TY - JOUR A1 - Brenner, Daniela A1 - Geiger, Nina A1 - Schlegel, Jan A1 - Diesendorf, Viktoria A1 - Kersting, Louise A1 - Fink, Julian A1 - Stelz, Linda A1 - Schneider-Schaulies, Sibylle A1 - Sauer, Markus A1 - Bodem, Jochen A1 - Seibel, Jürgen T1 - Azido-ceramides, a tool to analyse SARS-CoV-2 replication and inhibition — SARS-CoV-2 is inhibited by ceramides JF - International Journal of Molecular Sciences N2 - Recently, we have shown that C6-ceramides efficiently suppress viral replication by trapping the virus in lysosomes. Here, we use antiviral assays to evaluate a synthetic ceramide derivative α-NH2-ω-N3-C6-ceramide (AKS461) and to confirm the biological activity of C6-ceramides inhibiting SARS-CoV-2. Click-labeling with a fluorophore demonstrated that AKS461 accumulates in lysosomes. Previously, it has been shown that suppression of SARS-CoV-2 replication can be cell-type specific. Thus, AKS461 inhibited SARS-CoV-2 replication in Huh-7, Vero, and Calu-3 cells up to 2.5 orders of magnitude. The results were confirmed by CoronaFISH, indicating that AKS461 acts comparable to the unmodified C6-ceramide. Thus, AKS461 serves as a tool to study ceramide-associated cellular and viral pathways, such as SARS-CoV-2 infections, and it helped to identify lysosomes as the central organelle of C6-ceramides to inhibit viral replication. KW - ceramides KW - SARS-CoV-2 KW - azido-ceramides KW - sphingolipids Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-313581 SN - 1422-0067 VL - 24 IS - 8 ER - TY - JOUR A1 - Diesendorf, Viktoria A1 - Roll, Valeria A1 - Geiger, Nina A1 - Fähr, Sofie A1 - Obernolte, Helena A1 - Sewald, Katherina A1 - Bodem, Jochen T1 - Drug-induced phospholipidosis is not correlated with the inhibition of SARS-CoV-2 - inhibition of SARS-CoV-2 is cell line-specific JF - Frontiers in Cellular and Infection Microbiology N2 - Recently, Tummino et al. reported that 34 compounds, including Chloroquine and Fluoxetine, inhibit SARS-CoV-2 replication by inducing phospholipidosis, although Chloroquine failed to suppress viral replication in Calu-3 cells and patients. In contrast, Fluoxetine represses viral replication in human precision-cut lung slices (PCLS) and Calu-3 cells. Thus, it is unlikely that these compounds have similar mechanisms of action. Here, we analysed a subset of these compounds in the viral replication and phospholipidosis assays using the Calu-3 cells and PCLS as the patient-near system. Trimipramine and Chloroquine induced phospholipidosis but failed to inhibit SARS-CoV-2 replication in Calu-3 cells, which contradicts the reported findings and the proposed mechanism. Fluoxetine, only slightly induced phospholipidosis in Calu-3 cells but reduced viral replication by 2.7 orders of magnitude. Tilorone suppressed viral replication by 1.9 orders of magnitude in Calu-3 cells without causing phospholipidosis. Thus, induction of phospholipidosis is not correlated with the inhibition of SARS-CoV-2, and the compounds act via other mechanisms. However, we show that compounds, such as Amiodarone, Tamoxifen and Tilorone, with antiviral activity on Calu-3 cells, also inhibited viral replication in human PCLS. Our results indicate that antiviral assays against SARS-CoV-2 are cell-line specific. Data from Vero E6 can lead to non-transferable results, underlining the importance of an appropriate cell system for analysing antiviral compounds against SARS-CoV-2. We observed a correlation between the active compounds in Calu-3 cells and PCLS. KW - SARS-CoV-2 KW - phospholipidosis KW - Vero E6 KW - PCLS KW - Calu-3 KW - antivirals KW - Tamoxifen KW - cell line-specificity Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-326202 SN - 2235-2988 VL - 13 ER - TY - THES A1 - Ganskih, Sabina T1 - Dissecting the functional interplay between SARS-CoV-2 viral RNAs and the host proteome T1 - Charakterisierung der funktionalen Interaktionen zwischen SARS-CoV-2 RNA und dem Wirtszellproteom N2 - The recent pandemic has reminded the public that basic research in virology is pivotal for human health. Understanding the mechanisms of successful viral replication and the role of host factors can help to combat viral infections and prevent future pandemics. Our lab has published the first SARS-CoV-2 RNA-protein interaction atlas, laying the foundation to investigate the interplay between viral RNA and host RNA binding proteins (RBP). Based on this, my project created the largest collection of binding profiles of host and viral RBPs on SARS-CoV-2 RNA to date. This revealed the host protein SND1 as the first human RBP that specifically binds negative sense viral RNA at the 5´ end, a region associated with viral transcription