TY  - THES
A1  - Blank, Marc
T1  - Mechanismen der Glukokortikoid-induzierten Apoptose in T-Zellen
T1  - Dissecting the apoptotic pathways induced by Glucocorticoids in T-cells
N2  - Glukokortikoide induzieren Apoptose in vielen verschiedenen Zelltypen. Wenngleich die Glukokortikoid-induzierte Apoptose eine der zuerst entdeckten Formen des Programmierten Zelltodes war, ist sie dennoch kaum verstanden und daher heute noch Teil vieler Forschungen. Eine Bcl-2 Überexpression resultiert in einer Resistenz gegenüber GC- induzierter Apoptose in einer Reihe von Zellen wie einigen Lymphomzell-linien, aber auch normalen Thymozyten, sowie reifen T- und B-Zellen. Glukokortikoide können die Transkription der BH3-only Gene Bim (BCL-2-interacting mediator of cell death) und Puma (p53-upregulated modulator of apoptosis), einer proapoptotischen Untergruppe der Bcl-2 Familie, induzieren. Dies legt nahe, dass Bim und Puma am Weg der GC-induzierten Apoptose beteiligt sind. Ceramid ist in der Lage über die Aktivierung der proapoptotischen Bcl-2 Mitglieder Bax und Bak die äußere Mitochondrienmembran zu schädigen und damit zur Aktivierung von Caspasen zu führen. Verschiedene apoptotische Stimuli, wie z.B. Glukokortikoide, führen so über eine Erhöhung des endogenen Ceramid Levels zur Apoptose. Ceramid kann auf zwei verschiedenen Wegen gebildet werden: zum einen durch Hydrolyse von Sphingomyelin (katalysiert durch saure (a), oder neutrale (n) Sphingomyelinase (SMase)), zum anderen durch de novo Biosynthese. Studien an Thymozyten zeigen, dass von den beiden Möglichkeiten der Ceramidsynthese, lediglich die Inhibition der aSMase zu einer Resistenz gegenüber GC-induzierter Apoptose führt. Um nun die Rolle von Bim und der aSMase bei der Glukokortikoid-induzierten Apoptose zu untersuchen, wurde die murine T-Zelllymphomlinie WEHI7.15a zu Hilfe genommen. Während die Überexpression retroviral eingebrachter shRNAs gegen Bim und aSMase keine Wirkung auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose zeigten, führte der knockdown des Glukokortikoid-Rezeptors selbst zu einer Resistenz gegenüber Dexamethason. Auch der pharmakologische Inhibitor der Sphingomyelin-Hydrolyse, Imipramin, zeigte sowohl in vitro, als auch in vivo keine Wirkung auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose. Darüber hinaus waren sowohl Thymozyten, als auch periphere T-Zellen von aSMase knockout Mäusen genauso sensitiv auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose wie Wildtyp-Zellen. Die in vitro knockdown Ergebnisse von Bim und vom Glukokortikoid-Rezeptor selbst, konnten weiterhin ex vivo, durch das Einbringen der shRNAs in hämatopoetische Stammzellen, welche zur Rekonstitution bestrahlter Mäuse genutzt wurden, bestätigt werden. Während der Bim knockdown keinerlei Einfluss auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose ex vivo zeigte, konnte die verminderte Expression des Glukokortikoid-Rezeptors den Zelltod verhindern. Im Gegensatz hierzu zeigten sowohl der GR knockdown, als auch der Bim knockdown im hämatopoetischen System einen Einfluss auf die Thymozytenentwicklung in vivo.
N2  - Glucocorticoids (GC) induce apoptosis in many cell types, but the mechanisms are not well understood. Recently it was reported that the proapoptotic Bcl-2 family member Bim and an upregulation of ceramides by a caspase-activated acidic sphingomyelinase (aSMase) play important roles. In order to study their involvement in GC-induced apoptosis I took advantage of the GC-sensitive murine T-cell lymphoma line WEHI 7.15a. Overexpression of retrovirally expressed shRNAs against Bim or aSMase had no influence, whereas knockdown of the GC receptor (GR) itself rendered these cells resistant to Dexamethasone. In addition, various pharmacological inhibitors of ceramide production had no influence on GC-induced apoptosis. Moreover, thymocytes and peripheral T-cells from aSMase knockout mice were equally sensitive to GC induced apoptosis as wildtype cells. Furthermore, I confirmed the in vitro knock down results of Bim and the GR by introducing shRNAs into hematopoietic stem cells that were used to reconstitute lethally irradiated mice. While Bim inactivation did not impact ex vivo GC-induced apoptosis, loss of GR expression prevented cell death. In contrast both, the GR knockdown as well as the Bim knockdown in reconstituted mice, showed an influence in T-cell development in vivo.
