TY - THES A1 - Schardt, Simon T1 - Agent-based modeling of cell differentiation in mouse ICM organoids T1 - Agentenbasierte Modellierung von Maus ICM Organoiden N2 - Mammalian embryonic development is subject to complex biological relationships that need to be understood. However, before the whole structure of development can be put together, the individual building blocks must first be understood in more detail. One of these building blocks is the second cell fate decision and describes the differentiation of cells of the inner cell mass of the embryo into epiblast and primitive endoderm cells. These cells then spatially segregate and form the subsequent bases for the embryo and yolk sac, respectively. In organoids of the inner cell mass, these two types of progenitor cells are also observed to form, and to some extent to spatially separate. This work has been devoted to these phenomena over the past three years. Plenty of studies already provide some insights into the basic mechanics of this cell differentiation, such that the first signs of epiblast and primitive endoderm differentiation, are the expression levels of transcription factors NANOG and GATA6. Here, cells with low expression of GATA6 and high expression of NANOG adopt the epiblast fate. If the expressions are reversed, a primitive endoderm cell is formed. Regarding the spatial segregation of the two cell types, it is not yet clear what mechanism leads to this. A common hypothesis suggests the differential adhesion of cell as the cause for the spatial rearrangement of cells. In this thesis however, the possibility of a global cell-cell communication is investigated. The approach chosen to study these phenomena follows the motto "mathematics is biology's next microscope". Mathematical modeling is used to transform the central gene regulatory network at the heart of this work into a system of equations that allows us to describe the temporal evolution of NANOG and GATA6 under the influence of an external signal. Special attention is paid to the derivation of new models using methods of statistical mechanics, as well as the comparison with existing models. After a detailed stability analysis the advantages of the derived model become clear by the fact that an exact relationship of the model parameters and the formation of heterogeneous mixtures of two cell types was found. Thus, the model can be easily controlled and the proportions of the resulting cell types can be estimated in advance. This mathematical model is also combined with a mechanism for global cell-cell communication, as well as a model for the growth of an organoid. It is shown that the global cell-cell communication is able to unify the formation of checkerboard patterns as well as engulfing patterns based on differently propagating signals. In addition, the influence of cell division and thus organoid growth on pattern formation is studied in detail. It is shown that this is able to contribute to the formation of clusters and, as a consequence, to breathe some randomness into otherwise perfectly sorted patterns. N2 - Die embryonale Entwicklung von Säugetieren unterliegt komplexen biologischen Zusammenhängen, die es zu verstehen gilt. Bevor jedoch das gesamte Gebilde der Entwicklung zusammengesetzt werden kann, müssen zunächst die einzelnen Bausteine genauer verstanden werden. Einer dieser Bausteine ist die zweite Zellschicksalsentscheidung und beschreibt die Differenzierung von Zellen der inneren Zellmasse des Embryos hin zu Epiblast- und primitiven Endodermzellen. Diese Zellen teilen sich daraufhin räumlich auf und bilden die anschließend die Grundlagen für den Embryo und den Dottersack. In Organoiden der inneren Zellmasse wird ebenfalls beobachtet, wie sich diese zwei Typen von Vorläuferzellen bilden, und sich in gewissem Maße räumlich voneinander trennen. Diesem Phänomenen widmete sich diese Arbeit im Verlaufe der letzten drei Jahre. Über diese Zelldifferenzierung ist bereits bekannt, dass die ersten Anzeichen für Epiblast- und primitive Endodermdifferenzierung jeweils die Expressionslevel der Transkriptionsfaktoren NANOG und GATA6 sind. Dabei nehmen Zellen mit niedriger Expression an GATA6 und hoher Expression an NANOG das Epiblastschicksal an. Sind die Expressionen umgekehrt, so entsteht eine primitive Endodermzelle. Bei der räumlichen Aufteilung der beiden Zelltypen ist noch nicht eindeutig geklärt, welcher Mechanismus dazu führt. Eine gängige Hypothese besagt, dass die Ursache für die räumliche Umlagerung der Zellen in der unterschiedlichen Adhäsion der Zellen liegt. In dieser Arbeit wird jedoch die Möglichkeit einer globalen Zell-Zell-Kommunikation untersucht. Die gewählte Vorgehensweise bei der Untersuchung dieser Phänomene folgt dem Motto "Die Mathematik ist das nächste Mikroskop der Biologie". Mit Hilfe mathematischer Modellierung wird das zentrale genregulierende Netzwerk im Mittelpunkt dieser Arbeit in ein Gleichungssystem umgewandelt, welches es ermöglicht, die zeitliche Entwicklung von NANOG und GATA6 unter Einfluss eines externen Signals zu beschreiben. Ein besonderes Augenmerk liegt dabei auf der Herleitung neuer Modelle mit Hilfe von Methoden der statistischen Mechanik, sowie dem Vergleich mit bestehenden Modellen. Nach einer ausführlichen Stabilitätsanalyse werden die Vorteile des hergeleiteten Modells dadurch deutlich, dass ein exakter Zusammenhang der Modellparameter und der Formierung von heterogenen Mischungen zweier Zelltypen gefunden wurde. Dadurch lässt sich das Modell einfach kontrollieren und die Proportionen der resultierenden Zelltypen bereits im Voraus abschätzen. Dieses mathematische Modell wird außerdem kombiniert mit einem Mechanismus zur globalen Zell-Zell Kommunikation, sowie einem Modell zum Wachstum eines Organoiden. Dabei wird gezeigt dass die globale Zell-Zell Kommunikation dazu in der Lage ist die Bildung von Schachbrettmustern, sowie auch umrandenden Muster anhand unterschiedlich ausbreitender Signale zu vereinen. Zusätzlich wird der Einfluss der Zellteilung und somit des Organoidwachstums auf die Musterbildung genauestens untersucht. Es wird gezeigt, dass dies zur Bildung von Clustern beiträgt und infolgedessen eine gewisse Zufälligkeit in ansonsten perfekt sortierte Muster einbringt. KW - Mathematische Modellierung KW - Embryonalentwicklung KW - Organoid KW - Differentialgleichung KW - Agentenbasierte Modellierung KW - Transkriptionelle Regulierung Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-301940 ER - TY - CHAP A1 - Peter, R. U. A1 - Schartl, Manfred A1 - Anders, F. A1 - Duncker, H.-R. T1 - Pigment pattern formation during embryogenesis in Xiphophorus N2 - No abstract available. KW - Schwertkärpfling KW - Embryonalentwicklung KW - Pigmentmuster Y1 - 1985 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69370 ER - TY - THES A1 - Englberger, Eva T1 - Gene regulation in hearts of Hey-mutant mouse embryos and monitoring of sub-cellular Hey1 distribution T1 - Genregulation in Herzen Hey-mutierter Mausembryonen und Darstellung der sub-zellulären Verteilung von Hey1 N2 - Hey-mutant mouse hearts at embryonic day E14.5 were shown to react to the knock out of Hey2 with several up-regualted genes. This up-regulation is due to the lack of Hey2 and cannot be explained by the structural changes in heart morphology as shown using control animals. Part of the gene regulation was further validated using in situ hybridization. Hey1 was located to the nucleus in immunofluorescence experiments. However, experiments on protein level showed also amount of Hey1 within the cytoplasm. The nuclear localization of Hey1 was unchanged during all cell cycle phases as well as when CaMKII was co-expressed or other cellular pathways were inhibited or stimulated. Hey1 does not seem to interact with the nuclear transport proteins importin-alpha and -beta, therefore it still needs to be elucidated how Hey1 is transported into the nucleus. N2 - Am Embryonaltag 14,5 zeigten Herzproben von Hey2-KO-Mäusen eine deutliche Hochregulation mehrerer Gene, die auf das Fehlen von Hey2 zurückzuführen ist, da Kontroll-Tiere gezeigt haben, dass die morphologischen Veränderungen in der Herzstruktur keinen Einfluss auf die Genregulation haben. Vereinzelt wurden die regulierten Gene noch mittels in situ Hybridisierung weiter verdeutlicht. In Immunfloureszenzexperimenten wurde Hey1 im Zellkern lokalisiert. Auf Proteinebene zeigte sich allerdings auch ein Vorhandensein von Hey1 im Cytoplasma der Zellen. Die Kernlokalisaiton von Hey1 veränderte sich während des gesamten Zellzykluses nicht und wurde auch nicht durch die Co-Expression von CaMKII beeinflusst oder die Inhibition oder Stimulation anderer Signalwege in der Zelle. Hey1 scheint nicht mit den Kerntransportproteinen Importin-alpha und -beta zu interagieren, so dass weiterhin nach einem Kernimport-System für Hey1 gesucht werden muss. KW - Maus KW - Herz KW - Embryonalentwicklung KW - Genregulation KW - Herzentwicklung KW - Kerntransport KW - Hey KW - heart development KW - nuclear transport Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73395 ER - TY - THES A1 - Heisig, Julia T1 - Identifizierung neuer Zielgene der Hey bHLH Transkriptionsfaktoren T1 - Identification of novel target genes of Hey bHLH transcription factors N2 - Der Notch Signalweg spielt während der Embryonalentwicklung eine zentrale Rolle in der Spezifizierung des Zellschicksales, der Proliferation und der Kommunikation benachbarter Zellen. Die Hey bHLH Transkriptionsfaktoren sind Zielgene des Notch-Signalweges und besitzen wichtige Funktionen in der kardiovaskulären Entwicklung. Hey2 Knockout (KO) Mäuse und Hey1/HeyL Doppelknockout-Mäuse (DKO) sind gekennzeichnet durch eine fehlerhafte Ausbildung der Herzscheidewand und der Herzklappen und durch eine unzureichende Differenzierung während der Blutgefäßentwicklung. Ziel dieser Arbeit war es, neue Zielgene der Hey Proteine zu finden, um ihre Funktion in der Organentwicklung und die Ausprägung der Hey KO Maus-Phänotypen besser verstehen zu können. Dazu wurde als Methode eine Kombination aus Microarray-Analyse und Chromatinimmunpräzipitation (ChIP) gewählt, um gleichzeitig einen Überblick über die regulierten Zielgene und der direkt gebundenen Promotoren zu gewinnen. Als Zellkulturmodell wurden HEK293-Zellen genutzt, die doxyzyklin-induzierbar Flag-markiertes Hey1, bzw. Hey2 Protein überexprimieren. Eine Microarray-Analyse nach Überexpression von Hey1, bzw. Hey2 ergab insgesamt ca. 100 bis zu 5-fach herunterregulierte Zielgene und nur für Hey2 15 Gene, die stärker als 2-fach hochreguliert waren. Eine ChIP mit αFlag-Antikörper zeigte eine direkte DNA-Bindung von Hey1, bzw. Hey2, im proximalen Promotorbereich von 4 herunterregulierten Zielgenen (HEY1, BMP2, KLF10 und FOXC1). Ist jedoch die DNA-bindende basische Domäne des Hey1-Proteins deletiert, bzw. durch Aminosäureaustausche (3 Arginine zu 3 Lysine) vermutlich nicht mehr DNA-bindend, kann eine Herunterregulation der Zielgene nach Überexpression der Hey1-Mutanten nicht mehr festgestellt werden. Ebenso kann eine Bindung der Hey1-Mutanten an die ausgewählten Promotoren von HEY1, BMP2, KLF10 oder FOXC1 mit ChIP nicht mehr nachgewiesen werden. Dies deutet darauf hin, dass die basische Domäne essentiell für die DNA-Bindung und für die Funktion der Hey Proteine ist. Mit ChIP-PET und anschließender Hochdurchsatz-Sequenzierung wurde ein genomweiter Screen der Hey1- und der Hey2-Bindungsstellen in HEK293-Zellen durchgeführt. Für Hey1 wurden 1453 Zielgene, für Hey2 4288 Zielgene bestimmt, wobei 1147 Gene gemeinsame Zielgene von Hey1 und Hey2 waren. Obwohl die Bindungsstellen in 5'- und 3'-Richtung von kodierenden Sequenzen und auch in Exons und Introns lokalisiert waren, waren 55 %, bzw. 49 % aller Bindungsstellen für Hey1, bzw. Hey2 im proximalen Promotorbereich von -0,5 kb und im ersten Exon lokalisiert. Eine in silico Analyse des Bindemotivs deutete auf eine repetitive GC-haltige Sequenz hin, die vermutlich in CpG Inseln lokalisiert ist. Diese Ergebnisse weisen auf eine direkte Regulation der Transkriptionsmaschinerie durch die Hey Proteine hin. Ein Vergleich der Zielgene aus den Microarray-Analysen mit den ChIP-PET Daten zeigte einen hohen Anteil an herunterregulierten Genen mit Bindestellen, die direkt von Hey gebunden waren. Während 60 % der herunterregulierten Hey2 Zielgene in der ChIP-PET Analyse eine direkte DNA-Bindung zeigen, weisen nur 20 % der hochregulierten Gene Bindestellen für Hey2 auf. Dies spricht für eine überwiegende Repressorfunktion der Hey Proteine. Um zu überprüfen, inwieweit die Hey Proteine zelltypspezifisch verschiedene Zielgene regulieren, wurden embryonale Stammzellen (ES-Zellen) generiert, die ebenfalls doxyzyklin-induzierbar Hey1, bzw. Hey2 überexprimieren. Diese ES-Zellen konnten effektiv zu Kardiomyozyten differenziert werden, so dass auch in diesen Zellen eine Hey Überexpression induziert und somit eine Genexpressionsanalyse durchgeführt werden konnte. Microarray Analysen der ES-Zellen und Kardiomyozyten ergaben mehr hoch- als herunterregulierte Gene im Vergleich zu HEK293-Zellen. Die Überlappung an gemeinsam regulierten Zielgenen in HEK293, ES-Zellen und Kardiomyozyten war sehr gering. Nur zwei Hey2-Zielgene wurden gleichzeitig in HEK293 und ES-Zellen stärker als 2-fach reguliert (Hes1, Zic2). Diese geringe Überlappung deutet auf ein enges zelltypspezifische Regulationspotential hin. Eine Genontologie-Analyse aller Zielgene zeigte Interaktionen der Hey Proteine mit verschiedenen Signalwegen (z.B. TGFβ-, Id- oder Wnt-Signalweg), die alle unersetzlich in frühen Entwicklungsprozessen sind. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Hey Proteine zelltypspezifisch die Expression von Genen aus verschiedenen Signalwegen beeinflussen und modulieren können. Weiterhin eröffnen diese Daten neue Möglichkeiten für zukünftige Forschung, um die Rolle der Hey Proteine in der frühen Organentwicklung genauer ergründen. N2 - During embryonic development, the Notch signaling pathway plays a central role in cell fate specification, proliferation and communication between neighboring cells. Hey basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factors are targets of the Notch signaling pathway and show crucial functions in cardiovascular development. Hey2 knock out (KO) mice and Hey1/HeyL double knock out mice (DKO) exhibit incomplete formation of the septum and valves in heart development and defects in the differentiation of blood vessels. The aim of this study was to find new target genes of the Hey proteins to further clarify their function during organ development and to get more insight into the phenotypes of the Hey KO mice. Towards this goal, a combination of microarray analysis and chromatin immunoprecipitation (ChIP) was chosen to get an overview of genes directly regulated by Hey proteins in a cell culture model of HEK293 cells overexpressing doxycycline-inducible Flag-tagged Hey1 or Hey2. Microarray analysis revealed approximately 100 target genes that were downregulated up to 5-fold by both Hey1 and Hey2. Interestingly, 15 genes were upregulated more than 2-fold by Hey2. ChIP with αFlag antibody confirmed direct interaction of Hey1 and Hey2 with the proximal promotor regions of 4 downregulated target genes (HEY1, BMP2, KLF10 und FOXC1). Overexpression of mutant Hey1 proteins with deletion of the DNA-binding basic domain or single amino acid exchanges in the basic domain (3 arginine to lysine), failed to downregulate Hey1 target genes. Additionally, ChIP assay demonstrated that the binding of the Hey mutants to the promotor regions of HEY1, BMP2, KLF10 or FOXC1 is abolished, suggesting an essential role for the basic domain in DNA binding and function of the Hey proteins. We then utilized ChIP-PET in conjunction with highthroughput sequencing to perform a genome-wide screen for Hey1 and Hey2 binding sites in HEK293 cells. 1453 and 4288 target genes were identified for Hey1 and Hey2, respectively, of which 1147 genes were targets of both Hey1 and Hey2. Although the binding sites were located upstream and downstream of coding sequences, or even in exons and introns, 55 % and 49 % of all binding sites for Hey1 and Hey2, respectively, were located in proximal promoter regions between -0.5 kb and the first exon. An in silico binding motif analysis suggests a repetitive GC-rich sequence for Hey binding which is probably located in CpG islands, indicating a direct regulation of the transcriptional machinery by the Hey proteins. A comparison of the target genes from microarray analysis and ChIP-PET sequencing data demonstrates a large number of downregulated genes with binding sites that are directly bound by the Hey proteins. While 60 % of Hey2 downregulated genes contain binding sites, only 20 % of upregulated genes have binding sites for Hey2, invoking a repressor function for Hey proteins. To investigate, whether the Hey proteins regulate different target genes in a cell type specific manner, embryonic stem cells (ES cells) were generated which also overexpress doxycycline-inducible Hey1 or Hey2. These ES cells could be differentiated efficiently into cardiomyocytes and thus could also be used for gene expression analysis after induction of Hey overexpression. Microarray analysis of ES cells and cardiomyocytes resulted in more up- than downregulated genes in comparison to HEK293 cells. The overlap of common regulated genes in HEK293, ES cells and cardiomyocytes was very low. Only two Hey2 target genes were regulated more than 2-fold in both HEK293 and ES cells (Hes1, Zic2). This disparity indicates a narrow cell-type specific gene regulation by Hey proteins. Gene ontology analysis of all target genes demonstrated interactions of Hey proteins with different signaling pathways (e.g. TGFβ, Id or Wnt signaling), which are all indispensable for early developmental processes. These results show that Hey proteins influence and modulate gene expression levels in different signaling pathways in a cell-type specific manner. These data provide new possibilities for future research efforts to elucidate the role of Hey proteins in early organ development. KW - Gen notch KW - Transkriptionsfaktor KW - Embryonalentwicklung KW - Kardiovaskuläres System KW - bHLH KW - Hey KW - Chromatinimmunpräzipitation KW - Microarray KW - bHLH KW - Hey KW - Chromatin Immunoprecipitation Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65053 ER - TY - THES A1 - Subramanian, Narayan T1 - Role of NaV1.9 in activity dependent axon growth in embryonic cultured motoneurons T1 - Die Rolle der NaV1.9 in Aktivität abhängig Axonwachstum in embryonalen kultivierten Motoneuronen N2 - Spontaneous neural activity has been shown to regulate crucial events in neurite growth including axonal branching and path finding. In animal models of spinal muscular atrophy (SMA) cultured embryonic mouse motoneurons show distinct defect in axon elongation and neural activity. This defect is governed by abnormal clustering of Ca2+ channels in the axonal regions and the protruding growth cone area. The mechanisms that regulate the opening of calcium channels in developing motoneurons are not yet clear. The question was addressed by blocking neural activity in embryonic cultured motoneurons by pharmacological inhibition of voltage-gated sodium channels (VGSC) by saxitoxin (STX) and tetrodotoxin (TTX). Low dosages of STX resulted in significant reduction of axon growth and neural activity in cultured motoneurons. This pharmacological treatment did not affect survival of motoneurons in comparison to control motoneurons that was grown in the presence of survival neurotrophic factors BDNF and CNTF. It was also found that STX was 10 times more potent than TTX a common inhibitor of VGSC with a reduced activity on the TTX-insensitive sodium channels NaV1.5, NaV1.8 and NaV1.9. Reverse Transcriptase-PCR experiments revealed the presence of NaV1.9 as the likely candidate that begins to express from embryonic stage sixteen in the mouse spinal cord. Immunolabelling experiments showed that the channel is expressed in the axonal compartments and axonal growth cones in cultured motoneurons. Suppression of NaV1.9 in cultured motoneurons by lentivirus mediated short hairpin-RNA (shRNA) resulted in shorter axon length in comparison with uninfected and scrambled constructs. Further, embryonic motoneurons cultured from NaV1.9 knockout mice also showed a significant reduction in neural activity and axon growth. The findings of this work highlight the role of NaV1.9 as an important contender in regulating activity dependent axon growth in embryonic cultured motoneurons. NaV1.9 could therefore be considered as a prospective molecule that could play an important role in regulating axon growth in motoneuron disease models like spinal muscular atrophy (SMA). N2 - Spontane neuronale Aktivität reguliert essentielle Ereignisse im Neuritenwachstum, wie beispielsweise die axonale Verzweigung und die Erkennung des Wachstumspfades. Motoneurone, die aus Tiermodellen der Spinalen Muskelatrophie (SMA) gewonnen werden, zeigen einen auffälligen Defekt im Streckenwachstum von Axonen und in der neuronalen Aktivität. Dieser Defekt wird von anormaler Clusterbildung von Ca2+ Kanälen in axonalen Regionen und in Wachstumskegeln begleitet. Die Mechanismen, die das Öffnen von Kalziumkanälen in embryonalen Motoneuronen in der Entwicklung regulieren, und die für das aktivitätsabhängige Axonwachstum benötigt werden, sind nicht bekannt. Diese Frage wurde in dieser Studie bearbeitet, indem neuronale Aktivität in embryonalen Motoneuronen durch pharmakologische Inhibition von spannungsabhängigen Natriumkanälen durch Saxitoxin (STX) und Tetrodotoxin blockiert wurde. Geringe Dosen von Saxitoxin bewirkten eine deutliche Reduktion des Axonwachstums und der neuronalen Aktivität in kultivierten Motoneuronen. Diese pharmakologische Behandlung beeinflusste nicht das Überleben von Motoneuronen im Vergleich zu Kontroll-Motoneuronen, die in der Anwesenheit der neurotrophen Faktoren BDNF und CNTF kultiviert wurden. Saxitoxin war etwa 5-10-mal potenter als TTX, ein üblicher Blocker spannungsabhängiger Natriumkanäle mit einer verminderte Aktivität auf die TTX-insensitiven Natriumkanäle NaV1.5, NaV1.8, und NaV1.9. Reverse-Transkriptase-PCR Experimente bestätigten die Anwesenheit von NaV1.9 am Tag E16 (embryonaler Tag 16) im Rückenmark der Maus. NaV1.9 ist ein einzigartiger Typus von einem Natriumkanal welcher in der Lage ist neuronale Erregbarkeit in der Nähe des Ruhemembranpotentials zu steuern. Deshalb war NaV1.9 ein guter Kandidat für einen Kanal, der spontane Erregung in Motoneuronen vermittelt. Immunofärbungen zeigten, dass NaV1.9 in axonalen Kompartimenten und axonalen Wachstumskegeln von kultivierten Motoneuronen exprimiert ist. Die Unterdrückung von NaV1.9 in kultivierten Motoneuronen durch lentiviralexprimierte short hairpin-RNA (shRNA) resultierte in kürzerer Axonlänge, im Vergleich zu nicht-infizierten Motoneuronen oder Motoneuronen, die eine sinnlose Kontroll-shRNA Sequenz exprimierten. Embryonale, kultivierte Motoneurone von NaV1.9 knockout Mäusen zeigten eine signifikante Verringerung der neuronalen Aktivität und verkürzte Axone. Diese Ergebnisse weisen auf eine Bedeutung von NaV1.9 im aktivitätsabhängigen Axonwachstum hin KW - Axon KW - Embryonalentwicklung KW - Motoneuron KW - Natriumkanal KW - Motoneuronen KW - NaV1.9 KW - motoneuron KW - Nav1.9 KW - axon growth Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57536 ER - TY - THES A1 - Torlopp, Angela T1 - Die Rolle von FGF in der frühen Kardiogenese und Proepikardiogenese im Hühnerembryo T1 - The role of FGF signaling during early heart and proepicardium development in the chick embryo N2 - In dieser Arbeit sollte die Funktion von FGF-Signalen im Herzfeld und in der Entwicklung des Proepikards im Hühnerembryo untersucht werden. Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGF) sind eine große Gruppe von Signalmolekülen und in eine Vielzahl von Entwicklungsprozessen involviert. Das Proepikard (PE), welches sich asymmetrisch auf dem rechten Sinushorn des Sinus venosus entwickelt, bildet die Grundlage des Koronargefäßsystems des Herzens. FGF-Liganden (FGF2, FGF10, FGF12) werden insbesondere in den epithelialen Zellen des Proepikards exprimiert, sowie an der sinomyokardialen Basis dieser embryonalen Progenitorpopulation. Die FGF-Rezeptoren (FGFR1, FGFR2, FGFR4) weisen ein ähnliches Expressionsmuster auf und deren Inhibition, durch spezifische Antagonisten, war der Ausgangspunkt für die funktionelle Analyse der proepikardialen FGF-Signalaktivität. Die Inhibition von FGF-Signalen in vitro führt zu einem verringerten Wachstum sowie einer erhöhten Apoptoserate in proepikardialen Explantaten, die unter serumfreien Bedingungen kultiviert wurden. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl der Ras/MAPK- als auch der PI3-Kinase-Signalweg, beides Bestandteile der FGF-Signaltransduktion, für das Wachstum und Überleben proepikardialer Zellen verantwortlich sind. Dagegen sind FGF-Signale nicht in die Etablierung proepikardialer Identität involviert, wie die Analyse der Expression etablierter proepikardialer Markergene wie TBX18, WT1 und TBX5 nach FGF-Inhibition zeigte. Dies konnte gleichfalls durch in vivo-Experimente gezeigt werden, in denen die rechtsseitige Inhibition von FGF zu einem retardierten Proepikardwachstum führte. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die asymmetrische Apoptose in der sich transient entwickelnden linksseitigen Proepikardanlage auf eine frühe differentielle Expression von Apoptosegenen wie Caspase 2 zurückgeht. Diese asymmetrische Expression wird von FGF8 reguliert, wahrscheinlich als Teil eines frühen rechtsseitigen Signalweges, der Apoptose im rechten Sinushorn des kardialen Einflusstraktes verhindert. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Expression der Hyaluronansynthase 2 (HAS2) in Abhängigkeit von FGF in der Herzfeldregion analysiert. Hyaluronansynthasen produzieren Hyaluronsäure, welches eine essentielle Komponente der extrazellulären Matrix ist. Es wurde in vivo gezeigt, dass die Expression von HAS2 im primären Herzfeld in gleicher Weise von FGF reguliert wird wie die des kardialen Transkriptionsfaktors NKX2.5. Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen, dass FGF während der frühen Entwicklung des Herzens und der Entstehung des Proepikards diverse Funktionen besitzt. N2 - The aim of this study was the functional analysis of FGF signaling during early heart field formation and proepicardial development in the chick embryo. Fibroblast growth factors (FGF) belong to a large group of signaling molecules and play crucial roles in many different developmental processes. The proepicardium (PE) develops asymmetrically on the right sinus horn of the cardiac inflow tract and is the source of the coronary vasculature of the heart. FGF ligands (FGF2, FGF10, and FGF12) are specifically expressed in epithelial cells of the proepicardium as well as in the underlying inflow tract myocardium. FGF receptors (FGFR1, FGFR2, and FGFR4) display similar expression patterns in the proepicardium and their inhibition by specific antagonists was the entry point into the functional analysis of FGF signaling in proepicardial cells. The inhibition of FGF signaling in vitro leads to retarded outgrowth as well as increased apoptosis in proepicardial explants, which were cultured under serum free conditions. It was shown that both Ras/MAPK and PI3 kinase signaling as integral parts of FGF signaling transduction are responsible for growth and survival of proepicardial cells in this context. However, FGF signaling is not involved in the establishment of proepicardial identity as shown by the maintenance of expression of well-established proepicardial marker genes such as TBX18, WT1 and TBX5 after FGF inhibition. These findings were verified by in vivo experiments, showing that inhibition of FGF leads to retarded outgrowth of the proepicardium. Furthermore it was shown that asymmetric apoptosis in a transiently established left-sided PE-anlage is based on an early differential expression of apoptosis-inducing genes like Caspase 2. This asymmetric expression is regulated by FGF8 probably as part of an early right-sided signaling pathway, which prevents apoptosis in the right sinus horn of the cardiac inflow tract. In a second topic of this thesis the expression of the hyaluronan synthase 2 (HAS2) in the control of FGF signaling during early heart field formation was analyzed. Hyaluronan synthases are involved in the production of hyaluronic acid, which is an essential component of the extracellular matrix. The role of FGF signaling was tested in vivo and it is shown here, that the expression of HAS2 in the primary heart field is dependent on FGF as well as other cardiac marker genes such as the transcription factor NKX2.5. This thesis demonstrates that FGF has multiple roles during early heart development and formation of the proepicardium. KW - Huhn KW - Embryonalentwicklung KW - Fibroblastenwachstumsfaktor KW - Epikard KW - Hyaluronsäure KW - FGF KW - Wnt KW - Has2 KW - Proepikard KW - Kardiogenese KW - Apoptose KW - Hühnerembryo KW - FGF KW - Wnt KW - Has2 KW - proepicardium KW - cardiogenesis KW - apoptosis KW - chick embryo Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47695 ER - TY - THES A1 - Pühringer, Dirk T1 - Die Transaktivierung des Neurotrophin-Rezeptors TrkB durch EGF während der Kortexentwicklung der Maus T1 - Transactivation of the neurotrophin receptor trkB by EGF during corticogenesis in mice N2 - Die Rolle der Hirnrinde als Zentrum komplexer Funktionen wie Lernen und Ge-dächtnis wird nicht zuletzt durch deren komplexe, in Schichten organisierte Architek-tur ermöglicht. Von entscheidender Bedeutung ist die präzise Positionierung von Nervenzellen, die im Laufe der Embryonalentwicklung in der Ventrikularzone (VZ) geboren werden und anschließend in radialer Richtung zu ihrem Bestimmungsort wandern. Die Funktion des Neurotrophin-Rezeptors TrkB an der Entwicklung des zerebralen Kortex war Gegenstand dieser Arbeit. Am Tag 12,5 der Embryonalentwicklung konnte die Expression von TrkB so-wohl in den Zellen der VZ als auch in neu geborenen Neuronen der Präplatte nach-gewiesen werden. Die Phosphorylierung des Rezeptors erfolgte dabei unabhängig von den beiden Liganden BDNF und NT-3. Ebenso führten BDNF oder NT-3 zu keiner zellulären Antwort in isolierten kortikalen Vorläuferzellen, wohingegen die Stimulation mit EGF eine Phosphorylierung von TrkB an der PLCγ- und der Shc-Bindungsstelle hervorrief. Durch pharmakologische Inhibition und die Überexpression dominant negativer Src-Mutanten konnte die Beteiligung des EGF-Rezeptors und zweier neuronal exprimierter Src-Kinasen, cSrc und Fyn, an dieser Transaktivierung von TrkB durch EGF gezeigt werden. Durch die Zugabe von EGF kam es im Zuge der Aktivierung von TrkB auch zur Umverteilung des Rezeptors von intrazellulären Kompartimenten zur Zellmem-bran. Die Retention des Rezeptors im Zytoplasma wurde über post-translationelle Modifikation reguliert. Die Verhinderung von N-Glykosylierung durch Tunicamycin-Behandlung kortikaler Vorläuferzellen führte zur Exposition von TrkB an der Zellober-fläche und konnte so Responsivität gegenüber BDNF herstellen. Die physiologische Bedeutung einer Transaktivierung von TrkB durch EGF wurde durch das Fehlen der TrkB-Aktivierung in EGFR KO-Mäusen am Embryonal-tag 12,5 gezeigt. Dies hatte eine fehlerhafte Positionierung kortikaler Nervenzellen zum Zeitpunkt E15,5 zur Folge. Anhand eines Migrationsassays konnte schließlich gezeigt werden, dass die EGF-induzierte Wanderung kortikaler Vorläuferzellen in vitro mit einer asymmetrischen Translokation von TrkB einhergeht. Über die Transaktivierung von TrkB in frühen Phasen der Kortexentwicklung spielt EGF eine wichtige Rolle bei der Induktion neuronaler Differenzierung und ist an der Regulation der Wanderung postmitotischer Neurone in der Hirnrinde beteiligt. N2 - The complex layered architecture of the cerebral cortex is a prerequisite for its role as the centre of complex cognitive functions like learning and memory. In this respect, the precise positioning of neurons is a crucial event. During embryogenesis, the majority of cortical neurons is born in the ventricular zone of the forebrain, from where postmitotic cells migrate radially to their specific destinations. The role of the neurotrophin receptor TrkB for the development of the cerebral cortex was studied in this thesis. At embryonic day 12.5, the expression of TrkB was confined to the proliferative precursor cells in the ventricular zone as well as in the newborn neurons building up the preplate at the pial surface of the developing cortex. Thereby, the phospho-rylation of the receptor was independent of the ligands BDNF or NT-3. Likewise, the stimulation of isolated cortical precursor cells with BDNF or NT-3 did not lead to any cellular response, whereas cells challenged with EGF showed a robust increase of phospho-rylation at the PLCγ- and Shc-binding sites of TrkB. The contribution of the EGF receptor and the two src family members cSrc and Fyn to this transactivation event could be established via pharmacological inhibition and the overexpression of dominant negative mutants. Upon EGF stimulation, cortical precursor cells did not only show the activation of TrkB but also the translocation of the receptor from intracellular compartments to the plasma membrane. The retention of TrkB in the cytoplasm was achieved by post-translational modifications. In this respect, the inhibition of N-glycosylation in cortical precursors by treatment with tunicamycin led to the exposition of TrkB at the cell surface and thereby restored responsiveness to BDNF. The physiological significance of TrkB transactivation by EGF was underlined by the almost complete absence of TrkB phosphorylation in the forebrain of EGF receptor deficient mice at E12.5, leading to the disturbed positioning of cortical neurons at E15.5. Applying the stripe assay, it could be shown, that the migration of cortical precursors in vitro is accompanied with an asymmetric translocation of TrkB. By the transactivation of TrkB, EGF is able to induce neuronal differentiation in early phases of corticogenesis and furthermore takes part in regulating the migration of postmitotic neurons within the cerebral cortex. KW - Großhirnrinde KW - Embryonalentwicklung KW - Neurogenese KW - Genexpression KW - Neurotrophine KW - TrkB KW - EGFR KW - Migration KW - Kortikogenese KW - neurotrophins KW - trkB KW - EGFR KW - migration KW - corticogenesis Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-50049 ER - TY - THES A1 - Schlüter, Jan T1 - Molekulare Charakterisierung der Proepikardentwicklung T1 - Molecular Characterization of Proepicardial Development N2 - Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung der molekularen Grundlagen der Proepikardentwicklung im Huhn. Das Proepikard (PE) stellt die Vorläuferpopulation des Koronargefäßsystems dar. Es wurden zwei Schwerpunkte bearbeitet, zum einen die Rolle von einem Mitglied der TGFß-Superfamilie (BMP, bone morphogenetic protein) während der Induktionsphase des PE und zweitens die molekularen Mechanismen, welche der links/rechts Asymmetrie der PE Entwicklung zugrunde liegen. Die Expressionsmuster von TBX18, WT1, CFC weisen diese als proepikardiale Marker aus. BMP4 wird ebenfalls im PE exprimiert, wenngleich wesentlich schwächer als BMP2 im benachbarten Sinusmyokard. Durch in vitro Experimente mit proepikardialen Primärkulturen wurde festgestellt, dass die Zugabe von rekombinatem BMP2 einen Teil der Zellen zu Kardiomyozyten differenzieren lässt. Daher wird angenommen, dass ein Teil der proepikardialen Zellen konzentrationsabhängig auf Wachstumsfaktoren reagieren und in der Lage sind, die epikardiale Linie zu verlassen und ein myokardiales Schicksal