TY - THES A1 - Endlich, Alexander Dominic T1 - Die Rolle der Dsg3-Depletion in der Pathogenese des Pemphigus vulgaris T1 - The role of the Dsg3-depletion for the pathogenesis of pemphigus vulgaris N2 - Pemphigus vulgaris (PV) ist eine blasenbildende Autoimmunerkrankung, die durch Autoantikörper gegen Dsg1 und Dsg3 gekennzeichnet ist. Der genaue Pathomechanismus, der zu einem PV-IgG vermittelten Verlust der interzellulären Adhäsion führt, ist noch unklar. Die Dsg3-Depletion und die Modulation von Signalkaskaden stellen hierbei kennzeichnende Merkmale der Erkrankung dar. Mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit ist eine bessere Einordnung der Dsg3-Depletion in den pathogenetischen Kontext von Pemphigus vulgaris möglich. Die Experimente zeigen, dass die Dsg3-Depletion von Differenzierungsprozessen abhängig ist und mit einem Adhäsionsverlust einhergehen kann. Die Hemmung der PKC verhindert hierbei sowohl die PV-IgG vermittelten Effekte in der Zellkultur als auch die Blasenbildung im Mausmodell in vivo und in humaner Haut ex vivo. Des Weiteren liefert die Arbeit neue Erkenntnisse, welche für die suprabasale Lokalisation der Blasenbildung bedeutsam sein könnten. N2 - Pemphigus vulgaris (PV) is a blistering autoimmune disease characterised by antibodies directed against Dsg1 (desmoglein 1) and Dsg3 (desmoglein 3). The exact pathomechanism leading to PV-IgG induced loss of intercellular adhesion is still unclear. The Dsg3-depletion and the modulation of signaling pathways are characteristics of the disease. With the results of this study, a better classification of Dsg3-depletion in the pathogenetic context of pemphigus vulgaris becomes possible. The experiments show that the Dsg3-depletion is dependent on differentiation processes and can be accompanied by a loss of adhesion. Inhibition of PKC in this case prevents PV-IgG-mediated effects in the cell culture as well as blistering in murine skin in vivo and in human skin ex vivo. Furthermore, this work provides new insights that could be significant for the suprabasal localisation of blistering. KW - Zelladhäsion KW - Desmosom KW - Pemphigus KW - Keratinozyten KW - Cadherin KW - Dsg3-Depletion KW - pemphigus KW - desmosome KW - Dsg3-depletion Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-225573 ER - TY - THES A1 - Vielmuth, Franziska T1 - Die Rolle von cAMP bei Pemphigus vulgaris T1 - The role of cAMP in pemphigus vulgaris N2 - Desmosomen sind Zell-Zell-Kontakte, die eine starke interzelluläre Haftung vermitteln. Sie sind daher besonders wichtig für die Integrität von Geweben wie der Haut, die laufend einer starken mechanischen Beanspruchung ausgesetzt sind. Pemphigus vulgaris ist eine Autoimmundermatose, die zur Ausbildung schlaffer Blasen durch Spaltbildung in der Epidermis führt. Als ursächlich dafür wurden Autoantikörper gegen die desmosomalen Cadherine Dsg1 und 3 herausgestellt, die in Desmosomen vorkommen. cAMP ist ein wichtiger Botenstoff des Zellstoffwechsels und an der Regulierung und Modulation einer Vielzahl von zellulären Prozessen beteiligt, darunter auch die Stabilisierung der Endothelbarriere über Stärkung der Haftung eines klassischen Cadherins, nämlich VE-Cadherin. In Anknüpfung an die vorliegenden Daten aus Pemphigus- und Endothelforschung beschäftigt sich diese Arbeit mit der Rolle von cAMP bei Pemphigus vulgaris. Es wurde in Keratinozytenkultur sowie im neonatalen Pemphigus-Mausmodell untersucht, ob die Erhöhung der intrazellulären cAMP-Spiegel einen Einfluss auf PV-IgG-induzierte morphologische und funktionelle Veränderungen hat. Eine Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels konnte sowohl in vitro als auch in vivo als protektiv herausgestellt werden. In Keratinozytenkultur konnte gezeigt werden, dass eine Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels durch Forskolin/Rolipram oder Isoproterenol in der Lage war, die PV-IgG-induzierten morphologischen Veränderungen, die Dsg3-Depletion, sowie den Adhäsionsverlust zu blockieren. Weiterhin konnte die Blasenbildung in vivo durch cAMP-Erhöhung vollständig verhindert werden. Im Anschluss wurde untersucht, ob die Inkubation mit PV-IgGs einen Einfluss auf die intrazellulären cAMP-Spiegel in vitro hat. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Zellen mit einer Erhöhung der cAMP-Spiegel reagieren, wenn auch in einem geringeren Ausmaß als durch die eingesetzten Mediatoren. Somit kann cAMP als Rettungsmechanismus der Zellen angesehen werden und es wurde daraufhin der Einfluss von cAMP auf die Regeneration von Keratinozyten nach PV-IgG-Inkubation untersucht. Dieser Prozess konnte durch eine cAMP-Erhöhung verbessert werden und erwies sich als partiell abhängig von PKA. Schlussendlich konnte nachgewiesen werden, dass cAMP in vitro wie in vivo über die Blockade der p38MAPK-Aktivierung protektiv wirkt. Zusammenfassend konnte so ein neuer Einblick in die zelluläre Antwort von Keratinozyten auf Pemphigus-Autoantikörperbindung gewonnen werden. Dieser könnte auch im Hinblick auf die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien bei Pemphigus vulgaris wichtig sein. N2 - Desmosomes are cell-cell-contacts which provide strong intercellular adhesion. They are most abundant and important in tissues which are continuously exposed to mechanical stress such as the epidermis of the skin. Pemphigus vulgaris (PV) is a severe autoimmune blistering disease characterized by intraepidermal cleavage leading to flaccid blisters of the skin. These phenomena are caused by autoantibodies against the desmosomal adhesion molecules desmoglein (Dsg) 1 and 3. Cyclic adenosine-monophosphat (cAMP) is an important second messenger in various signaling pathways and takes part in regulation and modulation of distinct cellular processes. For instance, cAMP is capable to stabilize the endothelial barrier by increasing adhesion of another cadherin-type adhesion molecule referred to as vascular endothelial cadherin (VE-cadherin). Therefore, based on the knowledge from pemphigus and endothelial barrier research, the scope of the present dissertation is to clarify the role of cAMP in pemphigus vulgaris pathogenesis. Investigations in keratinocyte cell cultures and in a neonatal pemphigus mouse model were carried out to analyze the effect of an increased intracellular cAMP level on desmosomal adhesion. The data demonstrated that increased cAMP-levels are protective against the pathogenic effects of autoantibodies from PV patients (PV-IgG) in vitro and in vivo. In cultured keratinocytes the increase of intracellular cAMP mediated by application of either forskolin/rolipram or isoproterenol was capable to block PV-IgG-induced morphological changes as well as Dsg3-depletion and loss of cell cohesion. Further, development of flaccid blisters and intraepidermal cleavage formation was abolished in vivo. Since cAMP signaling in vitro as well as in vivo was effective to prevent autoantibody-induced p38MAPK activation, which is a central mechanism in pemphigus pathogenesis, it can be concluded that the signaling function of desmogleins was modulated by this approach. Next, we examined whether incubation with PV-IgG affected intracellular cAMP levels in vitro. Interestingly, we found that keratinocytes responded to PV-IgG incubation with an increase in cAMP levels, albeit to a smaller extend compared to the applied mediators. These data indicate that increase of cAMP may serve as a cellular rescue mechanism to enhance intercellular cohesion. Finally, the effect of cAMP on spontaneous regeneration of cell cohesion after PV-IgG incubation was examined. Here, it was observed that regeneration was improved by increase of cAMP and was at least partially PKA-dependent. In summary, this work provides new insights into the cellular responses of keratinocytes to the binding of pemphigus autoantibodies. This may be important especially with respect to development of new therapeutic approaches in pemphigus vulgaris. KW - Pemphigus KW - Cyclo-AMP KW - Autoimmundermatose KW - Keratinozyten KW - neonatales Pemphigus-Maus-Modell KW - Signalwege Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107757 ER - TY - THES A1 - Kriegebaum, Ulrike T1 - Entwicklung eines gewebenahen Konstruktes aus einer Matrix mit in vitro kultivierten Fibroblasten und Keratinozyten zum Ersatz der Oralmukosa unter Einsatz von Tissue Engineering T1 - Development of a tissue-related construct of a matrix with in vitro cultured fibroblasts and keratinocytes to replace oral mucosa using tissue engineering N2 - In der Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie besteht ein großer Bedarf an Transplantaten zur intra- und extraoralen Defektdeckung in der chirurgischen Therapie, insbesondere für die Rekonstruktion nach Traumen oder Tumorresektionen für den Erhalt von Funktion und Ästhetik. Konventionelle Methoden wie die Verwendung von autologen, freien Spalt- und Vollhaut-Transplantaten zeigen Nachteile wie z. B. die Entnahmemorbidität der Spenderregion oder die Notwendigkeit eines zweiten chirurgischen Eingriffs zur Deckung des Entnahmedefektes. Zudem sind diese Transplantate nur in kleinen Mengen verfügbar oder haben eine unterschiedliche Gewebestruktur sowie andere