TY - THES A1 - Eden, Lars T1 - Bedeutung von DNS-Polymorphismen bei Arthrose T1 - Impact of DNA-Polymorphisms on Osteoarthritis N2 - Arthrose ist eine Erkrankung des Gelenks, die einen erheblichen Einfluss auf die Lebensqualität der Betroffenen sowie auch auf die Volkswirtschaft eines Landes hat. Das Kniegelenk ist das dabei am häufigsten befallene Gelenk. Leider gibt es bis zum heutigen Tag keine kausale, kurative Therapie dieser Erkrankung. In Frühstadien kann der Verlauf im Idealfall gestoppt werden, in Spätstadien ist häufig der künstliche Gelenkersatz die einzige Therapieoption, die Aussicht auf Schmerzfreiheit und einen gewissen Funktionserhalt gewährleisten kann. Lange Zeit war man der Meinung, dass die Arthrose eine logische Konsequenz des Alterns sei. Zuletzt geht man jedoch mehr und mehr davon aus, dass die Arthrose ein komplexes Zusamenspiel aus Entzündung, mechanischen Kräften, zellulären und biochemischen Prozessen sowie nicht zuletzt der Genetik ist. Die Genetik wurde in dieser Studie zum Fokus des Interesses gemacht, als ein entscheidender Faktor der primären Arthrose. Untersucht wurden Polymorphismen in entscheidenden Regionen (Promoter, Exons) von Genen, die im Arthrose-Prozess eine große Bedeutung haben: Il-1 alpha, Il-1 beta, TNF alpha und MMP-3 (Stromelysin). Viele bereits durchgeführte Studien lieferten widersprüchliche Ergebnisse, wiesen zu geringe Fallzahlen auf oder definierten die Kollektive nur unzureichend. Ziel dieser Studie war es klar definierte Kollektive mit möglichst extremen Zuständen gegenüberzustellen. Junge bereits in frühen Jahren an Arthrose Erkrankte (<45 Jahre) sollten gesunden Patienten über 55 Jahre gegenübergestellt werden. Als dritte Gruppe dienten Altersarthrotiker. Die Diagnosen wurden arthroskopisch gestellt, der Zielwert pro Gruppe sollte 100 Patienten betragen. Für die Auswertung wurden etablierte Verfahren wie die PCR, Restriktion und der Gensequencer genutzt. Die Allelverteilungen der Polymorphismen TNF alpha und MMP-3 konnten in der Auswertung zwischen den Gruppen keinen signifikanten Unterschied aufweisen. Das legt nahe, dass diese beiden Polymorphismen wohl keinen Einfluss auf die Entstehung von Arthrose haben. Bei Il-1 alpha und Il-1 beta wurden keine eindeutigen Ergebnisse erzielt. Es deutet sich ein Trend an, dass diese beiden Polymorphismen einen Einfluss haben, der allerdings erst durch eine höhere Fallzahl bestätigt bzw. widerlegt werden könnte. Ziel weiterer Untersuchungen sollte es ebenso sein, die bestehende bzw. die in der Fallzahl erhöhte DNS-Bank auf weitere Polymorphismen von Genen, die im Arthroseprozess eine Rolle spielen (z.B. Il-1 ra, weitere MMPs, TIMP etc.), zu untersuchen. Interessant könnte auch die Kombination einzelner Varianten innerhalb eines Genclusters sein, entsprechend dem Beispiel von Smith, A.J. et al. 2004 bei einem Il-1 R1-Il-1 alpha –Il-1 beta-Il-1 RN Gencluster. Sicherlich bedarf es noch viel intensiver Forschung, um das komplexe Zusammenspiel der einzelnen Faktoren im Arthroseprozess zu verstehen, um so die einzelnen Mosaiksteinchen innerhalb des Gesamtkomplexes darzustellen. Jedoch lässt sich nur auf diese Weise das Ziel erreichen, eines Tages diese multifaktorielle Erkrankung zu verstehen und zu heilen. N2 - OA is a joint disease which has a huge influence on the life quality of the affected. It causes a high amount of direct and indirect costs for a nation´s economy (16,26 Billion DM 1997 in Germany). The knee shows the highest prevalance of OA among the big joints. Unfortunately there are no sufficient therapies available for this disease. In early stages it is sometimes possible to stop the cartilage degeneration, whereas in more proceeded stages mostly the prothetic replacement of the joint is the only pain-reducing and function-restoring alternative. For a long period of time one thougt OA is a logical consequence of aging, basically a matter of wear-and-tear. Lately leading scientists have found out that OA is more likely a complex disease which is affected by inflammation, mechanical forces, cellular and biochemical processes, and last but not least also genetics. This study focuses on polymorphisms in important regions of the DNA (promoter, Exons) of genes that play an important role in the osteoarthitic process: Interleukin-1 alpha and beta, Tumor Nekrosis Faktor alpha, MMP-3. Three groups were created: one consisting of young patients (age <45) with OA grade III or IV in at least two compartments of the knee diagnosed by arthroskopy. The second group contained patients who received a knee prothesis, mainly having a pangonarthrosis grade IV and an average age of 68,54 years. In both groups we focused on primary OA. Posttraumatic OA for example was excluded.. The third group consists of patients who are old (age >55) and have no Oseoarthritis or grade I at most, also diagnosed by arthroskopy. Each group counted around 100 participants The polymorphisms on the DNA were investigated by well established methods like PCR, enzym restriction and a Gene – sequencer. The evaluation of the allel distribution by comparing the different groups didn´t show any significant difference for TNF-alpha and MMP-3. Il-1 alpha and beta showed a trend for a difference between the groups. However, this is just a hint and no proof. Further investigation with a higher number of participants is necessary. In any case, a lot more research is needed to understand this complex disease and by that being able to heal it one day. KW - Polymorphismen KW - Arthrose KW - Interleukin-1 KW - TNF-alpha KW - MMP-3 KW - Polymorphism KW - Osteoarthritis KW - Interleukin-1 KW - TNF-alpha KW - MMP-3 Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-16996 ER - TY - THES A1 - Fahr, Martin Siegfried T1 - Akzessorische Gelenke zwischen Basiokziput und Atlas bzw. Dens axis in der Medianebene T1 - Accessory joints between basiocciput and atlas/axis in the median plane N2 - Der vordere kraniozervikale Übergang wurde an 99 Kopf-Hals-Präparaten aus dem Präpariersaal mittels MRT, CT und Sägeschnitten untersucht. Weiterhin wurden 110 Schädel, 56 Atlas- und 33 Axispräparate vermessen. Es fand sich in 70% der Präparate das Vorliegen einer Osteoarthrose (Ostheoarthritis) der Art. atlanto-axialis mediana; diese Erkrankung war durch die Bildung von maximalen Osteophyten, Vergrößerung der Gelenkflächen, Verlängerung der Gelenkhöhle und Verminderung des Abstandes zum Hinterhauptsbein charakterisiert. In drei Fällen hatten sich sehr große (giant), nach kranial gerichteten Osteophyten mit knöchernen Kontaktzonen zum Basiokziput gebildet. Die Kontaktzonen waren - wie sich feingeweblich zeigte – echte, erworbene, akzessorische, atlanto-okzipitale Gelenke in der Medianebene. In 11 Fällen lagen - wie die MRT- und CT- Schnittbilder zeigten – Reste des Proatlas bzw. der hypochondralen Spange vor: 3 mal als Condylus occipitalis tertius und knöchernen Kontaktzonen zu Atlas bzw. Axis und 7 mal als freie, überknorpelte Ossikel. Auch hier kann - wie die histologische Kontrolle zeigte – bei den Kontaktzonen von echten, allerdings angeborenen akzessorischen (atlantookzipitalen und odonto-okzipitalen) Gelenken in der Medianebene gesprochen werden. Der Casus mit Vorkommen eines Condylus occipitalis tertius und gleichzeitiger Bildung eines Osteophyten der Densspitze, die zusammen eine knöcherne Kontaktzone und akzessorische Gelenkkammern ausgebildet hatten, kann als „gemischter“ Fall bezeichnet werden. N2 - To explore the many osseous irregularities that are found in the area between the basiocciput, the anterior arch of the atlas and the tip of the dens axis we studied 99 cadaver specimens using magnetic resonance tomography (MRT), computed tomography (CT), median saw-cut sections, and histological sections. Additionally, dry specimens of the skull (n = 110), atlas (n = 56), and axis (n = 33) were investigated. In the median plane, the dry and cadaver specimens exhibited osteoarthritis-related osseous outgrowths and osteophytes of the articular surfaces of the median atlanto-axial joint (n = 63), and the presence of congenitally developed free ossicles (n = 22) and of third occipital condyles (n = 3). The largest osteophytes (giant osteophytes) (n = 4) of the anterior arch of the atlas formed osseous contact zones with the basiocciput that were visible histologically as real joints and were designated accessory median atlanto-occipital joints. The third occipital condyles also formed osseous contact zones, visible histologically as real joints, with the anterior arch of the atlas or with the tip of the dens, and were designated accessory atlanto-occipital or occipito-odontoid joints. Frequent free ossicles, incorporated into the accessory joint, were found by histological examination to be covered with hyaline cartilage. KW - Basiokziput KW - Atlas KW - Dens axis KW - TOC (Condylus occipitale tertius) KW - Osteoarthrose KW - Basiocciput KW - Atlas KW - Axis KW - TOC (third occipital condyle) KW - Osteoarthritis Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17912 ER - TY - THES A1 - Frischholz, Sebastian T1 - Resveratrol Counteracts IL-1β-mediated Impairment of Extracellular Matrix Deposition in 3D Articular Chondrocyte Constructs T1 - Resveratrol wirkt der IL-1β-vermittelten Beeinträchtigung von Extrazellulärmatrix-Deposition in 3D Konstrukten aus artikulären Chondrozyten entgegen N2 - Articular cartilage is an exceptional connective tissue which by a network of fibrillar collagen and glycosaminoglycan (GAG) molecules allows both low- friction articulation and distribution of loads to the subchondral bone (Armiento et al., 2018, Ulrich-Vinther et al., 2003). Because of its very limited ability to self-repair, chondral defects following traumatic injury increase the risk for secondary osteoarthritis (OA) (Muthuri et al., 2011). Still, current OA treatments such as common nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) and joint replacement primarily address end-stage symptoms (Tonge et al., 2014). As low-grade inflammation plays a pivotal role in the pathogenesis of OA (Robinson et al., 2016), there is a strong demand for novel therapeutic concepts, such as integrating application of anti-inflammatory agents into cartilage cell- based therapies in order to effectively treat OA affected joints in early disease stages. The polyphenolic phytoalexin resveratrol (RSV), found in the skin of red grapes, berries, and peanuts, has been shown to have effective anti-inflammatory properties (Shen et al., 2012). However, its long-term effects on 3D chondrocyte constructs cultured in an inflammatory environment with regard to tissue quality have remained unexplored so far. Therefore, in this study, pellets made from expanded porcine articular chondrocytes were cultured for 14 days with either the pro-inflammatory cytokine interleukin-1β (IL-1β) (1 - 10 ng/ml) or RSV (50 μM) alone, or a co-treatment with both agents. Constructs treated with chondrocyte medium only served as control. Treatment with IL-1β at 10 ng/ml resulted in a significantly smaller pellet size and reduced DNA content. However, RSV counteracted the IL-1β-induced decrease and significantly enhanced diameter and DNA content. Also, in terms of GAG deposition, treatment with IL-1β at 10 ng/ml resulted in a tremendous depletion of absolute GAG content and GAG/DNA. Again, RSV co-treatment counteracted the inflammatory stimulus and led to a partial recovery of GAG content. Histological analysis utilizing safranin-O staining confirmed these findings. Marked expression of the cartilage-degrading enzyme matrix metalloproteinase 13 (MMP13) was detected in IL-1β-treated pellets, but none upon RSV co- treatment. Moreover, co-treatment of IL-1β-challenged constructs with RSV significantly increased absolute collagen content. However, under non- inflammatory conditions, RSV induced gene expression and protein accumulation of collagen type X, a marker for undesirable hypertrophy. Taken together, in the present thesis, RSV was demonstrated to elicit marked beneficial effects on the extracellular matrix composition of 3D cartilaginous constructs in long-term inflammatory culture in vitro, but also induced hypertrophy under non-inflammatory conditions. Based on these findings, further experiments examining multiple concentrations of RSV under various inflammatory conditions appear desirable concerning potential therapeutic applicability in OA. N2 - Gelenkknorpel ermöglicht als spezielles Bindegewebe aus Kollagenfasern und Glykosaminoglykanen (GAG) sowohl die reibungsarme Beweglichkeit in Gelenken als auch die Lastübertragung auf angrenzende Knochen (Armiento et al., 2018, Ulrich-Vinther et al., 2003). Aufgrund der sehr begrenzten Fähigkeit zur intrinsischen Erneuerung erhöhen chondrale Defekte nach traumatischen Verletzungen das Risiko für sekundäre Arthrose (Osteoarthritis; OA) (Muthuri et al., 2011). Dennoch konzentrieren sich derzeitige Behandlungsansätze, einschließlich nichtsteroidaler Antirheumatika (NSAR) und des operativen Gelenkersatzes, hauptsächlich auf Symptome im Endstadium der Erkrankung (Tonge et al., 2014). Da eine geringgradige Entzündung eine entscheidende Rolle in der Pathogenese der Arthrose spielt (Robinson et al., 2016), besteht ein starker Bedarf an neuartigen Therapiekonzepten, wie der Kombination von anti- inflammatorischen Wirkstoffen mit knorpelzellbasierten Therapien, um von Arthrose betroffene Gelenke in frühen Krankheitsstadien wirksam zu behandeln. Das polyphenolische Phytoalexin Resveratrol (RSV), welches in der Schale roter Weintrauben, in Beeren und Erdnüssen vorkommt, besitzt starke entzündungshemmende Eigenschaften (Shen et al., 2012). Langzeiteffekte auf 3D-Knorpelkonstrukte unter inflammatorischen Bedingungen sind hinsichtlich der Gewebequalität jedoch bislang unerforscht geblieben. Daher wurden in der vorliegenden Studie Pellets aus expandierten porcinen Gelenkknorpelzellen über einen Zeitraum von 14 Tagen entweder mit dem pro-inflammatorischen Zytokin Interleukin-1β (IL-1β) (1 - 10 ng/ml) oder RSV (50 μM) allein, oder mit beiden Agenzien kombiniert behandelt. Konstrukte, welche nur serumfreies Chondrozytenmedium erhielten, dienten als Kontrolle. Die Behandlung mit IL- 1β in einer Konzentration von 10 ng/ml führte zu einem signifikant geringeren Durchmesser der Pellets sowie einem verringerten DNA-Gehalt. RSV wirkte dieser IL-1β-vermittelten Reduktion entgegen und steigerte signifikant sowohl Durchmesser als auch DNA-Gehalt der untersuchten Konstrukte. Auch in Bezug auf die Deposition von GAG-Molekülen führte die Kultur mit IL-1β (10 ng/ml) zu einer massiven Abnahme des absoluten GAG-Gehaltes und der GAG/DNA- Ratio. Abermals wirkte die gleichzeitige Behandlung mit RSV dem Entzündungsreiz deutlich entgegen und resultierte in einer partiellen Wiederherstellung des GAG-Gehaltes. Die histologische Analyse unter Verwendung von Safranin-O-Färbungen bestätigte diese Ergebnisse. Darüber hinaus manifestierte sich eine ausgeprägte Expression des knorpelabbauenden Enzyms Matrix-Metalloproteinase 13 (MMP13) in IL-1β behandelten Pellets, nicht jedoch in denen, die simultan mit RSV behandelt wurden. Außerdem resultierte die gleichzeitige Behandlung von IL-1β-stimulierten Konstrukten mit RSV in einer signifikanten Erhöhung des absoluten Kollagengehaltes. Unter nicht-inflammatorischen Bedingungen induzierte RSV die Genexpression und Proteinakkumulation von Kollagen Typ X, einem Marker für unerwünschte Hypertrophie. Zusammengefasst wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass RSV deutliche positive Effekte auf die Extrazellulärmatrix von 3D- Knorpelkonstrukten in einer Langzeit-Entzündungskultur in vitro hervorruft, allerdings unter nicht-inflammatorischen Bedingungen Hypertrophie induziert. Basierend auf diesen Befunden erscheinen weitere Experimente zur Untersuchung unterschiedlicher RSV-Konzentrationen unter verschiedenen Entzündungsbedingungen hinsichtlich einer möglichen therapeutischen Anwendbarkeit bei OA wünschenswert. KW - Resveratrol KW - Interleukin 1-beta KW - Gelenkknorpel KW - Extrazelluläre Matrix KW - Osteoarthritis KW - IL-1β KW - articular chondrocytes KW - cartilage KW - cell-based therapy KW - extracellular matrix KW - inflammation KW - osteoarthritis KW - resveratrol Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-237453 ER - TY - THES A1 - Jeßberger, Steffen T1 - Zelluläre pharmakodynamische Effekte eines