TY  - THES
A1  - Iosip, Anda-Larisa
T1  - Molecular Mechanosensing Mechanisms of the Carnivorous Plant \(Dionaea\) \(muscipula\)
T1  - Molekulare Mechanismen der Mechanoperzeption in der fleischfressenden Pflanze \(Dionaea\) \(muscipula\)
N2  - Plants are able to sense mechanical forces in order to defend themselves against predators,
for instance by synthesizing repellent compounds. Very few plants evolved extremely sensitive
tactile abilities that allow them to perceive, interpret and respond by rapid movement in the
milliseconds range. One such rarity is the charismatic Venus flytrap (Dionaea muscipula) - a
carnivorous plant which relies on its spectacular active trapping strategy to catch its prey. The
snapping traps are equipped with touch-specialised trigger hairs, that upon bending elicit an
action potential (AP). This electrical signal originates within the trigger hairs’ mechanosensory
cells and further propagates throughout the whole trap, alerting the plant of potential prey.
Two APs triggered within thirty seconds will set off the trap and more than five APs will
initiate the green stomach formation for prey decomposition and nutrient uptake. Neither
the molecular components of the plant’s AP nor the Venus flytrap’s fast closure mechanism
have been fully elucidated yet. Therefore, the general objective of this study is to expound
on the molecular basis of touch perception: from AP initiation to trap closure and finally to
stomach formation.

The typical electrical signal in plants lasts for minutes and its shape is determined by the
intensity of the mechanical force applied. In contrast, the Venus flytrap’s one-second AP is of
all-or-nothing type, similar in shape to the animal AP. In order to gain more insight into the
molecular components that give rise to the Venus flytrap’s emblematic AP, the transcriptomic
landscape of its unique mechanotransducer - the trigger hair – was compared to the rest
of the non-specialised tissues and organs. Additionally, the transcriptome of the electrically
excitable fully-developed adult trap was compared to non-excitable juvenile traps that are
unable to produce sharp APs. Together, the two strategies helped with the identification of
electrogenic channels and pumps for each step of the AP as follows: (1) the most specific to
the trigger hair was the mechanosensitive channel DmMSL10, making up the best candidate for
the initial AP depolarization phase, (2) the K+ outward rectifier DmSKOR could be responsible
for repolarisation, (3) further, the proton pump DmAHA4, might kick in during repolarisation
and go on with hyperpolarisation and (4) the hyperpolarization- and acid-activated K+ inward
rectifier KDM1 might contribute to the re-establishment of electrochemical gradient and
the resting potential. Responsible for the AP-associated Ca2+ wave and electrical signal
propagation, the glutamate-like receptor DmGLR3.6 was also enriched in the trigger hairs.
Together, these findings suggest that the reuse of genes involved in electrical signalling in
ordinary plants can give rise to the Venus flytrap’s trademark AP.

The Venus flytrap has been cultivated ever since its discovery, generating more than one
hundred cultivars over the years. Among them, indistinguishable from a normal Venus flytrap
at first sight, the ’ERROR’ cultivar exhibits a peculiar behaviour: it is unable to snap its traps
upon two APs. Nevertheless, it is still able to elicit normal APs. To get a better understanding
of the key molecular mechanisms and pathways that are essential for a successful trap closure,
the ’ERROR’ mutant was compared to the functional wild type.
Timelapse photography led to the observation that the ’ERROR’ mutants were able to leisurely
half close their traps when repeated mechanostimulation was applied (10 minutes after 20
APs, 0.03 Hz). As a result of touch or wounding in non-carnivorous plants, jasmonic acid
(JA) is synthesized, alerting the plants of potential predators. Curiously, the JA levels were reduced upon mechanostimulation and completely impaired upon wounding in the ’ERROR’
mutant. In search of genes accountable for the ’ERROR’ mutant’s defects, the transcriptomes
of the two phenotypes were compared before and after mechanostimulation (1h after 10
APs, 0.01 Hz). The overall dampened response of the mutant compared to the wild type,
was reflected at transcriptomic level as well. Only about 50% of wild type’s upregulated
genes after touch stimulation were differentially expressed in ’ERROR’ and they manifested
only half of the wild type’s expression amplitude. Among unresponsive functional categories
of genes in ’ERROR’ phenotype, there were: cell wall integrity surveilling system, auxin
biosynthesis and stress-related transcription factors from the ethylene-responsive AP2/ERF and
C2H2-ZF families. Deregulated Ca2+-decoding as well as redox-related elements together with
JA-pathway components might also contribute to the malfunctioning of the ’ERROR’ mutant. As
the mutant does not undergo full stomach formation after mechanical treatment, these missing
processes represent key milestones that might mediate growth-defence trade-offs under JA
signalling. This confirms the idea that carnivory has evolved by recycling the already available
molecular machineries of the ubiquitous plant immune system.

