TY  - THES
A1  - Bathe-Peters, Marc
T1  - Spectroscopic approaches for the localization and dynamics of β\(_1\)- and β\(_2\)-adrenergic receptors in cardiomyocytes
T1  - Spektroskopieansätze zur Bestimmung der Lokalisation und Dynamiken von β\(_1\)- und β\(_2\)-Adrenozeptoren in Kardiomyozyten
N2  - In the heart the β\(_1\)-adrenergic receptor (AR) and the β\(_2\)-AR, two prototypical G protein-coupled receptors (GPCRs), are both activated by the same hormones, namely adrenaline and noradrenaline. Both receptors couple to stimulatory G\(_s\) proteins, mediate an increase in cyclic adenosine monophosphate (cAMP) and influence the contractility and frequency of the heart upon stimulation. However, activation of the β\(_1\)-AR, not the β\(_2\)-AR, lead to other additional effects, such as changes in gene transcription resulting in cardiac hypertrophy, leading to speculations on how distinct effects can arise from receptors coupled to the same downstream signaling pathway. 
In this thesis the question of whether this distinct behavior may originate from a differential localization of these two receptors in adult cardiomyocytes is addressed. Therefore, fluorescence spectroscopy tools are developed and implemented in order to elucidate the presence and dynamics of these endogenous receptors at the outer plasma membrane as well as on the T-tubular network of intact adult cardiomyocytes. This allows the visualization of confined localization and diffusion of the β\(_2\)-AR to the T-tubular network at endogenous expression. In contrast, the β\(_1\)-AR is found diffusing at both the outer plasma membrane and the T-tubules. Upon overexpression of the β\(_2\)-AR in adult transgenic cardiomyocytes, the receptors experience a loss of this compartmentalization and are also found at the cell surface. These data suggest that distinct signaling and functional effects can be controlled by specific cell surface targeting of the receptor subtypes.
The tools at the basis of this thesis work are a fluorescent adrenergic antagonist in combination of fluorescence fluctuation spectroscopy to monitor the localization and dynamics of the lowly expressed adrenergic receptors. Along the way to optimizing these approaches, I worked on combining widefield and confocal imaging in one setup, as well as implementing a stable autofocus mechanism using electrically tunable lenses.
N2  - Im Herzen werden der β\(_1\)-adrenerge Rezeptor (AR) und der β\(_2\)-AR, zwei prototypische GPCR, durch die Hormone Adrenalin und Noradrenalin aktiviert. Dabei interagieren beide Rezeptoren mit dem stimulatorischen G\(_s\) Protein, bewirken eine Erhöhung des cyclischen Adenosinmonophosphates (cAMP) und beeinflussen die Kontraktionskraft und Frequenz des Herzens nach einem Stimulus. Jedoch hat die Aktivierung des β\(_1\)-ARs, nicht des β\(_2\)-ARs, auch weitere Effekte, wie z.B. Veränderungen in der Transkription von Genen. Dies wiederum führt zu Spekulationen, wie solch unterschiedliche Effekte von Rezeptoren hervorgerufen werden können, die gleiche Signalwege bedienen.
In dieser Arbeit wird untersucht, ob dieses unterschiedliche Verhalten durch eine ungleiche Verteilung dieser beiden Rezeptoren in adulten Kardiomyozyten hervorgerufen werden könnte. Dazu wird die Lokalisation und die Dynamik dieser endogenen Rezeptoren in der Plasmamembran sowie im T-tubulären Netzwerk von intakten adulten Kardiomyozyten, unter Entwicklung und Verwendung hochsensitiver Fluoreszenzspektroskopiemethoden, bestimmt. Dies ermöglicht die örtliche und dynamische Eingrenzung des β\(_2\)-adrenergen Rezeptors unter endogener Expression ausschließlich auf das T-tubuläre Netzwerk. Dementgegen stellt sich heraus, dass sich der β\(_1\)-adrenerge Rezeptor ubiquitär auf der äußeren Membran und den T-Tubuli befindet und diffundiert. In β\(_2\)-AR überexprimierenden transgenen Kardiomyozyten hingegen werden diese Kompartments nicht beibehalten und es findet eine Umverteilung der Rezeptoren, auch unter Einbezug der Zelloberfläche, statt. Diese Daten können stärker darauf hindeuten, dass einige Rezeptorsubtypen sich gezielt und spezifisch bestimmte Zelloberflächen aussuchen, um somit ihre verschiedenen Signale und funktionären Effekte erzeugen zu können.
Zu den Techniken, die in dieser Arbeit die Bestimmung der Lokalisation und der Dynamiken der niedrig exprimierten adrenergen Rezeptoren zulassen, gehört die Anwendung von Fluoreszenzspektroskopiemethoden in Kombination mit einem fluoreszierenden β-adrenergen Antagonisten. Weitere Techniken, die im Rahmen dieser Arbeit entwickelt wurden und in weiterführenden Studien aufschlussreiche Erkenntnisse liefern könnten, umfassen die Entwicklung eines Setups aus einer Kombination aus Weitfeld- und Konfokalmikroskopie und die Implementierung eines stabilen Autofokus mit Hilfe einer elektrisch veränderbaren Linse.
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - Beta-Adrenozeptor
KW  - Kardiomyozyt
KW  - Fluoreszenzmikroskopie
KW  - Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie
KW  - Fluorescence
KW  - Fluorescence Microscopy
KW  - G Protein-Coupled Receptor
KW  - Autofocus
KW  - Microscopy
KW  - Beta-Adrenergic Receptor
KW  - Cardiomyocyte
KW  - Fluorescence Correlation Spectroscopy
KW  - FCS
KW  - GPCR
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-258126
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TY  - THES
A1  - Schihada, Hannes
T1  - Novel optical methods to monitor G-protein-coupled receptor activation in microtiter plates
T1  - Neue optische Methoden zur Messung der Aktivierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren in Mikrotiter-Platten
N2  - G-protein-coupled receptors (GPCRs) regulate diverse physiological processes in the human body and represent prime targets in modern drug discovery. Engagement of different ligands to these membrane-embedded proteins evokes distinct receptor conformational rearrangements that facilitate subsequent receptor-mediated signalling and, ultimately, enable cellular adaptation to altered environmental conditions. Since the early 2000s, the technology of resonance energy transfer (RET) has been exploited to assess these conformational receptor dynamics in living cells and real time. However, to date, these conformational GPCR studies are restricted to single-cell microscopic setups, slowing down the discovery of novel GPCR-directed therapeutics. In this work, we present the development of a novel generalizable high-throughput compatible assay for the direct measurement of GPCR activation and deactivation. By screening a variety of energy partners for fluorescence (FRET) and bioluminescence resonance energy transfer (BRET), we identified a highly sensitive design for an α2A-adrenergic receptor conformational biosensor. This biosensor reports the receptor’s conformational change upon ligand binding in a 96-well plate reader format with the highest signal amplitude obtained so far. We demonstrate the capacity of this sensor prototype to faithfully quantify efficacy and potency of GPCR ligands in intact cells and real time. Furthermore, we confirm its universal applicability by cloning and validating five further equivalent GPCR biosensors. To prove the suitability of this new GPCR assay for screening purposes, we measured the well-accepted Z-factor as a parameter for the assay quality. All tested biosensors show excellent Z-factors indicating outstanding assay quality. Furthermore, we demonstrate that this assay provides excellent throughput and presents low rates of erroneous hit identification (false positives and false negatives). Following this phase of assay development, we utilized these biosensors to understand the mechanism and consequences of the postulated modulation of parathyroid hormone receptor 1 (PTHR1) through receptor activity-modifying protein 2 (RAMP2). We found that RAMP2 desensitizes PTHR1, but not the β2-adrenergic receptor (β2AR), for agonist-induced structural changes. This generalizable sensor design offers the first possibility to upscale conformational GPCR studies, which represents the most direct and unbiased approach to monitor receptor activation and deactivation. Therefore, this novel technology provides substantial advantages over currently established methods for GPCR ligand screening. We feel confident that this technology will aid the discovery of novel types of GPCR ligands, help to identify the endogenous ligands of so-called orphan GPCRs and deepen our understanding of the physiological regulation of GPCR function.
N2  - Die Klasse der G-protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) stellt die größte Familie membranständiger Proteine dar. GPCRs regulieren eine Vielzahl diverser physiologischer Prozesse in eukaryotischen Zellen und kontrollieren so unterschiedliche Zellfunktionen im menschlichen Organismus. Sie stellen die Zelloberflächenrezeptoren für verschiedenartige extrazelluläre Stimuli, wie zum Beispiel Photonen, niedermolekulare chemische Verbindungen, Peptide und Lipide dar. Die Wechselwirkung mit diesen sogenannten Liganden stabilisiert spezifische GPCR-Konformationen. Diese dienen wiederum als Ausgangspunkt für nachgeschaltete intrazelluläre Signalkaskaden, die beispielweise über membranverankerte G-Proteine vermittelt werden können. Während endogene GPCR-Agonisten diese Signalweiterleitung verstärken, können andere Biomoleküle wie Lipide, Ionen oder andersartige Membranproteine die Funktion, und damit die Signalweiterleitung der GPCRs modulieren.  	