standardisierten Kiefernrindenextraktes (Pycnogenol) bei Patienten mit schwerer Osteoarthritis T1 - Cellular pharmacodynamic effects of a standardized pine bark extract (pycnogenol) on patients with severe osteoarthritis. N2 - In klinischen Studien wurden bereits positive Effekte des standardisierten Kiefernrindenextrakts Pycnogenol® auf die Symptome von Patienten mit milden Formen von Kniegelenks-Osteoarthritis ermittelt; hauptsächlich ausgedrückt durch Senkung des WOMAC-Scores. Der hinter dieser Symptomverbesserung zu Grunde liegende Mechanismus wurde jedoch noch nicht untersucht. Deshalb sollten in der vorliegenden Arbeit erstmalig die zellulären pharmakodynamischen Effekte des Nahrungsergänzungsmittels, in Hinblick auf wichtige Marker der Knorpelhomöostase, untersucht werden. Hierfür wurden 30 Patienten mit schweren Gonarthrose-Formen und Indikation zum Kniegelenksersatz in eine randomisiert-kontrollierte Studie eingeschlossen. Die genaue Ursache der Erkrankung Osteoarthritis ist bis heute nicht geklärt, jedoch gilt ein Ungleichgewicht von Knorpelaufbau und –abbau in den betroffenen Gelenken als einer der zentralen Parameter der Pathogenese. Diese Imbalance resultiert in einem sukzessiven Knorpelverlust, der mit einem Entzündungsgeschehen im ganzen Gelenk, also auch unter Beteiligung von Synovium und subchondralen Knochen, einhergeht. Eine wichtige Rolle spielen hierbei die matrix-abbauenden Enzyme MMPs und ADAMTS sowie proinflammatorische Mediatoren, z.B. das IL-1β. Nach dreiwöchiger Einnahme von 200 mg Pycnogenol® am Tag, konnten wir, im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe, eine Senkung der relativen Genexpression von MMP-1, MMP-3 und MMP-13 im Knorpelgewebe feststellen. Bei MMP-3 und MMP 13 war diese Reduktion signifikant. Ebenso wurde die relative Expression von IL-1β statistisch signifikant gesenkt. Im Rahmen der Untersuchung der Entwicklung von Markerkonzentrationen im Serum im Verlauf der Studie wurde eine signifikante Senkung der ADAMTS-5-Konzentrationen bei behandelten Patienten, im Vergleich zur Kontrollgruppe, offenbar. Weiterhin wurden die MMP-13-Konzentrationen im Serum positiv durch Einnahme des Rindenextraktes beeinflusst. In der Körperflüssigkeit, die dem Erkrankungsgeschehen am nähesten kommt, der Synovialflüssigkeit, konnten ebenso hemmende Effekte auf knorpelabbauende Enzyme nach Einnahme von Pycnogenol® beobachtet werden. Hierbei sah man niedrigere Konzentrationen der Marker MMP-1 und MMP-13 sowie der Abbaumarker von Typ-II-Collagen und von Aggrecan in den Gelenkflüssigkeiten der Verum- im Vergleich zu denen der Kontrollgruppe. Im Rahmen von ex-vivo-Versuchen zeigten sich mit beiden Spezimen keine Unterschiede zwischen den beiden Studiengruppen. Die beobachteten Tendenzen konnten durch Korrelationsanalysen untermauert werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit liefern den ersten Ansatz zum Verständnis der zellulären Mechanismen, die für die positiven Einflüsse des standardisierten Kiefernrindenextraktes auf die Symptomatik der Gonarthrose verantwortlich sind. Weitere Studien mit einer größeren Studienpopulation und einer Anwendung von Pycnogenol® über einen längeren Zeitraum sind nötig, um diese zellulären Geschehnisse zu bestätigen und näher zu untersuchen. Auf Grund des günstigen Nebenwirkungsprofils von Pycnogenol® ist eine Langzeittherapie zur Verzögerung eines erstmaligen Kniegelenksersatzes durchaus denkbar. Dies hätte den Vorteil, dass das betroffene Gelenk weniger oft ausgetauscht werden müsste, was wegen der begrenzten Haltbarkeit in etwa alle 10 Jahre geschieht. Aus epidemiologischen Studien ist schon seit Längerem bekannt, dass eine hohe tägliche Aufnahme von Polyphenolen über die Nahrung zu geringeren Inzidenzraten neurologischer Erkrankungen, wie z.B. Morbus Parkinson oder Morbus Alzheimer, führt. Auch Pycnogenol® hat in-vivo schon positive Effekte auf diverse neurologische Erkrankungsgeschehen gezeigt. Um zu verstehen, welcher Inhaltsstoff bzw. welche Inhaltsstoffe und/oder Metabolite die Blut-Hirn-Schranke passieren und für diese Wirkungen verantwortlich sein könnten, wurde in der vorliegenden Arbeit mit Hilfe eines cEND-in-vitro-Modells die Blut-Hirn-Schrankengängigkeit ausgewählter Bestandteile des Extraktes und des Metaboliten M1 untersucht. Dabei zeigte keine der untersuchten Substanzen unter den gewählten Versuchsbedingungen einen quantifizierbaren Übertritt durch den Zellkultur-Monolayer. Auf Grund unserer Versuche ist jedoch eine Aufnahme des M1 und von (+)-Catechin in die Endothelzellen durchaus denkbar. Diese Aufnahme scheint für den M1, in erleichterter Form, durch den GLUT-1-Transporter zu verlaufen. Die positiven Effekte des Nahrungsergänzungsmittels auf neurologische Erkrankungen scheinen nicht durch direkte Einwirkungen im Gehirn selbst verursacht zu werden. Eine stabilisierende Wirkung auf die BHS, die eine wichtige Barriere zum Schutz des Gehirns vor äußeren Einflüssen ist, scheint dafür eine plausiblere Erklärung zu sein. Weiterführende in-vivo-Tierversuche können darüber Aufschluss geben. Zusammenfassend konnte mit der vorliegenden Arbeit ein Beitrag zur Aufklärung der zellulären Effekte des standardisierten Kiefernrindenextraktes bei schwerer Kniegelenks-Osteoarthritis geleistet werden. Zusätzlich konnten wir, mit Hilfe eines rationalen Ansatzes zur Ermittlung der Blut-Hirn-Schrankengängigkeit ausgewählter Inhaltsstoffe von Pycnogenol®, das Verständnis für die positiven Wirkungen von Pycnogenol® im Rahmen neurologischer Erkrankungen erweitern. N2 - In clinical trials, positive effects of standardized pine bark extract (Pycnogenol®) on symptoms of patients with mild forms of knee osteoarthritis were already seen, mostly identified by reduction of WOMAC scores. The underlying mechanisms were not investigated so far. Because of that, in the present work the cellular pharmacodynamic effects of the dietary supplement Pycnogenol® with regard to important markers of cartilage homeostasis should be observed. Therefore, 30 patients with severe forms of knee osteoarthritis, who had an indication for knee replacement surgery, were included. The precise cause of osteoarthritis is so far unknown, but an imbalance of buildup and depletion of cartilage in affected joints is considered to be a hallmark of pathogenesis. This imbalance results in successive loss of tissue, which goes along with inflammatory processes in the whole joint, also affecting synovium and subchondral bone. Here, matrix-degrading enzymes like MMPs and ADAMTS, as well as inflammatory mediators, e.g. IL-1β, play important roles. After daily intake of 200 mg Pycnogenol® over three weeks, reductions of relative gene expressions of MMP-1, MMP-3 and MMP-13 were observed. Regarding MMP-3 and MMP-13, this reduction was statistically significant. Relative gene expression of IL-1β was also diminished significantly. In context of the investigation of marker concentration developments in serum we observed a statistically significant reduction of ADAMTS-5 concentrations during the clinical trial in treated patients in relation to controls. Furthermore, MMP-13 concentrations were positively influenced by oral intake of pine bark extract. Regarding synovial fluid, the body fluid next to disease events, we also determined modulating effects through intake of Pycnogenol®. Here we could observe lower levels of MMP-1 and MMP-13, as well as of markers of degradation of aggrecan and type II collagen, in joint fluids of patients who took Pycnogenol® in relation to control group. In context of ex-vivo-approaches, including both kinds of samples, no differences were observed between the two study groups. The observed tendencies could be confirmed by correlation analysis. The results of the present work provide a first approach to understand the cellular mechanisms, which are responsible for the positive influences of standardized pine bark extract on symptoms of gonarthrosis. More clinical trials with greater study populations and longer intake of Pycnogenol® are needed to confirm the observed cellular effects and to investigate them in more detail. Because of good side effect profile, long-term use of pine bark extract for delaying the date of knee