To better understand the mutant’s defect in the trap snapping mechanism, the ground states
(unstimulated traps) of the two phenotypes were compared. In this case, many cell wall-related
genes (e.g. expansins) were downregulated in the ’ERROR’ mutant. For the first time, these
data point to the importance of a special cell wall architecture of the trap, that might confer
the mechanical properties needed for a functional buckling system - which amplifies the speed
of the trap closure.

This study provides candidate channels for each of the AP phases that give rise to and shape
the sharp Venus flytrap-specific AP. It further underlines the possible contribution of the cell
wall architecture to the metastable ready-to-snap configuration of the trap before stimulation
- which might be crucial for the buckling-dependent snapping. And finally, it highlights
molecular milestones linked to defence responses that ensure trap morphing into a green
stomach after mechanostimulation. Altogether, these processes prove to be interdependent
and essential for a successful carnivorous lifestyle.
N2  - Pflanzen sind in der Lage, mechanische Einflüsse zu spüren, um sich gegen Fressfeinde zu
verteidigen, indem sie zum Beispiel abweisende Verbindungen synthetisieren. Nur sehr wenige
Pflanzen haben extrem sensible taktile Fähigkeiten entwickelt, die es ihnen ermöglichen,
schnelle Bewegungen im Millisekundenbereich wahrzunehmen, zu interpretieren und darauf
zu reagieren. Eine solche Rarität ist die charismatische Venusfliegenfalle (Dionaea muscipula)
- eine fleischfressende Pflanze, die sich auf ihre spektakuläre aktive Fallenstrategie verlässt,
um ihre Beute zu fangen. Die Schnappfallen sind mit berührungssensitiven Auslösehaaren
ausgestattet, die beim Biegen ein Aktionspotenzial (AP) auslösen. Dieses elektrische
Signal entsteht in den mechanosensorischen Zellen der Auslösehaare und breitet sich in
der gesamten Falle aus, wodurch die Pflanze auf potenzielle Beute aufmerksam gemacht
wird. Zwei APs, die innerhalb von dreißig Sekunden ausgelöst werden, lösen die Falle aus,
und mehr als fünf APs leiten die Bildung des grünen Magens ein, der die Beute zersetzt
und die Nährstoffe aufnimmt. Weder die molekularen Komponenten des AP der Pflanze
noch der Schnellverschlussmechanismus der Venusfliegenfalle sind bisher vollständig geklärt.
Daher besteht das allgemeine Ziel dieser Studie darin, die molekularen Grundlagen der
Berührungswahrnehmung zu erforschen: von der Initiierung des AP bis zum Schließen der
Falle und schließlich zur Magenbildung.