Aufgrund ihrer Einbindung in eine Vielzahl physiologischer und pathophysiologischer Prozesse, wurden GPCRs schon früh als Angriffspunkte („Targets“) zur Behandlung verschiedener Erkrankungen erforscht und genutzt. Heutzutage vermitteln etwa 30% aller zugelassenen Arzneistoffe ihre Wirkung über G-protein-gekoppelte Rezeptoren. Dennoch wird das große Potential dieser Rezeptorfamilie als Targets für medikamentöse Behandlungen noch nicht in vollem Umfang ausgeschöpft. Tatsächlich gibt es für mehr als 200 GPCRs, die nicht der olfaktorischen Wahrnehmung dienen, noch keine Arzneistoffe, da wenig über deren Pharmakologie und physiologische Bedeutung bekannt ist. Zudem wird die Entwicklung neuartiger GPCR-Liganden erheblich durch das eingeschränkte Methodenrepertoire beeinträchtigt. Alle derzeit etablierten Techniken zur Identifizierung neuer GPCR-Liganden erfassen entweder den Ligand-GPCR-Bindungsprozess, der keine Informationen über die tatsächliche Aktivität der Verbindung liefert, oder messen weit-nachgeschaltete Signale, wie Änderungen sogenannter „Second-Messenger“-Konzentrationen (meist cAMP oder Calcium) und Reporter-Gen-Expressionslevel. Aufgrund ihrer Entfernung vom eigentlichen Rezeptor-Aktivierungsprozess haben diese Methoden allerdings bedeutende Nachteile und produzieren so häufig Falsch-Positive und Falsch-Negative Ergebnisse.	
Seit den frühen 2000er wurden GPCR-Konformationssensoren auf Basis von Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) zur Messung der Ligand-induzierten Rezeptordynamik genutzt. Jedoch wies keiner der bisher entwickelten FRET- oder BRET- (Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer) Sensoren ausreichende Signalstärke auf, um im Hochdurchsatz-Screening (HTS) angewendet werden zu können. 
Die vorliegende Studie beschreibt das erste GPCR-Sensordesign, das aufgrund seiner exzellenten Signalstärke im Hochdurchsatz-Verfahren verwendet werden kann. Wir haben 21 unterschiedliche FRET- und BRET-Sensoren des α2A-adrenergen Rezeptors (α2AAR) getestet und dabei die Kombination der kleinen und hellen Luziferase NanoLuciferase (Nluc) mit dem rot-fluoreszierenden HaloTag-Farbstoff 618 als sensitivstes RET-Paar identifiziert. Der α2AARNluc/Halo(618) Biosensor ermöglicht die Messung der Aktivität und Wirkstärke von α2AAR-Liganden im Mikrotiterplattenformat. Um die universelle Anwendbarkeit dieses Sensordesigns zu prüfen, wurden fünf weitere Nluc/Halo(618)-basierende Sensoren für GPCRs unterschiedlicher Unterfamilien entwickelt. Zudem konnten wir zeigen, dass diese GPCRNluc/Halo(618)-Fusionsproteine weiterhin ihre natürlichen Signalkaskaden in Gang setzen können und damit die biologische Funktionalität dieser Rezeptoren erhalten ist. Außerdem belegt die vorlegende Arbeit, dass diese neue Sensor-Generation zur Messung Ligand-vermittelter Rezeptordynamiken im Hochdurchsatz-Format und zur Untersuchung der GPCR-Regulation durch endogene Modulatoren genutzt werden kann.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass wir den ersten HTS-kompatiblen Assay zur Messung der GPCR-Konformationsänderungen entwickelt haben. Diese Biosensoren erlauben die Charakterisierung neuartiger GPCR-Liganden direkt auf der Rezeptorebene und funktionieren damit unabhängig von nachgeschalteter Signalamplifikation oder Überlagerung verschiedener Signalwege, welche die Aussagekraft traditioneller GPCR-Screening-Verfahren häufig beeinträchtigen. Diese Technik kann zur Entdeckung neuartiger GPCR-Arzneistoffe genutzt werden, zu einem besseren Verständnis bisher kaum erforschter Rezeptoren beitragen und der Identifizierung und Charakterisierung potentieller GPCR-Modulatoren dienen.
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - Hochdurchsatz-Screening
KW  - Förster Resonanz Energie Transfer
KW  - High-thropughput screening
KW  - Bioluminescence resonance energy transfer
KW  - G-protein-coupled receptors
KW  - Receptor dynamics
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-175415
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TY  - THES
A1  - Kauk, Michael
T1  - Investigating the Molecular Mechanism of Receptor Activation at Muscarinic Receptors by Means of Pathway-Specific Dualsteric Ligands and Partial Agonists
T1  - Molekulare Grundlagen der Rezeptoraktivierung von muskarinergen Acetylcholin Rezeptoren durch dualstere Liganden und Partialagonisten
N2  - G protein-coupled receptors (GPCRs) form the biggest receptor family that is encoded in the human genome and represent the most druggable target structure for modern therapeutics respectively future drug development. Belonging to aminergic class A GPCRs muscarinic Acetylcholine receptors (mAChRs) are already now of clinical relevance and are also seen as promising future drug targets for treating neurodegenerative diseases like Alzheimer or Parkinson. The mAChR family consist of five subtypes showing high sequence identity for the endogenous ligand binding region and thus it is challenging until now to selectively activate a single receptor subtype. A well accepted method to study ligand binding, dynamic receptor activation and downstream signaling is the fluorescence resonance energy transfer (FRET) application. Here, there relative distance between two fluorophores in close proximity (<10 nm) can be monitored in a dynamic manner. The perquisite for that is the spectral overlap of the emission spectrum of the first fluorophore with the excitation spectrum of the second fluorophore. By inserting two fluorophores into the molecular receptor structure receptor FRET sensors can serve as a powerful tool to study dynamic receptor pharmacology.
Dualsteric Ligands consist of two different pharmacophoric entities and are regarded as a promising ligand design for future drug development. The orthosteric part interacts with high affinity with the endogenous ligand binding region whereas the allosteric part binds to a different receptor region mostly located in the extracellular vestibule. Both moieties are covalently linked. Dualsteric ligands exhibit a dynamic ligand binding. The dualsteric binding position is characterized by a simultaneous binding of the orthosteric and allosteric moiety to the receptor and thus by receptor activation. In the purely allosteric binding position no receptor activation can be monitored.
In the present work the first receptor FRET sensor for the muscarinic subtype 1 (M1) was generated and characterized. The M1-I3N-CFP sensor showed an unaltered physiological behavior as well as ligand and concentration dependent responses. The sensor was used to characterize different sets of dualsteric ligands concerning their pharmacological properties like receptor activation. It was shown that the hybrids consisting of the synthetic full agonist iperoxo and the positive allosteric modulator of BQCA type is very promising. Furthermore, it was shown for orthosteric as well as dualsteric ligands that the degree of receptor activation is highly dependent on the length of and the chemical properties of the linker moiety. For dualsteric ligands a bell-shaped activation characteristic was reported for the first time, suggesting that there is an optimal linker length for dualsteric ligands. The gained knowledge about hybrid design was then used to generate and characterize the first photo-switchable dualsteric ligand. The resulting hybrids were characterized with the M1-I3N-CFP sensor and were described as photo-inactivatable and dimmable. In addition to the ligand characterization the ligand application methodology was further developed and improved. Thus, a fragment-based screening approach for dualsteric ligands was reported in this study for the first time. With this approach it is possible to investigate dualsteric ligands in greater detail by applying either single ligand fragments alone or in a mixture of building blocks. These studies revealed the insights that the effect of dualsteric ligands on a GPCR can be rebuild by applying the single building blocks simultaneously. The fragment-based screening provides high potential for the molecular understanding of dualsteric ligands and for future screening approaches. Next, a further development of the standard procedure for measuring FRET by sensitized emission was performed. Under normal conditions single cell FRET is measured on glass coverslips. After coating the coverslips surface with a 20 nm thick gold layer an increased FRET efficiency up to 60 % could be reported. This finding was validated in different approaches und in different configurations. This FRET enhancement by plasmonic surfaces was until yet unreported in the literature for physiological systems and make FRET for future projects even more powerful.