replacement surgery seems possible. Renewing affected joints less often, which takes place around every ten years, would be the advantage of this time lag. From epidemiological studies we know for quite some time that high daily intakes of polyphenols via food result in lower incidence rates of neurological disorders, like e.g. Parkinson’s disease and Alzheimer’s disease. Pycnogenol® also has already shown positive effects on neurological disturbances in-vitro and in-vivo. To understand, which ingredient or which ingredients and/or metabolites, respectively, are responsible for these effects, we measured the blood-brain barrier permeability of selected components of Pycnogenol® and its metabolite M1 in the present work by means of a cEND in-vitro model of this barrier. None of the investigated substances showed a quantifiable transfer through cell culture monolayers under present conditions. On basis of our approaches, an uptake of M1 and (+)-catechine in endothelial cells is reasonable, however. In this context, a facilitated uptake of M1 through GLUT-1 transporters seems likely. Positive influences of the dietary supplement on neurological disorders seem not to be caused by direct effects in brain. A stabilizing impact on the blood-brain barrier, which protects the brain from external influences, could be a more likely explanation. Further in-vivo animal studies possibly could shed more light on this issue. In summary the present work could make a contribution to the elucidation of the cellular mechanisms of standardized maritime pine bark extract in severe gonarthrosis of the knee. Additionally we could enlarge, by means of a rational approach to determine the blood-brain barrier permeability of selected ingredients of Pycnogenol®, the understanding of the positive impacts of Pycnogenol® in neurological disorders. KW - Pycnogenol KW - Osteoarthritis KW - Pharmakodynamik KW - Hyaliner Gelenkknorpel KW - Kniegelenk KW - Chondrozyten Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-132634 ER - TY - THES A1 - Konrad, Johannes T1 - Biomechanische Eigenschaften eines biomaterialbasierten Kreuzbandkonstruktes in-vivo und in-vitro T1 - Biomechanical properties of a biomaterial-based cruciate ligament construct in-vivo and in-vitro N2 - Kreuzbandrupturen stellen nach wie vor eine Herausforderung in der klinischen Praxis hinsichtlich kurz- und langfristiger unerwünschter Nebenwirkungen dar (z.B. Reruptur und Arthrosebildung). In der vorliegenden Arbeit wird der entwickelte Ansatz eines Kollagen-I-basierten künstlichen Kreuzbandkonstruktes hinsichtlich der Reißfestigkeit, Lagerung, Verstärkungsmöglichkeit mittels Fiber-tape und langfristigen Arthroseentstehung untersucht mittels in-vitro und in-vivo Untersuchungen unter zur Hilfe nahme des Minipig Tiermodels. Die Ergebnisse zeigen keinen Einfluss der Lagerungstemperatur sowie des Lagerungszeitraums auf die Reißfestigkeit des Konstruktes, sowie eine mögliche initiale Verstärkung mittels Fibertape im Minipig. Darüber hinaus wurde mikroskopisch wie makroskopische Arthroseentstehung nachgewiesen. Das Ausmaß der Arthroseentstehung ist diesbezüglich mit einer Abweichung der Konstruktimplantation von der ursprünglichen Kreuzbandinsertion mittels MRT bestätigt worden. N2 - Cruciate ligament ruptures remain a challenge in clinical practice with regard to short- and long-term undesirable side effects (e.g. rerupture and osteoarthritis formation). In the present study, the developed approach of a collagen-I-based artificial cruciate ligament construct is investigated with regard to tear strength, storage, reinforcement possibility by means of fibre-tape and long-term arthrosis development by means of in vitro and in vivo investigations using the Minipig animal model. The results show no influence of the storage temperature and the storage period on the tensile strength of the construct, as well as a possible initial reinforcement by means of fibre-tape in the Minipig. Furthermore, both microscopic and macroscopic osteoarthritis was detected. The extent of osteoarthritis development was confirmed in this regard with a deviation of the construct implantation from the original cruciate ligament insertion by means of MRI. KW - Ligamentum cruciatum anterius KW - Osteoarthritis KW - ACL construct KW - Minipig KW - Kreuzbandersatz KW - Arthroseentstehung Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-235555 ER - TY - THES A1 - Lavorante, Jochen T1 - Resektionsarthroplastik versus Arthrodese des Daumensattelgelenkes bei jungen, handwerklich tätigen Patienten mit Rhizarthrose T1 - LRTI versus arthrodesis of the trapeziometacarpal joint in the treatment of young, manually hard working patients suffering from osteoarthritis of this joint N2 - In der vorliegenden Studie zeigten sich wesentlich bessere Ergebnisse für die Resektionsarthroplastik als für die Arthrodese des Sattelgelenkes bei der Behandlung von jungen, handwerklich tätigen Patienten mit Rhizarthrose. Deshalb kann bei diesen Patienten der Resektionsarthroplastik eindeutig der Vorzug gegenüber der Arthrodese gegeben werden. Die Resektionsarthroplastik stellt eine gute Behandlungsoption dar und liefert vorhersagbare Ergebnisse, die sich weitgehend mit denen nach Behandlung von „normalen“, typischen Rhizarthrose-Patienten decken. Die Einschätzung des Stellenwertes der Arthrodese ist deutlich schwieriger. Aufgrund der teilweise gegensätzlichen Ergebnisse und Einschätzungen anderer Publikationen müssen die relativ schlechten Ergebnisse der vorliegenden Studie relativiert werden. Somit kann nicht generell von der Durchführung von Arthrodesen des Daumen-sattelgelenkes abgeraten werden. Die Ergebnisse nach Arthrodesen haben jedoch eine größere Schwankungsbreite und sind wahrscheinlich in höherem Maße von technischen Details und von der Erfahrung des Operateurs abhängig. Die Durchführung einer Arthrodese kann eine sinnvolle Alternative für Operateure sein, die ausreichende Erfahrung mit diesem Verfahren haben. Operateuren, die keine oder wenig Erfahrung mit der Durchführung von Arthrodesen haben, kann dieses Verfahren kaum empfohlen werden, sie können mit einer Resektionsarthroplastik wahrscheinlich bessere Ergebnisse erzielen. N2 - This survey shows much better outcome after resection arthroplasty in comparison to the outcome after arthrodesis of the trapeziometacarpal joint in the treatment of young, manually hard working patients suffering from osteoarthritis of this joint. Because of that, resection arthroplasty is suggested to be the preferred treatment for these patients. Resection arthroplasty is a good treatment option and delivers predictably good results, which are mostly identical to the results after treatment of “normal”, typical (i.e. older, not manually hard working) patients suffering from osteoarthritis of the trapeziometacarpal joint. The role of the arthrodesis in these cases is more difficult to judge. Due to the partially contrary results und assessments of other publications, the more or less bad results of this survey have to be relativized. The results after arthrodesis have a larger range of variation and are likely be more dependent on technical details, skill and experience of the surgeon. Performing an arthrodesis could be a reasonable alternative for surgeons who have experience in this operation. Surgeons who don’t have adequate experience in performing arthrodesis presumably could earn better results in performing a resection arthroplasty. KW - Rhizarthrose KW - Arthrodese KW - Arthroplastik KW - Rhizarthrose KW - Resektionsarthroplastik KW - Arthrodese KW - Arthrose KW - Handchirurgie KW - Hand surgery KW - Osteoarthritis KW - Arthrodesis KW - Resection arthroplasty KW - Trapeziometacarpal osteoarthritis Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-121462 ER - TY - THES A1 - Merle, Christian T1 - Bedeutung von DNA- Polymorphismen für die Entstehung primärer Gonarthrose in einem arthroskopisch definierten Patientenkollektiv T1 - Impact of DNA- Polymorphisms on Primary Knee Osteoarthritis in an Arthroscopically Defined Patient Cohort N2 - Die primäre Gonarthrose ist ein komplexer, multifaktoriell bedingter Krankheitsprozess mit genetischer Komponente und