Das typische elektrische Signal in Pflanzen dauert Minuten und seine Form wird durch
die Intensität der angewandten mechanischen Kraft bestimmt. Im Gegensatz dazu ist das
einsekündige AP der Venusfliegenfalle vom Alles-oder-Nichts-Typ und ähnelt in seiner Form
dem tierischen AP. Um mehr Einblick in die molekularen Komponenten zu erhalten, die
das emblematische AP der Venusfliegenfalle hervorbringen, wurde das Transkriptom ihres
einzigartigen Mechanosensors - des Triggerhaars - mit den übrigen nicht spezialisierten
Geweben und Organen verglichen. Darüber hinaus wurde das Transkriptom der elektrisch
erregbaren, voll entwickelten adulten Falle mit nicht erregbaren juvenilen Fallen verglichen,
die keine scharfen APs erzeugen können. Beide Strategien zusammen halfen bei der
Identifizierung von elektrogenen Kanälen und Pumpen für jeden Schritt des AP: (1) Am
spezifischsten für die Triggerhaare war der mechanosensitive Kanal DmMSL10, der der beste
Kandidat für die anfängliche AP-Depolarisationsphase war, (2) der K+-Auswärtsgleichrichter
DmSKOR könnte für die Repolarisation verantwortlich sein, (3) ferner, die H+-Pumpe DmAHA4,
könnte während der Repolarisation einsetzen und mit der Hyperpolarisation fortfahren und
(4) der durch Hyperpolarisation und Säure aktivierte K+-Einwärtsgleichrichter KDM1 könnte
zur Wiederherstellung des elektrochemischen Gradienten und des Ruhepotentials beitragen.
Der möglicherweise für die AP-assoziierte Ca2+-Welle und die elektrische Signalausbreitung
verantwortliche Glutamatrezeptor DmGLR3.6 war ebenfalls in den Triggerhaaren angereichert.
Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Wiederverwendung von
Genen, die an der elektrischen Signalübertragung in gewöhnlichen Pflanzen beteiligt sind, zu
dem für die Venusfliegenfalle typischen AP führen kann.

Die Venusfliegenfalle wird seit ihrer Entdeckung kultiviert und hat im Laufe der Jahre mehr
als hundert Kultivare hervorgebracht. Die Sorte "ERROR", die auf den ersten Blick nicht von
einer normalen Venusfliegenfalle zu unterscheiden ist, weist ein besonderes Verhalten auf:
Sie ist nicht in der Lage, ihre Fallen nach dem Auslösen von 2 APs zu schließen. Dennoch ist sie in der Lage, normale APs auszulösen. Um ein besseres Verständnis der molekularen
Schlüsselmechanismen und -wege zu erhalten, die für ein erfolgreiches Schließen der Fallen
notwendig sind, wurde die "ERROR"-Mutante mit dem funktionalen Wildtyp verglichen.

Zeitrafferaufnahmen führten zu der Beobachtung, dass die ’ERROR’-Mutanten in der Lage
waren, ihre Fallen bei wiederholter mechanischer Stimulation (10 Minuten nach 20 APs,
0,03 Hz) sehr langsam etwa zur Hälfte zu schließen. Bei nicht karnivoren Pflanzen
wird infolge von Berührungen oder Verletzungen Jasmonsäure (JA) synthetisiert, die die
Pflanzen vor potenziellen Fressfeinden warnt. Merkwürdigerweise waren die JA-Spiegel
bei mechanischer Stimulation reduziert und bei Verwundung in der "ERROR"-Mutante im
Gegensatz zum WT überhaupt nicht erhöht. Auf der Suche nach Genen, die für die
Defekte der "ERROR"-Mutante verantwortlich sind, wurden die Transkriptome der beiden
Phänotypen vor und nach der Mechanostimulation (1 Stunde nach 10 APs, 0,01 Hz) verglichen.
Die insgesamt gedämpfte Reaktion der Mutante im Vergleich zum Wildtyp spiegelte sich
auch auf transkriptomischer Ebene wider. Nur etwa 50 % der nach Berührungsstimulation
hochregulierten Gene des Wildtyps wurden in "ERROR" unterschiedlich exprimiert, und sie
wiesen nur die Hälfte der Expressionsamplitude des Wildtyps auf. Zu den nicht reagierenden
funktionellen Genkategorien gehörten: das System zur Überwachung der Zellwandintegrität,
die Auxin-Biosynthese und stressbezogene Transkriptionsfaktoren aus den auf Ethylen
reagierenden AP2/ERF- und C2H2-ZF-Familien. Deregulierte Ca2+-decodierende sowie
redoxbezogene Elemente könnten zusammen mit Komponenten des JA-Signalwegs ebenfalls
zur Fehlfunktion der "ERROR"-Mutante beitragen. Da die Mutante nach mechanischer
Behandlung keine vollständige Magenbildung durchläuft, stellen diese fehlenden Prozesse
wichtige Meilensteine dar, die bei der JA-Signalübertragung einen Kompromiss zwischen
Wachstum und Verteidigung vermitteln könnten. Dies bestätigt die Idee, dass sich Karnivorie
durch die Wiederverwertung bereits vorhandener Signalwege und -komponenten entwickelt
hat.