N2  - G Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) bilden die größte Proteinfamilie, die im humanen Genom verschlüsselt ist. Sie sind nicht nur die Zielstruktur für eine Vielzahl von derzeit gebräuchlichen Medikamenten, sondern gehören auch zu den vielversprechendsten Therapieansätzen für die moderne Medikamentenentwicklung. Muskarinerge Acetylcholin Rezeptoren (mAChRs) gehören zu den aminergen Klasse A GPCRs und sind bereits heute von klinischer Relevanz. Die muskarinerge Rezeptorfamilie wird von fünf Subtypen gebildet, die sich besonders durch eine hohe Sequenzidentität in der endogenen Ligandenbindestelle (orthostere Bindestelle) auszeichnen. Aus diesem Grund ist es mit den herkömmlich verwendeten Medikamenten nicht möglich, einen ganz bestimmten Subtyp zu therapieren, ohne auch andere Subtypen zu beeinflussen und so unerwünschte Nebenwirkungen zu erhalten. Eine Möglichkeit Ligandenbindung, dynamische Rezeptoraktivierung oder Signalweiterleitung von GPCRs nach pharmakologischen Gesichtspunkten zu charakterisieren, stellt der Floreszenz Resonanz Energietransfer (FRET) dar. Mit Hilfe dieser Methode kann über kleine Entfernungen (<10 nm) die relative Orientierung von zwei Fluorophoren mit überlappenden Spektralbereichen mit hoher zeitlicher Auflösung verfolgt werden. Integriert man das Fluorophorpaar mit Hilfe gentechnischer Methoden in die Molekülstruktur des Rezeptors, kann man dessen Konformationsänderung bzw. Aktivierung infolge einer Ligandenbindung aufzeichnen.
Dualstere Liganden sind eine Substanzklasse von hohem zukünftigen klinischen Potential und zeichnen sich durch die Verknüpfung mehrerer pharmakologisch aktiver Untereinheiten aus. Der orthostere Molekülteil interagiert mit der endogenen Ligandenbindestelle und der allostere Molekülteil interagiert mit einem zweiten Rezeptorabschnitt, der häufig in den extrazellulären Schlaufen des Rezeptors zu finden ist. Diese allosteren Bindestellen zeichnet sich durch eine vergleichsweise geringe Sequenzidentität aus, weswegen allostere Modulatoren auch selektiv an Subtypen binden können. Aufgrund des Aufbaus können dualstere Liganden auf vielfältige Weise mit dem Rezeptor interagieren und dieser Bindemechanismus wurde als dynamische Ligandenbindung beschrieben. Zum einen können beide Molekülteile gleichzeitig mit dem Rezeptor interagieren und ihn aktivieren (dualsterer Bindemodus) und zum anderen findet man einen rein allosteren Bindemodus, der den Rezeptor nicht aktiviert. Der orthostere Molekülteil ist vor allem für die Rezeptoraktivierung zuständig, die sich durch eine hohe Affinität auszeichnet und der allostere Molekülteil kann selektive Rezeptorinteraktionen vermitteln. Da dualstere Moleküle immer Eigenschaften beider Untereinheiten besitzen, werden dualstere Liganden als sehr vielversprechend erachtet, zukünftig subtypselektive Medikamente darzustellen.
In dieser Arbeit wurde der erste Rezeptor FRET Sensor für den muskarinergen Subtyp 1 (M1) beschrieben und es konnte gezeigt werden, dass sich dieser Rezeptorsensor in seiner physiologischen Funktion nicht von dem wild Typ unterscheidet. Des Weiteren können mit Hilfe dieses Sensors liganden- und konzentrationsabhängige Rezeptorantworten aufgezeichnet werden. Der M1-I3N-CFP wurde dazu genutzt verschiedene Reihen dualsterer Liganden zu charakterisieren und auf ihre aktivierenden Eigenschaften bezüglich des M1 zu testen. Es wurde gezeigt, dass die Kombination aus dem synthetischen und hochpotenten Agonisten Iperoxo als Orthoster und dem in der Literatur als M1 selektiven positiven allosteren Modulator beschriebenen BQCA als Alloster sehr vielversprechend ist. Es konnte gezeigt werden, dass die rezeptoraktivierenden Eigenschaften sowohl von orthosteren wie auch von dualsteren Liganden stark von der Linkerlänge abhängig sind. Für dualstere Liganden konnte so ein glockenförmiger Zusammenhang zwischen Linkerlänge und Rezeptoraktivierung herausgearbeitet werden. Des Weiteren wurde gezeigt, dass bestimmte Hybride, die den M1 aktivieren, an anderen Subtypen keine Effekte hervorrufen und somit als subtypselektiv beschrieben werden können. Im Anschluss wurde mit Hilfe des gewonnenen Wissens über Iperoxo/BQCA Hybride, das Moleküldesign der dualsteren Liganden weiterentwickelt. So wurden in dieser Arbeit die ersten photo-schaltbaren bzw. photo-dimmbaren dualsteren Liganden beschrieben und charakterisiert. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit die herkömmliche Charakterisierung von dualsteren Liganden weiterentwickelt. Es konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass es möglich ist, die Aktivierung eines Rezeptors durch einen dualsteren Liganden nachzustellen, indem die einzelnen Fragmente des ursprünglichen Liganden gleichzeitig appliziert werden. Diese auf Fragmenten basierende Charakterisierung ist die erste Anwendung dieser Art und birgt großes Potential für die zukünftige Suche nach neuen Wirkstoffen. Neben der Untersuchung von pharmakologischen Schwerpunkten wurde auch die Weiterentwicklung der Rezeptor FRET Methodik beschrieben. Die herkömmliche Anwendung der Rezeptor FRET Sensoren geschieht auf Objektträgern aus Quarzglas. In dieser Arbeit wurde diese Anwendung dahingehend weiterentwickelt, dass die Objektträger mit einer 20 nm dicken Goldschicht beschichtet wurden, um den Einfluss von Plasmonoberflächen auf physiologisch relevante FRET Messungen zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass mit Hilfe der Goldbeschichtung und in Abhängigkeit des Versuchsaufbaus die Energietransfereffizienz um bis zu 60 % gesteigert werden konnte. Diese Entdeckung zeigt Potential zukünftig die FRET-Reichweite zu erhöhen und so bisher nicht charakterisierbare Sachverhalte aufklären zu können.
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - Muscarinrezeptor
KW  - Dualsteric Ligands
KW  - Partial Agonists
KW  - Dualstere Liganden
KW  - Partialagonismus
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-173729
N1  - Online-Version enthält nicht den Appendix (Volltexte der Originalveröffentlichungen der Zeitschriftenaufsätze)
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TY  - THES
A1  - Stumpf, Anette D.
T1  - Development of fluorescent FRET receptor sensors for investigation of conformational changes in adenosine A1 and A2A receptors
T1  - Entwicklung fluoreszenter FRET Rezeptor-Sensoren zur Untersuchung von Konformationsänderungen in Adenosin A1 und A2A Rezeptoren
N2  - Adenosine receptors that belong to the rhodopsin-like G protein-coupled receptors (GPCRs) are involved in a lot of regulatory processes and are widely distributed throughout the body which makes them an attractive target for drugs. However, pharmacological knowledge of these receptors is still limited. A big advance regarding the structural knowledge of adenosine receptors was the development of the first crystal structure of the adenosine A2A receptor in 2008. The crystal structure revealed the amino acids that form the ligand binding pocket of the receptor and depicted the endpoint of receptor movement in the ligand binding process. Within the scope of this work two members of the adenosine receptor family were investigated, namely the adenosine A1 and the A2A receptor (A1R, A2AR). A1R was generated on base of the previously developed A2AR. Receptors were tagged with fluorophores, with the cyan fluorescent protein (CFP) at the C-terminal end of receptor and the Fluorescein Arsenical Hairpin binder (FlAsH) binding sequence within the third intracellular loop of receptors. Resulting fluorescent receptor sensors
A1 Fl3 CFP and A2A Fl3 CFP were investigated with help of Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) measurements within living cells. FRET experiments enable the examination of alteration in the distance of two fluorophores and thus the observation of receptor dynamical movements.
For comparison of A1R and A2AR regarding receptor dynamical movement upon ligand binding, fluorescent receptor sensors A1 Fl3 CFP and A2A Fl3 CFP were superfused with various ligands and the outcomes of FRET experiments were compared regarding signal height of FRET ratio evoked by the distinct ligand that is correlated to the conformational change of receptor upon ligand binding. Beside the different direction of FRET ratio upon ligand binding at A1R and A2AR sensor, there were differences observable when signal height and association and dissociation kinetics of the various ligands investigated were compared to each other. Differences between the adenosine receptor subtypes were especially remarkable for the A1R subtype selective agonist CPA and the A2AR subtype selective agonist CGS 21680. Another part of the project was to investigate the influence of single amino acids in the ligand binding process within the fluorescent A1R sensor. Amino acid positions were derived from the crystal structure of the A2AR forming the ligand binding pocket and these amino acids were mutated in the A1R structure. Investigation of the A1R sensor and its mutants regarding confocal analysis showed involvement
of some amino acids in receptor localization. When these amino acids were mutated receptors were not expressed in the plasma membrane of cells. Some amino acids investigated were found to be involved in the ligand binding process in general whereas other amino acids were found to have an influence on the binding of distinct structural groups of the ligands investigated. In a further step, A1R and A2AR were N-terminally tagged with SNAP or CLIP which allowed to label receptor sensors with multiple fluorophores. With this technique receptor distribution in cells could be investigated with help of confocal analysis. Furthermore, ligand binding with fluorescent adenosine receptor ligands and their competition with help of a non-fluorescent antagonist was examined at the SNAP tagged A1R and A2AR. Finally the previously developed receptor sensors were combined to the triple labeled receptor sensors SNAP A1 Fl3 CFP and SNAP A2A Fl3 CFP which were functional regarding FRET experiments and plasma membrane expression was confirmed via confocal analysis. In the future, with the help of this technique, interaction between fluorescent ligand and SNAP tagged receptor can be monitored simultaneously with the receptor movement that is indicated by the distance alteration between FlAsH and CFP. This can
lead to a better understanding of receptor function and its dynamical movement upon ligand binding which may contribute to the development of new and more specific drugs for the A1R and A2AR in the future.
