TY - THES A1 - Liu, Ruiqi T1 - Dynamic regulation of the melanocortin 4 receptor system in body weight homeostasis and reproductive maturation in fish T1 - Dynamische Regulation des Melanocortin-4-Rezeptor Systems bei der Körpergewichtshomöostase und der Fortpflanzungsreifung bei Fischen N2 - Puberty is an important period of life with physiological changes to enable animals to reproduce. Xiphophorus fish exhibit polymorphism in body size, puberty timing, and reproductive tactics. These phenotypical polymorphisms are controlled by the Puberty (P) locus. In X. nigrensis and X. multilineatus, the P locus encodes the melanocortin 4 receptor (Mc4r) with high genetic polymorphisms. Mc4r is a member of the melanocortin receptors, belonging to class A G-protein coupled receptors. The Mc4r signaling system consists of Mc4r, the agonist Pomc (precursor of various MSH and of ACTH), the antagonist Agrp and accessory protein Mrap2. In humans, MC4R has a role in energy homeostasis. MC4R and MRAP2 mutations are linked to human obesity but not to puberty. Mc4rs in X. nigrensis and X. multilineatus are present in three allele classes, A, B1 and B2, of which the X-linked A alleles express functional receptors and the male-specific Y-linked B alleles encode defective receptors. Male body sizes are correlated with B allele type and B allele copy numbers. Late-maturing large males carry B alleles in high copy number while early-maturing small males carry B alleles in low copy number or only A alleles. Cell culture co-expression experiments indicated that B alleles may act as dominant negative receptor mutants on A alleles. In this study, the main aim was to biochemically characterize the mechanism of puberty regulation by Mc4r in X. nigrensis and X. multilineatus, whether it is by Mc4r dimerization and/or Mrap2 interaction with Mc4r or other mechanisms. Furthermore, Mc4r in X. hellerii (another swordtail species) and medaka (a model organism phylogenetically close to Xiphophorus) were investigated to understand if the investigated mechanisms are conserved in other species. In medaka, the Mc4r signaling system genes (mc4r, mrap2, pomc, agrp1) are expressed before hatching, with agrp1 being highly upregulated during hatching and first feeding. These genes are mainly expressed in adult brain, and the transcripts of mrap2 co-localize with mc4r indicating a function in modulating Mc4r signaling. Functional comparison between wild-type and mc4r knockout medaka showed that Mc4r knockout does not affect puberty timing but significantly delays hatching due to the retarded embryonic development of knockout medaka. Hence, the Mc4r system in medaka is involved in regulation of growth rather than puberty. In Xiphophorus, expression co-localization of mc4r and mrap2 in X. nigrensis and X. hellerii fish adult brains was characterized by in situ hybridization. In both species, large males exhibit strikingly high expression of mc4r while mrap2 shows similar expression level in the large and small male and female. Differently, X. hellerii has only A-type alleles indicating that the puberty regulation mechanisms evolved independently in Xiphophorus genus. Functional analysis of Mrap2 and Mc4r A/B1/B2 alleles of X. multilineatus showed that increased Mrap2 amounts induce higher cAMP response but EC50 values do not change much upon Mrap2 co-expression with Mc4r (expressing only A allele or A and B1 alleles). A and B1 alleles were expressed higher in large male brains, while B2 alleles were only barely expressed. Mc4r A-B1 cells have lower cAMP production than Mc4r A cells. Together, this indicates a role of Mc4r alleles, but not Mrap2, in puberty onset regulation signaling. Interaction studies by FRET approach evidenced that Mc4r A and B alleles can form heterodimers and homodimers in vitro, but only for a certain fraction of the expressed receptors. Single-molecule colocalization study using super-resolution microscope dSTORM confirmed that only few Mc4r A and B1 receptors co-localized on the membrane. Altogether, the species-specific puberty onset regulation in X. nigrensis and X. multilineatus is linked to the presence of Mc4r B alleles and to some extent to its interaction with A allele gene products. This is reasoned to result in certain levels of cAMP signaling which reaches the dynamic or static threshold to permit late