initiation. The binding profile shares similarities with the viral RBP nsp9, which binds the 5´ ends of positive and negative sense SARS-CoV-2 RNA. Depletion of SND1 shows reduced levels of viral RNA revealing it as a proviral host factor. To decode the underlying molecular mechanism, I characterized the protein-protein interactions of SND1 in SARS-CoV-2 infected and uninfected cells. Infection remodels the protein interactors of SND1 from general RNA biology to membrane association and viral RNA synthesis. Upon infection, SND1 specifically interacts with nsp9, the RBP that shares the same binding region on the negative strand of SARS-CoV-2 RNA. Recent work demonstrates that nsp9 is NMPylated in vitro suggesting a functional role of nsp9 in priming of viral RNA synthesis. I was able to show that nsp9 is covalently linked to the 5´ ends of SARS-CoV-2 RNA during infection of human cells. Analysing the covalent bond of nsp9 with the viral RNA on nucleotide level shows close proximity to the initiation sites of viral RNA synthesis, suggesting that nsp9 acts as a protein-primer of SARS-CoV-2 RNA synthesis. SND1 modulates the distribution of nsp9 on the viral RNA, since depletion of SND1 results in imbalanced occupancy of nsp9 at the 5´ends of viral RNA. This study is the first to provide evidence for the priming mechanism of SARS-CoV-2 in authentic viral replication and further reveals how this mechanism is modulated by the host RBP SND1. Detailed knowledge about priming of viral RNA synthesis can help to find targeted antivirals that could be used to fight coronaviral infections. N2 - Die letzte Pandemie zeigte erneut, das Grundlagenforschung im Bereich der Virologie essentiell für die Gesundheit des Menschen ist. Das Wissen über Schlüsselelemente erfolgreicher viraler Replikation und der Relevanz humaner Proteine darin kann helfen Infektionen zu bekämpfen und künftige Pandemien zu verhindern. Unser Labor publizierte das erste SARS-CoV-2 RNA Protein-Interaktom und legte dabei den Grundstein für die Forschung am Zwischenspiel viraler RNA und humanen RNA Bindeproteinen (RBPs). Basierend darauf, generierte mein Projekt die bislang größte Sammlung an Bindeprofilen humaner sowie viraler RBPs auf der SARS-CoV-2 RNA. Dabei zeigte sich der Wirtsfaktor SND1 als das erste human RBP das in der Lage ist den Negativstrang der viral RNA zu binden, spezifisch an dessen 5´ Ende welches mit der Transkriptionsinitiierung assoziiert ist. Diese Bindestelle ist ähnlich zu dem viralen RBP nsp9, welches die 5´ Enden der positiv und negativ RNA bindet. Das Fehlen von SND1 in der Wirtszelle führt zu reduzierten Mengen viraler RNA und impliziert daher einen proviralen Einfluss von SND1. Um den zugrundeliegenden molekularen Mechanismus zu verstehen, betrachtete ich die Protein-Protein Interaktionen von SND1 in SARS-CoV-2 infizierten und uninfizierten Zellen. Dabei zeigte sich, dass durch die Infektion die Interaktionspartner von SND1 von genereller RNA Biologie zu Membranassoziierung sowie viraler RNA Synthese verschiebt. Mit Infektion der Zelle interagiert SND1 spezifisch mit nsp9, das RBP welches dieselbe Binderegion am Negativstrang mit SND1 auf der SARS-CoV-2 RNA teilt. Neuste in vitro Studien zeigen, dass nsp9 NMPyliert wird und deuten damit eine Relevanz von nsp9 in Priming an. Ich konnte im Kontext authentischer viraler Replikation zeigen, dass nsp9 kovalent an die 5´ Enden der SARS-CoV-2 RNA gebunden ist. Bei genauerer Untersuchung der kovalenten Bindung von nsp9 an der viralen RNA auf Nukleotidebene zeigt, dass diese Nahe der Initiationsstelle der Transkription liegen, was eine Relevanz von nsp9 als Protein-Primer in der SARS-CoV-2 RNA Synthese impliziert. Die Richtige Verteilung von nsp9 auf der viralen RNA wird von SND1 moduliert, da Abwesenheit von SND1 zu einem Ungleichgewicht von nsp9 an den 5´ Enden führt. XII Diese Studie ist die Erste, die Evidenzen für den Primingmechanismus von SARS-CoV-2 in authentischer viraler Replikation zeigt und wie diese durch SND1 moduliert wird. Detailliertes Wissen über das Priming viraler RNA Synthese kann dabei helfen gezielte nach antiviralen Substanzen zu suchen, die dabei helfen könnten Infektionen durch Coronaviren zu bekämpfen. KW - SARS-CoV-2 KW - RNA-Protein Interaktom KW - RNA-protein interactome Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-346486 ER - TY - JOUR A1 - Geiger, Nina A1 - Diesendorf, Viktoria A1 - Roll, Valeria A1 - König, Eva-Maria A1 - Obernolte, Helena A1 - Sewald, Katherina A1 - Breidenbach, Julian A1 - Pillaiyar, Thanigaimalai A1 - Gütschow, Michael A1 - Müller, Christa E. A1 - Bodem, Jochen T1 - Cell type-specific anti-viral effects of novel SARS-CoV-2 