anzunehmen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Rolle des NODAL-PITX2-Signalweges in Bezug auf die Unilateralität des Proepikards im Hühnchen analysiert. Dazu wurden Manipulationen des Hensenschen Knotens im HH Stadium 4 durchgeführt, mit dem Ziel linksseitige Markergene auf der rechten Seite ektopisch zu induzieren. Keine dieser Manipulationen, als auch eine virale Überexpression von PITX2 in sinuatrialen Progenitoren in vivo, liess eine Veränderung der TBX18-Lateralität erkennen, obwohl die PITX2-Expression randomisiert war. Dagegen führte die Inhibition des asymmetrischen Ionenfluxes sowie der Apoptose im Primitivstreifen zu einer völligen Randomisierung der TBX18-Expression, sowie unter anderem der Entwicklung bilateraler Proepikardien. Die Induktion bilateraler TBX18-Expressionsdomänen war ebenfalls durch ektopisches FGF8 auf der linken Seite des Knotens zu beobachten. Der Verlust der rechtsseitigen FGF Signalgebung im Knoten resultierte in einem Verlust der rechtsseitigen TBX18-Expression im Sinus. Daraus kann geschlossen werden, dass proepikardiale Progenitoren nicht nur durch den asymmetrischen Ionenflux sowie Apoptose im Primitivstreifen in ihrer Lateralität festgelegt werden, sondern auch von rechtsseitigen FGF-Signalen im Knoten und unabhängig vom linkseitigen NODAL-PITX2-Signalweg lateralisiert werden. N2 - The proepicardium (PE) is a progenitor population of cells, which gives rise to the coronary blood vessel system of the heart. The aim of this study was to unravel the underlying mechansims of the induction of proepicardial development in the chick. Two main topics were hereby addressed, (1) investigation of the role of BMP (bone morphogenetic protein), a member of the TGFß-superfamily, during the induction of the PE and (2) the molecular mechanisms, which underlie the asymmetrical development of the PE. The analysis of TBX18, CFC and WT1 expression shows that these genes serve as proepicardial markers. BMP4 is also expressed in the PE, but significantly weaker than BMP2 that was known to be expressed in the sinus myocardium. Studies of proepicardial explants revealed, that treatment with recombinant BMP2 leads to differentiation into contractile cardiomyocytes. One can assume that proepicardial cells react after stimulation with growth factors like BMP2 by leaving the epicardial lineage and adopting a myocardial fate. In the second topic, the role of the NODAL-PITX2 pathway in the asymmetrical PE development was analyzed. Manipulations of Hensens node at stage HH 4 were performed to induce leftsided marker gene expression on the right side. However, none of these manipulations as well as a forced overexpression of PITX2 in sinuatrial progenitors had an influence on the expression of TBX18 in the right sinus. In contrast, inhibition of asymmetrical ionflux and prevention of apoptosis in the primitive streak randomized TBX18 expression and lead to the induction of bilateral PE anlagen. The applicaton of FGF8 on the left side of the node also lead to induction of bilateral TBX18 expression domains and the loss of FGF on the right side was followed by a loss of rightsided TBX18 expression. Presumably, the laterality of proepicardial cells is not only determined by an early asymmetrical ionflux and apoptosis in the primitive streak, but also via rightsided FGF signaling in the node which acts independently of the leftsided NODAL-PITX2 pathway. KW - Embryonalentwicklung KW - Hühnerembryo KW - Proepikard KW - links-rechts Asymmetrie KW - BMP KW - FGF KW - chick embryo KW - proepicardium KW - left-right asymmetry KW - BMP KW - FGF Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-30287 ER - TY - THES A1 - Gareiß, Martin T1 - Molekulare Charakterisierung und entwicklungsspezifische Expression der Kernmembranproteine Emerin und MAN1 im Tiermodell Xenopus laevis T1 - Molecular characterization and developmental expression of the nuclear membrane proteins ,emerin’ and ,MAN1’ in the model system Xenopus laevis N2 - Mutationen im humanen Emerin-Gen verursachen beim Menschen eine angeborene Muskelschwäche, die X-gebundene Emery-Dreifuss. Der Phänotyp dieser Störung manifestiert sich in der zweiten und dritten Lebensdekade durch Verkürzungen der Nacken , Ellenbogen- und Achillessehnen, progressiven Muskelschwund am Oberkörper sowie Störung der Reizweiterleitung und eine Kardiomyopathie. Zwar wurden die Funktionen dieses ubiquitären Kernmembranproteins bislang intensiv erforscht, allerdings blieben die krankheitsverursachenden Mechanismen, die für den späten Ausbruch der gewebespezifischen Erkrankung verantwortlich sind, noch weitestgehend unverstanden. Um Erkenntnisse über die pathologische(n) Funktion(en) des integralen Membranproteins Emerin zu gewinnen, wurde dessen spatio-temporäre Transkriptions- und Expressionsmuster während der frühen Embryonalentwicklung im Modellsystem Xenopus laevis charakterisiert. Durch EST-Datenbankanalysen konnten in der pseudotetraploiden Spezies zwei Emerin-Gene (Xemerin1 und -2) identifiziert werden. Im Unterschied zu dem längeren Säuger-Emerin (254 Reste bei Homo sapiens ) konnte allerdings kein Kernlokalisationssignal und auch kein serinreicher Sequenzbereich festgestellt werden. Durch Herstellung monoklonaler Antikörper wurde die subzelluläre und gewebespezifische Lokalisation der Xemerin-Proteine untersucht. Interessanterweise war Xemerin weder in der Immunfluoreszenz noch im Immunblot in Oozyten nachweisbar. Mit dem zweidimensionalen Gelektrophorese-Verfahren NEPHGE konnte gezeigt werden, dass der von uns hergestellte monoklonale Antikörper 59/7 beide Xemerin-Formen erkannte und die Proteine durch unterschiedliche molekulare Massen und isoelektrische Punkte voneinander zu trennen waren. Durch Immunoblotting embryonaler Proteine aus unterschiedlichen Entwicklungsstadien konnte gezeigt werden, dass Xemerin1 und -2 im Laufe der Embryogenese von Xenopus laevis erstmals im Entwicklungsstadium 43 exprimiert werden. Unerwarteterweise konnte durch RT-PCR-Analysen eine Aktivität der Xemerin-Gene während der gesamten Embryogenese belegt werden. Northernblot- und Sequenzanalysen der Xemerin-mRNA zeigten außerordentlich große untranslatierte Bereiche mit snRNP-Bindungsmotiven. Durch zwei voneinander unabhängige Analyseverfahren wurde festgestellt, dass die Xemerin-Genaktivität ab dem Stadium 30 deutlich zunahm. Äußerst interessant war in diesem Zusammenhang die Beobachtung, dass exakt zu diesem Zeitpunkt die Aktivität des XMAN1-Gens, einem weiteren Protein der inneren Kernmembran, signifikant herunterreguliert wurde. Whole-mount in situ Hybridisierungsversuche zeigten einen Xemerin-Expressionsschwerpunkt in neuro-ektodermalen Geweben von Tadpole-Embryonen, wie dies auch von XMAN1 (auch SANE genannt) berichtet wurde. Aufgrund dieser Erkenntnisse wurde angenommen, dass Xemerin und XMAN1 überlappende Funktionen aufweisen. Durch die Herstellung rekombinanter Fusionproteine konnte gezeigt werden, dass XMAN1 eine identische subzelluläre Verteilung wie Xemerin aufwies. In vitro Bindungsassays wiesen eine direkte Wechselwirkung von XMAN1 mit beiden Xemerin-Formen sowie mit Xenopus Lamin A nach. Diese Arbeit konnte durch die Charakterisierung von Xenopus Emerin die Grundlagen für weitere intensive Forschungen legen und zeigt eindeutig, dass das Modellsystem Xenopus laevis mit dem Säugermodell Maus konkurrenzfähig ist, um die krankheitsverursachende Mechanismen der Emery-Dreifuss Muskeldystrophie aufzuklären. N2 - Mutations in the human emerin gene EMD cause a rare form of an inheritated muscle dysfunction of striated muscle, named Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD1; OMIM 310300). The clinical phenotype of this genetic perturbance is manifested in 2nd-3rd decade by contraction of the cervical, elbow and Achilles tendons, by progressive muscle wasting and disturbance of the conduction system and cardiomyopathy, often leading to sudden death. Extensive investigations were made on the functions of this ubiquitous nuclear membrane protein, but the disease causing mechanisms remain obscure leading to the late onset of this tissue specific disease. To allure insights of the pathological function(s) of emerin this work examines the spatio-temporal transcription and expression patterns of emerin during development of the vertebrate model Xenopus laevis. Sequence analysis of EST-databases identified two emerin genes in the pseudo-tetraploid organism Xenopus laevis, Xemerin1 and Xemerin2, respectively. In comparison to the human and murine orthologues Xenopus emerins exhibit both similarities and differences. Structural analyses revealed an N-terminal conserved LEM-domain in the C-terminus and a unique hydrophobic transmembrane domain in the carboxy tail. Unlike the extended mammalian emerin (Homo sapiens 254 residues, Mus musculus 259 residues) neither a nucleus localization signal nor a serinerich region could be detected. However, comparison of the putative phosphorylation sites showed three equivalent sites as for the human emerin. Synthesis of specific monoclonal antibodies and recombinant fusion proteins elucidate the subcellular and tissue-specific localization of Xemerins. Similar to mammalian emerins immunofluorescence microscopy and immunoblotting showed clearly that both Xemerin1 and Xemerin2 are integral nuclear membrane proteins expressing ubiquitously in differentiated cells. Intriguingly, in oocytes Xemerin was undetectable by immunofluorescence and immunoblotting, respectively. Two-dimensional gel electrophoresis NEPHGE proved that our self-made monoclonal antibody 59/7 recognized both Xemerins highlighting two different molecular masses and isoelectric points. Interestingly, Xemerin2 exhibits an increased isoelectric point in 5-days old larvae than in adult somatic culture cells. Immunoblotting of embryonic proteins derived from different developmental stages showed that Xemerin1 and -2 are expressed in stage 43 (Nieuwkoop and Faber, 1975) during Xenopus embryogenesis for the first time. In this context, it is noteworthy that Xenopus A-type lamins – in contrast to previous reports – are already detectable in stage 28. Unexpectedly, RT-PCR analyses proved activity of the Xemerin genes during entire embryogenesis in all stages examined yet. Northern-blotting and sequence analyses of the Xemerin mRNA revealed exceeding untranslated regions with snRNP binding motives. Two independent techniques (band-quantification and quantitative real-time-PCR) bared a significantly increased activity of the Xemerin-genes upon stage 30. Outstanding interest provided the awareness, that exactly at this moment the activity of XMAN1, another inner nuclear membrane protein, was significantly down regulated. Whole mount in situ hybridizations exhibited stressed Xemerin expression in neuro-ectodermal tadpole tissues, as simultaneously reported for XMAN1 (also known as SANE) by to other groups (Osada et al., 2003; Raju et al., 2003). Congruent expression patterns of Xemerin proteins were provided by indirect immunofluorescence of embryonic thin-sections. These results corroborate the theory that XMAN1 and Xemerin could have overlapping functions. At first, recombinant fusion proteins showed an identical subcellular distribution of XMAN1 in comparison with Xemerin. Hence, in vitro binding assays proved direct interaction between Xemerins and XMAN1 as well as with Xenopus A-type lamins. Unfortunately, there is no functional XMAN1 antibody available up to now. Thus, it remains unclear if XMAN1 has overlapping functions with Xemerins during embryogenesis in vivo. Nevertheless, by characterizing Xenopus emerin this work displayed fundamental features for further studies. This opus definitely showed that the model system Xenopus laevis is competitive to the mammalian model ‘mouse’ elucidating the disease causing mechanisms of Emery-Dreifuss muscular dystrophy. KW - Glatter Krallenfrosch KW - Emerin KW - Oozyte KW - Xenopus laevis KW - Emerin KW - MAN1 KW - Oozyte KW - Embryonalentwicklung