Keratinisierungsmuster. Diese Nachteile sollen mit Hilfe eines im Tissue Engineering hergestellten Oralmukosa-Äquivalentes umgangen werden. Dazu wurden zunächst Methoden zur Isolierung und Kultivierung primärer, oraler Fibroblasten bzw. Keratinozyten entwickelt, die das Ausgangsmaterial für die Herstellung von Dermal-Äquivalenten bzw. von organotypischen Kokulturen in vitro bilden. Die Zellen wurden sowohl histologisch als auch immunhistochemisch charakterisiert und nach Optimierung der Kulturbedingungen zur Entwicklung von Oralmukosa-Äquivalenten (OMÄs) eingesetzt. Dabei ist auch die Wahl eines geeigneten Trägermaterials ein entscheidender Faktor. Deshalb wurden in dieser Arbeit verschiedene Unterlagen auf Eignung als Scaffold für das Tissue Engineering von Oralmukosa getestet. Unter anderem wurden die Materialien Vicryl (resorbierbares Polyglactin-910-Netz), DRT (dermale Regenerationsmatrix aus bovinem Kollagen-I vernetzt mit einem Glycosaminoglycan) und TFE (equine Kollagen-I-Membran) in Zellkulturversuchen auf Biokompatibilität und Stabilität geprüft. Dazu wurden zunächst Fibroblasten auf die Scaffolds ausgesät um Dermal-Äquivalente (DÄs) zu erhalten. Das Wachstum der Zellen wurde mittels Elektronenmikroskopie sowie immunhistochemischen Methoden untersucht. Die Analyse zeigte gutes Zellwachstum und somit gute Biokompatibilität auf allen verwendeten Materialien. In folgenden Experimenten wurden zusätzlich Keratinozyten auf DÄs ausgesät und somit organotypische OMÄs entwickelt. Die generierten Konstrukte wurden mit Hilfe von IIF-Färbungen von Kryoschnitten sowie RT-qPCR bezüglich ihrer Zellarchitektur, ihrer Fähigkeit zur Bildung einer Basalmembran und ihrer Fähigkeit zur Differenzierung untersucht. Es stellte sich heraus, dass auf allen drei Trägern Fibroblasten-Keratinozyten Kulturen hergestellt werden konnten. Dabei zeigte Vicryl eine gute Biostabilität, jedoch ohne Ausbildung der natürlichen Stratifizierung der Keratinozytenschichten. Auf TFE dagegen zeigte sich die beste Architektur und Proliferation der Zellen mit Stratifizierung der Keratinozyten, allerdings eine schlechte Biostabilität. DRT stellte sich als die Matrix heraus, die die gewünschten Eigenschaften am besten vereint. Das Ergebnis war jedoch im Bezug auf die Dicke der Epithelschicht sowie deren Differenzierung und Ausbildung einer Basalmembran noch zu verbessern. Dies konnte mit Hilfe der Kulturmethode an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche erreicht werden. Jedoch gelang bezüglich der Zellarchitektur noch immer kein optimales Ergebnis. Erst der Einsatz einer weiteren Membran, SIS (azellularisierter Schweinedarm), die durch ihren natürlichen Ursprung ähnlich strukturiert ist wie humane Submukosa, zeigte, dass die angewandte Methodik zur Herstellung von OMÄs funktionierte. Auf diesem Träger gelang die Herstellung eines Transplantates, das eine mit normaler Oralmukosa vergleichbare, reguläre Zellarchitektur mit dermaler und epidermaler Komponente aufwies, die qualitativ noch besser war als auf TFE. Auch die Biostabilität während des Versuchszeitraumes war wie bei Vicryl und DRT gegeben. Die Neusynthese einer Basalmembran konnte mittels IIF-Färbung nachgewiesen werden. Die Proliferation der Keratinozyten war in der Basalschicht lokalisiert und nahm Richtung apikal ab. Lediglich eine Differenzierung des Transplantates war mittels immunhistochemischer Methoden nicht nachweisbar. Auf diese Weise konnte in der vorliegenden Arbeit ein OMÄ entwickelt werden, dessen Aufbau mit dem von natürlicher Oralmukosa vergleichbar war. Die in dieser Arbeit gewonnen Erkenntnisse dienen somit als Grundlage zur Optimierung und Verwirklichung des klinischen Einsatzes von mittels Tissue Engineering hergestellten, autologen OMÄs. N2 - In oral and maxillofacial surgery, there is a great demand for oral mucosa equivalents for intra- and extraoral grafting as oral reconstruction after trauma or tumor resections to preserve function and aesthetics. Current methods of covering intraoral defects with autologous epidermal and dermal grafts show disadvantages, e.g. donor site morbidity or the need for a second surgical procedure to cover the harvesting site. These grafts are either only available in small amounts or have a different texture, such as a different keratinization pattern. These disadvantages could be avoided by using autologous tissue engineered mucosa equivalents. In a first step, a method for isolation and cultivation of primary oral fibroblasts and keratinocytes was developed. They formed the starting material for production of dermal equivalents (DEs) and