main protease inhibitors JF - International Journal of Molecular Sciences N2 - Recently, we have described novel pyridyl indole esters and peptidomimetics as potent inhibitors of the severe acute respiratory syndrome coronavirus type 2 (SARS-CoV-2) main protease. Here, we analysed the impact of these compounds on viral replication. It has been shown that some antivirals against SARS-CoV-2 act in a cell line-specific way. Thus, the compounds were tested in Vero, Huh-7, and Calu-3 cells. We showed that the protease inhibitors at 30 µM suppress viral replication by up to 5 orders of magnitude in Huh-7 cells, while in Calu-3 cells, suppression by 2 orders of magnitude was achieved. Three pyridin-3-yl indole-carboxylates inhibited viral replication in all cell lines, indicating that they might repress viral replication in human tissue as well. Thus, we investigated three compounds in human precision-cut lung slices and observed donor-dependent antiviral activity in this patient-near system. Our results provide evidence that even direct-acting antivirals may act in a cell line-specific manner. KW - SARS-CoV-2 KW - protease inhibitors KW - cell line specificity pyridyl indole carboxylates KW - azapeptide nitriles KW - peptidomimetics Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-304034 SN - 1422-0067 VL - 24 IS - 4 ER - TY - JOUR A1 - Osmanoglu, Özge A1 - Gupta, Shishir K. A1 - Almasi, Anna A1 - Yagci, Seray A1 - Srivastava, Mugdha A1 - Araujo, Gabriel H. M. A1 - Nagy, Zoltan A1 - Balkenhol, Johannes A1 - Dandekar, Thomas T1 - Signaling network analysis reveals fostamatinib as a potential drug to control platelet hyperactivation during SARS-CoV-2 infection JF - Frontiers in Immunology N2 - Introduction Pro-thrombotic events are one of the prevalent causes of intensive care unit (ICU) admissions among COVID-19 patients, although the signaling events in the stimulated platelets are still unclear. Methods We conducted a comparative analysis of platelet transcriptome data from healthy donors, ICU, and non-ICU COVID-19 patients to elucidate these mechanisms. To surpass previous analyses, we constructed models of involved networks and control cascades by integrating a global human signaling network with transcriptome data. We investigated the control of platelet hyperactivation and the specific proteins involved. Results Our study revealed that control of the platelet network in ICU patients is significantly higher than in non-ICU patients. Non-ICU patients require control over fewer proteins for managing platelet hyperactivity compared to ICU patients. Identification of indispensable proteins highlighted key subnetworks, that are targetable for system control in COVID-19-related platelet hyperactivity. We scrutinized FDA-approved drugs targeting indispensable proteins and identified fostamatinib as a potent candidate for preventing thrombosis in COVID-19 patients. Discussion Our findings shed light on how SARS-CoV-2 efficiently affects host platelets by targeting indispensable and critical proteins involved in the control of platelet activity. We evaluated several drugs for specific control of platelet hyperactivity in ICU patients suffering from platelet hyperactivation. The focus of our approach is repurposing existing drugs for optimal control over the signaling network responsible for platelet hyperactivity in COVID-19 patients. Our study offers specific pharmacological recommendations, with drug prioritization tailored to the distinct network states observed in each patient condition. Interactive networks and detailed results can be accessed at https://fostamatinib.bioinfo-wuerz.eu/. KW - signaling network KW - controllability KW - platelet KW - SARS-CoV-2 KW - fostamatinib KW - drug repurposing KW - COVID-19 Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-354158 VL - 14 ER - TY - THES A1 - Seitz, Florian T1 - Synthesis, enzymatic recognition and antiviral properties of modified purine nucleosides T1 - Synthese, enzymatische Erkennung und antivirale Eigenschaften modifizierter Purin-Nukleoside N2 - Beyond the four canonical nucleosides as primary building blocks of RNA, posttranscriptional modifications give rise to the epitranscriptome as a second layer of genetic information. In eukaryotic mRNA, the most abundant posttranscriptional modification is N6-methyladenosine (m6A), which is involved in the regulation of cellular processes. Throughout this thesis, the concept of atomic mutagenesis was employed to gain novel mechanistic insights into the substrate recognition by human m6A reader proteins as well as in the oxidative m6A demethylation by human demethylase enzymes. Non-natural m6A atomic