Um den Defekt der Mutante im Fallenschnappmechanismus besser zu verstehen, wurden die
Grundzustände (unstimulierte Fallen) der beiden Phänotypen verglichen. In diesem Fall waren
viele zellwandbezogene Gene (z. B. Expansine) in der "ERROR"-Mutante herunterreguliert.
Diese Daten weisen zum ersten Mal auf die Bedeutung einer speziellen Zellwandarchitektur
der Falle hin, die möglicherweise die mechanischen Eigenschaften für ein Umklappen der
Fallenhälften verleiht, was wiederum die Geschwindigkeit des Fallenschlusses erhöht.

Diese Studie liefert Kandidatenkanäle für jede der AP-Phasen, die das scharfe
Venusfliegenfallen-spezifische AP hervorbringen und formen. Sie unterstreicht außerdem den
möglichen Beitrag der Zellwandarchitektur zur metastabilen, schnappbereiten Konfiguration
der Falle vor der Stimulation - die für das durch das Umklappen der Fallenhälften bedingte
Zuschnappen der Falle entscheidend sein könnte. Und schließlich werden molekulare
Meilensteine hervorgehoben, die mit Abwehrreaktionen verbunden sind und dafür sorgen,
dass sich die Falle nach mechanischer Stimulation in einen grünen Magen verwandelt.
Insgesamt erweisen sich diese Prozesse als voneinander abhängig und wesentlich für eine
erfolgreiche fleischfressende Lebens-weise.
KW  - carnivorous plants
KW  - action potential
KW  - trap closure
KW  - jasmonic acid
KW  - mechanosensation
KW  - touch
KW  - molecular pathways
KW  - wounding
KW  - defence mechanisms
KW  - transcriptomics
KW  - Venusfliegenfalle
KW  - Dionaea muscipula
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-287649
ER  - 
TY  - THES
A1  - Böhm, Jennifer
T1  - Die Nährstoffresorption in den Fallen von Dionaea muscipula weist Parallelen zur Nährsalzaufnahme in Wurzeln auf
T1  - Uptake of prey-derived nutrients in Dionaea muscipula traps displays similarities with the uptake of soil-derived nutrients into roots of non-carnivorous plants
N2  - Die Venusfliegenfalle, Dionaea muscipula, weckte aufgrund ihrer karnivoren Lebensweise schon sehr früh das Interesse vieler Wissenschaftler. Für karnivore Pflanzen, die auf Nährstoff-armen Böden wachsen, spielen Insekten als Beute und somit als Nährstofflieferant eine entscheidende Rolle. So können die Pflanzen durch die Verdauung der Beute mit wichtigen Makro- und Mikronährstoffen, wie Stickstoff, Phosphat, Kalium oder Natrium versorgt werden. Aus diesem Grund sollte im Rahmen meiner Arbeit ein besonderes Augenmerk auf die molekularen Mechanismen der Kationenaufnahme während der Nährstoffresorption gerichtet werden. Insbesondere die aus dem Insekt stammenden Nährstoffe Kalium und Natrium waren dabei von großem Interesse. 
Im Allgemeinen sind Kaliumionen für Pflanzen eine essentielle anorganische Substanz und von großer physiologischer Bedeutung für die Entwicklung, den Metabolismus, die Osmoregulation, das Membranpotential und viele zelluläre Prozesse. Analysen der Kaliumaufnahme an Wurzeln von Modellpflanzen wie Arabidopsis thaliana und Reis zeigten, dass die Aufnahme von K+ ein Zusammenspiel von hoch-affinen K+-Transportern der HAK5-Familie und nieder-affinen Kaliumkanälen (AKT1/AtKC1) erfordert, die in ein komplexes 