KW  - Glucocorticosteroidrezeptor
KW  - Apoptosis
KW  - Sphingomyelinphosphodiesterase
KW  - RNS-Interferenz
KW  - T-Lymphozyt
KW  - Glucocorticosteroide
KW  - Bim
KW  - Bcl-2 Familie
KW  - Bcl-2 family
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-41332
ER  - 
TY  - THES
A1  - Heck, Tobias Johannes
T1  - Die Rolle des 1A-Promotors in der glukokortikoidinduzierten T-Zell-Apoptose
T1  - The role of the 1A-promotor in glucocorticoid-induced T-cell-apoptosis
N2  - Glukokortikoide (GCs) gehören zur Familie der Steroidhormone. Unter physiologischen Bedingungen haben GCs eine bedeutende Funktion als Stresshormone in der Aktivierung kataboler Stoffwechselvorgänge. In hohen, therapeutischen Konzentrationen spielen zusätzlich antientzündliche und immunsuppressive Wirkungen eine bedeutende Rolle. Diese Modulation des Immunsystems geschieht unter anderem durch Induktion des programmierten Zelltodes (Apoptose) in T-Lymphozyten. Die Erforschung der Mechanismen dieses glukokortikoidinduzierten Zelltodes (GICD) trägt zu einem besseren Verständnis der Wirkungsweise von Glukokortikoiden innerhalb des Immunsystems bei. Timothy J. Cole et. al. konnten belegen, dass die Aktivität des Glukokortikoidrezeptor-Promotor 1A (GR-1A) mit einem Ansprechen von T-Lymphozyten auf GICD korreliert. Es ist das Ziel dieser Arbeit, den Zusammenhang von GR-1A-Promotor-Expression und GICD im Detail zu untersuchen. Sämtliche Zellexperimente wurden an WEHI 7.1 Zellen durchgeführt, einer murinen, unreifen T-Zell-Lymphomlinie. In ersten Untersuchungen der WEHI 7.1-Zellen zeigte sich, dass nur bestimmte Zellklone nach Glukokortikoid¬behandlung in Apoptose gingen, während andere vollständig resistent gegenüber GCs erschienen. In weiterführenden Experimenten wurden ausschließlich die GICD-sensible Zellen eingesetzt. Für diesen Typ der WEHI 7.1 Zellen wurde sowohl das Vorhandensein des GR-1A-Transkripts, als auch ein deutliches Ansprechen auf GICD nachgewiesen. In den folgenden Experimenten WEHI 7.1-5A Zellen mit WEHI 7.1-5A Zellen supprimierter GR-1A-Ausstattung verglichen. Die erwünschte Reduktion des GR-1A-Transkripts wurde über RNA-Interferenz (RNAi) mittels small interfering RNA (siRNA) erzielt. RNAi ist eine Technik, die durch kleine siRNA-Ketten selektiv den Abbau bestimmter mRNA bewirkt und dadurch zu einer Verringerung der Proteinbiosynthese eines bestimmten Gens führt. Der Zusammenhang von GR-1A und glukokortioidinduzierter Apoptose sollte an WEHI 7.1-Zellen mit einer reduzierten GR-1A-Expression untersucht werden. Durch das Einschleusen siRNA-tragender lentiviraler Vektoren gegen das GR-1A-Transkript sollten Zellen generiert werden, die eine erhöhte Resistenz gegen die glukokortikoidinduzierte Apoptose aufweisen. Diejenigen Zellen, die siRNA-Information in das Genom integriert hatten, konnten durch Detektion eines grün fluoreszierenden Markergens (eGFP) isoliert werden. Anschließend wurden die Zellen auf eine Änderung der GR-Proteinmenge analysiert. Western Blot Analysen zur Quantifizierung des GR ergaben keine signifikanten Unterschiede in der Expression des GR-Proteins in den erfolgreich GR-1A-defizienten WEHI 7.1-Zellen im Vergleich zur Negativkontrolle. Es wurden Dexamethason-Dose-Response-Assays durchgeführt, um den Anteil von GICD an den transfizierten Zellen zu erfassen. Nach Behandlung mit dem hochpotenten Glukokortikoid Dexamethason ergaben sich keine signifikanten Überlebensvorteile für Zellen, die aufgrund von RNAi einen Mangel an GR-1A-Transkript besitzen. Die in dieser Arbeit durchgeführten Studien konnten den von Cole et al. postulierten Zusammenhang zwischen GR-1A-Expression und GICD nicht beweisen. Es bleibt ungeklärt, ob es nach erfolgreicher Transfektion der WEHI 7.1-Zellen tatsächlich zu einer signifikanten Abnahme der GR-1A-Transkription gekommen ist, beziehungsweise ob tatsächlich eine korrekte Synthese von siRNA in den Zellen stattgefunden hat. Weitere Untersuchungen erscheinen daher nötig, um die Rolle des 1A-Promotor besser zu verstehen.