mutants featuring distinct steric and electronic properties were synthesized and incorporated into RNA oligonucleotides. Fluorescence anisotropy measurements using these modified oligonucleotides revealed the impact of the atomic mutagenesis on the molecular recognition by the human m6A readers YTHDF2, YTHDC1 and YTHDC2 and allowed to draw conclusions about structural prerequisites for substrate recognition. Furthermore, substrate recognition and demethylation mechanism of the human m6A demethylase enzymes FTO and ALKBH5 were analyzed by HPLC-MS and PAGE-based assays using the modified oligonucleotides synthesized in this work. Modified nucleosides not only expand the genetic alphabet, but are also extensively researched as drug candidates. In this thesis, the antiviral mechanism of the anti-SARS-CoV-2 drug remdesivir was investigated, which causes delayed stalling of the viral RNA-dependent RNA polymerase (RdRp). Novel remdesivir phosphoramidite building blocks were synthesized and used to construct defined RNA-RdRp complexes for subsequent studies by cryogenic electron microscopy (cryo-EM). It was found that the 1'-cyano substituent causes Rem to act as a steric barrier of RdRp translocation. Since this translocation barrier can eventually be overcome by the polymerase, novel derivatives of Rem with potentially improved antiviral properties were designed. N2 - Über die vier kanonischen Nukleoside als primäre RNA-Bausteine hinausgehend bauen posttranskriptionelle Modifikationen eine zweite Informationsebene, das Epitranskriptom, auf. Die häufigste posttranskriptionelle Modifikation in eukaryotischer mRNA ist N6-Methyladenosin (m6A), welches in die Regulierung zellulärer Prozesse involviert ist. In dieser Arbeit wurde das Konzept der atomaren Mutagenese genutzt, um neue Einblicke in die Erkennung von m6A durch menschliche m6A-bindende Proteine sowie in die oxidative Demethylierung von m6A durch menschliche Demethylase-Enzyme zu gewinnen. Es wurden nicht natürlich vorkommende m6A Atommutanten mit unterschiedlichen elektronischen und sterischen Eigenschaften synthetisiert und in RNA-Oligonukleotide eingebaut. Durch Fluoreszenzanisotropie-Messungen mit diesen Oligonukleotiden wurde der Einfluss der Atommutagenese auf die molekulare Erkennung durch die menschlichen m6A-bindenden Proteine YTHDF2, YTHDC1 und YTHDC2 untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse ließen Rückschlüsse auf die strukturellen Voraussetzungen für die Erkennung eines Substrates zu. Weiterhin wurden die in dieser Arbeit synthetisierten modifizierten Oligonukleotide zur Untersuchung von Substraterkennung und Demethylierungs-Mechanismus der menschlichen m6A-Demethylasen FTO und ALKBH5 mittels HPLC-MS- und PAGE-basierter Analysen verwendet. Modifizierte Nukleoside dienen nicht nur zur Erweiterung des genetischen Alphabets, sondern werden auch als potentielle Wirkstoff-Kandidaten erforscht. In dieser Arbeit wurde der antivirale Wirkmechanismus des Anti-SARS-CoV-2-Wirkstoffes Remdesivir untersucht, der eine verzögerte Blockade der viralen RNA-abhängigen RNA-Polymerase (RdRp) bewirkt. Neuartige Remdesivir Phosphoramidit-Bausteine wurden synthetisiert und genutzt, um RNA-RdRp-Komplexe mit definierter Struktur zu konstruieren, welche anschließend mittels Cryoelektronenmikroskopie (Cryo-EM) untersucht wurden. Es wurde herausgefunden, dass der 1'-Cyano-Substituent dazu führt, dass Rem als sterische Blockade der RdRp-Translokation agiert. Da diese Tranlokationsbarriere von der Polymerase überwunden werden kann, wurden neuartige Rem-Derivate mit potentiell verbesserten antiviralen Eigenschaften entworfen. KW - Nucleinsäuren KW - Nucleoside KW - Demethylierung KW - COVID-19 KW - SARS-CoV-2 KW - Demethylase KW - Epitranskriptom Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-313238 ER - TY - THES A1 - Sitter, Magdalena Maria T1 - Intensivmedizinische Behandlungen bei SARS-CoV-2 in der Schwangerschaft - Daten aus dem CRONOS-Register T1 - Intensive Care Treatment at SARS-CoV-2 Infection during Pregnancy — First Data from the CRONOS-Registry N2 - Mit dem Auftreten des SARS-CoV-2 Virus im Jahr 2020 war der Informationsgewinn für vulnerable Patientengruppen essentiell. Ziel dieser Arbeit war es maternale Charakteristika und das klinische Bild SARS-CoV-2 positiver Frauen mit Notwendigkeit einer intensivmedizinischen Behandlung während der Schwangerschaft und postpartal darzustellen, und diese Kohorte mit den SARS-CoV-2 positiven Schwangeren ohne intensivmedizinischen Handlungsbedarf zu vergleichen. Die Daten stammten aus dem deutschen CRONOS-Register, einem prospektiven, multizentrischen Register für SARS-CoV-2 positive schwangere