organotypic cocultures in vitro. The cells were characterized both by histological staining and by immunohistochemical staining. After optimization of the cell culture conditions they were used for the development of oral mucosa equivalents (OMEs). Thereby the selection of a suitable scaffold is a decisive factor. Therefore, different matrices for the tissue engineering of oral mucosa have been studied in this thesis. Amongst others, the materials Vicryl (woven membrane of polyglactin 910), DRT (dermal regeneration template of cross-linked bovine tendon collagen and a glycosaminoglycan) and TFE (equine collagen I membrane) have been tested in cell-culture experiments for biocompatibility and stability. For this purpose first only fibroblasts were seeded on scaffolds to obtain DEs. Cell growth was examined by electron microscopy and immunohistochemical methods. The analysis showed good cell growth and good biocompatibility as well on all the used materials. In following experiments keratinocytes were seeded on dermal equivalents to develop organotypic co-cultures. The obtained constructs were characterized by immunohistochemical staining and gene expression analysis using RT-qPCR to get information about cell architecture, formation of a basal membrane and status of differentiation. It has been found, that it was possible to create fibroblast-keratinocyte-cultures on all three scaffolds. Thereby Vicryl showed a good biostability but no formation of the natural stratification of the epidermal cells. These findings are in contrast to the results on TFE. Here was the best architecture and proliferation of the cells with stratification of the newly formed epidermis, but bad biostability of the membrane. The combination of the desired properties could only be seen on DRT, but the thickness, differentiation and basal membrane formation of the epithelial layer needed to be improved. This was achieved by cultivation of the cells in the air liquid interface but there was still no optimal result. Only the use of another scaffold, SIS (acellular matrix from porcine small bowel) which has a similar structure to humane submucosa, shows functionality of the developed method of OME generation. On this scaffold the generation of a transplant succeeded even better than on TFE. It had dermal and epidermal components with regular cell architecture like native oral mucosa. Also the biostability during the experimental period was comparable with Vicryl and DRT. It has been possible to demonstrate the formation of a basal membrane by IIF staining. Keratinocyte proliferation was localized in the basal layer with declining proliferation activity in apical direction. Only differentiation could not be proven by means of immunohistochemistry. Thus the present thesis developed a method for creation of an OME with comparable organization to that of the native oral mucosa. The findings summarized in this study will serve as basis for optimization and realization of the clinical use of tissue engineered autologous OMEs. KW - Tissue Engineering KW - Mundschleimhaut KW - Transplantat KW - Keratinozyten KW - Fibroblasten KW - Kokultur KW - Tissue Engineering KW - Biocompatible Materials KW - Oral Mucosa KW - Keratinocytes KW - Co-culture KW - Composite Graft Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57403 ER - TY - THES A1 - Spindler, Volker Bernd T1 - Bedeutung der Rho-GTPasen für desmosomale Adhäsion und Pemphigus-Pathogenese T1 - Role of Rho GTPases for desmosomal adhesion and pemphigus pathogenesis N2 - Die Stabiltät und Integrität der Epidermis beruht zu einem großen Teil auf der intakten Funktion der Desmosomen. Diese fleckförmigen Zellkontakte vermitteln extrazellulär die Haftung zwischen den Keratinozyten durch Desmocadherine und sind intrazellulär über Adaptorproteine im Intermediärfilamentsystem des Zellskeletts verankert. Diese Funktion ist bei der Autoimmunerkrankung Pemphigus gestört, die zu intraepidermaler Blasenbildung durch Akantholyse der Keratinozyten führt. Pemphigus vulgaris (PV) und Pemphigus foliaceus (PF) stellen die beiden Hauptvarianten dar, wobei PV durch Autoantikörper gegen die Desmocadherine Desmoglein (Dsg) 3 und oftmals zusätzlich gegen Dsg 1, PF durch Autoantikörper nur gegen Dsg 1 gekennzeichnet ist. Rho-GTPasen sind zelluläre Regulatorproteine, die das Aktinzytoskelett und verschiedene Zellkontakte beeinflussen. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit dem Einfluss von Rho-GTPasen bei der Regulation von desmosomal vermittelter Adhäsion. In einem zweiten Teil wurde die Beteiligung von Rho-GTPasen bei den Pemphigusvarianten PV und PF näher charakterisiert. Für den ersten Abschnitt wurden bakterielle Toxine verwendet, die spezifisch Rho GTPasen aktivieren bzw. inhibieren, während für den zweiten Teil IgG-Fraktionen von PV- und PF-Patienten in Kombination mit aktivierenden Toxinen zur Anwendung kamen. Eine Inhibition der drei Hauptvertreter der Rho-GTPasen in kultivierten Keratinozyten und humaner Epidermis führte zu einer Rarefizierung des Aktinfilamentsystems, zu Verlust von membranständig lokalisiertem Dsg 1 und 3 und zu Zelldissoziation sowie zu verminderter Dsg 1 und 3-vermittelter Haftung von Mikroperlen auf der Oberfläche von Keratinozyten. Die Aktivierung der GTPasen resultierte in vermehrter linearisierter Darstellbarkeit von Aktin und Dsg 3 an den Zellgrenzen und einer verstärkten Dsg-vermittelten Haftung. Pemphigus-IgG führten ebenfalls zu Zelldissoziation und Verlust von Dsg-Immunreaktivität in Keratinozytenkulturen, zu Spaltbildung in humaner Epidermis und zum Verlust der durch Dsg 1 und Dsg 3 vermittelten Adhäsion. Dies ging einher mit einer vermehrten Menge an nicht am Zytoskelett verankerten Dsg 3 und wurde durch eine p38MAPK-abhängige Verminderung der Aktivität von Rho A moduliert. Die Aktivierung von Rho A verhinderte die Ausbildung der Pemphigus-induzierten Effekte nahezu vollständig. Zusammenfassend regulieren Rho-GTPasen die desmosomale Haftung in Keratinozyten. Die Daten zeigen weiterhin, dass Pemphigus-IgG durch eine Inhibition von Rho A diese Regulation beeinträchtigt, was zu Schwächung der Zytoskelettverankerung von Desmogleinen und zu Haftungsverlust und Spaltbildung führt. Somit ist Rho A ein wichtiger Faktor der Pemphigus-Pathogenese und stellt einen Erfolg versprechenden Ansatzpunkt zur Entwicklung neuer Therapieoptionen dar. N2 - Integrity and stability of human epidermis is based on the correct function of desmosomes. These spot-like cell contacts mediate adhesion of adjacent keratinocytes by desmosomal cadherins and are linked via adapter proteins to the intermediate filament cytoskeleton. This function is impaired in the autoimmune disease pemphigus, resulting in intraepidermal blister formation by akantholysis of keratinocytes. Pemphigus vulgaris (PV) and pemphigus foliaceus (PF) are the main subtypes of pemphigus, with PV being characterized by autoantibodies targeting the desmosomal cadherins Desmoglein (Dsg) 3 and in part Dsg1. PF patients develeop autoantibodies against Dsg1 only. Rho GTPases are regulatory proteins which are known to modulate the actin cytoskeleton and different cell contacts. The aim of this thesis was to evaluate the role of Rho GTPases in the regulation of desmosome-mediated adhesion. The second part addresses the involvement of Rho GTPases in the pathogenesis of PV and PF. Toxins served to activate or inactivate specific GTPases in the first part, whereas in the latter part purified IgG fractions of pemphigus patients were used in combination with Rho activating toxins. An inhibition of the three best characterized GTPases in cultured keratinocytes and human epidermis resulted in rarefication of the actin cytoskeleton, loss and fragmentation of membrane-localized Dsg1 and Dsg3 immunostaining, cell dissociation and reduced adhesion of Dsg1 and Dsg3-coated microbeads on the cell surface of keratinocytes. Activation of GTPases led to linearized immunoreactivity of Dsg3 at the cell membrane, pronounced cortical actin staining and strengthened Dsg-mediated adhesion. Similarily to inhibition of Rho-GTPases, Pemphigus IgG caused cell dissociation and loss of Dsg staining in cultured keratinocytes, blister formation in human epidermis and reduction of Dsg-mediated adhesion. These changes were accompanied by a decrease of cytoskeleton-bound Dsg3 and were modulated by a p38MAPK-dependent reduction of RhoA activity. Activation of RhoA blocked the Pemphigus IgG-induced effects. Taken together, Rho GTPases regulate desmosomal adhesion in keratinocytes. Additionaly, Pemphigus IgG interfere with this regulation by inhibition of RhoA, resulting in reduced cytoskeletal anchorage of desmogleins, reduced intercellular adhesion and gap formation. Thus RhoA is identified as an important factor in pemphigus pathogenesis and might eventually serve as a target of new therapy approaches. KW - Zelladhäsion KW - Pemphigus KW - Rho-Proteine KW - Desmosom KW - Epidermis KW - Desmoglein KW - Keratinozyten KW - cell adhesion KW - desmosome KW - rho GTPases KW - keratinocytes KW - pemphigus Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-38728 ER - TY - THES A1 - Giner, Martin T1 - Signalmechanismen