puberty in large males. In summary, puberty onset regulation by dominant negative effect of Mc4r mutant alleles is a special mechanism that is found so far only in X. nigrensis and X. multilineatus. Other Xiphophorus species obviously evolved the same function of the pathway by diverse mechanisms. Mc4r in other fish (medaka) has a role in regulation of growth, reminiscent of its role in energy homeostasis in humans. The results of this study will contribute to better understand the biochemical and physiological functions of the Mc4r system in vertebrates including human. N2 - Die Pubertät ist ein wichtiger Lebensabschnitt mit physiologischen Veränderungen, die die Fortpflanzung von Tieren ermöglichen. Xiphophorus Fische weisen einen Polymorphismus in Bezug auf Körpergröße, Pubertätszeit und Fortpflanzungstaktik auf. Diese phänotypischen Polymorphismen werden durch den Pubertäts (P) Locus gesteuert. In X. nigrensis und X. multilineatus kodiert der P Locus den Melanocortin-4-Rezeptor (Mc4r) mit hohen genetischen Polymorphismen. Mc4r gehört zu den Melanocortin-Rezeptoren, die zur Klasse A der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren gehören. Das Mc4r-Signalsystem besteht aus Mc4r, dem Agonisten Pomc (Prohormon der verschiedenen MSH und des ACTH), dem Antagonisten Agrp und dem akzessorischen Protein Mrap2. Beim Menschen spielt MC4R eine Rolle bei der Energiehomöostase. MC4R und MRAP2 Mutationen stehen im Zusammenhang mit menschlicher Fettleibigkeit, jedoch nicht mit der Pubertät. Mc4rs in X. nigrensis und X. multilineatus sind in drei Allelklassen vorhanden, A, B1 und B2, von denen die X-chromosomalen A Allele funktionelle Rezeptoren exprimieren und die spezifischen männlichen Y-chromosomalen B Allele für defekte Rezeptoren kodieren. Die männliche Körpergröße korreliert mit dem B Alleltyp und der Kopienzahl des B Allels. Spätreife große Männchen tragen B Allele in hoher Kopienzahl, während frühreife kleine Männchen B Allele in niedriger Kopienzahl oder nur A Allele tragen. Koexpressions-Experimente in Zellkultur zeigten, dass B Allele als dominant negative Mutanten-Rezeptor auf A Allele wirken können. In dieser Studie war das Hauptziel die biochemische Charakterisierung des Mechanismus der Pubertätsregulation durch Mc4r in X. nigrensis und X. multilineatus. Dabei wurde untersucht, ob die Regulation durch eine Mc4r Dimerisierung und/oder Mrap2 Interaktion mit Mc4r oder durch andere Mechanismen erfolgt. Des Weiteren wurde Mc4r in X. hellerii (einer anderen Schwertträger Art) und Medaka (ein phylogenetisch naheliegender Modellorganismus von Xiphophorus) untersucht, um zu verstehen, ob die untersuchten Mechanismen in anderen Arten konserviert sind. In Medaka werden die Gene des Mc4r Signalsystems (mc4r, mrap2, pomc, agrp1) vor dem Schlüpfen exprimiert, wobei agrp1 während des Schlüpfens und der ersten Fütterung stark hochreguliert wird. Im adulten Medaka werden diese Gene hauptsächlich im Gehirn exprimiert und die Transkripte von mrap2 und mc4r kolokalisieren, was auf eine Funktion bei der Modulation der Mc4r-Signaltransduktion hinweist. Ein funktionaler Vergleich zwischen Wildtyp- und mc4r-Knockout Medaka zeigte, dass der Mc4r-Knockout das Pubertäts-Timing nicht beeinflusst, das Schlüpfen jedoch aufgrund der verzögerten embryonalen Entwicklung von Knockout-Medaka signifikant verzögert. Daher ist das Mc4r System in Medaka eher an der Regulation des Wachstums als an der Pubertät beteiligt. Bei Xiphophorus wurde die Lokalisierung von mc4r und mrap2 in erwachsenen Gehirnen von X. nigrensis und X. hellerii durch in situ Hybridisierung charakterisiert. Bei beiden Spezies zeigen große Männchen eine auffallend hohe Expression von mc4r, während mrap2 bei großen und kleinen Männchen und Weibchen ein ähnliches Expressionsniveau zeigt. Im Gegensatz dazu weist X. hellerii nur Allele vom A-Typ auf, was darauf hinweist, dass sich die Pubertätsregulationsmechanismen in dem Genus Xiphophorus unabhängig voneinander entwickelt haben. Die funktionelle Analyse der Mrap2 und Mc4r A/B1/B2 Allele von X. multilineatus zeigte, dass erhöhte Mrap2-Mengen eine höhere cAMP-Antwort induzieren, die EC50-Werte sich jedoch bei der Mrap2-Coexpression mit Mc4r nicht wesentlich ändern (nur A Allel oder A und B1 Allele). A und B1 Allele wurden in großen männlichen Gehirnen höher exprimiert, während B2 Allele kaum exprimiert