TY  - THES
A1  - Agarwal, Shruti
T1  - Functional characterization of four CDK-like kinases and one Calmodulin-dependent kinase of the human malaria parasite, Plasmodium falciparum
T1  - Funktionelle Charakterisierung von vier CDK-like kinasen und eine Calmodulin-dependent kinasen des human Malaria parasite, Plasmodium falciparum
N2  - Malaria still persists as one of the deadliest infectious disease in addition to AIDS and tuberculosis. lt is a leading cause of high mortality and morbidity rates in the developing world despite of groundbreaking research on global eradication of the disease initiated by WHO, about half a century ago. Lack of a commercially available vaccine and rapid spread of drug resistance have hampered the attempts of extinguishing malaria, which still leads to an annual death toll of about one million people. Resistance to anti-malarial compounds thus renders search for new target proteins imperative. The kinome of the human malaria parasite Plasmodium falciparum comprises representatives of most eukaryotic protein kinase groups, including kinases which regulate proliferation and differentiation processes. Several reports till date have suggested involvement of parasite kinases in the human host and as well as in the mosquito vector. Kinases essential for life cycle stages of the parasite represent promising targets for anti-malarial compounds thus, provoking characterization of additional malarial kinases. Despite extensive research on most plasmodial enzymes, very little information is available regarding the four identified members of the cyclin dependent kinase like kinase (CLK) family. Thus, the present thesis dealt with the functional characterization of four members of the PfCLK kinase family of the parasite denoted as PfCLK-1/Lammer, PfCLK-2, PfCLK-3 and PfCLK-4 with a special focus on the first two kinases. Additionally, one Ca2+/Calmodulin dependent putative kinase-related protein, PfPKRP, presumed to be involved in sexual stage development of the parasite, was investigated for its expression in the life cycle of the parasite. In other eukaryotes, CLK kinases regulate mRNA splicing through phosphorylation of Serine/Arginine-rich proteins. Transcription analysis revealed abundance of PfCLK kinase genes throughout the asexual blood stages and in gametocytes. By reverse genetics approach it was demonstrated that all four kinases are essential for completion of the asexual replication cycle of P. falciparum. PfCLK 1/Lammer possesses two nuclear localization signals and PfCLK-2 possesses one of these signals upstream of the C-terminal catalytic domains. Protein level expression and sub-cellular localization of the two kinases was determined by generation of antiserum directed against the kinase domains of the respective kinase. Indirect immunofluorescence, Western blot and electron microscopy data confirm that the kinases are primarily localized in the parasite nucleus, and in vitro assays show that both enzymes are associated with phosphorylation activity. Finally, mass spectrometric analysis of co immunoprecipitated proteins shows interactions of the two PfCLK kinases with proteins, which have putative nuclease, phosphatase or helicase functions. PfPKRP on the other hand is predominantly expressed during gametocyte differentiation as identified from transcriptional analysis. Antiserum directed against the catalytic domain of PfPKRP detected the protein expression profile in both asexual and gametocyte parasite lysates. Via immunofluorescence assay, the kinase was localized in the parasite cytoplasm in a punctuated manner, mostly in the gametocyte stages. Reverse genetics resulted in the generation of PfPKRP gene-disruptant parasites, thus demonstrating that unlike CLK kinases, PfPKRP is dispensable for asexual parasite survival and hence might have crucial role in sexual development of the parasite. On one hand, characterization of PfCLK kinases exemplified the kinases involved in parasite replication cycle. Successful gene-disruption and protein expression of PfPKRP kinase on the other hand, demonstrated a role of the kinase in sexual stage development of the parasite. Both kinase families therefore, represent potential candidates for anti-plasmodial compounds.