der epithelialen Proliferation und DIfferenzierung T1 - Signal mechanisms of Proliferation and Differentiation in Epithelia N2 - Gestörte Proliferations- und Differenzierungsprozesse in Keratinozyten spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese vieler Hauterkrankungen. Intrazelluläre Signalmechanismen, die die korrekte Balance zwischen epidermaler Proliferation und Differenzierung aufrecht halten, sind bis jetzt größtenteils unbekannt. Einer dieser ausschlaggebenden Transkriptionsfaktoren ist der Nukleäre Faktor-kappaB (NF-kB). Uns interessierte der Einfluss des IKK/IkBa/NF-kB-Signalweges auf das intrinsische Differenzierungsprogramm von Keratinozyten. Mittels retroviraler Infektion wurden sowohl in primären Keratinozyten als auch in HaCaT verschieden mutante Formen von Faktoren des NF-kB-Signalweges eingebracht: dominant negative (dn) Formen der IKK1 und IKK2, eine konstitutiv aktive Form der IKK2 (IKK2 EE) und eine nicht-degradierbare Form des Inhibitors IkBa. Zusätzlich wurden auch pharmakologische Inhibitoren von NF-kB (BAY 11-7082 und SC-514) untersucht. Die Funktionalität der Mutanten wurde im Westernblot durch Analyse der IkBa Degradation überprüft. Anschließend wurde die Differenzierung der Keratinozyten durch Erhöhung des extrazellulären Calciums induziert. Der Grad der Differenzierung wurde durch morphologische Studien und Untersuchung der Expression der Differenzierungs-marker p21 und Involucrin untersucht. Im Gegensatz zu Ergebnissen aus Tiermodellen, konnten wir keine Effekte der mutierten IkB Kinasen 1 und 2 auf die Calcium-induzierte in vitro Differenzierung beobachten. Jedoch wurde die Aktivierung inflammatorischer Gene, gemessen an der Induktion von ICAM-1 und IL-8 nach TNF-a Stimulation, vollständig in den IKK2 KD und mut IkBa exprimierenden Zellen inhibiert. In der Zelllinie, welche die entsprechende IKK1 Mutante trug, wurde deren Expression nur teilweise geblockt. Zusammenfassend lässt sich aus unseren Ergebnissen schließen, dass zumindest in vitro IKK1 und IKK2 nicht an der Regulation des Calcium-induzierten intrinsischen Differen-zierungsprozesses von Keratinozyten beteiligt sind, jedoch eine zentrale Rolle in der inflammatorischen Aktivierung dieser Zellen spielen. N2 - Disturbed proliferation and differentiation processes of keratinocytes play a major role in the pathogenesis of many skin diseases. Intracellular signalling mechanisms which regulate the balance between epidermal proliferation and differentiation, however, are thus far largely unknown. Earlier reports suggest a role for the transcription factor nuclear factor–kappaB (NF-kB) in such processes. Here we attempted to analyze the impact of the IKK/IkBa/NF-kB signalling pathway on the intrinsic differentiation process of keratinocytes. Primary human keratinocytes as well as HaCaT cells were retrovirally infected to express different mutant forms of components of the IKK/NF-kB pathway: dominant negative (dn) mutants of NF-kB upstream kinases IKK1 and IKK2, a constitutive active form of IKK2 (IKK2 EE), and a non degradable mutant form of IkBa. In addition, pharmacological inhibitors of the pathway such as BAY 11-7082 and SC-514 were analysed. Proper functionality of the generated mutants was subsequently confirmed by Western blot analysis monitoring induced IkBa degradation. Thereafter, differentiation of keratinocytes was induced by elevation of extracellular calcium levels. The differentiation state of keratinocytes was then assessed by studying morphology and expression of differentiation markers such as p21 as well as involucrin. In contrast to data reported from animal models, we could not detect any effects of mutated IKK1 or IKK2 on the calcium-induced intrinsic differentiation program in keratinocytes. However, inflammatory activation of keratinocytes as measured by TNF-a-mediated up-regulation of ICAM-1 and IL-8 was almost completely inhibited in cells expressing dn IKK2 and the IkBa mutant form whereas it was only partly blocked in IKK1dn cells. In conclusion, our data suggest that, in least in vitro, IKK1 and IKK2 are not involved in the regulation of calcium-induced keratinocyte differentiation while they are pivotal for inflammatory activation of these cells. KW - NF-kappaB KW - Keratinozyten KW - Involucrin KW - Differenzierung KW - Proliferation KW - inflammatorische Antwort KW - NF-kappaB KW - Keratinocytes KW - Involucrin KW - differentiation KW - proliferation KW - inflammatory response Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27069 ER - TY - THES A1 - Czisch, Michael T1 - Die Rolle von Bcl-2 