more into the direction of translation. Figuring out what properties still need to be checked and where the modification needs adjustment to enable a clinical use of the presented systems. N2 - Der menschliche Körper verfügt über sehr gute Selbstheilungsfähigkeiten für zahlreiche verschiedene Verletzungen in unterschiedlichen Geweben. Dazu gehört auch das wichtigste mechanische Gerüst des Menschen, das Skelett. Das Skelett ist in seiner Heilung ohne zusätzliche Hilfe durch die Medizin vor allem durch die Defektgröße begrenzt. Erreicht der Defekt eine Größe von mehr als 2,5 cm, ist die Regeneration des Defekts nicht mehr gewährleistet. Hier können Implantate, Defektfüller und andere in der Medizin entwickelte Unterstützungsansätze dem Körper helfen, den großen Defekt noch erfolgreich zu heilen. In der Regel werden stabile Implantate (auto-/allo-/xenogen) in den Defekt eingesetzt, um den Abstand zu überbrücken. Für auto- und allogene Implantate muss jedoch eine geeignete Spenderstelle gefunden werden, und für alle Quellen muss das Implantat in die defektspezifische Stelle geformt werden, um eine perfekte Passform, den besten Halt und eine gute Heilung zu gewährleisten. Diese Formgebung ist sehr zeitaufwendig und fehleranfällig, schon in der Planungsphase. Die Verwendung eines Materials, das formbar ist und kurz nach dem Auftragen in der gewünschten Form aushärtet, negiert diese Nachteile. Zementartige Materialien bieten genau diese Eigenschaft, indem sie sich nach dem Vermischen von Pulver und flüssigen Komponenten in einem pastösen Stadium befinden und anschließend zu einem festen Implantat aushärten. Diese Eigenschaften ermöglichen auch die Extrusion und damit möglicherweise auch die Injektion des Zements über eine Spritze in einem minimalinvasiven Verfahren. Um eine gute Injektion des Zements zu ermöglichen, sind Modifikationen erforderlich. Ziel dieser Arbeit war es, die gängigen Zementsysteme auf Kalziumphosphatbasis zu modifizieren, die auf α-TCP (apatitisch) und β-TCP (brushitisch) basieren. Diese wurden mit Natriumphytat bzw. Phytinsäure modifiziert. Zusätzlich wurde das α-TCP-System in einer zweiten Studie mit Natriumpyrophosphat modifiziert, um eine lagerfähige wasserbasierte Paste zu schaffen, die bei Bedarf mit einer hochkonzentrierten Natriumorthophosphatlösung aktiviert werden kann. Die Pulverphase des α-TCP-Zementsystems bestand aus neun Teilen α-TCP und einem Teil CDHA. Diese wurden so aufbereitet, dass sie unterschiedliche Partikelgrößen aufweisen und somit eine bessere Fließfähigkeit des Pulvers durch die bimodale Größenverteilung ermöglichen. α-TCP hatte eine Hauptpartikelgröße von 20 μm und CDHA von 2,6 μm. Die Modifizierung mit Natriumphytat führte zu einer Adsorption von Phytat-Ionen an der Oberfläche der α-TCP-Partikel, wo sie Komplexe mit den Ca2+-Ionen in der Lösung zu bilden begannen. Diese Adsorption hatte zwei Auswirkungen. Die erste bestand darin, dass die Calciumionen nicht mehr verfügbar waren, wodurch die Übersättigung und letztlich die Ausfällung von CDHA verhindert wurde, was zur Erhärtung des Zements geführt hätte. Der zweite Effekt war die Erhöhung des Betrags der Oberflächenladung, des Zetapotenzials, des Pulvers in der Zementpaste. Hier konnte eine Abnahme von +3 mV auf -40 mV gemessen werden. Ein hoher Wert für das Zetapotenzial führt zu einer stärkeren Abstoßung ähnlich geladener Teilchen und verhindert somit die Agglomeration des Pulvers und das Verstopfen der Kanüle während der Injektion. Diese beiden Modifikationen (bimodale Partikelgrößenverteilung und Phytinsäure) führen zu einer deutlichen Verbesserung der Injektionsfähigkeit der Paste. Die unmodifizierte Paste war nur zu 30 % injizierbar, während alle modifizierten Pasten praktisch vollständig injizierbar waren ~90 %(die Restpaste blieb in der Kanüle, während der Spritzenkolben bereits das Ende der Spritze erreichte). Eine sehr ähnliche Beobachtung konnte für das β-TCP-System gemacht werden. Dieses System wurde mit Phytinsäure modifiziert. Das Zetapotenzial sank noch stärker von -10 ± 1,5 mV auf -71,5 ± 12mV. Die Adsorption der Phytat-Ionen und die anschließende Bildung von Chelatkomplexen mit den neu gelösten