N2  - Malaria stellt neben AIDS und Tuberkulose weiterhin eine der bedeutendsten Infektionskrankheiten dar. Trotz intensiver, auf die Auslöschung der Krankheit abzielender Forschung, welche vor etwa 50 Jahren durch die Weltgesundheitsorganisation initiiert wurde, bleibt Malaria einer der Hauptgründe für hohe Mortalität und Morbidität in Entwicklungsländern. Das Fehlen eines Impfstoffes und die schnelle Ausbreitung von Resistenzen erschweren die Versuche, Malaria zu eliminieren, welche jährlich weiterhin eine Todesrate von einer Millionen Menschen aufweist. Aufgrund der Zunahme an Resistenzen ist die Suche nach neuen Angriffspunkten für Antimalariamedikamente zwingend erforderlich. Das Kinom des humanpathogen Parasiten Plasmodium falciparum besteht aus Vertretern der meisten eukaryotischen Proteinkinasegruppen, einschließlich einiger Kinasen, welche Proliferations- und Differenzierungsprozesse regulieren. Verschiedenen Berichten zufolge ist eine Rolle von Parasitenkinasen sowohl im menschlichen Wirt als auch in der die Krankenheit übertragende Mücke denkbar. Kinasen, welche für verschiedene Parasitenstadien essentiell sind, stellen viel versprechende Angriffspunkte für Malariamedikamente dar. Dies bestätigt die Bedeutung der Erforschung von weiteren, bisher uncharakterisierten Kinasen. Trotz extensiver Forschungsarbeit an den meisten Enzymen des Parasiten ist bisher sehr wenig über die vier identifizierten Mitglieder der Proteinfamilie Zyklin-abhängige Kinase-ähnlicher Kinasen (cyclin-dependent kinase like kinases, CLK) bekannt. Aufgrund dessen war die Charakterisierung der vier Mitglieder der PfCLK Kinasefamilie, PfCLK-1/PfLAMMER, PfCLK-2, PfCLK-3 und PfCLK-4 Bestandteil dieser Arbeit. Der Forschungsschwerpunkt lag hierbei auf den beiden erstgenannten Kinasen. Zusätzlich wurde die stadienspezifische Expression von PfPKRP, einer Kinase, welche vermutlich in der Entwicklung der Sexualstadien des Parasiten beteiligt ist, untersucht. In anderen Eukaryoten regulieren die CLK kinases das Spleißen von mRNA durch die Phosphorylierung von Serin-/Arginin-reichen Proteinen. Untersuchungen hinsichtlich der Expression der CLK kinase zeigten eine Transkriptabundanz in allen asexuellen Blutstadien sowie in Gametozyten. Mit Hilfe der Reverse-Genetics-Technik, wurde festgestellt, dass alle vier Kinasen essentiell sind für die asexuelle Replikation von P. falciparum. PfCLK-1/Lammer besitzt zwei Kernlokalisationssequenzen, während PfCLK-2 ein solches Signal stromaufwärts der C-terminalen katalytischen Domäne aufweist. Die Expression auf Proteinebene sowie die subzelluläre Lokalisation der beiden Kinasen wurde durch die Herstellung von Antiseren gegen die jeweilige Kinasedomainen hergestellt. Indirekte Immunfluoreszenzstudien, Westernblots und elektronenmikroskopische Daten bestätigten die Lokalisation vornehmlich in Zellkern des Parasiten. In-vitro-Studien demonstrierten, das beide Enzyme mit Phosphorylierungsaktivität assoziierte sind. Die massenspektrometrische Analyse von ko-immunopräzipitierten Proteinen zeigten Interaktionen der beiden PfCLK Kinasen mit Proteinen, welche vermutlich Nuklease-, Phosphatase- oder Helikase-Funktion besitzen. Im Gegensatz zu den CLK-Kinasen wird PfPKRP wird hauptsächlich während der Differenzierung der Gametozyten exprimiert wie Transkriptanalysen zeigten. Antiseren gegen die katalytische Domäne von PfPKRP detektierten jedoch Proteinexpression sowohl in Lysaten asexueller Parasiten als auch in Gametozytenlysaten. In Immunfluoreszenzstudien wurde ein punktiertes Expressionsmuster im Zytoplasma beobachtet, wobei die Expression vornehmlich in Gametozyten stattfand. Die Tatsache, dass die Herstellung einer PfPKRP-Knock out Mutante möglich war, zeigt, dass PfPKRP für das Überleben asexueller Parasiten entbehrlich ist, weshalb eine wichtige Rolle in der sexuellen Entwicklung der Parasiten möglich ist. Zum Einen dient die Charakterisierung der PfCLK-Kinasen als Beispiel für Kinasen, welche eine wichtige Rolle im Replikationszyklus der Parasiten spielen. Das erfolgreiche Ausschalten von PfPKRP sowie Untersuchungen zur Expression der PfPKRP-Kinase lassen zum Anderen eine Rolle in den Sexual- oder Transmissionstadien vermuten. Aufgrund dessen stellen beide Kinasefamilien viel versprechende Kandidaten für die Herstellung von malariamedikamenten dar.
