TY - THES A1 - Faist, Hanna T1 - Bedeutung und Charakterisierung der bakteriellen Flora in Vitis vinifera mit und ohne Wurzelhalsgallen T1 - Significance and characterization of the bacterial community in Vitis vinifera with and without crown galls N2 - Am Rebstock werden in der Natur von Agrobacterium vitis, dem Auslöser Wurzelhalsgallenerkrankung, charakteristische Wurzelhalsgallentumore induziert. Virulente Vertreter der Gattung der Agrobacteria schleusen bakterielle DNA in das pflanzliche Genom ein, wodurch die Pflanze Tumore produziert. Die Wurzelhalsgallenerkrankung wird seit einem Jahrhundert als ein Beispiel der Pflanzen-Pathogen-Interaktion untersucht. Die Rolle der bakteriellen Flora im Zusammenhang mit der Wurzelhalsgallenerkrankung beim Rebstock wurde bisher kaum betrachtet. Um dieser Frage nachzugehen, habe ich die endophytische mikrobielle Zusammensetzung von Rebstöcken mit und ohne Wurzelhalsgalle analysiert. Es werden Proben von drei Zeitpunkten einer Wachstumsperiode (Frühling, Sommer und Herbst) und von den Organen der Rebstöcke (Wurzeln, Pfropfstelle und einjährige Triebe) sowie dem Boden in einer Weinanlage bei Himmelstadt in Unterfranken genommen. Die Bakterienflora dieser Umweltproben wird mit kultivierungsabhängigen (Isolierung von Bakterien) und kultivierungsunabhängigen (Hochdurchsatzsequenzierungen) Methoden untersucht. Zudem werden i) die Virulenz der verschiedenen Agrobacterium-Isolate in Tumorassays bestimmt, ii) synthetische Bakteriengemeinschaften von in vitro kultivierten Weinpflänzchen mit Wurzelhalsgallen analysiert, iii) die Genome von einem virulenten und einem nicht-virulenten Agrobacteria-Isolat aus der Wurzelhalsgalle verglichen, iv) erste Interaktionsstudien auf festen Nährmedien durchgeführt und v) virulente Agrobacteria mittels bildgebender Fluoreszenz-Lebenszeit-Mikroskopie (FLIM) in Wurzelhalsgallen lokalisiert. Die Rebstöcke dieser Studie haben eine organspezifische Bakterienflora, die innerhalb einer Wachstumsperiode variiert. Nur die Bakterienflora der Pfropfstelle (mit oder ohne Wurzelhalsgalle) aber nicht die des Bodens, der Wurzeln, und der einjährigen Triebe unterscheidet sich strukturell zwischen gesunden und erkrankten Rebstöcken. Mikroskopisch konnten virulente Agrobacteria punktuell in Interzellularen, sklerenchymatischen Geweben und assoziiert mit Leitgefäßen nachgewiesen werden. Dadurch ist ausreichend Lebensraum vorhanden, der zusätzlich von tumorspezifischen Bakterien besiedelt werden kann. Im Gegensatz zur gesunden Pfropfstelle ist in der Wurzelhalsgalle eine saisonal stabile Kernmikroflora, bestehend aus Vertreter von A. vitis, Pseudomonas, Enterobacteriaceae, Agrobacterium tumefaciens, Gammaproteobacteria und Burkholderiales, vorhanden. Diese Bakterien werden überwiegend aus dem Boden rekrutiert und profitieren von der Nährstoffsituation in der Wurzelhalsgalle. Wurzelhalsgallen enthalten Opine, die nur von der transformierten Pflanzenzelle produziert werden. Interessanterweise hat in dieser Arbeit ein Agrobacterium-Isolat Gene, die zum Opinkatabolismus beitragen und ein Pseudomonas-Isolat kann Opine als einzige Kohlenstoffquelle nutzen. Trotzdem sind beide Isolate weder virulent noch verdrängen sie die virulenten A. vitis, die ebenso Opine nutzen, aus der Wurzelhalsgalle. In synthetischen Bakteriengemeinschaften an in vitro kultivierten Weinpflänzchen konnte gezeigt werden, dass diese und weitere tumorspezifischen Bakterien, neben A. vitis, nicht essentiell zur Entstehung der Wurzelhalsgalle nötig sind aber unterschiedliche Funktionen in der Wurzelhalsgalle übernehmen. Ein Serratia-Isolat hemmt das Wachstum von A. vitis auf festen Nährmedium, andere fördern oder hemmen das Wachstum der Wurzelhalsgalle. Nach Studien in der Literatur erhöhen weitere Bakterien die Resistenz des Rebstocks gegenüber biotischem und abiotischem Stress. Zusammengefasst identifizierten und isolierte ich in dieser Studie unter 150 unterschiedlichen Bakterien in der Wurzelhalsgalle jene Bakterien, die neben A. vitis von der neuen ökologischen Nische profitieren und somit wahrscheinlich Opportunisten mit unterschiedlichen Funktionen sind. In Folge von multiplen Interaktionen in der Wurzelhalsgalle entsteht ein ökologisches Gleichgewicht zwischen den opportunistischen Bakterien, der Wurzelhalsgalle und dem Rebstock, das den Fortbestand des Rebstocks mit Wurzelhalsgalle ermöglicht. N2 - In nature, Agrobacterium vitis is known for the ability to introduce bacterial DNA into the grapevine genome, thereby causing crown gall disease. This plant disease has been studied for a century as a model for plant-pathogen interaction, while the role of the plant microbiota in disease development is not well understood. My study contributes to the understanding of the microbial ecology in crown galls of grapevine, combining culture-dependent with culture-independent high-throughput