Frauen. Eingeschlossen wurden alle schwangeren und postpartalen Frauen, die während ihrer SARS-CoV-2 Infektion auf eine ITS aufgenommen wurden. Diese wurden hinsichtlich maternaler Charakteristika, Krankheitsverlauf, sowie Outcomes verglichen. In 101 von 2650 Fällen (4%) der Patientinnen des CRONOS-Registers, kam es zu einer Aufnahme auf die ITS. Als invasivste Form der COVID-19 Behandlung war bei 6 Patientinnen nur eine Überwachung notwendig, 30 Patientinnen benötigten eine Sauerstoffinsufflation, 22 wurden nicht-invasiv beatmet, 28 erhielten eine invasive Beatmung und bei 15 Frauen wurde die Behandlung zur ECMO-Therapie eskaliert. Es wurden keine klinisch signifikanten Unterschiede zwischen Patientinnen gefunden, die unterschiedliche Behandlungsformen benötigten. Die Gruppe der ITS und Non-ITS Patientinnen unterschied sich statistisch signifikant beim Einfluss von Alter, BMI bei Einschluss und der Herkunft. Die Prävalenz der Frühgeburtlichkeit war unter den invasiv behandelten Patientinnen signifikant höher und auch im Vergleich der ITS mit den Non-ITS Patientinnen zeigte sich ein signifikanter Unterschied. Vier Frauen verstarben an COVID-19 und sechs Feten der ITS-Gruppe waren Totgeburten. Diese Kohorte zeigt, dass schwere COVID-19 Erkrankung bei schwangeren Frauen und Wöchnerinnen selten sind. Die Frühgeburtenrate ist hoch und COVID-19 mit Notwendigkeit einer Atemunterstützung erhöht das Risiko für ein schlechtes maternales und neonatales Outcome. Unter anderem ein höheres Alter und BMI sind mit einem höheren Risiko für eine ITS-Aufnahme verbunden. N2 - With the spreading of the SARS-CoV-2 virus in the year 2020, gain of information regarding vulnerable groups of patients was essential. We aimed to describe maternal characteristics and clinical presentation of SARS-CoV-2 positive women requiring intensive care treatment for COVID-19 during pregnancy and postpartum period, based on data of a comprehensive German surveillance system in obstetric patients. Data from COVID-19 Related Obstetric and Neonatal Outcome Study (CRONOS), a prospective multicenter registry for SARS-CoV-2 positive pregnant women, was analyzed with respect to ICU treatment. All women requiring intensive care treatment for COVID-19 were included and compared regarding maternal characteristics, course of disease, as well as maternal and neonatal outcomes. Also the ICU-cohort was compared to the cohort of pregnant and postpartum women not requiring intensive care treatment searching for characteristics and risk factors. Of 2650 cases in CRONOS, 101 women (4%) had a documented ICU stay. As the most invasive form of COVID-19 treatment interventions, patients received either continuous monitoring of vital signs without further treatment requirement (n = 6), insufflation of oxygen (n = 30), non-invasive ventilation (n = 22), invasive ventilation (n = 28), or escalation to extracorporeal membrane oxygenation (n = 15). No significant clinical differences were identified between patients receiving different forms of ventilatory support for COVID-19. Prevalence of preterm delivery was significantly higher in women receiving invasive respiratory treatments as well as in women receiving intensive care treatment in general. Four women died of COVID-19 and six fetuses were stillborn. Our cohort shows that progression of COVID-19 in pregnant and postpartum women with admission to ICU is rare. Preterm birth rate is high and COVID-19 requiring respiratory support increases the risk of poor maternal and neonatal outcome. Admission to ICU in this cohort was associated with a higher maternal age and maternal BMI before pregnancy. KW - Schwangerschaft KW - Intensivmedizin KW - COVID-19 KW - SARS-CoV-2 KW - Pregnancy KW - Critical Care Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-325462 ER - TY - JOUR A1 - Solimando, Antonio G. A1 - Bittrich, Max A1 - Shahini, Endrit A1 - Albanese, Federica A1 - Fritz, Georg A1 - Krebs, Markus T1 - Determinants of COVID-19 disease severity – lessons from primary and secondary immune disorders including cancer JF - International Journal of Molecular Sciences N2 - At the beginning of the COVID-19 pandemic, patients with primary and secondary immune disorders — including patients suffering from cancer — were generally regarded as a high-risk population in terms of COVID-19 disease severity and mortality. By now, scientific evidence indicates that there is substantial heterogeneity regarding the vulnerability towards COVID-19 in patients with immune disorders. In this review, we aimed to summarize the current knowledge about the effect of coexistent immune disorders on COVID-19 disease severity and vaccination response. In this