wurden. Mc4r A-B1 Zellen haben eine geringere cAMP-Produktion als Mc4r A Zellen. Zusammengenommen deutet dies auf eine Rolle von Mc4r-Allelen, jedoch nicht von Mrap2, bei der Signalgebung zur Regulation des Pubertätsbeginns hin. Interaktionsstudien mit den FRET-Methoden zeigten, dass Mc4r A und B Allele in vitro Heterodimere und Homodimere bilden können, jedoch nur für einen bestimmten Anteil der exprimierten Rezeptoren. Die Einzelmolekül-co-lokalisierungsstudie unter Verwendung von der hochauflösenden Mikroskopiemethode dSTORM bestätigte, dass nur wenige Mc4r A und B1 Rezeptoren auf der Membran co-lokalisiert sind. Insgesamt ist die artspezifische Regulation des Pubertätsbeginns bei X. nigrensis und X. multilineatus auf das Vorhandensein von Mc4r B Allelen und teilweise auf deren Interaktion mit Genprodukten des A Allels zurückzuführen. Dies wird dadurch begründet, dass ein bestimmtes cAMP Niveau (statische oder dynamische Schwelle) erreicht werden muss, um die Pubertät einzuleiten. In großen Männchen wird dieses cAMP Niveau später erreicht und so die Pubertät später eingeleitet. Zusammenfassend ist die Regulation des Pubertätsbeginns durch die dominante negative Wirkung von mutierten Mc4r Allelen ein spezieller Mechanismus, der bisher nur bei X. nigrensis und X. multilineatus zu finden ist. Andere Xiphophorus Arten haben offensichtlich durch andere Mechanismen die gleiche Funktion des Signalwegs entwickelt. In anderen Fischen (Medaka) spielt Mc4r eine Rolle bei der Regulation des Wachstums und erinnert an seine Rolle bei der Energie-Homöostase beim Menschen. Die Ergebnisse dieser Studie werden dazu beitragen, die biochemischen und physiologischen Funktionen des Mc4r-Systems bei Wirbeltieren, einschließlich Menschen, besser zu verstehen. KW - Japankärpfling KW - Mc4r KW - Schwertkärpfling KW - Pubertät KW - Molekularbiologie KW - GPCR KW - Mrap2 KW - Medaka KW - Xiphophorus KW - Puberty KW - Growth Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-206536 ER - TY - THES A1 - İşbilir, Ali T1 - Localization and Trafficking of CXCR4 and CXCR7 T1 - Lokalisation und Verteilung von CXCR4 und CXCR7 N2 - G protein-coupled receptors (GPCRs) constitute the largest class of membrane proteins, and are the master components that translate extracellular stimulus into intracellular signaling, which in turn modulates key physiological and pathophysiological processes. Research within the last three decades suggests that many GPCRs can form complexes with each other via mechanisms that are yet unexplored. Despite a number of functional evidence in favor of GPCR dimers and oligomers, the existence of such complexes remains controversial, as different methods suggest diverse quaternary organizations for individual receptors. Among various methods, high resolution fluorescence microscopy and imagebased fluorescence spectroscopy are state-of-the-art tools to quantify membrane protein oligomerization with high precision. This thesis work describes the use of single molecule fluorescence microscopy and implementation of two confocal microscopy based fluorescence fluctuation spectroscopy based methods for characterizing the quaternary organization of two class A GPCRs that are important clinical targets: the C-X-C type chemokine receptor 4 (CXCR4) and 7 (CXCR7), or recently named as the atypical chemokine receptor 3 (ACKR3). The first part of the results describe that CXCR4 protomers are mainly organized as monomeric entities that can form transient dimers at very low expression levels allowing single molecule resolution. The second part describes the establishment and use of spatial and temporal brightness methods that are based on fluorescence fluctuation spectroscopy. Results from this part suggests that ACKR3 forms clusters and surface localized monomers, while CXCR4 forms increasing amount of dimers as a function of receptor density in cells. Moreover, CXCR4 dimerization can be modulated by its ligands as well as receptor conformations in distinct manners. Further results suggest that antagonists of CXCR4 display distinct binding modes, and the binding mode influences the oligomerization and the basal activity of the receptor: While the ligands that bind to a “minor” subpocket suppress both dimerization and constitutive activity, ligands that bind to a distinct, “major” subpocket only act as neutral