sequencing techniques. I analysed the structure of the endophytic microbiota by collecting different samples (soil, roots, graft unions and canes) of diseased and non-diseased grapevines from one vine-yard in Franconia, Bavaria, Germany during one growing season (spring, summer, autumn). The characterization of the grapevine-associated bacterial microbiota was completed by (i) detecting the virulence of diverse agrobacterial isolates using a tumour growth assay with in vitro cultivated grapevine plantlets, (ii) microbial analysis of synthetic communities of in vitro cultivated grapevine plantlets with crown galls, (iii) genome sequencing of a virulent and a non-virulent agrobacterial isolate, (iv) in vitro interaction studies on solid medium with bacterial isolates and (v) localisation of virulent A. vitis using Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) in tumour tissues. Grapevine plants of this study have an organ-specific bacterial community that varies during one growing season. Healthy and diseased grapevine plants differed in the struc-ture of the bacterial community only in the graft union (with or without a crown gall), but not in the soil, root and one-year old cane. Microscopy revealed that virulent Agrobacteria mainly accumulate in defined spots of sclerenchymatous tissue, intercellular space and tissues associated with vessels. Therefore, there is unoccupied living space in a crown gall, which can be additionally colonized by tumour-specific bacteria. A season-independent stable core bacteria exists in grapevine crown galls in contrast to healthy graft unions, consisting of OTUs assigned to A. vitis, Pseudomonas, Enterobacteriaceae, Agrobacterium tumefaciens, Gammaproteobacteria and Burkholderiales. These bacteria are predominantly recruited from the soil and most likely profit from special nutrients in the crown gall. The crown gall contains opines, exclusively produced by transformed plant cells. Curiously individual isolates of Agrobacteria and Pseudo-monas of this study that are non-virulent do not outcompete virulent A. vitis in the crown gall but harbour, like A. vitis, genes involved in octopin-catabolism or use opines in liquid cultures as a sole nutrient source. Although synthetic bacterial communities revealed that the tumour-specific bacteria are not required for crown gall induction us-ing in vitro grown grapevine plantlets, they may have different functions in crown gall persistence. A Serratia-isolate inhibits the growth of A. vitis on solid medium, others reduce or support crown gall development, while some, according to literature, increase resistance of the grapevine plant against biotic and abiotic stresses. Taken together, among the 150 bacteria found in the crown galls, I identified and isolated bacteria in addition to A. vitis that profit from the new ecological niche suggesting an opportunistic lifestyle with different ecological functions. An ecological equilibrium in a bacterial community that balances crown gall growth will support the existence of grapevine plants with a crown gall in vineyards. KW - Wurzelhalsgalle KW - DNA Barcoding KW - Agrobacterium vitis KW - Weinrebe KW - Angewandte Mikrobiologie KW - bakterielle Flora KW - Holobiont KW - Mikrobiota Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-154359 ER - TY - THES A1 - Heisig, Martin T1 - Development of novel Listeria monocytogenes strains as therapeutic agents for targeted tumor therapy T1 - Entwicklung von neuen Listeria monocytogenes Stämmen zur Anwendung in der Tumortherapie N2 - Despite marked progress in development and improvement of cancer therapies the rate of cancer related death remained stable over the last years. Especially in treating metastases alternative approaches supporting current therapies are required. Bacterial and viral vectors have been advanced from crude tools into highly sophisticated therapeutic agents detecting and treating neoplastic leasions. They might be potent enough to fill in this therapeutic demand. In this thesis Listeria monocytogenes was investigated as carrier for targeted bacterial cancer therapy. One part of the study focussed on modification of a functional bacterial mRNA delivery system. Genomic integration of T7 RNA polymerase driving mRNA production allowed reduction to an one-plasmid-system and thereby partially relieved the growth retardation exerted by mRNA delivery. Importantly the integration allowed metabolic attenuation of the mRNA delivery mutant potentially enabling in vivo applications. Further expansion of the bacterial RNA delivery system for transfer of shRNAs was examined. Bacterial mutants producing high amounts of RNA containing shRNA sequences were constructed, however a functional proof of gene silencing on delivery in eukaryotic cell lines was not achieved. The second part of this thesis focussed on increasing tumor colonization