gilt aufgrund ihrer epidemiologischen und sozioökonomischen Bedeutung als Volkskrankheit. Die Gene bzw. Proteine der Wnt- Familie spielen eine wichtige Rolle in der komplexen Regulation der Morphogenese, der Zelldifferenzierung , -proliferation und der Homöostase von Knochen und Knorpel. LRP 1 und LRP 5 fungieren als Co-rezeptoren des Wnt- Signalweges. In der vorliegenden Untersuchung wurden der A217V Polymorphismus des LRP 1 Gens und der A1330V Polymorphismus des LRP 5 Gens auf eine signifikante Assoziation mit dem Auftreten primärer Gonarthrose in einem arthroskopisch definierten Patientenkollektiv untersucht. Ziel der Studie war es, klar definierte Kollektive mit möglichst extremen Zuständen gegenüberzustellen und eine hochspezifische und hochsensitive Diagnostik zu verwenden. Junge, bereits in frühen Jahren an Gonarthrose erkrankte Patienten (<45 Jahre, Gruppe 1, n= 100) wurden älteren Patienten (>55 Jahre, Gruppe 3, n= 103), die nicht an Gonarthrose erkrankt waren, gegenübergestellt. Als weitere Gruppe dienten Patienten, welche eine endoprothetische Versorgung bei fortgeschrittener Gonarthrose erhielten (>55 Jahre, Gruppe 2, n= 86). Die Diagnose der primären Gonarthrose wurde anhand anamnestischer Daten sowie arthroskopischer bzw. direkt visuell erhobender Befunde im Rahmen der Arthrotomie bei Prothesenimplantation gestellt. Der Arthroseausschluss (Gruppe 3) erfolgte ebenfalls arthroskopisch. Methodisch wurden der WOMAC- Score, die Restriktions- Fragment- Längen- Polymorphismus (RFLP) Analyse sowie die Gensequenzierung angewendet. Die Allelverteilung der untersuchten Polymorphismen von LRP 1 und LRP 5 konnte zwischen den beiden gegenübergestellten Gruppen 1 und 3 keinen signifikanten Unterschied aufweisen. Für den LRP 5 A1330V Polymorphismus ergab sich ein signifikanter Unterschied (p< 0,05) zwischen den Gruppen 2 und 3. Dies kann als Hinweis auf eine mögliche arthrosefördernde oder auch protektive Funktion dieses Polymorphismus gewertet werden. Im Vergleich der Extremkollektive (Gruppe 1 vs. Gruppe 3) deutet sich lediglich ein Trend an (p= 0,067), so dass eine Assoziation des A1330V Polymorphismus des LRP 5 Gens mit primärer Gonarthrose erst durch weitere Untersuchungen mit höherer Fallzahl eindeutig bestätigt bzw. widerlegt werden kann. N2 - Primary osteoarthritis of the knee is a complex, multifactorial process with a genetic component and has a high epidemiologic and sociooeconomic impact. Genes and proteins of the Wnt- family play a key role in the complex regulation of bone and catilage development and homeostasis. LRP 1 and LRP 5 act as co- receptors of Wnt signaling. The aim of this study was to investigate a potential association of the A217V SNP of the LRP 1 gene and the A1330V SNP of the LRP 5 gene with primary knee osteoarthritis in an arthroscopically defined patient cohort. SNP allels of young patients with severe knee OA (<45 years, group 1, n= 100) were compared to those of patients without knee OA (>55 years, group 3, n= 103) and to those of patients who received a total knee replacement (>55 years, group 2, n= 86). Primary OA was diagnosed on the basis of anamnestic data, arthroscopy or open joint exploration during total knee replacement. OA was ruled out by arthroscopy for patients in group 3. Methods included WOMAC- Scores, restriction- fragment- length- polymorphism (RFLP) analysis and gene sequencing. No differences in genotyp distribution were detected between group 1 and group 3 for LRP 1 and the LRP 5 SNPs. There was a statisically significant association (p< 0,05) of the LRP 5 A1330V SNP comparing group 2 and group 3 which may be interpreted as a potential protective or promoting function of this SNP in the OA process. Comparing the extreme groups 1 and 3 for the LRP 5 SNP, only a trend (p= 0,067) was observed, so that future research with higher patients numbers is recommended to clarify these results. The role of SNPs in the process of primary knee OA remains to be investigated. KW - Kniegelenkarthrose KW - Molekulargenetik KW - Arthroskopie KW - Polymorphismus KW - LRP KW - SNP KW - Knee KW - Osteoarthritis KW - Genetics KW - SNP KW - Arthroscopy Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-38784 ER - TY - THES A1 - Mülek, Melanie T1 - Distribution and metabolism of constituents and metabolites of a standardized maritime pine bark extract (Pycnogenol®) in human serum, blood cells and synovial fluid of patients with severe osteoarthritis T1 - Verteilung und Metabolismus von Bestandteilen und Metaboliten eines standardisierten Kiefernrindenextraktes (Pycnogenol®) in humanem Serum, Blutzellen und Synovialflüssigkeit von Patienten mit schwerer Osteoarthritis N2 - Dietary polyphenols have been related to beneficial effects on humans’ health. Pycnogenol®, a dietary polyphenol-rich food supplement complies with the monograph “Maritime pine extract” in the United States Pharmacopeia (USP) and has demonstrated effects in different diseases. Several human trials concerning knee osteoarthritis have shown significant improvement of the symptoms like reducing the pain and the stiffness of the joint(s) upon intake of Pycnogenol®. After oral intake of multiple doses of Pycnogenol® previously low concentrations in the nanomolar range of monomeric extract constituents have been found in human plasma as well as a bioactive metabolite, δ-(3,4-dihydroxy-phenyl)-γ-valerolactone (M1), which is formed by the human intestinal flora from the procyanidins’ catechin units. It is not clear yet which compound(s) of the complex extract is (are) mainly responsible for the described clinical effects of Pycnogenol®. To gain deeper insights into the in vivo fate of the pine bark extract the distribution of its constitutents and metabolites was closer investigated in the present thesis. Initial in vitro experiments suggested a facilitated cellular uptake of M1 into human erythrocytes, possibly via GLUT-1 transporter. For elucidating further the in vitro and in vivo metabolism of M1 in human blood cells, a metabolomic approach was performed using UPLC-ESI-qTOF-MSE analysis, which revealed a comprehensive and rapid metabolism of M1 to a variety of biotransformation products in human blood cells. Predominant metabolites were found to be conjugates of glutathione (GSH) isomers, namely M1-S-GSH and M1-N-GSH. Further sulfur-containing biotransformation products of M1 were conjugates with oxidized glutathione (M1-GSSG) and cysteine (M1-CYS) and the sulfated derivative of M1 (M1-sulfated). Other in vitro biotransformation products constituted the open-chained ester form of M1 (M1-COOH), hydroxybenzoic acid and the methylated (M1-methylated), acetylated (M1-acetylated), hydroxylated (M1-hydroxylated) and ethylated (M1-ethylated) derivatives of M1. Indeed, six of these in vitro metabolites, respectively M1-COOH, M1-sulfated, hydroxybenzoic acid, M1-S-GSH, M1-methylated and M1-acetylated, were also identified in vivo in blood cells of human volunteers after ingestion of Pycnogenol®. Related reference material was synthesized for reliable confirmation of the metabolites M1-GSH, M1-GSSG, M1-CYS and M1-COOH. In the course of a randomized controlled clinical trial patients suffering from severe osteoarthritis ingested multiple doses of 200 mg/day Pycnogenol® for three weeks before they were scheduled for an elective knee replacement surgery. Various biological specimen, respectively blood cells, synovial fluid and serum samples, were to be analyzed to investigate the distribution and disposition of possibly bioactive constituents and metabolites. Therefore, highly sensitive methods were developed using liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)- technology because of the expected low concentrations of the analytes in the related matrices. Initially, for each matrix different sample preparation techniques (protein precipitation, liquid-liquid extraction, solid phase extraction and useful combinations thereof) were compared to achieve maximum detection sensitivity of the analytes that were of highest interest, namely M1, ferulic acid and taxifolin. By comparing 32 various sample clean-up procedures in human serum, the highest recovery of the metabolite M1 was achieved