bei der UV- und TRAIL-induzierten Keratinozytenapoptose T1 - The role of Bcl-2 in UV- and TRAIL-induced keratinocyte apoptosis N2 - In Keratinozyten wird sowohl durch UVB als auch durch PUVA-Bestrahlung Apoptose induziert. Wir untersuchten die in Keratinozyten durch UVB, PUVA, UVA und Todesliganden wie TRAIL ausgelösten Apoptosewege näher. UVB und PUVA, nicht aber UVA-Bestrahlung lösen in vitro Keratinozytenapoptose aus. 2-4 h nach UVB beobachteten wir die Aktivierung von Caspasen. Nach PUVA setzt die Aktivierung von Caspasen wesentlich später ein, nämlich erst 12 h nach Bestrahlung. Passend dazu, ist ein Verlust des mitochondrialen Transmembranpotentials 6-8 h nach UVB und 12-14 h nach PUVA detektierbar. Die Überexpression des Proteins Bcl-2 verhindert den Verlust des mitochondrialen Transmembranpotentials und die Caspase-Aktivierung nach UVB, und vermittelt auch einen klonogen Schutz, unabhängig von der Bildung reaktiver Sauerstoffradikale. Im Gegensatz dazu verzögert es den Verlust des Transmembranpotentials und die Caspase-Aktivierung nach PUVA nur und verhindert sie nicht. PUVA-bestrahlte Zellen können sich nicht weiter teilen, sind also durch Bcl-2 nicht klonogen geschützt. N2 - An important response of keratinocytes to UVB or PUVA irradiation is the induction of apoptosis. In order to understand the apoptotic responses of keratinocytes, we compared UVB, PUVA, UVA irradiated and TRAIL-treated keratinocytes for the activation of major apoptosis signalling pathways. UVB and PUVA, but not UVA irradiation induced keratinocyte apoptosis in vitro. Activation of caspases was detectable within 2 – 4 h after UVB irradiation. Interestingly, caspase activation following PUVA was delayed, beginning by 12 hours post irradiation. In line, mitochondrial transmembrane potential (MTP) decreased 6 – 8 hours after UVB, whereas PUVA mediated MTP loss started only 12 - 14h post irradiation. Interestingly, Bcl-2 overexpression protected against UVB induced early MTP loss and caspase activation. Moreover, Bcl-2 also protected clonogenic survival following UVB irradiation independent of the UV-induced generation of reactive oxygen species. In marked contrast, although Bcl-2 delayed PUVA induced MTP loss and caspase activation, Bcl-2 overexpressing keratinocytes failed to protect clonogenic survival following PUVA. Interestingly, similar levels of ROS were produced by UVA and PUVA irrespective of the expression of Bcl-2, suggesting that ROS generation does not have a major role in PUVA induced activation of apoptosis signalling. We conclude that distinct pathways independent of caspases are employed to exert the cell death program in PUVA and UVB induced apoptosis. While PUVA-induced cell death overcomes Bcl-2 protected mitochondrial pathways of apoptosis, UVB induced cell death is dose-dependently protected by Bcl-2. Our data suggest that PUVA-induced DNA damage rather than ROS generation plays the key role for PUVA induced apoptosis. KW - Bcl-2 KW - Apoptose KW - UV KW - UVB KW - UVA KW - PUVA KW - Keratinozyten KW - HaCaT KW - TRAIL KW - Zytochrom c KW - Caspasen KW - ROS KW - Mitochondrium KW - Bcl-2 KW - apoptosis KW - UV KW - UVB KW - UVA KW - PUVA KW - keratinocytes KW - HaCaT KW - TRAIL KW - cytochrome c KW - caspases KW - reactive oxygen species KW - mitochondria Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-10903 ER - TY - THES A1 - Schmidt, Marc T1 - Die Rolle mitogener und stressinduzierter MAPK-Signalwege in der Regulation von keratinozytären Wachstums- und Differenzierungsvorgängen T1 - The role of mitogenic and stress-induced MAPK pathways in the regulation of growth and differentiation of keratinocytes N2 - Fehlgeleitete Proliferations- und Differenzierungsprozesse von Keratinozyten spielen eine entscheidende Rolle in der Pathogenese vieler Hauterkrankungen. Die intrazellulären Signalmechanismen, die die Balance zwischen Keratinozytenwachstum und -differen-zierung steuern, sind bislang weitgehend unbekannt. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung Mitogen-aktivierter Proteinkinase (MAPK-) Signalwege in keratinozytären Wachstums- und Differenzierungsvorgängen untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß Induktion von Keratinozytendifferenzierung durch Erhöhung der extrazellulären Calciumkonzentration mit einer raschen und transienten Aktivierung des Raf/MEK/Erk- (MAPK-) Signalweges verbunden ist, während keine veränderte Aktivität der stressinduzierten MAPK Jnk und p38 nachweisbar war. Die calciuminduzierte Erk-Aktivierung unterschied sich in ihrer Kinetik von mitogener Erk-Aktivierung durch den Epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und konnte durch Veränderungen der intrazellulären Calciumkonzentration moduliert werden. Während die mitogene Erk-Aktivierung durch die kleine GTPase Ras vermittelt wird, erfolgte calciuminduzierte Aktivierung von Erk Ras-unabhängig, was auf einen fundamentalen Unterschied mitogener und differenzierungsinduzierender Stimuli hinsichtlich ihrer Aktivierungsmechanismen der Raf/MEK/Erk-Kaskade hindeutet. Trotz der transienten Natur der calciuminduzierten Erk-Aktivierung waren die calcium-vermittelte Expression des Zellzykusinhibitors p21/Cip1 und des Differenzierungsmarkers Involucrin sensitiv für MEK-Inhibition, was auf eine wichtige Rolle des Raf/MEK/Erk-Signalweges in frühen Stadien des Differenzierungsprozesses hinweist. Wichtige Konvergenzpunkte zwischen calcium- und MAPK-abhängigen Signalwegen scheinen die beiden calciumbindenden S100-Proteine MRP8 und MRP14 zu sein. Beide Proteine werden in vitro differenzierungsabhängig exprimiert und translozieren sowohl nach Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration als auch nach Stimulation stress-aktivierter MAPK an Zytoskelettstrukturen. Untersuchung der Expression von MRP8 und MRP14 in paraffin- und kryofixierten Serienschnitten gesunder und pathologisch veränderter Haut ergab, dass deren Expression normalerweise auf differenzierende Zellen im Haarfollikel beschränkt ist, jedoch in differenzierten Hautschichten hyperproliferativer oder tumoröser Haut massiv induziert werden kann. In der hier vorgestellten Arbeit wurden interessante neue Signalbeziehungen identifiziert, deren Entdeckung einen wichtigen Beitrag zum Verständnis der regulatorischen Mechanismen leisten könnte, durch die die Epidermis ihre funktionell wichtige Homöostase erhält. N2 - Abnormal proliferation and differentiation processes play an important role in the pathogenesis of various skin diseases. The intracellular signaling mechanisms governing the balance between growth and differentiation of keratinocytes are still largely unknown. In this thesis the role of mitogen-activated protein kinase (MAPK) cascades in keratinocyte growth and differentiation was analysed. Induction of keratinocyte differentiation by elevation of extracellular calcium levels resulted in a rapid and transient activation of the Raf/MEK/Erk (MAPK) pathway but did not increase activity of the stress-activated Jnk or p38 MAPKs. Calcium-induced Erk activation differed in kinetics from mitogenic Erk activation by epidermal growth factor (EGF) and and could be modulated by alterations of intracellular calcium levels. While EGF-induced Erk activation was mediated by the small GTPase Ras, calcium-induced Erk activity occurred independently of active Ras. This suggests that proliferative and differentiation-inducing stimuli use alternative mechanisms to activate the Raf/MEK/Erk pathway. Despite the transient nature of Erk activation, calcium-induced expression of the cell cycle inhibitor protein p21 and the differentiation marker involucrin were sensitive to MEK inhibition which implies a role for the Raf/MEK/Erk pathway in early stages of keratinocyte differentiation. The two calcium binding S100 proteins additionally studied here, MRP8 and MRP14, seem to represent important convergent points between calcium and MAPK signaling. In vitro both proteins are expressed in a differentiation-dependent manner in keratinocytes. Elevation of intracellular calcium levels as well as activation of stress-activated MAPKs resulted in translocation of MRP8/MRP14 complexes to the cytoskeleton. When expression of MRP8 and MRP14 was analysed in serial paraffin- or kryo-sections of healthy or diseased skin, signals in normal skin were largely restricted to differentiating cells of the hair follicle, however, additionally a strong induction of MRP8/14 expression was observed in differentiating epidermal layers of hyperproliferative or tumorigenic skin. In this thesis important novel signaling interactions were identified which provide new basic insights into the molecular mechanisms involved in the regulation of skin homeostasis which is essential for the maintenance of the multiple functions of the epidermis. KW - Keratinozyt KW - Zelldifferenzierung KW - MAP-Kinase KW - Signaltransduktion KW - Keratinozyten KW - Differenzierung KW - Calcium KW - MAP-Kinase KW - Signaltransduktion KW - S100-Protein KW - Raf/MEK/ERK KW - Keratinocyte KW - differentiation KW - calcium KW - MAPK KW - signal transduction KW - S100 protein KW - Raf/MEK/ERK Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2013 ER -