by Listeria monocytogenes in vivo. Coating bacteria with antibodies against receptors overexpressed on distinct tumor cell lines enabled specific bacterial internalization into these cells in vitro. Optimization of the bacterial antibody coating process resulted in an up to 104-fold increase of intracellular bacteria. Combination of this antibody-mediated targeting with the delivery of prodrug-converting enzymes showed a cytotoxic effect in cell lines treated with the corresponding prodrug. Since incubation in murine serum completely abrogated antibodymediated bacterial internalization the antibodies were covalently linked to the bacteria for application in xenografted tumor mice. Bacteria coated and crosslinked in this manner showed enhanced tumor targeting in a murine tumor model demonstrating antibodymediated bacterial tumor targeting in vivo. Independent of antibody-mediated tumor targeting the intrinsic tumor colonization of different Listeria monocytogenes mutants was examined. Listeria monocytogenes ΔaroA ΔinlGHE colonized murine melanoma xenografts highly efficient, reaching up to 108 CFU per gram of tumor mass 7 days post infection. Taken together the presented data shows highly promising aspects for potential bacterial application in future tumor therapies. Combination of the delivery systems with antibodymediated- and intrinsic bacterial tumor targeting might open novel dimensions utilizing Listeria monocytogenes as therapeutic vector in targeted tumor therapy. N2 - Die Weiterentwicklung der Therapiemöglichkeiten bei Krebserkrankungen hat trotz deutlicher Fortschritte nicht zu einer grundsätzlichen Verringerung der krebsbedingten Sterberate geführt. Besonders in der Behandlung von Metastasen werden alternative Therapieansätze zur Unterstützung der etablierten Standardmethoden benötigt. Insbesondere bakterielle und virale Vektoren wurden von groben Werkzeugen zu hochtechnischen therapeutischen Instrumenten verfeinert und könnten in der Zukunft diese therapeutische Lücke schliessen. In dieser Arbeit wurden verschiedene Aspekte der Anwendung von Listeria monocytogenes in der bakteriellen Tumortherapie untersucht. Im ersten Teil der Arbeit wurde das bereits publizierte System zur bakteriellen Übertragung von mRNAs modifiziert. Die genomische Integration der T7 RNA Polymerase, welche die mRNA herstellt, erlaubte die Reduktion der Plasmidzahl und verringerte die Stoffwechselbelastung auf die RNA-übertragenden Bakterien. Diese Integration erlaubte zum ersten Mal die metabolische Attenuation von RNAübertragenden Listerien und ermöglicht damit den in vivo Einsatz dieser Stämme. Als Erweiterung zur bakteriellen mRNA Übertragung wurde die Übetragung von shRNAs untersucht. Obwohl große Mengen an bakteriellen RNAs nachgewiesen wurden, die die shRNA Sequenz enthielten, konnte nach Infektion eukaryotischer Zellen mit diesen Bakterienmutanten keine funktionale Genregulation nachgewiesen werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde mit verschiedenen Methoden die Kolonisierung von Tumoren durch Listeria monocytoges verbessert. Durch Beladung der Bakterien mit Antikörpern gegen Rezeptoren, die auf bestimmten Tumorzellen überexprimiert werden, wurde die bakterielle Internalisierung in diese Zelllinien ermöglicht. Durch Optimierung des Antikörper-Beladungsprozesses konnte die Antikörper-vermittelte bakterielle Internalisierung auf das 104 fache der Kontrollen gesteigert werden. In Verbindung mit der Übertragung von Enzymen, die Medikamentenvorstufen in cytotoxische Medikamente umwandeln, konnten in Zellen, die mit der Medikamentenvorstufe inkubiert wurden, zytotoxische Effekte beobachtet werden. Da aber die Behandlung Antikörper-beladener Bakterien mit murinem Serum die spezifische Internalisierung vollständig verhindert, wurden die Antikörper für die Anwendung in Xenograft Tumormäusen kovalent an die Bakterien gebunden. Auf diese Weise behandelte Bakterien zeigten eine verbesserte Tumorzielsteuerung bei Beladung mit tumorbindenden Antikörpern. Unabhängig von der Antikörper-vermittelten Tumorzielsteuerung wurde die Tumorkolonisation verschiedener Listeria monocytogenes Mutanten untersucht. Insbesondere Listeria monocytogenes ΔaroA ΔinlGHE kolonisierte Melanom-Xenograft Tumoren sehr effizient und erreicht bis zu 108 CFU pro Gramm Tumormasse. Zusammengefasst zeigt diese Arbeit verschiedene vielversprechende Aspekte der bakteriellen Tumortherapie, die möglicherweise in Zukunft angewandt werden können. Durch Verbindung der RNA-Transfersysteme mit Antikörper-vermittelter- und intrinsischer Tumorzielsteuerung können neue Möglichkeiten für den Einsatz von Listeria monocytogenes als therapeutischer Vektor geschaffen werden. KW - Krebs KW - Therapie KW - Angewandte Mikrobiologie KW - bacterial cancer therapy KW - bacterial tumor targeting Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48628 ER -