KW - Xenopus laevis KW - emerin KW - MAN1 KW - oocyte KW - early development Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19869 ER - TY - THES A1 - Xiang, Chaomei T1 - The role of B-RAF in embryonic development of mouse forebrain T1 - Die Rolle von B-RAF in der Embryonalentwicklung des Maus-Vorderhirns N2 - Die Familie der RAF-Kinasen umfasst drei Mitglieder, A-RAF, B-RAF und C-RAF. Nur für die B-RAF-Isoform wurde eine wichtige Funktion für die Entwicklung des Zentralen Nervensystems (ZNS) gefunden. Das Fehlen von B-RAF führt bei neu generierten embryonalen Neuronen zum Zelltod, weil sie in vitro nicht auf überlebensfaktoren reagieren können. Bei einer zweiten Zelllinie, die durch die Abwesenheit von B-RAF beeinträchtigt ist, handelt es sich um endotheliale Zellen. Ihr Zelltod führt zu inneren Blutungen und zu Letalität von B-RAF-/--Mäusen zwischen Tag 10.5 (E10.5) und 12.5 (E12.5) der Embryonalentwicklung. Dies verhinderte bisher weitere Untersuchungen der neuralen B-RAF-Funktion bei späteren Stadien. Im Gegensatz zu B-RAF-/--Mäusen überleben B-RAFKIN/KIN-Mäuse die Mitte der Embryonalentwicklung, da ihre Endothelzellen vor Apoptose geschätzt sind. Diese Tiere besitzen kein B-RAF, stattdessen wird im B-RAF-Locus ein chimäres Protein exprimiert, das den N-Terminus von B-RAF sowie alle Domänen von A-RAF umfasst. Der Schutz vor abnormaler neuraler Apoptose im Vorderhirn macht diese Tiere zu einem potentiellen Modell zur Untersuchung der Proliferations- und Differenzierungsfunktion von B-RAF, die die Kinase neben der Überlebensfunktion in der ZNS-Entwicklung ausübt. Die detaillierte Untersuchung der B-RAFKIN/KIN-Tiere konzentrierte sich auf die Entwicklung der Hirnrinde. Augenscheinlich waren kortikale Defekte im B-RAFKIN/KIN Vorderhirn: Der Verlust von B-RAF führte zu einer starken Reduzierung von Brn-2 exprimierenden pyramidalen Projektions-Neuronen begleitet von einer Störung der Dendritenbildung mit weniger und dünneren Dendriten in diesen oberen Schichten. Weitere Untersuchungen mit BrdU-Markierungsexperimenten zeigten in der ventrikulären Schicht reduzierte Zellproliferation für E14.5-E16.5 der Mutantenembryonen und ein Migrationsdefizit der spätgebideten kortikalen Neuronen. Während der Proliferationsdefekt der Hirnrinden-Vorläuferzellen mit einer reduzierten ERK-Aktivierung einherging, bleibt der Mechanismus der gestörten neuralen Migration zu erklären. Unsere Hypothese ist, dass die subzelluläre Lokalisation von Phospho-ERK in den wandernden Hirnrinden-Neuronen der B-RAFKIN/KIN-Mäuse verändert sein könnte. Zur Bestäigung der in vivo-Funktion von B-RAF und weiteren Studien zu ihrer unbekannten Rolle in der embryonalen Neurogenese sowie anderen Morphogenesen wäre die konditionale B-RAF Inaktivierung erforderlich. Durch die Deletion des genetischen Materials bzw. die Inaktivierung der Genfunktion in ausgew�hlten Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt ließen sich die Embryo-Letalität sowie unerwünschte pleiotrope Nebeneffekte vermeiden und akkumulierende, kompensierende Entwicklungsveränderungen von Beginn an ausschließen. Um die Cre Rekombinase-Methode einsetzen zu können, wurden floxed B-RAF embryonale Stammzell (ES)-Zelllinien generiert. Außerdem wurde ein auf dem Tetrazyklin Operator basierendes Schaltallel in den B-RAF Genort von embryonalen Stammzellen integriert, so dass die B-RAF Expression konditional und reversibel durch die Zugabe von Doxyzyklin angeschaltet werden konnte. Bisher wurden hochgradige chimäre Mäuse nach Blastozysten-Injektion geboren. Die Keimbahnübertragung dieser chimären Mäuse wird momentan untersucht. Wenn beide konditionale Mauslinien bereit sind, k�nnte die Entwicklung ihres Zentralnervensystems untersucht werden, um die Rolle von B-RAF in der Entwicklung des Nervensystems herauszufinden. N2 - The RAF family of protein kinases consists of three members, A-RAF, B-RAF and C-RAF. Unlike the other isotypes, B-RAF has been found to have an important function for normal development of the central nervous system (CNS), because newly generated embryonic neurons lacking B-RAF cannot respond to survival factors and undergo cell death in vitro. A second cell lineage affected by the absence of B-RAF are endothelial cells and their death leads to internal bleedings and lethality of B-RAF-/- mice between embryonic day 10.5 (E10.5) and E12.5 precluding an opportunity to further analyze neural B-RAF function at a later stage. In contrast to B-RAF-/- mice, B-RAFKIN/KIN mice, which are B-RAF deficient but express a chimeric protein consisting of the unique N terminus of B-RAF and all the domains of A-RAF in the B-RAF gene locus, survive after midgestation because their endothelial cells are protected from apoptosis. More importantly, overall prevention of abnormal neural apoptosis in the forebrain allows us to study proliferation- or differentiation-oriented function of B-RAF other than its survival effects in CNS development. The detailed investigation of B-RAFKIN/KIN animals was concentrated on cortical development. There were apparent cortical defects in B-RAFKIN/KIN forebrain: Loss of B-RAF led to severe reduction of Brn-2 expressing pyramidal projection neurons accompanied by a disruption of dendrite formation in the upper layers. In further analysis, BrdU labelling experiments showed that from E14.5 to E16.5 cell proliferation in the ventricular zone of the mutant mice was reduced and that the late-born cortical neurons failed to migrate properly. While the proliferation defect of cortical progenitors was associated with reduced ERK activation, the mechanism causing impaired neuronal migration remains to be determined. Our hypothesis is that the subcellular localization of phospho-ERK may be altered in migrating cortical neurons in B-RAFKIN/KIN mice. To confirm in vivo function of B-RAF and further study unknown roles in embryonic neurogenesis as well as other morphogenesis, conditional B-RAF knockouts would be the ideal models, which can efficiently avoid embryonic lethality, prevent unwanted pleiotropic side effects and exclude accumulative compensatory developmental changes from the earliest developmental stage on, through the deletion of genetic material/gene function in selected cells at a specific time. The use of site-specific recombinases such as Cre and the successful development of the reversible tetracycline-based switch have provided powerful venues for creating conditional loss-of-function mouse models. Generation of tetracycline-regulated B-RAF and floxed B-RAF mouse embryonic stem (ES) cell lines was performed. Up to now, high-grade chimeric mice were obtained after blastocyst injection of the modified ES cell clones. The germline transmission from these chimeric mice is currently under investigation. When either of conditional mouse lines is ready, detailed examination in their CNS development would be done to reveal how B-RAF plays a real role for normal development of the nervous system. KW - Maus KW - Embryonalentwicklung KW - Protein-Serin-Threonin-Kinasen KW - Vorderhirn KW - B-RAF KW - neurale Migration KW - Hirnrinden KW - Vorderhirn KW - B-RAF KW - neuronal migration KW - neocortex KW - forebrain Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18326 ER - TY - THES A1 - Tyrsin, Oleg T1 - Role of Raf family members in mouse development T1 - Rolle der Raf-Kinase Familie in der Mausentwicklung N2 - Raf Proteine sind Serin/Threonin Kinasen, die als zentrale Elemente des Ras, Raf, Mek, Map Kinase Wegs, an der Weiterleitung von extrazellulären Signalen von der Zellmembran zu nukleären Effektoren beteiligt sind. Auf diese Weise kontrollieren sie elementare Prozesse wie Proliferation, Differenzierung und das Überleben von Zellen. In Säugetieren wurden drei funktionelle Gene (A-, B- and C-raf) beschrieben. Aus biochemischen Untersuchungen ergibt sich, dass die Isozyme überlappende aber auch differentielle Funktionen übernehmen. Allerdings wurde ein differenziertes Verständnis der jeweiligen spezifischen Rolle dadurch erschwert, dass in den meisten Zelltypen verschiedene Raf-Isozyme expremiert werden und dass wegen der Vielzahl der Aktivatoren und Effektoren eine eindeutige Isoform-Zuordnung schwer möglich war. Aufgrund der Beteiligung an verschiedenen Krankheitsbildern, insbesondere der Tumorentstehung und –progression, ist jedoch die Aufklärung der Isozym-spezifischen Funktionen von vorranginger wissenschaftlicher Bedeutung. B-Raf hat unter den Raf Kinasen die höchste Kinaseaktivität und zeigt antiapoptotische Eigenschaften. B-Raf knockout Mäuse zeigen eine allgemeine Wachstumsverzögerung und sterben zwischen E10,5 und E12,5 aufgrund fehlentwickelter Gefässe in Folge massiver Apoptose differenzierter Endothelzellen. [1]. Um die Lethalität des B-Raf-/- (KO) Phänotyps zu überkommen und um die Redundanz der B-Raf Proteine weiter zu untersuchen, wurden Mäuse generiert, die unter der Kontrolle des B-Raf Promoters statt B-Raf eine A-Raf cDNA exprimieren. Nur in einem Fall entwickelte sich eine ausgewachsene p20 Maus ohne sichtbare Entwicklungsdefekte oder Verhaltensauffälligkeiten. Darüber hinaus wurden lebende Embryonen mit normaler Entwicklung aber reduzierter Grösse mit niedriger Inzidenz zwischen E12,5d und E16,5d beobachtet. In allen diesen Fällen fanden wir ein intaktes Gefäßsystem. Andererseits waren Neurogenese und die Bewegung der neuralen Vorläuferzellen in den überlebenden Embryonen gestört, was in einigen Fällen zu unterentwickelten Hirnregionen führte. Mittels TUNEL bzw. PCNA Assay konnten wir zeigen, dass mehr apoptotische und weniger proliferierende Zellen in ventrikulärer und subventrikulärer Zone der Hirn Ventrikel und im Striatum der KIN Embryonen zu finden sind. Außerdem wurden in einer Reihe von Geweben von E13,5d und in den Lungen von E16,5d Embryonen, vermehrt apoptotische Zellen beobachtet. Dies war in der einen ausgewachsenen KIN Maus nicht der Fall. Diese zeigte einen reduzierten Anteil an neuronalen Vorläuferzellen in der subgranulären Zone des Hippocampus und an reifen Neuronen im Riechkolben. Ansonsten waren aber keine Störungen der Neurogenese in der ausgewachsenen KIN Maus detektierbar. Fibroblasten die aus KIN Embryonen etabliert wurden, zeigten im Vergleich zu Wildtypzellen reduzierte Fähigkeit zur Proliferation und erhöhte Sensibilität gegenüber Apoptoseauslösern. Die erhöhte Apoptosetendenz spiegelte sich auf molekularer Ebene in einer Reduktion an antiapoptotischen Molekülen wieder. Aktive ERK und Akt Kinase sind erniedrigt. Außerdem war von dem bekannten Raf Substrat BAD, weniger an der inaktiven phosphorylierten Form zu beobachten, wodurch bei gleicher Menge Gesamtprotein auf ein Mehr an proapoptotischem unphosphoryliertem BAD geschlossen werden kann. Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass die Substitution von B-Raf durch die weniger aktive A-Raf Kinase zwar die endotheliale Apoptose verhindern kann, die die Ursache für das frühe Absterben der B-Raf-/- (KO) Mäuse ist, dass aber die normale Entwicklung dennoch entscheidend gestört ist. N2 - Cellular proliferation, differentiation and survival in response to extracellular signals are controlled by the signal transduction pathway of Ras, Raf and MAP kinase. The Raf proteins are serine/threonine kinases with essential function in growth/differentiation/survival - related signal transduction events. In mammals, three functional (A-, B-, and C-Raf) genes were described. Biochemical studies suggest overlapping and differential utilization of Raf isozymes. However, the frequent co-expression of Raf isozymes and their multiple activators and effectors impedes the full understanding of their specific roles. The elucidation of these roles is important due to the involvement of the Ras/Raf/MEK/MAP kinase cascade in human disorders especially in tumor development and progression. B-Raf was shown to posses the strongest kinase activity among Raf kinases and display antiapoptotic properties. Mice deficient in B-Raf show overall growth retardation and die between E10.5 and E12.5 of vascular defects caused by excessive death of differentiated endothelial cells. To elucidate the redundancy of Raf isozymes during embryonic development and to rescue B-Raf-/- (KO) phenotype, B-Raf alleles were disrupted by introducing A-Raf cDNA under the control of endogenous B-Raf promoter. The resulting BRaf A-Raf/A-Raf (KIN) phenotype depends on genetic background. The living embryos displaying normal development but size reduction were found with low incidence at E12.5d-16.5d. All of them displayed the rescue of vascular system. One adult p20 mouse without any visible defects in development and behavior was obtained. On the other hand, the processes of neurogenesis and neural precursors migration in survived embryos were disturbed which led in some cases to underdevelopment of different brain compartments. TUNEL and cell proliferation (PCNA staining) assays revealed more apoptotic (E13.5d) and less proliferating(E12.5d cells within ventricular and sub-ventricular zones of brain ventricles and in striatum of KIN embryos. In addition, more apoptotic cells were detected in many other tissues of E13.5d and in lung of E16.5d KIN embryos but not in adult KIN mouse. p20 KIN mouse demonstrated reduced fraction of neural precursor cells in sub-granular zone of hippocampus and mature neurons in olfactory bulb. The other processes of neurogenesis were not disturbed in adult KIN animal. Fibroblasts obtained from KIN embryos demonstrated less proliferative ability and were more susceptible to apoptotic stimuli compared to WT. This was accompanied by the reduction of active ERK and Akt required for survival, and with decrease of inactive phosphorylated BAD. The kinetic of both ERK and Akt phosphorylation upon serum stimulation was delayed. All these data indicate that moderate A-Raf kinase activity can prevent the endothelial apoptosis but is not enough to completely rescue the other developmental consequences. KW - Maus KW - Embryonalentwicklung KW - Raf Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9453 ER - TY - THES A1 - Petrovic, Suzana T1 - In vivo analysis of homing pattern and differentiation potential of cells deriving from embryonic and adult haematopoietic regions T1 - In-vivo-Analyse der Besiedelung und der Differenzirung von Zellen die aus embrionalen und hämatopoetischen Regionen stammen N2 - The experimental work of this thesis addresses the questions of whether established cell lines injected into murine blastocysts find their way back home and seed preferentially at the site of their origin. Furthermore, can they change their fate and differentiate to unrelated cell types when exposed to the embryonic environment. This survey was based on the fact that different cell lines have different potentials in developing embryos, dependent on their cellular identity. The cell lines used in this survey were AGM region-deriving DAS 104-4, DAS 104-8 cells, yolk sac-deriving YSE cells and bone marrow-deriving FDCP mix cells. These cells were injected into mouse blastocysts. Donor cells were traced in developing embryos via specific markers. Analysis of the embryos revealed that DAS cells are promiscuous in their seeding pattern, since they were found in all analysed tissues with similar frequencies. YSE cells showed preferences in seeding yolk sac and liver. YSE donor cells in chimaeric tissues were not able to change their immuno-phenotype, indicating that they did not change their destiny. Analysis of adult mice did not reveal any of YSE-derived cells donor contribution. In contrast, FDCP mix cells mostly engrafted haematopoietic tissues, although the embryos analysed by in situ hybridization had donor signals frequently in cartilage primordia, heads, and livers. Analysis of whether FDCPmix-derived cells found in foetal livers were of haematopoietic or hepatocytes nature showed that progeny of injected FDCP mix cells do not differentiate into cells that express a hepatocyte-specific marker. Further analysis showed that FDCPmix-derived donor cells found in brain express neural or haematopoietic markers. In order to reveal if they transdifferentiate to neurons or fuse with neurons/glial cells, nuclear diameters of donor and recipient cells were determined. Comparison of the nuclear diameters of recipient and donor cells revealed no differences. Therefore this suggests that progeny of FDCP mix in brain are not fusion products. Analysis of adult mice tissues revealed that presence of FDCP mix-derived cells was the highest in brains. These results confirmed the assumption that the developmental potential of the analysed cells cannot be easily modified, even when exposed to early embryonic environment. Therefore one can conclude that the analysed cell types had different homing patterns depending on their origins. N2 - In der vorliegenden Arbeit wurde als zentrale Frage untersucht, wie Zellen verschiedener etablierter Zelllinien nach Injektion in murine Blastozysten an der Entwicklung der resultierenden chimären Tiere beitragen. Insbesondere wurde untersucht, ob injizierte Zellen bevorzugt oder ausschließlich Gewebe ihres Ursprungs besiedeln (“Homing“), oder ob Donorzellen auch heterologe Gewebe infiltrieren und gegebenenfalls gar unter dem Einfluß der frühembryonalen Blastozysten-Umgebung ihr Zellschicksal ändern und in andere Zelltypen transdifferenzieren können. Diese Studie basiert auf früheren Arbeiten, in denen gezeigt wurde, daß unterschiedliche Zelllinien - in Abhängigkeit ihrer Identität - verschiedene Entwicklungspotentiale im frühen Embryonalstadium haben. Folgende Zelllinien wurden in der vorliegenden Arbeit untersucht: DAS 104-4 und DAS 104-8 (beide aus der sogenannten AGM Region isoliert), YSE (aus dem Dottersack) und FDCP mix (aus Knochenmark abstammend). Zellen dieser Zelllinien wurden in Maus Blastozysten injiziert und der Chimärismus in sich entwickelnden Embryonen oder adulten Tieren mit Hilfe von Donorzell-spezifischen Markern analysiert. Die Analyse chimärer Embryonen ergab, daß DAS Zellen diese promiskuitiv besiedeln: DAS Zellen wurden in allen untersuchten Geweben mit ähnlichen Häufigkeiten gefunden. YSE Zellen hingegen wurden bevorzugt in der fötalen Leber und im Dottersack nachgewiesen. YSE Donorzellen in chimären Geweben zeigten keine Änderungen in ihrem Immunphänotyp und damit keine Hinweise auf eine mögliche Transdifferenzierung. In adulten Mäusen konnten keine YSE-abstammende Zellen mehr identifiziert werden. FDCP mix Zellen besiedelten vor allem hämatopoetische Gewebe. In Embryonen wurden allerdings auch häufig Donorzell-spezifische in situ Hybridisierungssignale in Knorpelvorläufergewebe, der Leber und in der Kopfregion erhalten. Die FDCP mix Marker positiven Zellen der fötalen Leber wurden negativ auf die Expression von Hepatozyten-Markern getestet. Dies spricht auch in diesem Fall gegen einen Wechsel der Donorzellidentität und Transdifferenzierung. Im Gegensatz dazu wurden im Gehirn FDCP mix abstammende Spenderzellen identifiziert, die entweder neurale oder hämatopoetische Marker tragen. Die Zellkerndurchmesser wurden für die Donor-abstammenden Zellen und für die endogenen Gehirnzellen bestimmt und wiesen keinen signifikanten Unterschied auf. Dieser Befund läßt vermuten, daß FDCP mix abstammende Zellen mit Expression von neuralen Markern nicht das Produkt von Zellfusion von Donorzellen mit Neuronen oder Gliazellen sind. In der Analyse von adulten Mäusen wurden FDCP mix abstammende Zellen am häufigsten im Gehirn identifiziert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen für die analysierten Zelllinien, daß sich deren Entwicklungspotential auch bei Exposition in frühembryonalem Milieu nicht leicht modifizieren läßt. Es wurde weiterhin gezeigt, daß die analysierten Zelltypen in Bezug auf ihren Ursprung ein sehr unterschiedliches “Homing“-Verhalten aufweisen. KW - Zelllinie KW - Zelldifferenzierung KW - Maus KW - Embryonalentwicklung KW - Blastozysten KW - DAS104-4 KW - DAS104-8 KW - YSE KW - FDCPmix KW - Blastocysts KW - DAS104-4 KW - DAS104-8 KW - YSE KW - FDCPmix Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9323 ER - TY - THES A1 - Körner, Ulrich T1 - Funktionelle Rolle von HMGN-Proteinen während der Embryonalentwicklung von Xenopus laevis T1 - The functional role of the HMGN proteins during embryogenesis of Xenopus laevis N2 - HMGN Proteine sind Architekturelemente des Chromatins und besitzen die Fähigkeit, Chromatin aufzulockern. Sie ermöglichen anderen Proteinen den Zugang zu Nukleosomen und unterstützen DNA-abhängige Prozesse wie Replikation, Transkription und DNA-Reparatur. In dieser Arbeit wurde die funktionelle Rolle der HMGN Proteine während der Embryogenese am Beispiel des südafrikanischen Krallenfroschs Xenopus laevis untersucht. Dabei wurde entdeckt, dass sowohl die Expression als auch die zelluläre Verteilung der HMGN Proteine entwicklungsspezifisch reguliert ist. Eine Manipulation der HMGN Proteinmengen während der Embryonalentwicklung führte zu schweren Fehlentwicklungen in Postblastula Embryonen. In der Oogenese waren sowohl Xenopus HMGN mRNAs als auch Xenopus HMGN Proteine in allen Oozytenstadien nachweisbar. Interessanterweise waren HMGN Proteine in späteren Oozytenstadien nur im Zytoplasma zu finden und nicht mit Lampenbürstenchromosomen assoziiert. Im Zuge der Maturation der Oozyten zu Eiern verschwinden die Proteine gänzlich. Während der Embryogenese waren HMGN Proteine dann erst wieder ab der Blastula detektierbar, zeitgleich mit der transkriptionellen Aktivierung des embryonalen Genoms. Gleichzeitig wiesen ihre Expressionsmuster, zumindest auf mRNA-Ebene, auf Gewebspezifität hin. Whole mount in situ-Hybridisierungen und RT-PCR-Analysen zeigten eine erhöhte mRNA-Menge in mesodermalen und neuroektodermalen Geweben von Schwanzknospenstadien. Nach Injektion rekombinanter HMGN Proteine (Überexpression) oder Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden (knock-down) in die Zygote entwickelten sich Embryonen mit offenen Rücken, stark verkürzten und gebogenen Körperachsen und deformierten Kopfstrukturen als Hauptmerkmale. Histologische Analysen und insbesondere die Magnetresonanz Bildgebung deuteten auf Fehler in der Mesodermdifferenzierung hin. Die Analysen zeigen, dass eine bestimmte kritische zelluläre HMGN Proteinmenge für eine korrekte Embryonalentwicklung von Xenopus laevis notwendig ist. Durch „animal cap assays“ und RT-PCR-Expressionsanalysen Mesoderm-spezifischer Gene konnte schließlich gezeigt werden, dass HMGN Proteine die Regulation Mesoderm-spezifischer Gene beeinflussen. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass auch die HMGN-Genexpression während der Mesodermdifferenzierung reguliert wird. Durch eine Analyse des Expressionsbeginns entwicklungsrelevanter Gene während der Midblastula Transition konnte gezeigt werden, dass veränderte HMGN Proteinmengen den Expressionsbeginn spezifischer Gene wie Xbra und chordin beeinflussen. Damit konnte zum ersten Mal ein Einfluss dieser ubiquitären Chromatinproteine auf die Expression spezifischer Gene gefunden werden. Die durch HMGN Proteine verursachte fehlerhafte Expression von Xbra und chordin als Schlüsselgene der Mesodermdifferenzierung kann die Fehlentwicklungen mesodermaler Strukturen erklären. N2 - HMGN proteins are architectural chromatin proteins that reduce the compaction of the chromatin fiber, facilitate access to nucleosomes and modulate DNA-dependent processes such as replication, transcription and DNA repair. In this work the functional role of the HMGN proteins during embryogenesis was analyzed using the African clawed frog Xenopus laevis as a model system. The expression and cellular location of the HMGN proteins was found to be developmentally regulated. Experimental manipulations of the HMGN protein amounts led to gross developmental defects in postblastula embryos. HMGN transcripts and proteins were present throughout oogenesis. Interestingly, the HMGN proteins were stored in the cytoplasm of later oocyte stages and excluded from the oocytes nuclei and lampbrush chromosomes. Upon maturation of oocytes into eggs, HMGN proteins were no longer detectable. During embryogenesis, HMGN proteins were first detected in blastula stage embryos, coinciding with the transcriptional activation of the embryonic genome. At least at the mRNA level the expression pattern showed a tissue specific pattern, with relatively high levels of mRNAs in the mesodermal and neuroectodermal regions of early tailbud embryos as shown by whole mount in-situ hybridization and RT-PCR-analyses. After microinjection of recombinant HMGN proteins (overexpression) or morpholino-antisense oligonucleotides (knock-down) the embryos displayed typical phenotypes with imperfect closure of the blastopore, distorted body axis and abnormal head structures. Histological analyses and magnetic resonance imaging indicated that mesoderm differentiation was particularly affected by aberrant HMGN protein levels. The results demonstrate that proper embryonic development of Xenopus laevis requires precisely regulated levels of HMGN proteins. “Animal cap assays” and RT-PCR-analyses of the expression of mesodermal genes indicated that HMGN proteins are involved in the regulation of mesoderm specific genes. These experiments also indicated that the HMGN expression itself is regulated during mesoderm differentiation. Moreover, by studying the expression pattern of developmentally relevant genes during midblastula transition it became evident that altered HMGN protein levels influence the onset of the expression of specific genes such as Xbra and chordin. The results show, for the first time, that these ubiquitous chromatin proteins modulate the expression of specific genes. The HMGN-induced misexpression of Xbra and chordin as key regulatory genes during mesoderm differentiation may explain the observed malformations of mesodermal structures. KW - Glatter Krallenfrosch KW - HMG-Proteine KW - Genexpression KW - Embryonalentwicklung KW - HMGN Proteine KW - Xenopus laevis KW - Genexpression KW - Chromatin KW - Embryonalentwicklung KW - HMGN proteins KW - Xenopus laevis KW - chromatin KW - gene expression KW - early development Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9166 ER - TY - THES A1 - Philipp, Melanie T1 - Die Rolle von alpha2-adrenergen Rezeptoren während der Embryonalentwicklung der Maus T1 - The role of alpha2-adrenergic receptors during murine development N2 - Alpha2-Rezeptoren, die weiter in alpha2A, alpha2B und alpha2C unterteilt werden, gehören zur Gruppe der adrenergen Rezeptoren innerhalb der Klasse der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Sie sind maßgeblich an der Regulation vieler physiologischer Prozesse beteiligt. Vieles, was heute über alpha2-Rezeptoren bekannt ist, wurde mithilfe von alpha2-defizienten Mäusen, sogenannten „Knock-Out“-Mäusen (KO) herausgefunden, von denen bislang drei Einzel-KOs und der Doppel-KO der Subtypen A und C existieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurden durch Kreuzung der vorhandenen KO-Linien Mauslinien generiert, die defizient für alpha2A und alpha2B, für alpha2B und alpha2C oder alle drei alpha2-Rezeptoren sind. Während alpha2AB-KO-Mäuse ungefähr entsprechend der Mendelschen Verteilung geboren wurden, zeigte sich, dass alpha2BC-KO-Mäuse teilweise und alpha2ABC-KO-Mäuse sogar komplett embryonal letal waren. Die morphologischen Unter-suchungen legten den Zeitpunkt der embryonalen Letalität der alpha2ABC-KO-Mäuse auf den Tag E10,5 der Embryonalentwicklung fest und konnten zeigen, dass diese Letalität in einem Vaskularisierungsdefekt innerhalb der extraembryonalen Organe Plazenta und Dottersack begründet lag. Diese Organe stellen die Versorgung des Embryos mit Nährstoffen und Sauerstoff sicher und sorgen somit für dessen Entwicklung. Durch RT-PCR-Experimente konnte die mRNS für alle drei alpha2-Rezeptorsubtypen an Tag E10,5 sowohl im Embryo als auch in Plazenta und Dottersack nachgewiesen werden. Autoradiographische Experimente und Radioligandenbindungsstudien an Plazenten machten deutlich, dass der Großteil an alpha2-Rezeptoren im embryonalen Teil der Plazenta exprimiert wird, nämlich in den Riesenzellen und in der sich daran anschließenden Spongiotrophoblastschicht, und dass hierbei alpha2-Rezeptoren vom B-Subtyp vorherrschen. In den genannten Zellen konnte mittels Immunhistochemie eine alpha2-Rezeptor-vermittelte Phosphorylierung der MAP-Kinasen ERK1/2 gezeigt werden, die auch in kultivierten WT-Dottersäcken beobachtet werden konnte. Unter basalen Bedingungen zeigte sich, dass die ERK1/2-Phosphorylierung in Gewebe von alpha2ABC-KO-Embryonen drastisch vermindert war, während andere Signalwege, die von alpha2-Rezeptoren angestoßen werden können, nicht beeinträchtigt waren. Versuche in einem Zellkulturmodell und mit kultivierten WT-Dottersäcken ergaben eine physiologisch relevante Wechselwirkung zwischen dem alpha2B-Rezeptor und dem PDGFbeta-Rezeptor, einer Rezeptortyrosinkinase, als deren Mechanismus sich in Co-Kultur-Experimenten mit alpha2B-Rezeptor-transfizierten Zellen und alpha2ABC-defizienten Dottersäcken die Transaktivierung von Rezeptortyrosinkinasen herausstellte. In dieser Arbeit konnte demonstriert werden, dass a2-Rezeptoren bei der Maus über eine Transaktivierung von ERK1/2 die Vaskularisierung der Plazenta und des Dottersacks bedingen und damit eine normale Embryonalentwicklung sicherstellen. N2 - alpha2-Receptors belong to the familiy of adrenergic receptors within the superfamily of G-protein coupled receptors. They are involved in the regulation of many physiological processes. Most of the known functions have been investigated using mice deficient in alpha2-receptors. To date, single knockout mouse lines exist for each subtype of alpha2-receptors and also the alpha2AC-knockout. In this study the remaining double knockouts and the triple-knockout were generated by crossing the existing knockout mice. While mice deficient for the alpha2A- and the alpha2B-receptor were born with the expected Mendelian ratio, embryonic lethality occurred in the alpha2BC-knockout mice, and this was complete in mice lacking all three alpha2-receptors. Morphological examinations revealed that alpha2ABC-mice die around midgestation because of a defect in vascularisation in the extra-embryonic organs placenta and yolk sac. These are the organs which support the embryo with nutrients and oxygen and are therefore essential for embryonic development. RT-PCR-experiments detected mRNA for all three subtypes of alpha2-receptors on day E10.5 of embryonic development in embryo, placenta and yolk sac. Autoradiography and radioligand binding studies showed that most of the alpha2-receptors are expressed in the embryonic part of the placenta, in particular in giant cells and the underlying spongiotrophoblast layer. The alpha2B-receptor is the main subtype in these tissues. Immunohistochemistry of stimulated placenta slices demonstrated alpha2-receptor mediated phosphorylation of the MAP-kinase ERK1/2, which was also observed in cultivated yolk sacs of WT-mice. In freshly prepared tissue of alpha2ABC-knockout embryos ERK1/2-phosphorylation was dramatically decreased, while other signaling pathways of alpha2-receptors were unaffected. Experiments using cell culture and cultivated yolk sacs of WT-mice revealed a physiologically relevant interaction between alpha2B-receptors and PDGFbeta-receptors, a receptor tyrosine kinase. The mechanism of this interaction was illucidated in co-culture experiments of alpha2B-receptor transfected cells and alpha2 ABC-knockout yolk sacs as a G-protein coupled receptor initiated transactivation of receptor tyrosine kinases. In this study it was demonstrated that in mice alpha2-receptors are responsible for the vascularisation of placenta and yolk sac by transactivation of ERK1/2, and that they are, therefore, necessary for proper embryonic development. KW - Maus KW - Embryonalentwicklung KW - Alpha-2-Rezeptor KW - Signaltransduktion KW - MAP-Kinase KW - alpha2-adrenerge Rezeptoren KW - Plazenta KW - MAP-Kinase KW - Gefäßentwicklung KW - alpha2-adrenergic receptors KW - placenta KW - Map-kinase KW - vasculogenesis Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5186 ER - TY - THES A1 - Kibler, Eike Mathias U. T1 - Casein-Kinase-2-Beta und neuronale Entwicklungsprozesse T1 - Casein kinase 2ß and neural development - examinations employing the neurogenetic model organism Drosophila melanogaster N2 - Die Pilzkörper von Drosophila melanogaster stellen eine für die Lebensfähigkeit dieses Organismus entbehrliche Gehirnstruktur dar. Die Entwicklungsprozesse, die der Bildung dieser zentralnervösen Struktur zugrunde liegen, sind gut erforscht. Die neuronalen Stammzellen, die für die Bildung dieser Gehirnstruktur verantwortlich sind, sind identifiziert und experimentell gut zugänglich. Daher bietet sich die Drosophila-Pilzkörperentwicklung als neurogenetisches Modellsystem an, grundlegende Mechanismen der Gehirnentwicklung durch die Untersuchung von Pilzkörperstrukturmutanten zu erforschen. In dieser Arbeit wurde mushroom bodies undersized P1 (mbuP1) als eine durch Transposon- Insertion in den Casein-Kinase-2ß-Genlokus verursachte, hypomorphe Mutation identifiziert, die zu einer starken Verringerung der Anzahl der die Pilzkörper bildenden intrinsischen Neurone führt. Eine Reversion des mbuP1-Pilzkörperphänotyps konnte unter anderem durch die Expression von Casein-Kinase-2ß-(CK2ß)-Transgenen im mbuP1-Hintergrund erzielt werden. Durch Rekombination wurde ein fertiler mbuP1-Stamm etabliert, der nun die Untersuchung der zellulären mbuP1-Defekte ermöglicht. Eine partielle, letale Deletion der CK2ß-Transkriptionseinheit wurde erzeugt. Die Letalität dieser Deletion konnte sowohl durch ein genomisches CK2ß-Transgen als auch durch die ubiquitäre Expression einer CK2ß-cDNA gerettet, und hierdurch die essentielle Funktion der CK2ß-Transkriptionseinheit in Drosophila belegt werden. Durch die ubiquitäre Expression von in vitro-mutagenisierten CK2ß-cDNAs im CK2ß-Letalhintergrund wurde gezeigt, daß die Phosphorylierung der regulatorischen CK2ß-Untereinheit durch die katalytisch aktive CK2α-Untereinheit kein lebensnotwendiger Prozess ist. Gleichartige Experimente wurden zur Untersuchung der funktionellen Bedeutung eines CK2ß-Zinkfingermotivs und eines CK2ß-Destruction-Box-Motivs durchgeführt. Diese legen nahe, daß das Zinkfingermotiv im Gegensatz zum Destruction-Box-Motiv für die in vivo-Funktion der CK2ß-Untereinheit essentiell ist. Expression der in vitro-mutagenisierten CK2ß-cDNAs im mbuP1-Hintergrund werden die funktionelle Bedeutung der ausgetauschten Aminosäuren für die Pilzkörperentwicklung zeigen. Eine letale genetische Interaktion von mbuP1 mit einer Mutation des Drosophila-MAP-Kinase-Gens rolled (rlSem) und eine lebensfähige Interaktion von mbuP1 mit einer Mutation des Drosophila-S6-Kinase-p90rsk-Gens ignorant (ignP1), bei der Flügel- und Augenent-wicklungsdefekte zu beobachten sind, wurden gefunden. Es wurde zudem gezeigt, daß rlSem als Suppressor des Pilzkörperphänotyps eines schwächeren mbu-Allels wirkt. Hierdurch konnte eine Beteiligung der Casein-Kinase-2 an MAP-Kinase-Signalübertragungswegen wahrscheinlich gemacht werden. N2 - Mushroom bodies are dispensable for the developing and adult Drosophila fly. The developmental processes underlying mushroom body formation are well studied, the neural stem cells responsable for their development are identified and experimentally well accessable. Therefore Drosophila mushroom body development can be used as a powerful neurogenetic model system to find out about fundamental mechanisms underlying brain development by studying mutant flies showing aberrant mushroom body development. In the course of this work, mushroom bodies undersized P1 (mbuP1) was identified as a hypomorphic casein kinase 2ß-allele (CK2ß) caused by the insertion of transposable elements in the casein kinase 2ß