Ca2+-Ionen zeigten ebenfalls eine verzögernde Wirkung bei der Abbindereaktion des Zements. Während der unmodifizierte Zement im Rheometer nicht messbar war, da die Reaktion schneller verlief als der Messaufbau (~1,5 min), zeigten die modifizierten Zemente einen Übergang durch den Gelpunkt zwischen 3-6 min. Dies bedeutet, dass die Pasten zwischen 2 und 4 mal länger viskos blieben als ohne die Modifikation. Wie beim ersten Zementsystem zeigte sich auch hier der positive Einfluss des Phytatzusatzes bei der Messung der Injektionsfähigkeit. Der unmodifizierte Zement war überhaupt nicht injizierbar, was auf das gleiche Problem zurückzuführen ist, das bereits bei den rheologischen Messungen aufgetreten ist, aber alle modifizierten Pasten waren mindestens 5 min (niedrigste Phytatkonzentration) und mindestens 10 min (alle anderen Konzentrationen) nach dem Mischen von Pulver und Flüssigkeit vollständig injizierbar. Das Hauptziel der letzten Modifikation mit Natriumpyrophosphat bestand darin, eine Paste zu schaffen, die in wässriger Umgebung stabil ist und bis zur Aktivierung nicht aushärtet, die aber dennoch eine gute Injektionsfähigkeit aufweisen sollte, da dies die gewünschte Art der Anwendung nach der Aktivierung war. Wie zuvor änderte sich auch das Zetapotenzial nach der Zugabe von Pyrophosphat. Es konnte von -22 ± 2mV auf -61 bis -68 ± 4mV (abhängig von der Pyrophosphatkonzentration) gesenkt werden. Die Pasten wurden in luftdichten Behältern bei Raumtemperatur gelagert und über 14 Tage auf ihre Phasenzusammensetzung untersucht. Die unmodifizierte Paste zeigte zwischen 7 und 14 Tagen eine beginnende Phasenumwandlung in Hydroxyapatit. Alle anderen Pasten waren noch stabil und nicht umgewandelt. Die Pasten wurden mit einer hochkonzentrierten (30 Gew.-%) Natriumorthophosphatlösung aktiviert. Nach der Aktivierung wurden die Pasten auf ihre Injektionsfähigkeit geprüft und zeigten einen Anstieg von -57 ± 11 % für die unmodifizierte Paste auf -89 ± 3 % (praktisch vollständig injizierbar, wie zuvor beschrieben) für die beste modifizierte Paste (PP005). Daraus lässt sich schließen, dass das Ziel, die vollständige Injektion herkömmlicher Kalziumphosphat-Knochenzementsysteme zu ermöglichen, erreicht wurde. Weitere Arbeiten führten zu einer lagerstabilen Paste, die dennoch eine vollständige Injektionsfähigkeit gewährleistet. In nachfolgenden Arbeiten wurde die lagerfähige Paste bereits verwendet und mit Hyaluronsäure modifiziert, um eine Tinte für den 3D-Extrusionsdruck herzustellen. Die ersten beiden Zementsysteme wurden auch bereits in Zellkulturen auf ihren Einfluss auf Osteoblasten und Osteoklasten untersucht. Die nächsten Schritte müssten mehr in Richtung Translation gehen. Es gilt herauszufinden, welche Eigenschaften noch überprüft werden müssen und wo die Modifikation angepasst werden muss, um einen klinischen Einsatz der vorgestellten Systeme zu ermöglichen. KW - Calciumphosphat KW - Cement KW - Knochenersatz KW - Zement KW - Injectability KW - Bone-replacement KW - IP6 KW - Modification KW - Rheology KW - Setting Control KW - Calcium Phosphate Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-326616 ER - TY - JOUR A1 - Wang, Shuang A1 - Sarwat, Mariah A1 - Wang, Peng A1 - Surrao, Denver C. A1 - Harkin, Damien G. A1 - St John, James A. A1 - Bolle, Eleonore C. L. A1 - Forget, Aurelien A1 - Dalton, Paul D. A1 - Dargaville, Tim R. T1 - Hydrogels with Cell Adhesion Peptide‐Decorated Channel Walls for Cell Guidance JF - Macromolecular Rapid Communications N2 - A method is reported for making hollow channels within hydrogels decorated with cell‐adhesion peptides exclusively at the channel surface. Sacrificial fibers of different diameters are used to introduce channels within poly(ethylene glycol) hydrogels crosslinked with maleimide‐thiol chemistry, which are backfilled with a cysteine‐containing peptide solution which is conjugated to the lumen with good spatial efficiency. This allows for peptide patterning in only the areas of the hydrogel where they are needed when used as cell‐guides, reducing the amount of required peptide 20‐fold when compared to bulk functionalization. The power of this approach is highlighted by