N2  - Adenosin Rezeptoren, die zur Gruppe der Rhodopsin-ähnlichen G Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) gehören, sind in eine Vielzahl regulatorischer Prozesse eingebunden und weit im Körper verbreitet. Das macht sie zu einer interessanten Zielstruktur für Arzneistoffe. Das Wissen über die Struktur der Adenosin Rezeptoren ist jedoch noch begrenzt. Ein großer Fortschritt zu mehr strukturellem Wissen war die Entwicklung der ersten Kristallstruktur des Adenosin A2A Rezeptors im Jahr 2008. Mit der Kristallstruktur wurden die Aminosäuren bekannt, die die Ligandenbindetasche dieses Rezeptors formen. Zudem gab die Kristallstruktur Einblick in den Endpunkt der dynamischen Rezeptorbewegung nach Ligandenbindung. Im Rahmen der hier vorgestellten Arbeit wurden zwei Mitglieder der Adenosin Rezeptor Familie, der Adenosin A1 Rezeptor und der Adenosin A2A Rezeptor (A1R, A2AR), genauer untersucht. Der A1R wurde auf Basis des vor kurzem veröffentlichten A2AR entwickelt. Die Rezeptoren wurden mit Fluorophoren versehen, zum einen mit dem cyan fluoreszierenden Protein (CFP) am C-Terminus des Rezeptors und zum anderen mit der Bindesequenz des kleinen Fluorophors "Fluorescein Arsenical Hairpin binder" (FlAsH) in der dritten intrazellulären Schleife des Rezeptors. Die daraus resultierenden Rezeptorsensoren A1 Fl3 CFP und A2A Fl3 CFP wurden mit Hilfe des Fluoreszenz Resonanz Energie Transfers (FRET) in lebenden Zellen erforscht. FRET Messungen ermöglichen es, eine Änderung der Distanz zwischen
den beiden Fluorophoren und damit Rezeptorbewegungen zu untersuchen. Um A1R und A2AR bezüglich dynamischer Rezeptorbewegungen nach Ligandenbindung vergleichen zu können, wurden die fluoreszierenden Rezeptorsensoren A1 Fl3 CFP und A2A Fl3 CFP mit verschiedenen Liganden umspült. Die Ergebnisse der FRET Messungen bezüglich ihrer Höhe des FRET Ratio wurden verglichen, welche
mit der Konformationsänderung des Rezeptors nach Ligandenbindung zusammenhängt. Neben der unterschiedlichen Richtung des FRET Ratio nach Ligandenbindung am A1R und A2AR Sensor waren Unterschiede bezüglich der Signalhöhe und der Bindungs- und Dissoziationskinetiken feststellbar, wenn die verschiedenen Liganden miteinander verglichen wurden. Unterschiede zwischen den Adenosin Rezeptor Subtypen waren speziell für den A1R subtypselektiven Agonist CPA und für den
A2AR subtypselektiven Agonist CGS 21680 feststellbar. Einen weiteren Punkt in diesem Projekt stellte die Erforschung des Einflusses, den einzelne Aminosäuren im fluoreszierenden A1R Sensor auf den Prozess der Ligandenbindung haben, dar. Die Position der Aminosäuren wurde der Kristallstruktur des A2AR entnommen und entsprechende Aminosäuren im A1R mutiert. Die konfokalmikroskopische Analyse des A1R Sensors und seiner Mutanten ergab, dass einige Aminosäuren direkt an der zellulären Expression des Rezeptors beteiligt waren. Wurden diese Aminosäuren mutiert, wurde der Rezeptor nicht in der Plasmamembran der Zellen exprimiert. Einige Aminosäuren die untersucht wurden,hatten einen generellen Einfluss auf die Bindung der Liganden, andere Aminosäuren hatten mehr Einfluss auf die Bindung bestimmter struktureller Gruppen der untersuchten Liganden. In einem weiteren Schritt wurden A1R und A2AR am N-terminalen Rezeptorende
mit SNAP oder CLIP versehen, was eine Markierung der Rezeptoren mit einer Vielzahl an Fluorophoren erlaubt. Mit Hilfe dieser Technik konnte die Verteilung der Rezeptoren in der Zelle mit konfokaler Mikroskopie untersucht werden. Des Weiteren wurde die Bindung von fluoreszierenden Adenosin Rezeptor Liganden und deren Verdrängung mit einem nicht-fluoreszierenden Adenosin Rezeptor Antagonist erforscht. Am Ende des Projekts wurden die zuvor beschriebenen fluoreszierenden Rezeptorsensoren zu dreifach fluorophormarkierten Rezeptorsensoren kombiniert, was zu den Sensoren SNAP A1 Fl3 CFP und SNAP A2A Fl3 CFP führte. Beide Rezeptorsensoren waren funktionell bezüglich FRET Experimenten und der Expression in der
Plasmamembran der Zellen. In Zukunft können mit dieser Methode gleichzeitig die Bindung von fluoreszierenden Liganden am SNAP-markierten Rezeptor, so wie die Rezeptorbewegung beobachtet
werden, die durch eine Distanzänderung zwischen CFP und FlAsH angezeigt wird. Das kann zu einem besseren Verständnis der Rezeptorfunktion und der dynamischen Rezeptorbewegung nach Ligandenbindung führen, die in Zukunft zur Entwicklung spezifischerer Wirkstoffe am A1R und A2AR beitragen könnte.
KW  - Adenosinrezeptor
KW  - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - Adenosine receptors
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-125469
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TY  - THES
A1  - Emami-Nemini, Alexander Darius
T1  - Differential parathyroid hormone receptor signaling directed by adaptor proteins
T1  - Steuerung differenzieller Signalgebung des Parathormon Rezeptors durch Adapterproteine
N2  - The superfamily of G protein-coupled receptors (GPCR) regulates numerous physiological and pathophysiological processes. Hence GPCRs are of significant interest for pharmacological therapy. Embedded into cytoplasmic membranes, GPCRs represent the core of large signaling complexes, which are critical for transduction of exogenous stimuli towards activation of downstream signaling pathways. As a member of the GPCR family B, the parathyroid hormone receptor (PTHR) activates adenylyl cyclases, phospholipases C β as well as mitogen-activated protein kinase-dependent signaling pathways, thereby mediating endocrine and paracrine effects of parathyroid hormone (PTH) and parathyroid hormone-related peptide (PTHrP), respectively. This regulates, calcium homeostasis, bone metabolism and bone development. Paradoxically, PTH is able to induce both catabolic and anabolic bone metabolism. The anabolic effect of PTH is successfully applied in the therapy of severe osteoporosis. Domination of anabolic or catabolic bone-metabolism is entailed by temporal and cell-type specific determinants. The molecular bases are presumably differential arrangements of adaptor proteins within large signaling complexes that may lead to differential activation of signaling pathways, thereby regulating physiological effects. The molecular mechanisms are largely unclear; thus, there is significant interest in revealing a better understanding of PTHR-related adaptor proteins. To identify novel adaptor proteins which direct PTHR signaling pathways, a proteomic screening approach was developed. In this screening, vav2, a guanine-nucleotide exchange factor (GEF) for small GTPases which regulates cytoskeleton reorganization, was found to interact with intracellular domains of PTHR. Evidence is provided that vav2 impairs PTH-mediated phospholipase C β (PLCβ) signaling pathways by competitive interactions with G protein αq subunits. Vice versa, PTH was shown to regulate phosphorylation and subsequent GEF activity of vav2. These findings may thus shed new light on the molecular mechanisms underlying the effects of PTH on bone metabolism by PLC-signaling, cell migration and cytoskeleton organization. In addition to the understanding of intracellular molecular signaling processes, screening for ligands is a fundamental and demanding prerequisite for modern drug development. To this end, ligand binding assays represent a fundamental technique. As a substitution for expensive and potentially harmful radioligand binding, fluorescence-based ligand-binding assays for PTHR were developed in this work. Based on time-resolved fluorescence, several assay variants were established to facilitate drug development for the PTHR.