context, we also regarded cancer as a secondary immune disorder. While patients with hematological malignancies displayed lower seroconversion rates after vaccination in some studies, a majority of cancer patients’ risk factors for severe COVID-19 disease were either inherent (such as metastatic or progressive disease) or comparable to the general population (age, male gender and comorbidities such as kidney or liver disease). A deeper understanding is needed to better define patient subgroups at a higher risk for severe COVID-19 disease courses. At the same time, immune disorders as functional disease models offer further insights into the role of specific immune cells and cytokines when orchestrating the immune response towards SARS-CoV-2 infection. Longitudinal serological studies are urgently needed to determine the extent and the duration of SARS-CoV-2 immunity in the general population, as well as immune-compromised and oncological patients. KW - COVID-19 KW - SARS-CoV-2 KW - disorder of immunity KW - cancer Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-319412 SN - 1422-0067 VL - 24 IS - 10 ER - TY - THES A1 - Stiller, Carina T1 - Synthesis and applications of modified nucleosides and RNA nucleotides T1 - Synthese und Anwendungen von modifizierten Nukleosiden und RNA-Nukleotiden N2 - As central components of life, DNA and RNA encode the genetic information. However, RNA performs several functions that exceed the competences stated in the ‘central dogma of life‘. RNAs undergo extensive post-transcriptional processing like chemical modifications. Among all classes of RNA, tRNAs are the most extensively modified. Their modifications are chemically diverse and vary from simple methylations (e.g. m3C, m6A) to more complex residues, like isopentenyl group (e.g. i6A, hypermodifications: e.g. ms2i6A) or even amino acids (e.g. t6A). Depending on their location within the overall structure, modifications can have an impact on tRNA stability and structure, as well as affinity for the ribosome and translation efficiency and fidelity. Given the importance of tRNA modifications new tools are needed for their detection and to study their recognition by proteins and enzymatic transformations. The chemical synthesis of these naturally occurring tRNA modifications as phosphoramidite building blocks is a prerequisite to incorporate the desired modification via solid-phase synthesis into oligonucleotides. With the help of the m3C, (ms2)i6A, and t6A oligonucleotides, the importance and impact of tRNA modifications was investigated in this thesis. To this end, the role of METTL8 as the methyltransferase responsible for the installation of the methyl group at C32 for mt-tRNAThr and mt-tRNASer(UCN) was resolved. Thereby, the respective adenosine modification on position 37 is essential for the effectiveness of the enzyme. Besides, by means of NMR analysis, CD spectroscopy, thermal denaturation experiments, and native page separation, the impact of m3C32 on the structure of the tRNA ASLs was shown. The modification appeared to fine-tune the tRNA structure to optimize mitochondrial translation. To investigate the regulation of the dynamic modification pathway of m3C, demethylation assays were performed with the modified tRNA-ASLs and the (α-KG)- and Fe(II)-dependent dioxygenase ALKBH1 and ALKHB3. A demethylation activity of ALKBH3 on the mt-tRNAs was observed, even though it has so far only been described as a cytoplasmic enzyme. Whether this is physiologically relevant and ALKBH3 present a mitochondrial localization needs further validation. In addition, ALKBH1 was confirmed to not be able to demethylate m3C on mt-tRNAs, but indications for a deprenylation and exonuclease activity were found. Furthermore, the aforementioned naturally occurring modifications were utilized to find analytical tools that can determine the modification levels by DNAzymes, which cleave RNA in the presence of a specific modification. Selective DNA enzymes for i6A, as well as the three cytidine isomers m3C, m4C, and m5C have been identified and characterized. Besides the naturally occurring tRNA modifications, the investigation on artificially modified nucleosides is also part of this thesis. Nucleosides with specific properties for desired applications can be created by modifying the scaffold of native nucleosides. During the pandemic, the potential of antiviral nucleoside analogues was highlighted for the treatment of the SARS-CoV-2 infection. For examinations of the potential drug-candidate Molnupiravir, the N4-hydroxycytidine phosphoramidite building block was synthesized and incorporated into several RNA oligonucleotides. A two-step