N2  - Glucocorticoids (GCs) belong to the family of the steroid hormones. Under physiological conditions GCs have an important function as stress hormones in the activation of catabolic metabolism processes. In high, therapeutic concentrations anti-inflammatory and immunsuppressive effects play, in addition, an important role., Among the rest, this modulation of the immune system happens by induction of the programmed cell death (apoptosis) in T-lymphocytes. The investigation of the mechanisms of this glucocorticoid-induced cell death (GICD) contributes to a better understanding of the impact of glucocorticoids within the immune system. Timothy J. Cole et. al. could prove that the activity of the glucocorticoid-receptor-promotor 1A (GR-1A) appealing in T-lymphocytes correlates on GICD. The aim of this work is to examine the connection by GR-1A-promotor-expression and GICD in detail. All cell experiments were carried out in WEHI 7.1 cells, a murine, immature T-cell-lymphoma. In the first investigations of the WEHI 7.1-cells appeared that only certain cell clones went to glucocorticoid-induced apoptosis while others were completely resistant towards GCs. In continuing experiments exclusively the GICD-sensitive cells were used. For this celltype the available being of the GR-1A-Transkripts, as well as clear appealing to GICD has been proved. In the following experiments 7.1-5A WEHI cells were compared to 7.1-5A WEHI cells of suppressed GR-1A equipment. The desired reduction of the GR-1A-transkricts was achieved about RNA interference (RNAi) by means of small interfering RNA (siRNA). RNAi is a technology which causes selectively the dismantling of mRNA by small siRNA chains and thereby leads to a reduction of the protein biology synthesis of a certain gene. The connection of GR-1A and glucocorticoid apoptosis should be examined in WEHI 7.1-cells with a diminished GR-1A expression. The cells which show a raised resistance against glucocorticoidinduced apoptosis should be generated by the infiltration of siRNA weight-bearing lentiviraler vectors against the GR-1A-transcript. Those cells which had integrated siRNA information into the genome could be isolated by detection of a green fluorescing marker gene (eGFP). Afterwards the cells were analysed on a change of the GR protein amount. No significant differences in western blot analyses to the quantification of the GR in the expression of the GR protein in the successfully GR-1A-deficient WEHI 7.1-cells in comparison to the negative control were found. Dexamethason-dose-response-assays were carried out to grasp the portion of GICD in the transfected cells. After treatment with the highly potent glucocorticoid dexamethason no significant survival advantages arose for the cells which own a lack of GR-1A-transcript on the basis of RNAi. The studies carried out in this work could not prove the postulated connection between GR-1A expression and GICD. It remains unsettled whether it has come to a significant decrease of the GR-1A after the successful transfection of the WEHI 7.1-cells, or whether a really correct synthesis from siRNA has taken place in the cells. Hence, other investigations seem necessary to understand the role of the promotor 1A better.