KW  - Plasmodium falciparum
KW  - Kinasen
KW  - RNS-Spleißen
KW  - Malaria
KW  - Kinase
KW  - Calcium
KW  - Splicing
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48522
ER  - 
TY  - THES
A1  - Engelhardt, Catherine Marie
T1  - Identification and characterisation of the Spred protein family
T1  - Identifizierung und Charakterisierung der Spred Proteinfamilie
N2  - The subject of this thesis was the cloning and the initial biochemical and functional characterisation of novel human proteins with an N-terminal Ena-VASP homology (EVH)-1 domain and a C-terminal Sprouty homologous region (SPR), which are related to the Drosophila AE33 protein. During the course of this work, three mouse homologues of the AE33 fly protein have been reported and termed Sprouty-related protein with an EVH-1 domain 1, 2 and 3 (Spred-1, -2, -3)(Wakioka et al, 2001; Kato et al, 2003). Spred-1, -2 and -3 are membrane associated substrates of receptor tyrosine kinases and they act as negative regulators of the Ras pathway during growth factor stimulation. As the Spred-family members seem to exert similar functions, the specific function of each member remains enigmatic. Therefore, we investigated the mRNA and protein expression patterns of the two murine protein family members Spred-1 and Spred-2 on the whole organ level. Furthermore, we focussed on the cellular localisation and the role of human and murine Spred-2 in the organism. The expression patterns of Spred-1 and Spred-2 differed markedly among various tissues and cell types. In mouse, Spred-1 is abundantly expressed in adult brain, cerebellum, and fetal tissues, whereas Spred-2 was ubiquitously expressed. In humans, Spred-2 was found to be strongly expressed in glandular epithelia and in invasive cytotrophoblasts, and at the subcellular level its immunoreactivity was associated with secretory vesicles and was found to colocalise with Rab11 GTPase. The new human Spred gene family was investigated in detail. Cloning of the fulllength form of human Spred-2 resulted in an 1254 bp coding sequence, corresponding to a 418 amino-acids protein. Immunoblotting with a set of affinitypurified antibodies confirmed the expression of a 47 kDa protein and suggested the presence of additional differently sized variants. Cloning of various shortened Spred- 2 mRNAs and identification of 2 additional human Spred genes (localised on different chromosomes) with their respective EST (expressed sequence tag) revealed that the new human Spred gene family displays extensive splicing, leading to the generation of short and long Spred proteins. All protein isoforms and splicing variants contain an EVH1-domain located at the N-terminus of the protein. The full-length forms (“a” forms) comprised the SPR, another functional domain localised at the C-terminus whereas the short variants (Spred-1b, 2 c-e, 3 c) lack the entire C-terminal SPR domain or part of it. The existence of short and long splicing variants of Spred-1, -2 and -3 revealed a common principle of organisation and splicing pattern in the Spred family. Functional analyses of the 5 cloned Spred-2 splicing variants revealed differential subcellular localisation and differential regulation of serum- and EGF- mediated ERK activation in HEK-293 cells. Taken together, these results indicate a highly specific expression pattern of Spred-1 and Spred-2 in various tissues suggesting a specific physiological role for the individual Spred isoform in these tissues. For example, Spred-2 appears to be involved in regulating secretory pathways. Furthermore, the human Spred family contains three genes, which are subject to extensive alternative splicing resulting in at least 8 different proteins with differential subcellular localisation and differential regulatory potential of the MAPK pathways during growth factor stimulation.