N2  - Die Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) reguliert eine Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen, was sie bedeutend für die Pharmakotherapie macht. Eingebettet in die Zytoplasmamembran sind GPCRs das Zentrum von Signalkomplexen, die eine Transduktion äußerer Stimuli zur Aktivierung von nachgeschalteten Signalwegen ermöglichen. Der zur Familie B der GPCRs gehörige Parathormon-Rezeptor (PTHR) aktiviert Adenylyl-Zyklasen-, Phospholipasen Cβ- und Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK)-abhängige Signalwege, wodurch endokrine und parakrine Wirkungen des Parathormons (PTH) und des Parathormon-ähnlichen Peptides (PTHrP) vermittelt werden. Dies ermöglicht die Regulation der Calcium-Homöostase, des Knochenmetabolismus und der Knochenentwicklung. Paradoxerweise kann PTH sowohl katabole als auch anabole Effekte auf den Knochenstoffwechsel induzieren. Den anabolen Effekt von PTH nutzt man erfolgreich in der Therapie der schweren Osteoporose. Ob ein anaboler oder kataboler Knochenmetabolismus überwiegt, wird durch zeitliche und Zelltyp-spezifische Faktoren bestimmt. Dem zugrunde liegt vermutlich unter anderem eine differenzielle Anordnung verschiedener Adapterproteine innerhalb der Signalkomplexe, die zur differenziellen Aktivierung von Signalwegen führen und so eine Steuerung bestimmter physiologischer Effekte ermöglichen. Die molekularen Mechanismen sind jedoch noch weitgehend unklar, weshalb großes Interesse besteht, ein besseres Verständnis über die PTHR-assoziierten Adapterproteine zu entwickeln. Zur Identifizierung neuer Adapterproteine, die PTHR-Signalwege beeinflussen, wurde in dieser Arbeit ein auf dem Proteom-basierender Screening-Ansatz entwickelt. Dieser führte zur Entdeckung einer Interaktion von intrazellulären Domänen des PTHR mit vav2, einem Guanin-Nukleotid Austauschfaktor (GEF) für kleine GTPasen, der die Zytoskelett-Reorganisation steuert. Des Weiteren wurde nachgewiesen, dass vav2 über kompetitive Interaktionen mit G Protein αq Untereinheiten PTH-vermittelte Phospholipase Cβ (PLCβ)-abhängige Signalwege beeinflusst. Umgekehrt wurde gezeigt, dass PTH die Phosphorylierung und damit die GEF Aktivität von vav2 reguliert. Diese Befunde können Aufschluss über molekulare Mechanismen geben, die den Wirkungen von PTH auf den Knochenstoffwechsel durch PLC-Signalwege, Zellmigration und Zytoskelett-Reorganisation zugrunde liegen. Neben dem Verständnis über molekulare Prozesse der intrazellulären Signalgebung ist die Suche nach Liganden eine herausfordernde Grundvoraussetzung für die aktuelle Arzneistoffentwicklung. Liganden-Bindungs-Experimente stellen dafür elementare Techniken dar. Zur Substitution kostenintensiver und potentiell gesundheitsschädlicher Radioliganden-Bindungen, wurden in dieser Arbeit Fluoreszenz-basierte Liganden-Bindungs-Experimente für den PTHR entwickelt. Basierend auf Zeit-aufgelöster Fluoreszenz wurden mehrere Varianten dieser Experimente etabliert, um die Arzneistoffentwicklung am PTHR zu unterstützen.
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - Parathormon
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - Parathormon
KW  - vav2
KW  - Guanin Nukleotid Austauschfaktor
KW  - G protein coupled receptor
KW  - parathyroid hormone
KW  - vav2
KW  - guanine nucleotide exchange factor
KW  - Guaninnucleotid-Austauschfaktoren
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72369
ER  - 
TY  - THES
A1  - Deiß, Katharina
T1  - Die Regulation des Kinasemodulators Raf Kinase Inhibitor Protein (RKIP): Einfluss von Phosphorylierung und Dimerisierung auf die Interaktion mit Raf1 und G Protein-gekoppelter Rezeptorkinase 2 (GRK2)
T1  - Regulation of the kinase modulator Raf kinase inhibitor protein (RKIP): Influence of phosphorylation and dimerization on its interaction with Raf1 and G protein coupled receptor kinase 2 (GRK2)
N2  - RKIP reguliert Proteinkinasen der Signaltransduktionskaskaden von G Protein-gekoppelten Rezeptoren, der Raf/MEK/ERK-MAPK, des Transkriptionsfaktors NFκB und von GSK3β. Unklar war bisher, wie die spezifische Interaktion von RKIP mit seinen mannigfaltigen Interaktionspartnern ermöglicht und reguliert wird. Raf1 und GRK2 sind die einzigen bekannten direkten Interaktionspartner von RKIP und wurden deshalb gewählt, um die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen dieser Interaktion genauer zu untersuchen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass RKIP nach PKC-vermittelter Phosphorylierung von Serin153 dimerisiert und dass diese Dimerisierung für die RKIP/Raf1-Dissoziation und die RKIP/GRK2-Interaktion essentiell ist. Co-Immunpräzipitationsexperimente mit einer phosphorylierungsdefizienten Mutante zeigten, dass für diese Dimerisierung die Phosphorylierung von beiden RKIP-Molekülen notwendig ist. Als Dimerinteraktionsfläche wurden die Aminosäuren 127-146 von RKIP identifiziert, da das Peptid RKIP127-146 die Dimerisierung von RKIP spezifisch und effizient hemmte. Um die Bedeutung dieser phosphorylierungsinduzierten Dimerisierung von RKIP für seine Interaktion mit Raf1 und GRK2 zu untersuchen, wurden eine phosphomimetische Mutante (RKIPSK153/7EE) und eine Mutante von RKIP generiert, welche bereits unphosphoryliert dimerisiert (RKIP∆143-6). Folgende Ergebnisse legen nahe, dass die Dimerisierung von RKIP für die spezifische Interaktion mit Raf1 bzw. GRK2 entscheidend ist: (i) Die Dimerisierung von phosphoryliertem RKIP ging mit der Dissoziation von RKIP und Raf1 und der Assoziation von RKIP und GRK2 einher; (ii) die Mutanten RKIPSK153/7EE und RKIP∆143-6, die bereits in unstimulierten Zellen eine starke Dimerisierung zeigten, hatten eine höhere Affinität zu GRK2 als zu Raf1; (iii) die Hemmung der RKIP-Dimerisierung interferierte nur mit der RKIP/GKR2- aber nicht mit der RKIP/Raf1-Interaktion; (iv) in vitro und in Mausherzen konnte ein RKIP- und GRK2-immunreaktiver Komplex nachgewiesen werden; (v) Untersuchungen zur RKIP-vermittelten Hemmung der Kinaseaktivität von GRK2 und Raf implizierten, dass dimerisiertes RKIP nur die Aktivität von GRK2, nicht aber von Raf hemmt. Diese Arbeit zeigt, dass die phosphorylierungsinduzierte Dimerisierung von RKIP die spezifische Interaktion von RKIP mit Raf1 und GRK2 koordiniert. Die Aufklärung dieses Mechanismus erweitert unser Verständnis der spezifischen Interaktion von Kinasen mit ihren Regulatorproteinen.
N2  - RKIP is a regulator of several distinct kinases and modulates diverse signal transduction cascades such as the signaling of G protein coupled receptors, of the Raf/MEK/ERK-cascade, of the transcription factor NFκB, and of GSK3β. Until now, it was not well understood how the specific interaction of RKIP with its diverse targets is achieved and regulated. Raf1 and GRK2 are the only known direct interaction partners of RKIP and were thus chosen to untangle the molecular mechanisms regulating the specific interaction of RKIP with these kinases. In this dissertation it is shown that RKIP dimerizes upon PKC-mediated phosphorylation of serine153 and that this dimerization is essential for RKIP/Raf1-dissociation and RKIP/GRK2-association. Co-immunoprecipitation experiments with a phosphorylation-deficient mutant revealed that the dimerization of RKIP requires the phosphorylation of two RKIP molecules. The amino acids 127-146 of RKIP were identified as dimer-interface, since RKIP-dimerization was efficiently and specifically inhibited by the peptide RKIP127-146. To elucidate the implication of this phosphorylation-induced dimerization on the target specificity of RKIP, a phosphomimetic RKIP mutant (RKIPSK153/7EE) and a dimeric RKIP mutant (RKIP∆143-6) were generated. The following results indicated that dimerization of RKIP controls its specific interaction with Raf1 or GRK2, respectively: (i) dimerization of phosphorylated RKIP occurred concomitantly with the release of RKIP from Raf1 and its association with GRK2; (ii) the RKIP mutants RKIPSK153/7EE and RKIP∆143-6, which had a higher propensity for RKIP-dimerization already under basal conditions, had a higher affinity to GRK2 than to Raf1; (iii) inhibition of RKIP-dimerization prevented only RKIP/GRK2-binding but did not interfere with RKIP/Raf1-binding; (iv) an RKIP- and GRK2-immunoreactive complex was detected in vitro as well as in mouse hearts; (v) analyses of RKIP-mediated inhibition of GRK2 and Raf showed that a higher propensity for RKIP-dimerization translates into efficient GRK2-inhibition but not into Raf-inhibition. The results of this thesis show that phosphorylation-induced dimerization of RKIP regulates its specific interaction with Raf1 and GRK2. The elucidation of this mechanism improves our understanding how specificity in the interaction of kinases and their regulatory proteins can be achieved.