KW  - Apoptosis
KW  - Glucocorticosteroide
KW  - T-Zell-Lymphom
KW  - apoptosis
KW  - glucocorticoid
KW  - t-cell
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40417
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TY  - THES
A1  - Langer, Manuel
T1  - Analyse der Instabilität und Funktionalität des Anti-Apoptose-Proteins A1
T1  - Analysis of instability and function of the anti- apoptotic protein A1
N2  - Apoptose ist eine bestimmte Art des programmierten Zelltods. Dieser Prozess erfüllt zahlreiche wichtige physiologische Funktionen. Eine pathologische Dysregulation der Apoptose ist an der Entstehung etlicher Krankheiten beteiligt. Bei der Regulation der Apoptose nehmen die Bcl-2-Familienmitglieder und damit auch das anti-apoptotisches Familienmitglied A1 eine wichtige Stellung ein. Die Stabilität und anti-apoptotische Funktion von A1 wird über den Ubiquitin-Proteasomen-Weg reguliert. Hierbei ist das C-terminale Ende von A1 essentiell. Ausgangspunkt für diese Arbeit war die Hypothese, dass an den C-Terminus von A1 eine bisher unbekannte Ubiquitin-E3-Ligase bindet, verzweigte Ubiquitinketten an Lysinreste des A1-Proteins konjugiert und das Protein dadurch für den proteasomalen Abbau markiert. Durch Mutationen einzelner Lysinreste von A1 sollte untersucht werden, welche dieser Aminosäuren ubiquitinyliert werden. Damit sollte der molekulare Mechanismus, der hinter der Instabilität und der anti-apoptotischen Funktion steckt, weiter charakterisiert werden. In dieser Arbeit wurden insgesamt 11 Mutanten des A1-Proteins hergestellt, bei denen die 11 Lysinreste von A1 gruppenweise zu Argininresten (K-A1-Mutanten) ausge-tauscht wurden. Der Austausch von Lysin zu Arginin wurde gewählt, weil hierdurch die Ladung an der entsprechenden Position des Proteins gleich bleibt, während eine Konjugation von Ubiquitin an Arginin nicht möglich ist. Im Ergebnis zeigte sich, dass das A1-Protein nicht nur an einzelnen, ganz spezifischen Lysinen, sondern an allen oder doch zumindest den meisten seiner 11 Lysine ubiquitinyliert werden kann, denn es ergaben sich bei den K-A1-Mutanten keine signifikanten Unterschiede in Stärke oder Muster ihrer Ubiquitinylierung. Es müssen also nicht einige wenige Lysine notwendigerweise ubiquitinyliert werden, um A1 zu destabilisieren, sondern die Ubiquitinylierung ganz unterschiedlicher Lysine markiert das Protein für den proteasomalen Abbau. Auch hat der Verlust bestimmter Lysingruppen und damit potentieller Ubiquitinylierungsstellen keinen signifikanten Einfluss auf die anti-apoptotische Funktion des A1-Proteins. Zusammengefasst unterstützen die Ergebnisse die Hypothese, dass eine bisher nicht bekannte Ubiquitin-E3-Ligase sowohl die Stabilität als auch die anti-apoptotische Funktion von A1 reguliert, indem sie verzweigte Ubiquitinketten an (fast) alle Lysine des Protein anhängt und das Protein damit für den proteasomalen Abbau markiert.