successfully using these patterned hydrogels without active perfusion to guide fibroblasts and olfactory ensheathing cells—the latter having unique potential in neural repair therapies. KW - 3D printing KW - cell guidance KW - cell transplantation KW - melt electrowriting KW - synthetic hydrogels Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-218031 VL - 41 IS - 15 ER - TY - THES A1 - Vogt, Fabian T1 - Elektrochemisch abgeschiedenes Calciumhydroxid Ca(OH)\(_2\) als antibakterielle, antiinflammatorische und proosseointegrative Titanimplantat-Oberflächen-Modifikation im In vivo Versuch T1 - Electrochemically deposited calcium hydroxide Ca(OH)\(_2\) as an antibacterial, anti-inflammatory and proosseointegrative titanium implant surface modification in an in vivo experiment N2 - Das Ziel der experimentellen Studie war die Erprobung der (bereits in vitro erfolgreich getesteten) Ca(OH)2-Beschichtung In vivo unter dem Aspekt, ob und inwieweit die antibakteriellen und somit auch antiinflammatorischen bzw. entzündungsmoderierenden Eigenschaften der Ca(OH)2-Beschichtung eine sinnvolle und effektive Ergänzung zu den bisher erfolgreich eingesetzten Calciumphosphat(CaP)-Beschichtungen mit bewiesenen, guten proosseointegrativen Eigenschaften bei lasttragenden Implantaten sein können. Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die Ergebnisse der In vitro Untersuchung durch die In vivo Versuche in den Bereichen 0-100 KBE grundsätzlich als gestützt gelten können. Die Zuverlässigkeit der Wirkung durch Ca(OH)2 nimmt jedoch mit steigender KBE-Zahl ab, sodass weitere Testreihen sinnvoll sind. N2 - The aim of the experimental study was to test the Ca(OH)2-coating (which has already been successfully tested in vitro) in vivo under the aspect of whether and to what extent the antibacterial and thus also anti-inflammatory or inflammation-moderating properties of the Ca(OH)2-coating can be a useful and effective addition to the common successfully used calcium phosphate (CaP)-coatings with proven, good proosseointegrative properties in load-bearing implants. In summary, it can be stated that the results of the in vitro investigation can generally be considered supported through the in vivo tests in the range of 0 -100 CFU. However, the reliability of the effect caused by Ca(OH)2 decreases as the CFU number increases, so further series of tests make sense. KW - Calciumhydroxid KW - Implantat KW - In vivo KW - antibakteriell KW - antiinflammatorisch KW - proosseointegrativ KW - S.aureus KW - Tierversuch KW - Titan Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-346343 ER - TY - JOUR A1 - Tylek, Tina A1 - Blum, Carina A1 - Hrynevich, Andrei A1 - Schlegelmilch, Katrin A1 - Schilling, Tatjana A1 - Dalton, Paul D A1 - Groll, Jürgen T1 - Precisely defined fiber scaffolds with 40 μm porosity induce elongation driven M2-like polarization of human macrophages JF - Biofabrication N2 - Macrophages are key players of the innate immune system that can roughly be divided into the pro-inflammatory M1 type and the anti-inflammatory, pro-healing M2 type. While a transient initial pro-inflammatory state is helpful, a prolonged inflammation deteriorates a proper healing and subsequent regeneration. One promising strategy to drive macrophage polarization by biomaterials is precise control over biomaterial geometry. For regenerative approaches, it is of particular interest to identify geometrical parameters that direct human macrophage polarization. For this purpose, we advanced melt electrowriting (MEW) towards the fabrication of fibrous scaffolds with box-shaped pores and precise inter-fiber spacing from 100 μm down to only 40 μm. These scaffolds facilitate primary human macrophage elongation accompanied by differentiation towards the M2 type, which was most pronounced for the smallest pore size of 40 μm. These new findings can be important in helping to design new biomaterials with an enhanced positive impact on tissue regeneration. KW - cell elongation KW - human macrophages KW - melt electrowriting (MEW) KW - macrophage polarization KW - 3D scaffolds Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-254012 VL - 12 IS - 2 ER -