KW  - Signaltransduktion
KW  - Dimerisierung
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - Proteinkinase C
KW  - Raf Kinase Inhibitor Protein (RKIP)
KW  - G protein-gekoppelte Rezeptor Kinase 2 (GRK2)
KW  - Raf1
KW  - Raf Kinase Inhibitor Protein (RKIP)
KW  - G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2)
KW  - Raf1
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73884
ER  - 
TY  - THES
A1  - Bätz, Julia
T1  - FRET-basierte Untersuchungen zur ligandenselektiven Beeinflussung der Rezeptorkonformation durch orthosterische und allosterische Liganden am Beispiel des muskarinischen M2 Acetylcholinrezeptors
T1  - FRET-based analysis of the ligandselective influence of orthosteric and allosteric ligands on the change of receptor conformation of the muscarinic m2 acetylcholine receptor
N2  - Zahlreiche experimentelle Befunde lassen vermuten, dass G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR) nach ihrer Aktivierung einer ligandenselektiven Änderung der Rezeptorkonformation unterliegen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es dieses Phänomen am Subtyp 2 der muskarinischen Acetylcholinrezeptoren (M2 AChR) zu untersuchen. Muskarinische Acetylcholinrezeptoren (mAChR) können in fünf Subtypen (M1-M5) unterschieden werden. Durch die Beteiligung der mAChR an zahlreichen physiologischen Prozessen stellen sie wichtige Zielstrukturen pharmakologischer Therapien dar. Da die orthosterische Ligandenbindestelle (= Bindestelle des endogenen Liganden) in allen fünf Subtypen hoch konserviert ist, wird ihr pharmakologischer Nutzen derzeit allerdings durch die unselektive Rezeptormodulation und dem damit verbundenen Auftreten unerwünschter Arzneimittelwirkungen stark limitiert. Ein Ansatz zur Erzielung subtypselektiver Effekte besteht in der Verwendung allosterischer Modulatoren. Da die allosterische Bindestelle der mAChR eine geringere Sequenzhomologie aufweist, können so gezielt einzelne Subtypen der mAChR reguliert werden. Der M2 AChR stellt hinsichtlich allosterischer Modulation ein gut charakterisiertes Modellsystem dar. Für ihn wurde bereits eine Vielzahl allosterischer Liganden entwickelt. Auch bitopische Liganden, die sowohl einen allosterischen als auch einen orthosterischen Anteil enthalten, wurden für den M2 AChR bereits beschrieben. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene FRET-Sensoren des M2 AChR generiert und charakterisiert. Als FRET-Paar wurden das cyan fluoreszierende Protein (CFP) und der niedermolekulare fluorescein-basierte Fluorophor FlAsH (fluorescein arsenical hairpin binder) gewählt. CFP wurde in den Sensoren am Ende des C-Terminus angefügt. Die zur Markierung mit FlAsH nötige Tetracysteinsequenz wurde in verschiedenen Bereichen der dritten intrazellulären Rezeptorschleife (IL) eingebracht. Die auf diese Weise erstellten Re-zeptorsensoren trugen das Tetracysteinmotiv in der N terminalen (M2i3-N) bzw. in der C terminalen Region (M2i3-C) von IL 3. Die Charakterisierung der Rezeptorsensoren bezüglich Ligandenbindung, Gi-Protein Aktivierung und β-Arrestin2 Translokation ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen M2i3-N, M2i3 C und M2CFP oder Wildtyp M2 AChR. Zunächst wurden sowohl unterschiedliche orthosterische, als auch allosterische Liganden hinsichtlich ihrer mittleren effektiven Konzentration und ihrer maximalen Wirkstärke an den Rezeptorsensoren untersucht. Mit Hilfe von FRET-Messungen konnte ein superago-nistisches Verhalten des orthosterischen Testliganden Iperoxo gezeigt werden. Die Eigenschaften der allosterischen Substanzen wurden durch Messung der Rezeptordeakti-vierungskinetik und des maximalen Hemmeffekts auf einen vorstimulierten Rezeptor charakterisiert. Alle allosterischen Liganden deaktivierten den vorstimulierten M2 AChR mit einer schnelleren Kinetik als Atropin. Die EC50-Werte der unterschiedlichen Substanzen waren unabhängig von der Markierungsposition im verwendeten Rezeptorsensor vergleich-bar. Ausnahmen bildeten die allosterischen Liganden JK 289, JK 338, ½ W84 und EHW 477, die liganden- und sensorabhängig unterschiedliche mittlere effektive Konzentrationen aufwie-sen. Bei der Untersuchung der Konformationsänderung des M2 AChR konnte kein liganden-selektiver Unterschied zwischen den FRET-Signalen für 19 getestete orthosterische Liganden beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, dass alle orthosterischen Testliganden eine dem Acetylcholin (ACh) vergleichbare Änderung der M2 AChR Konformation induzier-ten. Um zu untersuchen, ob für die orthosterischen Testliganden eine Korrelation zwischen ihrer maximalen Wirkstärke hinsichtlich Rezeptoraktivierung in FRET-Experimenten und der Aktivierung nachgeschalteter Signalwege besteht, wurde die orthosterisch-vermittelte Translokation von β-Arrestin2 mit Hilfe der Konfokalmikroskopie bestimmt. Bis auf 5-Methyl-furmethiodid translozierten alle orthosterischen Liganden β-Arrestin2 in einem Ausmaß, das mit der maximalen Rezeptoraktivierung vergleichbar war. Dagegen rief 5 Methylfurmethiodid verglichen mit dem endogenen Liganden ACh zwar eine ca. halbmaximale Rezeptorakti-vierung, aber nur eine äußerst geringe β-Arrestin2 Translokation hervor. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Einfluss verschiedener Allostere auf eine ligandenselektive Konformationsänderung des M2 AChR untersucht. Die allosterischen Liganden JK 337 und Seminaph beeinflussten den M2i3-C Sensor signifikant stärker, als das M2i3-N Konstrukt. Dagegen zeigte EHW 477 eine stärkere Beeinflussung der Rezeptorkon-formation des M2i3-N-, als des M2i3-C Sensors. Dies erlaubt die Vermutung, dass JK 337 und Seminaph eine stärkere Bewegung unterhalb von Transmembrandomäne (TM) 6, als unterhalb von TM 5 hervorriefen. Die Ergebnisse für EHW 477 legen nahe, dass TM 5 eine größere Bewegung eingeht, als TM 6. FRET-basierte Untersuchungen der Einflüsse der allosterischen Testliganden auf nachgeschaltete Signalwege ergaben, dass sowohl die Akti-vierung des Gi Proteins, als auch die β-Arrestin2 Translokation selektiv durch einzelne allosterische Liganden beeinflusst werden. Auch ein Zusammenhang zwischen Rezeptor-aktivierung und der Regulation nachgeschalteter Signalwege war erkennbar. Allerdings waren auf Grund der Versuchsbedingungen keine quantitativen Aussagen möglich. Im Folgenden wurden die bitopischen Liganden Hybrid 1 und 2 (H 1, H 2) hinsichtlich ihres Effekts auf die Konformationsänderung des M2 AChR untersucht. Während eine Stimulation mit H 1 vergleichbare FRET-Signale an beiden Sensoren ergab, konnte mit H 2 weder am M2i3-N-, noch an M2i3-C Sensor eine FRET-Änderung detektiert werden. Um den mangeln-den Effekt der Hybridsubstanzen in FRET-mikroskopischen Untersuchungen aufzuklären, wurden verschiedene Ansätze gewählt: Mit kettenverlängerten Derivaten der Hybridsubstanzen konnte in FRET-Messungen eine Änderung des FRET-Signals detektiert werden. Die Entfernung des allosterischen Bausteins führte in FRET-Experimenten zu einer verglichen mit dem endogenen Liganden ACh etwa halbmaximalen Aktivierung beider Sensoren. Dagegen resultierte die Mutation der alloste-rischen Bindestelle in nachfolgenden FRET-Untersuchungen mit H 1 und H 2 in keiner Signaländerung des FRET-Ratio. Diese Beobachtungen führten zu der Annahme, dass die Linkerkette, die orthosterischen und allosterischen Baustein der Hybride miteinander verbindet, zu kurz war um eine gleichzeitige Bindung an die allosterische und orthosterische Bindestelle zu ermöglichen. Ein anderer Erklärungsansatz besteht darin, dass nach Bindung des Orthosters der Kanal zwischen orthosterischer und allosterischer Bindestelle durch die Konformationsänderung des Rezeptors verschlossen wird, weshalb keine dauerhafte, dualsterische Bindung der Hybridsubstanzen an den M2 AChR möglich ist. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen mittels FRET-Experimenten die Existenz einer ligandenselektiven Rezeptorkonformation des M2 AChR mit allosterischen Liganden nachzuweisen. Darüber hinaus konnte auch ein Bezug zum Auftreten einer funktionellen Selektivität mit allosterischen Liganden hergestellt werden. Die Untersuchung von 19 orthosterischen Liganden hinsichtlich ihres Einflusses auf die Rezeptorkonformation des M2 AChR ergab keinen Hinweis auf eine ligandenselektive Konformationsänderung. Die Betrachtung der orthosterisch-vermittelten Translokation von β-Arrestin2 zeigte, dass zwischen der Effizienz der orthosterischen Testliganden, den M2 AChR zu aktivieren und dem Ausmaß, in dem sie eine β Arrestin2 Translokation induzierten eine direkte Korrelation besteht. Lediglich 5-Methylfurmethiodid rief eine ungleich geringere β-Arrestin2 Translokation hervor, verglichen mit dem Ausmaß an Rezeptoraktivierung. Diese Beobachtung deutet auf die Existenz eines signaling-bias für diesen Liganden hin. Die Untersuchung der dualsterischen Liganden H 1 und 2 bezüglich ihrer Fähigkeit zur Rezeptoraktivierung ergab, dass erst durch eine Verlängerung der Linkerkette, durch die orthosterischer und alloste-rischer Baustein miteinander verbunden sind eine Konformationsänderung des M2 AChR hin zu einer aktiven Konformation erreicht werden kann. Es kann somit angenommen werden, dass in den ursprünglichen Hybridsubstanzen H 1 und H 2 eine zu kurze Linkerkette, durch die keine dualsterische Bindung der Hybride an die allosterische und orthosterische Bindestelle möglich ist, ursächlich für die mangelnde Rezeptoraktivierung des M2 AChR war.