antagonists on the receptor, and do not modulate neither the quaternary organization nor the basal signaling of CXCR4. Together, these results link CXCR4 dimerization to its density and to its activity, which may represent a new strategy to target CXCR4. N2 - G protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden die größte Klasse der Membranproteine und sind entscheidend an der Übersetzung extrazellulärer Reize in intrazelluläre Signale beteiligt, welche wiederum unzählige physiologische und pathophysiologische Prozesse regulieren. Die Forschungsergebnisse der letzten drei Jahrzehnte deutet darauf hin, dass viele GPCRs mittels noch weitgehend unbekannter Mechanismen miteinander Komplexe bilden können. Trotz vielfältiger Beobachtungen, die für die funktionelle Relevanz von GPCR-Dimeren und -Oligomeren sprechen, ist deren Existenz dennoch weiterhin umstritten, vor allem da verschiedene Methoden auf unterschiedliche quaternäre Anordnungen derselben Rezeptoren hinweisen. Von den derzeit verfügbaren Methoden zur genauen Untersuchung der GPCR Dimerisierung/-Oligomerisierung, stellen die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie sowie die bildbasierte Fluoreszenzspektroskopie die Techniken der Wahl dar. Die hier vorliegende Arbeit beschreibt die Anwendung der Einzelmolekül Fluoreszenzmikroskopie sowie zweier konfokalmikroskopischer Methoden zur Messung der Fluoreszenzfluktuation, mit deren Hilfe die quaternäre Anordnung zweier klinisch hochattraktiver Klasse A GPCRs untersucht wurde: der C-X-C Typ Chemokinrezeptoren 4 (CXCR4) und 7 (CXCR7), letzterer auch bekannt als atypischer Chemokinrezeptor 3 (ACKR3). Der erste Teil der Ergebnisse legt anhand Untersuchungen an einzelnen Molekülen dar, dass CXCR4 überwiegend in Form monomerer Einheiten auftritt, die bei sehr geringen Expressionsleveln kurzlebige Dimere bilden können. Der zweite Teil beschreibt die Etablierung und Anwendung räumlicher und zeitlicher Brillanzmethoden, die auf der spektroskopischen Untersuchung der Fluoreszenzfluktuation beruhen. Die Ergebnisse dieses Abschnitts deuten darauf hin, dass ACKR3 sowohl in Form beständiger Rezeptor-Cluster, und monomere Einheit an der Oberfläche lebender Zellen auftritt. CXCR4 ist bei zunehmender Rezeptordichte hingegen vermehrt in Form von Dimeren zu finden. Zudem kann die Dimerisierung von CXCR4 von dessen Liganden, als auch von der drei dimensionalen Anordnung der Rezeptorteilstrukturen (Rezeptorkonformation)auf unterschiedliche Weise reguliert werden. Die weiteren Ergebnisse legen nahe, dass Antagonisten auf unterschiedliche Weise an CXCR4 binden können und dass der jeweilige Bindungsmodus entscheidend für den Einfluss des Liganden auf Oligomerisierung und basale Aktivität von CXCR4 ist: Während Liganden, die an eine kleinere Untertasche des Rezeptors binden, sowohl die Dimerisierung als auch die Basalaktivität unterdrücken, fungieren Verbindungen, die an eine andere, größere Untertasche binden, lediglich als neutrale Antagonisten und zeigen keinerlei Einfluss auf die quaternäre Anordnung und basale Aktivität von CXCR4. Zusammenfassend verknüpfen diese Ergebnisse CXCR4-Dimerisierung mit der Rezeptordichte in Zellen und seiner Aktivität, was die Grundlage für neue Strategien zur phamakologischen Modulation von CXCR4 darstellen könnte. KW - G-Protein gekoppelter Rezeptor KW - GPCR KW - Receptor KW - Chemokine KW - oligomerization KW - CXCR4 Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-249378 ER - TY - THES A1 - Bathe-Peters, Marc T1 - Spectroscopic approaches for the localization and dynamics of β\(_1\)- and β\(_2\)-adrenergic receptors in cardiomyocytes T1 - Spektroskopieansätze zur Bestimmung der Lokalisation und Dynamiken von β\(_1\)- und β\(_2\)-Adrenozeptoren in Kardiomyozyten N2 - In the heart the β\(_1\)-adrenergic receptor (AR) and the β\(_2\)-AR, two prototypical G protein-coupled receptors (GPCRs), are both activated by the same hormones, namely adrenaline and noradrenaline. Both receptors couple to stimulatory G\(_s\) proteins, mediate an increase in cyclic adenosine monophosphate (cAMP) and influence the contractility and frequency of the heart upon stimulation. However, activation of the β\(_1\)-AR, not the β\(_2\)-AR, lead to other additional effects, such as changes in gene transcription resulting in cardiac hypertrophy, leading to speculations on how distinct