model for the NHC-induced mutagenesis of SARS-CoV-2 was proposed based on RNA elongation, thermal denaturation, and cryo-EM experiments using the modified RNA strands with the recombinant SARS-CoV-2 RNA-dependent RNA polymerase. Two tautomeric forms of NHC enable base pairing with guanosine in the amino and with adenosine in the imino form, leading to error catastrophe after the incorporation into viral RNA. These findings were further corroborated by thermal melting curve analysis and NMR spectroscopy of the NHC-containing Dickerson Drew sequence. In conclusion, the anti-amino form in the NHC-G base pair was assigned by NMR analysis using a 15N-labeld NHC building block incorporated into the Dickerson Drew sequence. This thesis also addressed the synthesis of a 7-deazaguanosine crosslinker with a masked aldehyde as a diol linker for investigations of DNA-protein interactions. The diol functional group can be unmasked to release the reactive aldehyde, which can specifically form a covalent bond with amino acids Lys or Arg within the protein complex condensin. The incorporation of the synthesized phosphoramidite and triphosphate building blocks were shown and the functionality of the PCR product containing the crosslinker was demonstrated by oxidation and the formation of a covalent bond with a fluorescein label. The development of assays that detect changes in this methylation pattern of m6A could provide new insights into important biological processes. In the last project of this thesis, the influence of RNA methylation states on the structural properties of RNA was analyzed and a fluorescent nucleoside analog (8-vinyladenosine) as molecular tools for such assays was developed. Initial experiments with the fluorescent nucleoside analog N6-methyl-8-vinyladenosine (m6v8A) were performed and revealed a strong fluorescence enhancement of the free m6v8A nucleoside by the installation of the vinyl moiety at position 8. Overall, this thesis contributes to various research topics regarding the application of naturally occurring and artificial nucleoside analogues. Starting with the chemical synthesis of RNA and DNA modifications, this thesis has unveiled several open questions regarding the dynamic (de-)methylation pathway of m3C and the mechanism of action of molnupiravir through in-depth analysis and provided the basis for further investigations of the protein complex condensin, and a new fluorescent nucleoside analog m6v8A. N2 - Als zentrale Bestandteile des Lebens kodieren DNA und RNA die genetische Information. Die RNA erfüllt jedoch noch mehr Funktionen, die über die im 'zentralen Dogma des Lebens' ge-nannten Kompetenzen hinausreichen. RNA Stränge werden posttranskriptionell verändert, wie zum Beispiel durch chemische Modifikationen. tRNAs sind unter allen RNA-Klassen am umfangreichsten und chemisch vielfältigsten modifiziert. Ihre Modifikationen reichen von ein-fachen Methylierungen (z. B. m3C oder m6A) bis hin zu komplexeren Resten, wie einer Iso-pentenyl-Gruppe (i6A, Hypermodifikation: z. B. ms2i6A) oder sogar Aminosäuren (t6A). Ab-hängig von ihrer Position innerhalb der tRNA können Modifikationen Einfluss auf die tRNA Stabilität und Struktur, sowie die Affinität zu den Ribosomen und die Translationseffizienz und Genauigkeit, haben. Angesichts dieser Bedeutung von tRNA-Modifikationen werden zum einen Nachweisemethoden zur Detektion von Modifikationen, als auch Werkzeuge zur Unter-suchung der Erkennungsmechanismen spezifischer Proteine und deren enzymatischer Funk-tionalisierung benötigt. Dabei ist die chemische Synthese dieser natürlichen Modifikationen als Phosphoramidit-Bausteine die Voraussetzung, um die gewünschte Modifikation überhaupt erst über Festpha-sensynthese in Oligonukleotide einbauen zu können. Mit Hilfe der m3C-, (ms2)i6A- und t6A-modifizierten Oligonukleotide wurde die Bedeutung dieser tRNA-Modifikationen für die Struk-tur und Funktionalität des jeweiligen tRNA Anticodon-Loops (ACL) untersucht. Ein Kapitel dieser Arbeit klärte die tatsächliche Rolle von METTL8 auf. Als Methyltransferase ist das Protein für den Einbau der Methylgruppe an C32 in den mitochondrialen tRNAThr und tRNASer(UCN) verantwortlich, kann dies aber nur bewerkstelligen, wenn zuvor bereits eine ent-sprechende Adenosin-Modifikation an A37 installiert wurde. Außerdem wurde mittels NMR-Analyse, CD-Spektroskopie, Schmelzkurvenanalysen und Gelelektrophorese der Einfluss von m3C32 auf die Struktur der tRNA Anticodon-Stem-Loops (ASLs) gezeigt. Die Modifikation scheint die tRNA-Struktur anzupassen, um die mitochondriale Translation zu optimieren. Um herauszufinden, wie die dynamischen Modifikationswege von m3C reguliert