using a liquid-liquid extraction with ethyl acetate and tert-butyl methyl ether at a serum pH-value of 3.2. A similar extraction method was also chosen for analyte detection in human synovial fluid after comparing 31 different sample preparation techniques. Whole blood or blood cells are difficult to handle because of their high viscosity and strong coloration. The QuEChERS (quick, easy, cheap, effective, rugged and safe) approach which was originally developed for the food safety and thus for the determination of pesticide residues in fruits and vegetables yielded the highest total recovery rate of M1 in human blood cells when assessing 18 different sample clean-up techniques. By applying the QuEChERS method for the first time for the simultaneous and highly sensitive quantification of selected polyphenols in human blood cells it was demonstrated that this fast and inexpensive technique can be applied in clinical fields for cleaning-up highly complex and thus challenging biological matrices. All developed methods for the different biological specimen were optimized to achieve maximum sensitivity of the target analytes. The determined lower limits of quantification (LLOQs) were sufficient for the quantification of the study samples. The LLOQs ranged from 113 pg/mL for taxifolin to 48 ng/mL for caffeic acid in blood cells and from 80 pg/mL for taxifolin to 3 ng/mL for caffeic acid in synovial fluid. In human serum the LLOQs even ranged down to 35 pg/mL for taxifolin and up to 8 ng/mL for caffeic acid. All analytical methods were subjected to a full validation according to current EMA and FDA guidelines and fulfilled those criteria, showing excellent performance and reliability of the developed and optimized methods. Serum, blood cells and synovial fluid samples of the osteoarthritis patients were all processed with an enzymatic incubation with ß-glucuronidase/sulfatase to hydrolyse conjugates (phase-II-metabolism) prior the actual sample preparation. Additionally, serum samples of the osteoarthritis patients were prepared without enzymatic hydrolysis to determine the individual degree of conjugation with sulfate and glucuronic acid of the analytes. All determined concentrations in the patients’ samples were in the lower ng/mL range. Notably, highest total concentrations of the polyphenols were not detected in serum, in which the degree of analyte conjugation with sulfate and glucuronic acid ranged from 54.29 ± 26.77% for catechin to 98.34 ± 4.40% for M1. The flavonoids catechin and taxifolin mainly partitioned into blood cells, whereas the metabolite M1, ferulic and caffeic acid primarily resided in the synovial fluid. The concentration of M1 in the blood cells was low, however, this could be explained by the previously observed extensive and rapid intracellular metabolism in vitro. This was now supported by the in vivo evidence in samples of patients who received Pycnogenol® in which the open-chained ester form of M1 (M1-COOH) as well as the glutathione conjugate of M1 (M1-GSH) were identified, indicating that M1 does not accumulate in its original form in vivo. Possibly, a variety of bioactive metabolites exist which might play an important role for the clinical effects of Pycnogenol®. Although the study participants were requested to avoid polyphenol-rich food and beverages within the last two days before the blood samplings this was obviously difficult for most of the patients. Hence, no statistically significantly difference was observed in the mean polyphenol concentrations in serum, blood cells and synovial fluid between the intervention and the control group. Nevertheless, it was possible to identify marker compounds for Pycnogenol® intake under real life conditions with occasional or regular consumption of polyphenol-rich foods and beverages. Thereby, ferulic acid was found in serum samples exclusively after intake of Pycnogenol®, confirming that ferulic acid is a suitable marker of consumption of French maritime pine bark extract. Taxifolin was present in serum and synovial fluid exclusively in the intervention group indicating a role as further marker of Pycnogenol® intake. Taxifolin, ferulic acid and caffeic acid were detected in both serum and synovial fluid only in the intervention group. Moreover, the metabolite M1, taxifolin and ferulic acid were only detected simultaneously in all matrices (serum, blood cells and synovial fluid) after ingestion of Pycnogenol®. Thus, deeper insights into the distribution of bioactive constituents and metabolites of Pycnogenol® into serum, blood cells and synovial fluid after oral administration to patients with severe osteoarthritis were gained. The present study provides the first evidence that polyphenols indeed distribute into the synovial fluid of patients with osteoarthritis where they might contribute to clinical effects. N2 - Polyphenole in Nahrungsmitteln werden mit positiven Wirkungen auf die menschliche Gesundheit in Verbindung gebracht. Pycnogenol®, ein polyphenolreiches Nahrungs-ergänzungsmittel, welches der Monographie "Maritime Pine Extract" im US-Amerikanischen Arzneibuch (United States Pharmacopeia, USP) entspricht, wurde bereits Effekte bei verschiedenen Krankheiten zugeschrieben. Eine orale Einnahme von Pycnogenol® hat in mehreren Humanstudien, welche sich mit Arthrose am Knie beschäftigt haben, eine signifikante Verbesserung der Symptome wie die Reduzierung von Schmerzen und der Steifheit des Gelenks gezeigt. Nach Mehrfacheinnahmen von Pycnogenol® wurden im menschlichen Plasma bereits niedrige Konzentrationen (im nanomolaren Bereich) von monomeren Extraktbestandteilen gefunden sowie ein bioaktiver Metabolit, δ-(3,4-Dihydroxy-phenyl)-γ-Valerolacton (M1), welcher durch die menschliche Darmflora aus den Catechin-Einheiten der Procyanidine gebildet wird. Bis jetzt ist noch unklar, welche Verbindung(en) des komplexen Extraktes für die beschriebenen klinischen Wirkungen von Pycnogenol® hauptsächlich verantwortlich ist (sind). Um einen tieferen Einblick in das in vivo Verhalten des Kiefernrindenextraktes zu gewinnen, wurde in der vorliegenden Arbeit die Verteilung von Bestandteilen und Metaboliten des Extraktes näher untersucht. Erste in vitro Experimente wiesen auf eine erleichterte zelluläre Aufnahme von M1 in menschliche Erythrozyten hin, möglicherweise vermittelt über den GLUT-1-Transporter. Um den in vitro und in vivo Metabolismus von M1 in menschlichen Blutzellen weiter aufzuklären, wurden metabolomische Untersuchungen mittels UPLC-ESI-qTOF-MS-Analyse durchgeführt, welche eine umfassende und schnelle Metabolisierung von M1 in menschlichen Blutzellen zu einer Vielzahl von Biotransformationsprodukten zeigten. Die Hauptmetabolite waren Konjugate von Glutathion(GSH)-Isomeren, nämlich M1-S-GSH und M1-N-GSH. Daneben entstanden schwefelhaltige Biotransformationsprodukte von M1, nämlich Konjugate mit oxidiertem Glutathion (M1-GSSG) und Cystein (M1-CYS) sowie ein Derivat von M1 mit Sulfat (M1-sulfatiert). Andere in vitro Biotransformationsprodukte waren die offenkettige Esterform von M1 (M1-COOH), Hydroxybenzoesäure, die methylierte (M1-methyliert), acetylierte (M1-acetyliert), hydroxylierte (M1-hydroxyliert) und ethylierte (M1-ethyliert) Form von M1. Sechs dieser in vitro Metabolite, nämlich M1-COOH, M1-sulfatiert, Hydroxybenzoesäure, M1-S-GSH, M1-methyliert und M1-acetyliert, wurden tatsächlich auch in vivo in humanen Blutzellen von freiwilligen Spendern identifiziert, welche zuvor Pycnogenol® oral eingenommen hatten. Für eine zuverlässige Bestätigung der Metaboliten M1-GSH, M1-GSSG, M1-CYS und M1-COOH wurde entsprechendes Referenzmaterial synthetisiert. Im Rahmen einer randomisiert-kontrollierten Studie wurden Patienten, welche an einer schweren Arthrose litten, eine orale Mehrfachdosis von 200 mg Pycnogenol® pro Tag über drei Wochen hinweg verabreicht, bevor sich diese anschließend einer notwendigen Kniegelenksersatz-Operation unterzogen. Um das Auftreten und die Verteilung von möglichen bioaktiven Bestandteilen und Metaboliten zu untersuchen, wurden verschiedene biologische Flüssigkeiten, nämlich Serum, Blutzellen und die Gelenkflüssigkeit analysiert. Da sehr geringe Konzentrationen der Analyten in den einzelnen