N2  - Apoptosis is a certain kind of programmed cell death and plays an important role in many physiological processes. Pathological dysregulation of apoptosis is involved in the development of a number of diseases. The Bcl-2 family members and with it the anti-apoptotic family member A1 are important regulators of apoptosis by regulating the integrity of the mitochondria. A1 is a very unstable protein, its stability is regulated by the ubiquitin/proteasome pathway. Based on published work, the hypothesis was set up, that a so far unknown ubiquitin-E3-ligase binds to the C-terminal end of A1, attaches ubiquitin chains to lysine residues and thereby marks the protein for proteasomal degradation. The ubiquitinylation and the molecular mechanisms behind the instability and the anti-apoptotic capacity of A1 should be further characterized by mutating the lysine residues of the protein. For this paper altogether 11 mutants of the A1 protein were cloned. The 11 lysine residues of A1 were replaced in groups with arginine residues (K-A1 mutants). Arginine was chosen to keep the charge at that position in the protein but to inhibit ubiquitylation at this position. The experiments indicate that all or at least most of the lysine residues of the A1 protein can be ubiquitinylated, because no significant differences in ubiquitinylation of the K-A1 mutants compared to A1 wildtype protein could be observed. Thus, no specific lysine residues have to be necessarily ubiquitinylated to destabilize the A1 protein, but ubiquitinylation of different lysine residues can mark the protein for proteasomal degradation. Furthermore, the loss of certain lysines showed no significant influence on the anti-apoptotic capacity of A1. Altogether, the results support the hypothesis, that a so far unknown ubiquitin-E3-ligase attaches ubiquitin to most if not all lysine residues and thereby regulates the stability and the anti-apoptotic capacity of the protein.
KW  - Apoptosis
KW  - Ubiquitin-Protein-Ligase
KW  - Apoptose
KW  - anti- apoptotisches Bcl-2 Familienmitglied A1
KW  - Ubiquitin- Proteasomen- Weg
KW  - apoptosis
KW  - anti- apoptotic Bcl-2 family member A1
KW  - ubiquitin- proteasome- pathway
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-50119
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TY  - THES
A1  - Zeitz, Jonas
T1  - Analyse der Funktion und Lokalisation des anti-apoptotischen Bcl-2 Familienmitglieds A1
T1  - Analysis of the Function and Localization of the Anti-Apoptotic Bcl-2 Family Member A1
N2  - In multizellulären Organismen ist die Apoptose, eine Art des programmierten Zelltods, ein hoch spezifischer, natürlicher Prozess um unerwünschte, überschüssige oder beschädigte Zellen auf einem geordneten, nicht entzündlichen, Weg zu beseitigen. Auch im menschlichen Körper werden täglich Milliarden an Zellen durch Apoptose abgebaut. Dadurch kann der Organismus die Zellzahl und Gewebegröße regulieren. Eine Fehlregulation der Apoptose kann weitreichende Konsequenzen haben. Während es bei einer unzureichenden Apoptose zu Autoimmunität und Tumoren kommen kann, führt ein gesteigerter Zelltod zu Immunschwäche oder akuten und chronischen degenerativen Erkrankungen. Aus diesem Grund ist die Erforschung der genauen Regulation des programmierten Zelltods von großer Bedeutung. Die Mitochondrien spielen eine Schlüsselrolle bei der Regulation des programmierten Zelltods. Während des Ablaufs der Apoptose kommt es zur Freisetzung von Mediatoren der Apoptose aus diesen Organellen. Diese Moleküle sind dann an der Aktivierung von Caspasen beteiligt, welche die Degradation von Proteinen und als Folge davon der DNA bewerkstelligen. Die Proteine der Bcl-2 Familie, zu der pro- und anti-apoptotische Mitglieder gehören, kontrollieren die Integrität der Mitochondrien hauptsächlich durch Protein-Protein und Protein-Membran Interaktionen. Viele anti-apoptotische Mitglieder der Bcl-2 Familie sind mittels einer C-terminalen Transmembrandomäne in der Lage an die äußere Mitochondrienmembran zu binden. A1, ein anti-apoptotisches Mitglied dieser Proteinfamilie, besitzt allerdings keine typische Transmembrandomäne. Die Funktion und Lokalisation des Proteins werden sehr kontrovers diskutiert. Daher ist das Ziel dieser Arbeit, die Lokalisation und Funktion von A1 zu analysieren. Um ein umfassendes Bild zu bekommen, wandten wir gentechnische Methoden zur Modifizierung des A1 C-Terminus an. Die intrazelluläre Lokalisation des Proteins wurde mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. Die Bedeutung des proteasomalen Abbaus von A1 wurde schließlich durch Inhibitionsexperimente