N2  - A large body of experimental evidence suggests that upon receptor activation G-protein coupled receptors are subject to ligandspecific changes of receptor conformation. The aim of this study was to investigate this phenomenon using the muscarinic M2 acetylcholine receptor (M2 AChR). Muscarinic acetylcholine receptors (mAChR) can be subdivided into five different subtypes (M1-M5). Their involvement in various physiological processes makes them an important target of pharma-cological therapies. With the orthosteric binding site (= binding site of the endogenous ligand) being highly conserved across all five mAChR subtypes, the unselective receptor modulation can lead to severe side effects. Thus the clinical use of drugs modulating muscarinic receptors is currently limited. Allosteric modulation is one attempt to achieve subtype-selective receptor regulation. Since the allosteric binding site of mAChR is less well conserved, it is possible to selectively target one mAChR subtype. As far as allosteric modulation is concerned, the M2 AChR represents a well characterized model with a large number of allosteric modulators being available. For the M2 AChR bitopic ligands which contain an allosteric as well as an orthosteric binding block have been developed as well. In the first part of this study several FRET-sensors of the M2 AChR were designed and characterized. The cyan fluorescent protein (CFP) was fused to the C-terminus of both sensors while the FlAsH (fluorescein arsenical hairpin binder) binding site was inserted into the N-terminal (M2i3-N) or the C terminal (M2i3-C) region of the third interacellular loop (IL). The receptor sensors were characterized concerning ligand affinity, activation of the Gi protein and -arrestin2 translocation and did not display any significant differences compared to the wildtype M2 or the M2 CFP receptor. Various orthosteric as well as allosteric ligands were investigated regarding their affinity and efficacy at both sensors. Using FRET-measurements iperoxo was proven to behave as a superagonist. The characteristics of the allosteric ligands were investigated by measuring the receptor deactivation kinetics and their maximum inhibitory effect on a pre-stimulated receptor. All allosteric test substances displayed faster deactivation kinetics compared to the antagonist atropine and similar EC50 values at both receptor sensors. When investigating the change of receptor conformation of the M2 AChR upon ligand binding there were no ligand selective differences in the FRET-signal detected for either of the 19 orthosteric ligands at both M2 sensors. This data suggest that all orthosteric ligands induced a change in receptor conformation comparable to acetylcholine (ACh). In order to correlate the efficacy of various orthosteric ligands to activate the M2 AChR in FRET-experiments with their effect on downstream signaling pathways, the translocation of  arrestin2 upon receptor activation with orthosteric ligands was investigated using confocal microscopy. Except for 5 methylfurmethiodide all orthosteric ligands induced -arrestin2 translocation to an extent which was comparable to the maximal receptor activation observed with each other ligand, respectively. In contrast 5-methylfurmethiodide evoked a half maximal receptor activation compared to the endogenous ligand ACh while only a minimal translocation of -arrestin2 was observed. The second aim of this study was to investigate the effects of allosteric ligands on the change of receptor conformation of the M2 AChR. The allosteric ligands JK 337 and seminaph more strongly influenced the M2i3-C than the M2i3-N, whilst EHW 477 behaved just the opposite way. This data suggest that the orthosteric ligands induce a conformation of the M2 AChR comparable to ACh. JK 337 and seminaph seem to evoke a greater movement underneath TM 6 compared to TM 5 whereas EHW 477 probably induces a larger movement beneath TM 5. The allosteric ligands were tested via FRET-measurements concerning their ability to activate the Gi protein and to translocate  arrestin2. The activation of the Gi protein as well as the -arrestin2 translocation were selectively influenced by all allosteric ligands. However, due to the experimental setup, a quantification of the effects was not possible. Furthermore the bitopic ligands hybrid 1 and 2 (H 1, H 2) were tested regarding their effect on the receptor conformation of the M2 AChR. While stimulation with H 1 induced FRET signals that were comparable for both receptor sensors, it wasn’t possible to detect any change in the FRET ratio neither of the M2i3-N nor of the M2i3-C with H 2. The lack of effect of H 1 and H 2 in the FRET-experiments was explored using two different approaches: Derivatives of H 1 and H 2, in which the carbon linker between the allosteric and the orthosteric building block had been elongated, were able to induce changes in the FRET ratio. Upon the removal of the allosteric building block a half-maximal activation of both receptor sensors could be detected. However, the mutation of the allosteric binding site did not result in any change of the FRET-signals upon stimulation of the receptor mutants with H 1 or H 2. These data suggest that the carbon linker, which connects the allosteric and the orthosteric building block, is not long enough to enable a simultaneous binding to the allosteric and the orthosteric binding site. Another explanation would be that upon binding of an orthoster the channel between the orthosteric and the allosteric binding site of the M2 AChR is closed because of the change in receptor conformation, hence a stable, dual-steric binding of the hybrid substances to the M2 AChR would not be possible. In the course of this study it was possible to prove the existence of a ligand selective receptor conformation of the M2 AChR with allosteric ligands using FRET-experiments. In addition a connection was found to the occurrence of a functional selctivity with allosteric ligands. The investigation of 19 orthosteric ligands regarding their influence on the receptor conformation of the M2 AChR did not reveal any evidence of the existence of a ligand selective change of the receptor conformation. Regarding the translocation of β arrestin2 induced by orthosteric ligands there was a direct correlation between the efficency of the orthosteric ligands to activate the receptor and the extend of β-arrestin2 translocation observed. With the only exception being 5-methylfurmethiodide which induced far less β arrestin2 translocation compared to the magnitude of the conformational change of the receptor. This data suggest the existence of a signaling bias for this ligand. The analysis of the dualsteric ligands H 1 and H 2 concerning their ability to activate the M2 AChR revealed that an activation of the M2 AChR could just be observed upon elongation of the linker which connects the orthosteric with the allosteric building block. This suggests that the short linker chain of the original hybrid substances inhibited a dualsteric binding to the orthosteric and the allosteric binding site and thus caused the difficency of H 1 and H 2 to activate the M2 AChR.