gene locus. The mbuP1-mutation leads to a drastic reduction of the number of intrinsic neurons forming the adult mushroom body. Expression of transgenic CK2ß in a mbuP1-mutant background led to a reversion of the mbuP1-associated mushroom body phenotype. Fertility of mbuP1-flies could be partially restored by recombining the original mbuP1{P3843/2}-chromosome with a w1118-chromosome. This will allow future studies to identify the cellular defects caused by mbuP1. A partial deletion of the CK2ß gene causes lethality which could be rescued by either a genomic CK2ß-transgene or by ubiquitous expression of a CK2ß-cDNA. Therefore, CK2ß has been shown to be an essential gene in Drosophila. By ubiquitous expression of in vitro mutagenized CK2ß-cDNAs in a CK2ß-lethal background, a non-essential role of phosphorylation of the regulatory CK2ß-subunit by the catalytically active CK2α-subunit could be shown. Similar experiments were performed to examine the role of a CK2ß-zincfinger motif and a CK2ß-destruction-box motif. The obtained results suggest a non-essential in vivo function for the destruction-box motif and an essential in vivo function for the zincfinger-motif. Expression of the in vitro mutagenized CK2ß-cDNAs in a mbuP1-background will reveal the functional significance of the substituted amino acids for mushroom body development. Performed genetic interaction studies showed a lethal interaction of mbuP1 with a mutation in the Drosophila-MAP-kinase gene rolled (rlSem) and a viable genetic interaction with a mutation in the Drosophila-S6-kinase-p90rsk gene ignorant (ignP1) which revealed defects in wing formation and eye development. It also could be shown that rlSem acts as a suppressor of the mushroom body phenotype associated with a weaker mbu-allele. These observations point towards a role of casein kinase 2 in MAP-kinase signalling. KW - Taufliege KW - Pilzkörper KW - Ontogenie KW - Embryonalentwicklung KW - Proteinkinase CK2 KW - Drosophila KW - CK2 KW - Pilzkörper KW - CK2ß KW - Entwicklung KW - Drosophila KW - CK2 KW - mushroom body KW - CK2ß KW - development Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4202 ER - TY - THES A1 - Porsch, Matthias T1 - OMB and ORG-1 T1 - OMB und ORG-1 N2 - Members of the T-box gene family encode transcription factors that play key roles during embryonic development and organogenesis of invertebrates and vertebrates. The defining feature of T-box proteins is an about 200 aa large, conserved DNA binding motif, the T domain. Their importance for proper development is highlighted by the dramatic phenotypes of T-box mutant animals. My thesis was mainly focused on two Drosophila T-box genes, optomotor-blind (omb) and optomotor-blind related 1 (org-1), and included (i) a genetic analysis of org-1 and (ii) the identification of molecular determinants within OMB and ORG-1 that confer functional specificity. (i) Genetic analysis of org-1 initially based on a behavioral Drosophila mutant, C31. C31 is a X-linked, recessive mutant and was mapped to 7E-F, the cytological region of org-1. This pleiotropic mutant is manifested in walking defects, structural aberrations in the central brain, and "held-out" wings. Molecular analysis revealed that C31 contains an insertion of a 5' truncated I retrotransposon within the 3' untranslated transcript of org-1, suggesting that C31 might represent the first org-1 mutant. Based on this hypothesis, we screened 44.500 F1 female offspring of EMS mutagenized males and C31 females for the "held-out" phenotype, but failed to isolate any C31 or org-1 mutant, although this mutagenesis was functional per se. Since we could not exclude the possibility that our failure is due to an idiosyncracy of C31, we intended not to rely on C31 in further genetic experiments and followed a reverse genetic strategy . All P element lines cytologically mapping to 7E-7F were characterized for their precise insertion sites. 13 of the 19 analyzed lines had P element insertions within a hot-spot 37 kb downstream of org-1. No P element insertions within org-1 could be identified, but several P element insertions were determined on either side of org-1. The org-1 nearest insertions were used for local-hop experiments, in which we associated 6 new genes with P insertions, but failed to target org-1. The closest P elements are still 10 kb away from org-1. Subsequently, we employed org-1 flanking P elements to induce precise deletions in 7E-F spanning org-1. Two org-1 flanking P elements were brought together on a recombinant chromosome. Remobilization of P elements in cis configuration frequently results in deletions with the P element insertion sites as deficiency endpoints. In a first attempt, we expected to identify deficiencies by screening for C31 alleles. 8 new C31 alleles could be isolated. The new C31 chromosomes, however, did not carry the desired deletion. Molecular analysis indicated that C31 is not caused by aberrations in org-1, but by mutations in a distal locus. We repeated the P element remobilization and screened for the absence of P element markers. 4 lethal chromosomes could be isolated with a deletion of the org-1 locus. (ii) The consequences of ectopic org-1 were analyzed using UAS-org-1 transgenic flies and a number of different Gal4 driver lines. Misexpression of org-1 during imaginal development interfered with the normal development of many organs and resulted in flies with a plethora of phenotypes. These include a homeotic transformation of distal antenna (flagellum) into distal leg structures, a strong size reduction of the legs along their proximo-distal axis, and stunted wings. Like ectopic org-1, ectopic omb leads to dramatic changes of normal developmental pathways in Drosophila as well. dpp-Gal4/ UAS-omb flies are late pupal lethal and show an ectopic pair of wings and largely reduced eyes. GMR-Gal4 driven ectopic omb expression in the developing eye causes a degeneration of the photoreceptor cells, while GMR-Gal4/ UAS-org-1 flies have intact eyes. Hence, ectopic org-1 and omb induce profound phenotypes that are qualitatively different for these homologous genes. To begin to address the question where within OMB and ORG-1 the specificity determinants reside, we conceptionally subdivided both proteins into three domains and tested the relevance ofthese domains for functional specificity in vivo. The single domains were cloned and used as modules to assemble all possible omb-org-1 chimeric trans- genes. A method was developed to determine the relative expression strength of different UAS-transgenes, allowing to compare the various transgenic constructs for qualitative differences only, excluding different transgene quantities. Analysis of chimeric omb-org-1 transgenes with the GMR-Gal4 driver revealed that all three OMB domains contribute to functional specificity. N2 - Die Mitglieder der T-box Genfamilie kodieren Transkriptionsfaktoren mit Schlüsselrollen in der Embryogenese und der Organentwicklung von Invertebraten und Vertebraten. Charakteristisch für T-box Proteine ist der Besitz einer T Domäne, eines ungefähr 200 Aminosäuren großen, homologen DNA Bindungsmotivs. Die Relevanz dieser Proteine in vielen Entwicklungsprozessen zeigt sich deutlich in den dramatischen Phänotypen von Tieren mit Mutationen in T-box Genen. Die vorliegende Arbeit konzentrierte sich vor allem auf das Studium von zwei Drosophila T-box Genen, optomotor-blind (omb) und optomotor-blind related 1 (org-1) und beinhaltet (i) eine genetische Analyse der org-1 Gens und (ii) die Identifikation der molekularen Determinanten innerhalb OMB und ORG-1, die den verwandten Proteinen ihre funktionelle Spezifität verleihen. (i) Die genetische Analyse des org-1 Gens stützte sich anfänglich auf die Drosophila Mutante C31. C31 ist eine X-gekoppelte, rezessive Mutation und wurde in den Bereich 7E-7F kartiert, in dem sich auch org-1 befindet. C31 Fliegen zeigen Defekte im Laufverhalten, Strukturdefekte im Zentralkomplex des Gehirns und eine Flügelfehlstellung. Eine Molekularanalyse ergab, daß C31 eine Insertion eines 5' verkürzten I Retrotransposons innerhalb des 3' untranslatierten org-1 Transkripts enthält und ließ vermuten, daß C31 das erste mutante org-1 Allel darstellen könnte. Dieser Hypothese folgend durchsuchten wir ca 44.500 F1 Weibchen aus der Kreuzung von EMS mutagenisierten Männchen mit C31 Weibchen auf den C31 Flügelphänotyp, konnten allerdings keine org-1 oder C31 Mutante isolieren. Da wir nicht ausschließen konnten, daß unser Scheitern durch eine Eigentümlichkeit der C31 Mutante verursacht wurde, verfolgten wir nun eine revers-genetische Strategie mit dem Ziel, P Element Insertionen im org-1 Gen zu isolieren. Alle Fliegenlinien mit P Elementen in 7E-7F wurden molekular charakterisiert und ihre Integrationsstellen präzise bestimmt. 13 der 19 analysierten Linien trugen ihre Insertionen in einem hot-spot ungefähr 37 kb distal zu org-1. Keine P Element Insertion konnte im org-1 Gens gefunden werden, jedoch wurden mehrere P Elemente auf beiden Seiten von org-1 identifiziert. Die beiden org-1 nächsten Insertionen wurden für mehrere local-hop Experimente verwendet, in denen wir 6 neue Gene mit P Insertionen assoziieren konnten, jedoch nicht org-1. Nachfolgend wurden zwei org-1 flankierende P Elemente verwendet, um präzise Deletionen über den org-1 Genlokus zu erzeugen. Zwei org-1 flankierende P Elemente wurden zunächst auf ein Chromosom rekombiniert. Die Remobilisierung von P Elementen in cis Anordnung führt häufig zu Deletionen mit den P Element Insertionsstellen als Defizienz-Endpunkten. In einem ersten Versuch erwarteten wir mutmaßliche Defizienzen als neue C31 Allele zu identifizieren. Acht C31 Allele konnten isoliert werden. Zu unserer Überraschung trugen diese neuen C31 Chromosomen aber nicht die gewünschte Deletion. Weitere Analysen ergaben, daß C31 nicht durch Mutationen im org-1 Gen verursacht wird, sondern durch Mutationen in einem distalen Gen. Wir wiederholten die P Element Remobilisierung, suchten nun aber auf Verlust der P Element-Marker nach Defizienzen. Vier lethale Chromosomen konnten isoliert werden, die eine Deletion über org-1 tragen. (ii) Die Konsequenzen einer ektopischen Expression von org-1 wurden mit Hilfe von UAS-org-1 transgenen Fliegen und einer Reihe Gal4 Treiberlinien studiert. Mißexpression von org-1 während der Imaginalentwicklung stört die normale Entwicklung in vielen Organen und führt zu Fliegen mit einer Vielzahl von Phänotypen. Diese beinhalten eine homeotische Transformation distaler Antennensegmente in distale Beinstrukturen, stark verkürzte Beine und verkrüppelte Flügel. Ebenso wie ektopische org-1 Expression bewirkt auch die ektopische Expression von omb eine dramatische Veränderung des normalen Entwicklungsprogramms. dpp-Gal4/ UAS-omb Fliegen sind puppal lethal und weisen ein ektopisches Flügelpaar und verkleinerte Augen auf. GMR-Gal4 getriebene ektopische omb Expression in der Augenentwicklung verursacht eine Degeneration der Photorezeptorzellen, während GMR-Gal4/ UAS-org-1 Tiere intakte Augen besitzen. Die ektopische Expression von omb und org-1 verursacht also jeweils deutliche, jedoch qualitativ sehr unterschiedliche Phänotypen für die homologen Gene. Um zu bestimmen, wo sich innerhalb der OMB und ORG-1 Proteine die Spezifitätsdeterminanten befinden, haben wir beide Proteine konzeptionell in drei Domänen unterteilt und die Bedeutung der einzelnen Domänen für funktionelle Spezifität mit Hilfe von chimären omb-org-1 Transgenen in vivo untersucht. Die Analyse der chimären omb-org-1 Transgene mit der GMR-Gal4 Treiberlinie ergab, daß alle drei OMB Domänen zur funktionellen Spezifität von OMB beitragen. KW - Taufliege KW - Transkriptionsfaktor KW - Embryonalentwicklung KW - Drosophila KW - Transkriptionsfaktor KW - chimär KW - Spezifität KW - Beinentwicklung KW - Drosophila KW - transcription factor KW - chimeric KW - specificity KW - appendage development Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3614 ER -