charakterisiert. Durch eine Fusion des C-terminalen Endes von A1 mit dem „enhanced green fluorescent protein“ haben wir die Funktion und Lokalisierungseigenschaften des A1 C-terminus mittels Durchflusszytometrie und konfokaler Mikroskopie untersucht. Wir konnten zeigen, dass das C-terminale Ende das so entstandene chimäre Protein deutlich destabilisieren konnte. Eine Blockade des proteasomalen Abbaus führte zu einer Stabilisierung des Fusionsproteins. Des Weiteren konnte in der konfokalen Mikroskopie eine diffuse Verteilung des chimären Proteins in 293T Zellen nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass das C-terminale Ende von A1 keine Lokalisation an spezifische intrazelluläre Organellen vermitteln kann, jedoch für die Instabilität und den proteasomalen Abbau des Proteins verantwortlich ist. Eine Analyse der Lokalisation des Gesamtproteins A1 in 293T Zellen mittels konfokaler Mikroskopie konnte eine Verteilung von A1 zugunsten des Zytoplasmas mit Anreicherung an den Mitochondrien nachweisen. Obwohl das C-terminale Ende von A1 für sich keine spezifische intrazelluläre Lokalisation vermittelt, zeigte das Protein eine Kolokalisation an den Mitochondrien. Somit scheinen noch andere N-terminale Bereiche des Proteins an der Lokalisation von A1 beteiligt zu sein. Zusammenfassend konnte mit dieser Arbeit gezeigt werden, dass der C-Terminus von A1 eine wichtige Rolle für die Stabilität des anti-apoptotischen Bcl-2 Familienmitglieds spielt.
N2  - In multicellular organisms, apoptosis (one kind of programmed cell death) is a highly regulated natural process that can remove unwanted, redundant, or damaged cells in an orderly non-inflammatory way. In a typical human being, billions of cells undergo apoptosis every day. That way the organism can control the cell number and the size of a tissue. A dysregulation of apoptosis can have extensive consequences. While insufficient apoptosis can manifest as autoimmunity or cancer, accelerated cell death can lead to immunodeficiency or acute and chronic degenerative diseases. Therefore, analysis of apoptosis is of great importance. Mitochondria play a key role in the regulation of cell death. In the progress of apoptosis, mediators of apoptosis can be released from these organelles. These mediators then participate in the activation of caspases, enzymes that degrade proteins and as a consequence regulate the degradation of DNA. Proteins of the Bcl-2 family consisting of pro- and anti-apoptotic members, control the integrity of the mitochondria mainly by protein-protein and protein-membrane interactions. Many anti-apoptotic members of the Bcl-2 family are able to bind to the outer mitochondrial membrane by a C-terminal transmembrane domain. A1, an anti-apoptotic member of this protein family, lacks this typical transmembrane domain. Function and localization of this protein are discussed very controversially. Therefore, the aim of this thesis was to analyze the localization and function of A1. The intracellular distribution of various versions of genetically modified A1 proteins was analyzed by confocal microscopy. Eventually, the contribution of the proteasomal degradation pathway in regulating the amount of A1 inside cells was investigated by applying relevant inhibitors. By fusing the C-terminal end of A1 to the enhanced green fluorescent protein, we analyzed the function and localization features of the A1 C-terminus by confocal microscopy and flow-cytometry. We could show that the C-terminal end of A1 made the chimeric protein very unstable. Treating the cells with a proteasomal inhibitor lead to a stabilization of the fusion protein. Furthermore the chimeric protein showed a diffuse distribution in 293T cells. These results indicate that the C-terminus of A1 is not sufficient to mediate localization to special intracellular organelles, but is responsible for the instability and proteasomal degradation of the protein. By analyzing the localization of the full length protein A1 in 293T cells by confocal microscopy we could demonstrate that A1 is mainly found in the cytosol with accumulation at the mitochondria. As the C-terminus of A1 by itself was not sufficient for specific intracellular targeting of the protein, other N-terminal regions of A1 seem to contribute in targeting the protein to these organelles. Taken together, we could show that the C-terminus of A1 plays an important role for the stability of this anti-apoptotic Bcl-2 family member.
KW  - Apoptosis
KW  - Immunsystem
KW  - A1
KW  - Bcl-2
KW  - Apoptosis
KW  - A1
KW  - Bcl-2
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-37071
ER  -