KW  - Muscarinrezeptor
KW  - Allosterie
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
KW  - allosteric modulation
KW  - muscarinic aceylcholine receptor
KW  - GPCR
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72836
ER  - 
TY  - THES
A1  - Frölich, Nadine
T1  - Analyse der µ-Opiatrezeptoraktivierung und Signaltransduktion in lebenden Zellen mittels FRET-Mikroskopie
T1  - Analysis of µ-opioid receptor activation and signal transduction in living cells using FRET microscopy
N2  - Der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer ist ein Phänomen, welches erstmals 1948 von Theodor Förster beschrieben wurde. Mit der Entwicklung von Fluoreszenzproteinen konnten in Kombination mit Mikroskopietechniken Einblicke in zellbiologische Vorgänge gewonnen werden, die durch biochemische oder physiologische Experimente nicht möglich sind. Dabei spielt die hohe zeitliche und räumliche Auflösung eine wichtige Rolle. Auf dem Forschungsgebiet der GPCR, welche die größte Gruppe von Membranproteinen bei den Säugetieren darstellen, wurden insbesondere Erkenntnisse über Konformationsänderungen der Rezeptoren, die Kinetik der Rezeptoraktivierung und die Interaktion mit intrazellulären Signalproteinen gewonnen. Der µ-Opioidrezeptor gehört zur Familie der GPCR und stellt aufgrund seiner analgetischen Wirkungen eine wichtige pharmakologische Zielstruktur dar. Das Ziel dieser Arbeit war sowohl den Rezeptor als auch seine Signalwege mittels FRET-Mikroskopie zu untersuchen. Zunächst sollte ein intramolekularer FRET-Sensor des µ-Opioidrezeptors entwickelt werden, dazu wurden basierend auf den Kenntnissen über die Tertiärstruktur und dem Aufbau bereits bekannter GPCR-Sensoren verschiedene Rezeptorkonstrukte kloniert. Bei den Konstrukten wurden entweder zwei Fluoreszenzproteine oder ein Fluoreszenzprotein und ein Fluorophor-bindendes Tetracysteinmotiv kombiniert. Auch die Positionen der eingefügten Sequenzen wurden in den intrazellulären Domänen variiert, da der Rezeptor auf die Modifikationen mit beeinträchtigter Membranlokalisation reagierte. Durch die Optimierung wurden Rezeptoren konstruiert, die an der Zellmembran lokalisiert waren. Jedoch zeigte keines der Rezeptorkonstrukte Funktionalität im Hinblick auf die Rezeptoraktivierung. Im zweiten Teil wurden die pharmakologischen Effekte der Metabolite von Morphin am humanen µ-Opioidrezeptor systematisch analysiert. Dazu wurde die Fähigkeit der Metabolite, Gi-Proteine zu aktivieren und β-Arrestin2 zu rekrutieren, mittels FRET-basierter Messungen an lebenden Zellen untersucht. Außerdem wurde die Affinität der Metabolite zum humanen µ Opioidrezeptor anhand der Verdrängung eines radioaktiven Liganden analysiert. Meine Experimente identifizierten eine Gruppe mit stark agonistischen und eine mit schwach agonistischen Eigenschaften. Die starken Partialagonisten aktivieren den Rezeptor bereits bei nanomolaren Konzentrationen, während die schwachen Metabolite den Rezeptor erst bei Konzentrationen im mikromolaren Bereich aktivieren. Die Metabolite Normorphin, Morphin-6-Glucuronid und 6-Acetylmorphin zeigen geringere Potenz als Morphin bei der Gi-Aktivierung aber überraschenderweise höhere Potenz und Effizienz für die β-Arrestin-Rekrutierung. Dies deutet auf eine bevorzugte Aktivierung von β-Arrestin2 hin. Die aus diesen Studien gewonnenen Ergebnisse liefern Hinweise darauf, welche Metabolite bei der Signalverarbeitung am µ Opioidrezeptor in vivo beteiligt sind.
N2  - Fluorescence resonance energy transfer was first described by Theodor Förster in 1948. The discovery and development of intrinsic fluorescent proteins revolutionized cell and molecular biology. The FRET-technique allows the analysis of protein-protein interactions and intramolecular conformational changes. In this method, its high temporal and spatial resolution plays a crucial role. Especially in the research field of GPCR, which are the largest family of membrane proteins in mammals, insights into receptor conformational changes, kinetics of receptor activation and the interaction with intracellular proteins were obtained. The µ-opioid receptor belongs to the GPCR family and is involved in analgesia. Therefore, the receptor is an important pharmacological target. Its pharmacological properties were extensively analyzed in the current thesis by FRET. Engineering of an intramolecular MOR-biosensor was initially planned. Based on the knowledge about the tertiary receptor structure and earlier GPCR-sensors, different receptor constructs were cloned. For each receptor construct either two fluorescent proteins or one fluorescent protein and one fluorophore binding tetracysteine motif were combined. The insertion of the additional amino acid sequences prevented the membrane localization for some constructs. Hence, the insertion site of the amioacid sequences was varied in the intracellular loops. Ultimately, the optimization resulted in some membrane localized receptor constructs with the tetracysteine motif in the third intracellular loop. Nevertheless, none of the receptor constructs was functional in terms of measurable conformational change upon receptor activation. In the second part of this thesis, the pharmacological effects of morphine and its metabolites were studied. The analgesic effects of morphine are mainly mediated via the activation of the µ opioid receptor. This receptor activates inhibitory G-proteins and induces the recruitment of β-arrestin2. Therefore I analyzed activation of these two pathways induced by morphine metabolites using FRET-microscopy in living cells. Furthermore, radioligand binding studies were used to determine the affinity of each compound to the human µ-opioid receptor. This approach identified two groups of metabolites, which were classified into strong and weak ligands. Strong partial agonists showed efficacies in the nanomalar range. In contrast, weak metabolites activated µ opioid receptor pathways in the micromolar range. Normorphine, morphine-6-glucuronide and 6 acetylmorphine had lower potencies regarding Gi-protein activation but higher potencies and efficacies for β-arrestin2 recruitment than morphine. These findings indicate that these metabolites are biased towards β-arrestin2 pathways.
KW  - Opiatrezeptor
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - Morphin
KW  - Stoffwechsel
KW  - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
KW  - Mikroskopie
KW  - Metabolite von Morphin
KW  - Metabolismus
KW  - Metabolites of morphine
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71009
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hommers, Leif
T1  - Über die Interaktion aktivierter G-Proteine mit G-Protein gekoppelten Rezeptoren
T1  - Interaction of activated G Protein with activated G Protein coupled receptors
N2  - Aktivierte G-Protein gekoppelte Rezeptoren aktivieren heterotrimere GProteine, in dem sie den Austausch von GDP zu GTP am G-Protein katalysieren. Theoretische Untersuchungen mittels eines vereinfachten kinetischen Modells des Gi/o-Protein Zyklus legen nahe, dass nicht nur GDP-,sondern auch GTP-gebundene Gi/o-Proteine mit aktivierten α2A-adrenergen Rezeptoren (α2A-AR) interagieren können. Demgemäß sollten aktivierte Gi/o-Proteine mit aktivierten α2A-AR vermehrt interagieren, wenn mehr α2A-AR aktiviert werden als für eine maximale G-Protein Aktivierung nötig sind. Dies sollte zu einer paradoxen Deaktivierung von Gi/o-Proteinen und deren Effektorproteinen, z.B. dem G-Protein gekoppelten, einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanal (GIRK-Kanal) führen. Mittels FRET lässt sich in lebenden und in permeabilisierten Zellen unter Kontrolle der intrazellulären Nukleotide die Aktivierung von α2A-AR, die Interaktion von Gi/o-Proteinen mit α2A-AR und die Aktivierung von Gi/o-Proteinen bestimmen. Die Arbeit zeigt auf mehreren Ebenen, dass Go-Proteine mit aktivierten α2A-AR interagieren und im nukleotidfreiem Zustand sequestriert werden können: (I) Go-Proteine,irreversibel durch GTPγS aktiviert werden abhängig von der Rezeptor Aktivierung in Abwesenheit von Nukleotiden deaktiviert, (II) Go-Proteine interagieren in Gegenwart niedriger Nukleotidkonzentrationen in wesentlich größer Fraktion mit aktivierten α2A-AR als in Gegenwart hoher Nukleotidkonzentrationen, (III) Go Proteine können in Gegenwart niedriger GTP und GTPγS-Konzentrationen bei Aktivierung des α2A-AR inaktiviert werden. Die Arbeit zeigt exemplarisch an der Signalkaskade des α2A-AR und Go, dass der G-Protein Zyklus in lebenden Zellen reversibel ist, woraus eine Deaktivierung aktivierter G-Proteine und aktivierter G-Protein Effektoren resultieren kann. Dies erklärt paradoxe Befunde zur Deaktivierung von GIRK-Kanälen in Myozyten durch A1-Rezeptoren.
N2  - G protein coupled receptors activate heterotrimeric G proteins by catalyzing the exchange of GDP with GTP at the Gα subunit. Kinetic modelling of the Gi/o protein cycle suggests, that both GDP- and GTP-bound Gi/o proteins interact with activated α2A-adrenergic receptors (α2A-AR). Consequently, upon activating more α2A-AR then required for maximal Gi/o protein activation, the interaction of activated Gi/o proteins with activated α2A-AR will become incresingly prominent and ultimately lead to a paradoxic deactivation of Gi/o proteins and their effectors such as G protein coupled inwardly rectifying potassium channels. Using means of FRET allows the detection of the receptor activation, receptor/G protein interaction and G protein activation in single living cells and in single permeabilized cells while controlling the intracellular nucleotide composition.Data suggest, that activated Go proteins may be sequestrated at activated α2A-AR in their nucleotide-free state: (I) Go proteins irreversibly activated by GTPγS become inactivated upon receptor stimulation in the absence of nucleotides, (II) Go proteins interact with activated α2A-AR to a large extent in the presence of low concentrations of nucleotide, (III) Go proteins may be inactivated upon activation of α2A-AR in the presence of low concentrations of GTP or GTPγS. Taken together, the data demonstrate the reversibility of the G protein cycle in living cells for the paradigm α2A-AR/Go pathway. The data thereby explain the paradoxic inactivation of G protein coupled inwardly rectifying potassium channels in myocytes upon activation of adenosine A1 receptors.
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - G protein coupled receptor
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56576
ER  -