werden, wurden mit den modifizierten tRNA-ASLs und den (α-KG)- und Fe(II)-abhängigen Dio-xygenasen ALKBH1 und ALKHB3 Demethylierungsassays durchgeführt. Obwohl ALKBH3 bisher nur als cytoplasmatisches Enzym bekannt war, konnte es mt-tRNAs demethylieren. Inwiefern diese Aktivität physiologisch relevant ist und ob ALKBH3 vielleicht zusätzlich auch eine mitochond-riale Lokalisierung aufweist, muss noch weiter untersucht werden. Zudem wurde gezeigt, dass ALKBH1 m3C32-modifizierte mt-tRNAs nicht demethylieren kann, es jedoch Hinweise darauf gibt, dass ALKBH1 zusätzlich zu der bereits beschriebenen Aktivität der Oxidation von m5C zu f5C in mitochondrialer tRNAMet eine noch näher zu untersuchende Deprenylierungs- und Exonuklease-Aktivität besitzt. Außerdem wurden die zuvor erwähnten natürlichen Modifikationen verwendet, um DNA-Enzyme als analytische Werkzeuge zur Bestimmung des Modifikationsgrades zu finden. Die Enzyme katalysieren die Spaltung von RNA, falls eine spezielle Modifikation vorhanden ist. Es wurden selektive DNA-Enzyme für i6A sowie die drei Cytidin-Isomere m3C, m4C und m5C identifiziert und charakterisiert. Neben den posttranskriptionalen Modifikationen war auch die Untersuchung künstlich modifi-zierter Nukleoside ein Teil dieser Arbeit. Das Gerüst nativer Nukleoside kann so modifiziert werden, dass die Nukleoside spezifischen Eigenschaften für die gewünschte Anwendung erhalten. Während der Pandemie wurde antiviralen Nukleosidanaloga zur Behandlung der SARS-CoV-2-Infektion eine große Bedeutung zugeschrieben. Um den potenziellen Arzneimittelkandidaten Molnupiravir zu untersuchen, wurde N4-Hydroxycytidin als Phosphoramidit-Baustein syntheti-siert und in mehrere RNA-Oligonukleotide mittels Festphasensynthese eingebaut. Basierend auf den Ergebnissen von RNA-Elongations-, thermischen Denaturierungs- und Cryo-EM-Experimenten, bei denen die modifizierten RNA-Stränge und die rekombinante SARS-CoV-2-RNA-abhängige RNA-Polymerase verwendet wurde, wurde ein zweistufiges Modell für die NHC-induzierte Mutagenese von SARS-CoV-2 postuliert. Dieser Mechanismus wird durch die zwei tautomeren Formen von NHC ermöglicht, wobei die Amino-Form ein Basenpaar mit Guanosin bildet und die Imino-Form mit Adenosin basenpaaren kann. Nach dem Einbau in die virale RNA kommt es zu Mutationen und zur sogenannten Fehlerkatastrophe. Diese Er-kenntnisse wurden durch thermische Schmelzkurvenanalyse und NMR-Spektroskopie der NHC-haltigen Dickerson Drew Sequenz ergänzt. Mit Hilfe eines 15N-markierten NHC-Bausteins, der in die Dickerson Drew Sequenz eingebaut wurde, konnte schließlich die Anti-Amino Form in dem NHC-G Basenpaar durch NMR-Analyse eindeutig nachgewiesen wer-den. Ein weiteres Forschungsprojekt dieser Arbeit befasste sich mit der Synthese eines 7-Deazaguanosin-Crosslinkers, welcher einen geschützten Aldehyd als Diol-Linker enthielt. Die-ser Crosslinker sollte zur Untersuchung von DNA-Protein-Interaktionen dienen. Der Einbau der synthetisierten Phosphoramidit- und Triphosphat-Bausteine konnte erfolgreich durchge-führt werden und die Funktionalität des PCR-Produktes, welches den Crosslinker enthielt, wurde durch Oxidation und die Bildung einer kovalenten Bindung mit einem Fluorescein-Label demonstriert. Der letzte Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der der Entwicklung eines Assays, um Ver-änderungen im Methylierungslevel von m6A nachweisen zu können. Dies könnte neue Einbli-cke in wichtige biologische Prozesse liefern. Daher wurde im letzten Projekt der Einfluss von RNA-Methylierungszuständen auf die strukturellen Eigenschaften von RNA untersucht und dafür ein fluoreszierendes Nukleosidanalog (8-Vinyladenosin) als molekulares Werkzeug ent-wickelt. Die ersten Experimente mit dem Nukleosidanalog N6-Methyl-8-Vinyladenosin (m6v8A) zeigten einen deutlichen Fluoreszenzanstieg durch den Einbau der Vinyleinheit an Position 8 im Vergleich zu dem nicht fluoreszierenden m6A. Insgesamt trägt diese Arbeit zu verschiedenen Forschungsthemen bezüglich der Anwendung von natürlich vorkommenden und künstlichen Nukleosidanaloga bei. Ausgehend von der chemischen Synthese von RNA- und DNA-Modifikationen hat diese Arbeit durch eingehende Analysen mehrere offene Fragestellungen zum dynamischen (De-)Methylierungsweg von m3C und zum Wirkmechanismus von Molnupiravir aufgedeckt und die Grundlage für weitere Untersuchungen des Proteinkomplexes Condensin und eines neuen fluoreszierenden Nukle-osidanalogons m6v8A geschaffen. KW - Nucleinsäuren KW - Chemische Synthese KW - SARS-CoV-2 KW - Oligonucleotide KW - Festphasensynthese KW - Crosslinker KW - Phosphoramidite KW - Methyltransferase Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-311350 ER -