Matrizes erwartet wurden, waren hochempfindliche Methoden erforderlich. Daher wurde Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) eingesetzt. Zunächst wurden unterschiedliche Probenvorbereitungstechniken (Proteinfällung, Flüssig-Flüssig-Extraktion, Festphasenextraktion und sinnvolle Kombinationen davon) für jede Matrix verglichen, um eine maximal empfindliche Detektion der wichtigsten Analyten, nämlich M1, Ferulasäure und Taxifolin, zu erzielen. Durch den Vergleich von 32 verschiedenen Probenaufarbeitungen in humanem Serum wurde die höchste Wiederfindung des Metaboliten M1 unter Verwendung einer Flüssig-Flüssig-Extraktion mit Essigsäureethylester und Methyl-tert-butylether bei einem pH-Wert im Serum von 3,2 erreicht. Zum Nachweis der Analyten in der humanen Gelenkflüssigkeit wurde nach einem Vergleich von 31 verschiedenen Probenaufarbeitungen eine ähnliche Extraktion angewandt. Aufgrund der hohen Viskosität und der starken Färbung ist die Aufarbeitung von Vollblut oder Blutzellen sehr anspruchsvoll. Das QuEChERS (quick, easy, cheap, effective, rugged and safe) Verfahren, welches ursprünglich für die Lebensmittelüberwachung zur Bestimmung von Pestizidrückständen in Obst und Gemüse entwickelt wurde, ergab bei der Bewertung von 18 Probenaufarbeitungs-techniken die höchste Gesamtwiederfindungsrate von M1 in menschlichen Blutzellen. Durch die erstmalige Anwendung von QuEChERS zur hochempfindlichen und simultanen Quantifizierung von ausgewählten Polyphenolen in menschlichen Blutzellen wurde gezeigt, dass diese schnelle und kostengünstige Methode durchaus auch in klinischen Bereichen zur Aufreinigung von sehr komplexen und anspruchsvollen biologischen Matrizes angewendet werden kann. Alle entwickelten Methoden wurden umfassend optimiert um eine maximal empfindliche Quantifizierung der Analyten zu erhalten. Die ermittelten unteren Bestimmungs-grenzen (lower limit of quantification, LLOQ) waren ausreichend für die Quantifizierung der Studienproben. Die LLOQs reichten in humanen Blutzellen von 113 pg/mL für Taxifolin bis 48 ng/mL für Kaffeesäure und in der menschlichen Gelenkflüssigkeit von 80 pg/mL für Taxifolin bis hin zu 3 ng/mL für Kaffeesäure. In humanem Serum bewegten sich die Bestimmungsgrenzen sogar bis zu 35 pg/mL für Taxifolin und bis zu 8 ng/mL für Kaffeesäure. Alle analytischen Methoden wurden einer „Full Validation“ nach den gegenwärtigen EMA- und FDA-Richtlinien unterzogen und erfüllten deren Kriterien, was eine hervorragende Leistungsfähigkeit und Zuverlässigkeit der entwickelten und optimierten Methoden bewies. Serum-, Blutzell- und Gelenkflüssigkeitsproben der Arthrose-Patienten wurden einer enzymatischen Inkubation mit ß-Glucuronidase/Sulfatase unterworfen, um die konjugierten (Phase-II-Metabolismus) Verbindungen vor der eigentlichen Probenvorbereitung zu hydrolysieren. Die Serumproben der Studienteilnehmer wurden zusätzlich noch ohne enzymatische Hydrolyse aufgearbeitet, um den individuellen Grad der Analytkonjugation mit Sulfat und Glucuronsäure zu bestimmen. Alle ermittelten Konzentrationen in den Patientenproben lagen im unteren ng/mL-Bereich. Bemerkenswerterweise wurden die höchsten Gesamtkonzentrationen der Polyphenole nicht in Serum, in welchem der Grad der Analytkonjugation mit Sulfat und Glucuronsäure von 54,29 ± 26,77 % für Catechin bis 98,34 ± 4,40 % für M1 reichte, bestimmt. Die beiden Flavonoide Catechin und Taxifolin verteilten sich vor allem in die Blutzellen, während der Metabolit M1, Ferulasäure und Kaffeesäure in erster Linie in Gelenkflüssigkeit zu finden war. Die Konzentration von M1 in den Blutzellen war gering, was durch den zuvor beobachteten umfangreichen und schnellen intrazellulären in vitro Metabolismus erklärt werden konnte. Durch den in vivo Nachweis der offenkettigen Esterform von M1 (M1-COOH) als auch des Glutathion-Konjugats von M1 (M1-GSH) in Proben von Patienten, welche zuvor Pycnogenol® eingenommen hatten, konnte dies bestätigt werden. Dies deutet darauf hin, dass M1 in vivo nicht in der ursprünglichen Form akkumuliert und möglicherweise eine Vielzahl von biologisch aktiven Metaboliten vorliegt, was für die klinische Wirkung von Pycnogenol® eine wichtige Rolle spielen könnte. Obwohl die Studienteilnehmer darum gebeten wurden in den letzten zwei Tagen vor den Blut-entnahmen weitestgehend auf polyphenolreiche Nahrungsmittel und Getränke zu verzichten, war die Umsetzung für die meisten der Patienten doch sehr schwierig. Daher wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen der Interventions- und der Kontrollgruppe in den mittleren Polyphenolkonzentrationen im Serum, Blutzellen und in der Gelenkflüssigkeit beobachtet. Dennoch war es möglich, einige Markerverbindungen für eine Aufnahme von Pycnogenol® unter Alltagsbedingungen mit gelegentlichem oder regelmäßigem Konsum von polyphenolreichen Lebensmitteln und Getränken zu identifizieren. So wurde Ferulasäure nur in Serumproben nach der Einnahme von Pycnogenol® gefunden, was bestätigt, dass Ferulasäure ein geeigneter Marker für die Einnahme des Kiefernrindenextraktes ist. Taxifolin wurde ausschließlich im Serum und Gelenkflüssigkeit der Interventionsgruppe nachgewiesen, was auf einen weiteren Marker der Pycnogenol®-Einnahme hindeutet. Taxifolin, Ferulasäure und Kaffeesäure wurden nur in der Interventionsgruppe in den beiden Matrizes Serum und Gelenkflüssigkeit nachgewiesen. Darüber hinaus wurde das gleichzeitige Vorhandensein des Metaboliten M1, Taxifolin und Ferulasäure in allen Körperflüssigkeiten (Serum, Blutzellen und Gelenkflüssigkeit) nur nach einer Aufnahme von Pycnogenol® festgestellt. Somit konnten tiefere Einblicke in die Verteilung von bioaktiven Inhaltsstoffen und Metaboliten von Pycnogenol® in Serum, Blutzellen und Gelenkflüssigkeit nach oraler Verabreichung an Patienten mit schwerer Arthrose gewonnen werden. Die vorliegende Studie liefert den ersten Beweis dafür, dass sich Polyphenole durchaus in die Gelenkflüssigkeit von Patienten mit Osteoarthritis verteilen, in welcher diese möglicherweise zu klinischen Effekten beitragen können. KW - Pycnogenol KW - Pharmakokinetik KW - Metabolismus KW - Arthrose KW - LC-MS/MS KW - Kiefernrindenextrakt KW - Matrix Effekte KW - biologische Körperflüssigkeiten KW - Probenaufarbeitung KW - Osteoarthritis Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-128085 ER - TY - THES A1 - Rothaug, Johanna T1 - Vergleich des Redifferenzierungspotenzials von zonalen Chondrozyten-Subpopulationen im 3D-Hydrogelmodell T1 - Comparison of redifferentiation potential of zonal chondrocyte subpopulations in a 3D hydrogel model N2 - Im Rahmen neuer Therapieansätze der Arthrose versucht man mittels Tissue Engineering transplantationsfähige, hochwertige Knorpelkonstrukte zu züchten. Dabei kommen häufig auch expandierte und redifferenzierte zonenspezifische Chondrozyten-Subpopulationen zum Einsatz. Wenige Studien beschäftigten sich bisher mit dem Redifferenzierungspotential dieser Zellen und dem Effekt einer zonalen Schichtung unter verschiedenen Kulturbedingungen. In dieser Arbeit konnten Ähnlichkeiten im Phänotyp sowie der Chondrogenese der redifferenzierten Zellen zu den jeweiligen Subpopulationen in nativem Knorpel nachgewiesen werden. Sowohl die zonale Schichtung als auch Veränderungen im Studienprotokoll zeigten sich als entscheidende Einflussfaktoren auf das Zellverhalten. Die Frage nach den optimalen Kulturbedingungen stellt die Forschung jedoch weiterhin vor eine große Herausforderung. N2 - In the context of new therapeutic approaches for osteoarthritis, attempts are being made to design high-quality cartilage constructs suitable for transplantation by means of tissue engineering. The use of expanded and redifferentiated zone-specific chondrocyte subpopulations is widely reported. Few studies previously addressed the redifferentiation potential of these cells and the effect of mimicking zonal organization under different culture conditions. In this work, similarities in phenotype as well as chondrogenesis of the redifferentiated cells to the respective subpopulations in native cartilage were demonstrated. Both zonal organization and changes in the study protocol were shown to be crucial factors influencing cell behavior. However, the