N2  - Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Klonierung, sowie die biochemische und funktionelle Charakterisierung der neuen Spred Proteinfamilie, welche sich durch eine N-terminale EVH1-Domäne und C-terminal eine Sprouty homology Domäne (SPR) auszeichnet (Sprouty-related protein with an EVH-1 domain, Spred). Spred-1, -2, -3 sind membranassoziierte Substrate von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen und hemmen den Wachstumsfaktor-stimulierten Ras Signalweg. Während für die drei Mitglieder der Spred-Familie ähnliche biochemische Funktionen beschrieben sind, ist bislang deren spezifische physiologische Funktion unbekannt. Wir haben deshalb zunächst die mRNA- und Protein-Expression von Spred-1 und Spred-2 in verschiedenen Organen der Maus untersucht. Zudem haben wir die zelluläre und subzelluläre Lokalisation bestimmt. Dabei zeigte sich, daß sich die Expression der Spred-Isoformen deutlich voneinander unterscheidet. Während Spred-1 stark im Großhirn, Kleinhirn und in fetalen Geweben exprimiert wird, kommt Spred-2 verstärkt in adulten Geweben vor. Beim Menschen konnte zudem gezeigt werden, daß Spred-2 stark in Drüsenepithelien, in Zytotrophoblasten und auf subzellulärer Ebene mit sekretorischen Vesikeln assoziiert war. Das Expressionsmuster der humanen Spred-Proteine wurde im Detail untersucht. Die Klonierung des humanen Spred-2 ergab eine 1254 bp lange kodierende Sequenz, die für ein Protein mit 418 Aminosäuren kodiert. Durch einen Immunoblot mit affinitätsgereinigten Antikörpern bestätigte sich die Expression eines 47 kD großen Proteins, gleichzeitig zeigten sich zusätzliche Varianten des Proteins mit abweichenden Größen. Daraufhin konnten vier kürzere mRNAs für Spred-2 kloniert werden, die durch alternatives Spleißen entstehen. Zudem konnten zwei neue Spred-Gene identifiziert werden, die auf unterschiedlichen Chromosomen lokalisiert sind und die jeweils für mehrere Proteine unterschiedlicher Größe kodieren. Alle Proteinisoformen und Spleißvarianten enthalten eine N-terminale EVH-1-Domäne, während nur die langen Isoformen (“a-Formen”) zusätzlich eine C-terminale SPRDomäne enthalten. Die Untersuchung der Funktion der 5 klonierten Spleißvarianten von Spred-2 ergab eine differentielle subzelluläre Lokalisation. Zudem zeigte sich eine unterschiedliche Regulation der Serum- und EGF-induzierten ERK-Aktivierung durch die verschiedenen Spred-2 Spleißvarianten. Diese Ergebnisse zeigen, daß Spred-1 und Spred-2 ein hochspezifisches Expressionsmuster in verschiedenen Organen aufweisen, ein Befund, der auf eine spezifische funktionelle Rolle der einzelnen Isoformen hindeutet. Die vorliegenden Befunde weisen darauf hin, daß Spred-2 an der Regulation sekretorischer Vorgänge beteiligt ist. Die Mitglieder der humanen Spred Proteinfamilie werden von drei Genen kodiert, durch alternatives Spleißen resultieren hieraus mindestens 8 verschiedene mRNAs. Werden die korrespondierenden Proteine überexprimiert, zeigen sie differentielle subzelluläre Lokalisationen und unterschiedliche Regulation der MAPKinase Aktivität.
KW  - Spred Protein
KW  - RNS-Spleißen
KW  - EVH1 Domäne
KW  - Spred Protein
KW  - Spleißvarianten
KW  - EVH1 domain
KW  - Spred protein
KW  - splice variant
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11456
ER  -