effects can arise from receptors coupled to the same downstream signaling pathway. In this thesis the question of whether this distinct behavior may originate from a differential localization of these two receptors in adult cardiomyocytes is addressed. Therefore, fluorescence spectroscopy tools are developed and implemented in order to elucidate the presence and dynamics of these endogenous receptors at the outer plasma membrane as well as on the T-tubular network of intact adult cardiomyocytes. This allows the visualization of confined localization and diffusion of the β\(_2\)-AR to the T-tubular network at endogenous expression. In contrast, the β\(_1\)-AR is found diffusing at both the outer plasma membrane and the T-tubules. Upon overexpression of the β\(_2\)-AR in adult transgenic cardiomyocytes, the receptors experience a loss of this compartmentalization and are also found at the cell surface. These data suggest that distinct signaling and functional effects can be controlled by specific cell surface targeting of the receptor subtypes. The tools at the basis of this thesis work are a fluorescent adrenergic antagonist in combination of fluorescence fluctuation spectroscopy to monitor the localization and dynamics of the lowly expressed adrenergic receptors. Along the way to optimizing these approaches, I worked on combining widefield and confocal imaging in one setup, as well as implementing a stable autofocus mechanism using electrically tunable lenses. N2 - Im Herzen werden der β\(_1\)-adrenerge Rezeptor (AR) und der β\(_2\)-AR, zwei prototypische GPCR, durch die Hormone Adrenalin und Noradrenalin aktiviert. Dabei interagieren beide Rezeptoren mit dem stimulatorischen G\(_s\) Protein, bewirken eine Erhöhung des cyclischen Adenosinmonophosphates (cAMP) und beeinflussen die Kontraktionskraft und Frequenz des Herzens nach einem Stimulus. Jedoch hat die Aktivierung des β\(_1\)-ARs, nicht des β\(_2\)-ARs, auch weitere Effekte, wie z.B. Veränderungen in der Transkription von Genen. Dies wiederum führt zu Spekulationen, wie solch unterschiedliche Effekte von Rezeptoren hervorgerufen werden können, die gleiche Signalwege bedienen. In dieser Arbeit wird untersucht, ob dieses unterschiedliche Verhalten durch eine ungleiche Verteilung dieser beiden Rezeptoren in adulten Kardiomyozyten hervorgerufen werden könnte. Dazu wird die Lokalisation und die Dynamik dieser endogenen Rezeptoren in der Plasmamembran sowie im T-tubulären Netzwerk von intakten adulten Kardiomyozyten, unter Entwicklung und Verwendung hochsensitiver Fluoreszenzspektroskopiemethoden, bestimmt. Dies ermöglicht die örtliche und dynamische Eingrenzung des β\(_2\)-adrenergen Rezeptors unter endogener Expression ausschließlich auf das T-tubuläre Netzwerk. Dementgegen stellt sich heraus, dass sich der β\(_1\)-adrenerge Rezeptor ubiquitär auf der äußeren Membran und den T-Tubuli befindet und diffundiert. In β\(_2\)-AR überexprimierenden transgenen Kardiomyozyten hingegen werden diese Kompartments nicht beibehalten und es findet eine Umverteilung der Rezeptoren, auch unter Einbezug der Zelloberfläche, statt. Diese Daten können stärker darauf hindeuten, dass einige Rezeptorsubtypen sich gezielt und spezifisch bestimmte Zelloberflächen aussuchen, um somit ihre verschiedenen Signale und funktionären Effekte erzeugen zu können. Zu den Techniken, die in dieser Arbeit die Bestimmung der Lokalisation und der Dynamiken der niedrig exprimierten adrenergen Rezeptoren zulassen, gehört die Anwendung von Fluoreszenzspektroskopiemethoden in Kombination mit einem fluoreszierenden β-adrenergen Antagonisten. Weitere Techniken, die im Rahmen dieser Arbeit entwickelt wurden und in weiterführenden Studien aufschlussreiche Erkenntnisse liefern könnten, umfassen die Entwicklung eines Setups aus einer Kombination aus Weitfeld- und Konfokalmikroskopie und die Implementierung eines stabilen Autofokus mit Hilfe einer elektrisch veränderbaren Linse. KW - G-Protein gekoppelte Rezeptoren KW - Beta-Adrenozeptor KW - Kardiomyozyt KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie KW - Fluorescence KW - Fluorescence Microscopy KW - G Protein-Coupled Receptor KW - Autofocus KW - Microscopy KW - Beta-Adrenergic Receptor KW - Cardiomyocyte KW - Fluorescence Correlation Spectroscopy KW - FCS KW - GPCR Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-258126 ER -