question of optimal culture conditions remains a major challenge for current research. KW - Osteoarthritis KW - Gelenkknorpel KW - Tissue Engineering KW - Chondrozyten-Subpopulationen KW - zonal Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-249226 ER - TY - THES A1 - Wagenbrenner, Mike Helmut T1 - In vitro-Charakterisierung mesenchymaler Stromazellen aus dem menschlichen Hüftgelenk T1 - In vitro characterization of mesenchymal stromal cells from the human hip joint N2 - In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass plastik-adhärent wachsende, multipotente Vorläuferzellen, die eine für MSCs charakteristische Kombination von Oberflächenantigenen tragen, aus allen vier untersuchten Geweben des arthrotischen Hüftgelenks isoliert werden konnten. MSC-ähnliche Zellen können somit nicht nur in der Spongiosa und im Gelenkknorpel, sondern auch in der anterioren Gelenkkapsel und dem Ligamentum capitis femoris (LCF) des arthrotisch veränderten menschlichen Hüftgelenks nachgewiesen werden. Die FACS Analyse der Oberflächenantigene auf Zellen, die aus den vier unterschiedlichen Geweben eines beispielhaft gewählten Spenders isoliert wurden, zeigte eine deutliche Expression der Antigene CD44, CD73, CD90 und CD105. Unabhängig vom Nativgewebe zeigten somit alle untersuchten Zellen ein für MSCs charakteristisches, aber nicht spezifisches Profil an Antigenen auf ihrer Oberfläche. Eine Übereinstimmung mit den ISCT Kriterien für MSCs war aufgrund der fehlenden Kontrolle hämatopoetischer Marker nicht möglich. Die multipotente Differenzierung der isolierten Zellen erfolgte mithilfe spezifischer Differenzierungsmedien in Monolayer-Kulturen oder für die chondrogene Differenzierung in dreidimensionalen Pellet-Kulturen. Nach 21 Tagen konnten in allen differenzierten Kulturen histologisch und immunhistochemisch klare Zeichen der Osteo- und Adipogenese detektiert werden, während die Auswertung spezifischer Markergene eine klare Steigerung der Expression dieser im Vergleich zu den Negativkontrollen zeigte. Histologische und immunhistochemische Auswertungen bestätigten auch eine erfolgreiche chondrogene Differenzierung der Zell-Pellets aus Spongiosa, Knorpel und Kapsel. Lediglich in den chondrogen differenzierten Zell-Pellets aus dem LCF konnte immunhistochemisch keine Bildung des knorpelspezifischen Matrixproteins Col II nachgewiesen werden. Mikroskopisch zeigten vor allem die differenzierten MSC-Pellets aus Spongiosa und Knorpel morphologisch eine starke Ähnlichkeit zu hyalinem Knorpelgewebe. Trotz dieser Abstufungen zeigten sich für die relative Expression der chondrogenen Markergene AGG, Col II und Sox-9 keine signifikanten Unterschiede zwischen den differenzierten MSC-Kulturen der vier unterschiedlichen Nativgewebe. Ein positiver Nachweis des Markers Col X wies nach 27 Tagen sowohl in differenzierten als auch in undifferenzierten Pellet-Kulturen auf eine leichte chondrogene Hypertrophie hin. Zusammenfassend zeigten sich keine signifikanten Unterschiede im Hinblick auf das osteogene und adipogene Differenzierungspotential aller untersuchten Zellen. Während das chondrogene Differenzierungspotential der Zellen aus Spongiosa, Knorpel und Kapsel sich aus histologischer und immunhistochemischer Sicht ähnelte, zeigten Pellets aus dem LCF ein schwächeres chondrogenes Differenzierungspotential in vitro. Obwohl somit erstmals MSC-ähnliche Zellen aus dem LCF und Gewebsproben, die neben dem Stratum synoviale auch das Stratum fibrosum der Hüftgelenkskapsel beinhalteten, charakterisiert wurden, sind weitere wissenschaftliche Arbeiten notwendig, um das multipotente Differenzierungspotential dieser Zellen zu optimieren. N2 - This study showed for the first time that plastic-adherent growing multipotent progenitor cells carrying a combination of surface antigens characteristic of MSCs could be isolated from four tissues of the arthritic hip joint.MSC-like cells can thus be detected not only in cancellous bone and articular cartilage, but also in the anterior joint capsule and ligamentum capitis femoris (LCF) of the osteoarthritic human hip joint. FACS analysis of surface antigens on cells isolated from the four different tissues of an exemplarily selected donor showed a clear expression of the antigens CD44, CD73, CD90 and CD105. Thus, irrespective of the native tissue, all cells examined showed a profile of antigens on their surface that is characteristic but not specific for MSCs. However, cells did not meet the ISCT criteria since hematopoietic markers were not analyzed. Multipotent differentiation of the isolated cells was performed using specific differentiation media in monolayer cultures or three-dimensional pellet cultures for chondrogenic differentiation. After 21 days, clear signs of osteo- and adipogenesis could be detected histologically and immunohistochemically in all differentiated cultures, while evaluation of specific marker genes showed a clear increase in the expression of these compared with negative controls. Histological and immunohistochemical evaluations also confirmed successful chondrogenic differentiation of cell pellets from cancellous bone, cartilage, and capsule. Chondrogenically differentiated cell pellets from the LCF showed no formation of cartilage-specific matrix protein Col II. Microscopically the differentiated MSC pellets from cancellous bone and cartilage showed strong morphological similarity to hyaline cartilage tissue. Despite these gradations, there were no significant differences between the differentiated MSC cultures of the four different native tissues for the relative expression of the chondrogenic marker genes AGG, Col II, and Sox-9. Positive detection of the marker Col X indicated mild chondrogenic hypertrophy after 27 days in both differentiated and undifferentiated pellet cultures. In conclusion, there were no significant differences in osteogenic and adipogenic differentiation potential of all cells examined. While chondrogenic differentiation potential of progenitor cells isolated from cancellous bone, cartilage, and capsule was similar from a histological and immunohistochemical point of view, pellets from LCF showed a weaker chondrogenic differentiation potential in vitro. Although our current research proved the presence of MSC-like cells in the LCF and full-thickness tissue samples of the hip joint capsule further scientific work is required to evaluate the differentiation of the chondrogenic cells in the LCF. Histological and immunohistochemical evaluations also confirmed successful chondrogenic differentiation of cell pellets from cancellous bone, cartilage, and capsule. Only in the chondrogenically differentiated cell pellets from the LCF could no formation of the cartilage-specific matrix protein Col II be detected by immunohistochemistry. Microscopically, especially the differentiated MSC pellets from cancellous bone and cartilage showed strong morphological similarity to hyaline cartilage tissue. Despite these gradations, there were no significant differences between the differentiated MSC cultures of the four different native tissues for the relative expression of the chondrogenic marker genes AGG, Col II, and Sox-9. Positive detection of the marker Col X indicated mild chondrogenic hypertrophy after 27 days in both differentiated and undifferentiated pellet cultures. In conclusion, there were no significant differences in osteogenic and adipogenic differentiation potential of all cells examined. While the chondrogenic differentiation potential of cells from cancellous bone, cartilage, and capsule were similar from a histological and immunohistochemical point of view, pellets from LCF showed a weaker chondrogenic differentiation potential in vitro. Although our current research proved the presence of MSC-like cells in the LCF and full-thickness tissue samples of the human hip joint capsule further scientific work is required to optimize the multipotent differentiation potential of these cells. KW - Hüftgelenk KW - Arthrose KW - Mesenchymzelle KW - Knorpel KW - MSCs KW - tissue engineering KW - Hüfte KW - Arthrose KW - Regenerative Medizin KW - hip KW - Osteoarthritis Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-237110 ER -