(De-)Phosphorylierungsnetzwerk eingebunden sind. In der vorliegenden Arbeit war es mir möglich das Netzwerk zur Kaliumaufnahme in den Drüsen der Venusfliegenfalle zu entschlüsseln. Es konnten Orthologe zum Kaliumtransporter HAK5 aus Arabidopsis (DmHAK5) und zum Kaliumkanal AKT1 (DmKT1) identifiziert und im heterologen Expressionssystem der Xenopus laevis Oozyten elektrophysiologisch charakterisiert werden. Dabei zeigte sich, das DmKT1 durch einen Ca2+-Sensor/Kinase-Komplex aus der CBL/CIPK-Familie phosphoryliert und somit aktiviert wird. Phylogenetische Analysen von DmKT1 bestätigten die Eingruppierung dieses Kaliumkanals in die Gruppe der pflanzlichen Shaker-Kaliumkanäle des AKT1-Typs. Die Transporteigenschaften zeigten zudem, dass DmKT1 bei hyperpolarisierenden Membranpotentialen aktiviert wird und einen K+-selektiven Einwärtsstrom vermittelt. In Oozyten konnte eine Kaliumaufnahme bis zu einer externen Konzentration von ≥1 mM beobachtet werden. DmKT1 repräsentiert also einen Kaliumkanal mit einer hohen Transportkapazität, der die nieder-affine Kaliumaufnahme in die Drüsenzellen der Venusfliegenfalle vermitteln kann. 
Unterhalb einer externen Kaliumkonzentration von 1 mM würde der anliegende elektrochemische Kaliumgradient einen Kaliumausstrom und somit einen Verlust von Kalium favorisieren. Hoch-affine K+/H+-Symporter können durch die Ausnutzung des Protonengradienten eine Kaliumaufnahme im mikromolaren Bereich gewährleisten. In Wurzelhaaren von Arabidopsis vermittelt der Transporter AtHAK5 die Kaliumaufnahme unter Kaliummangelbedingungen. DmHAK5, ein Ortholog zu AtHAK5, ist in Dionaea Drüsen exprimiert und konnte zum ersten Mal im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten im Detail charakterisiert werden. Interessanterweise zeigte sich, dass DmHAK5 wie der K+-Kanal DmKT1 durch denselben CBL/CIPK-Komplex posttranslational reguliert und aktiviert wird. Die Transporteigenschaften von DmHAK5 wiesen auf einen Transporter mit einer breiten Substratspezifität hin, sodass sich DmHAK5 neben Kalium auch für Ammonium permeabel zeigte. Affinitätsuntersuchungen von DmHAK5 zu seinem Substrat Kalium klassifizierten das Protein als einen hoch-affinen Kaliumtransporter, der im Symport mit Protonen die Kaliumaufnahme im mikromolaren Konzentrationsbereich vermitteln kann. 
Das Kaliumtransportmodul besteht also aus dem K+-selektiven Kanal DmKT1 und dem 
K+/H+-Symporter DmHAK5, die die hoch- und nieder-affine Kaliumaufnahme in den Drüsenzellen während der Beuteverdauung in Dionaea muscipula Fallen ermöglichen. Beide Transportmodule werden Kalzium-abhängig durch die Kinase CIPK23 und den Ca2+-Sensor CBL9 auf posttranslationaler Ebene reguliert.
Zusammenfassend gelang es in dieser Arbeit Einblicke in die Kationenaufnahme während der Nährstoffresorptionsphase der Venusfliegenfalle, Dionaea muscipula, zu gewinnen. Dabei wurde klar, dass Dionaea muscipula im Laufe ihrer Evolution zu einer karnivoren Pflanze, nicht neue Transportmodule zur Nährstoffresorption aus der Beute entwickelte, sondern bekannte aus Wurzeln stammende Transportmodule umfunktionierte. Auf molekularer Ebene konnten die biophysikalischen Charakteristika der K+- und Na+-Transportproteine, sowie ihre Regulation entschlüsselt werden. Diese Erkenntnisse wurden schließlich in den Kontext des Beutefangs der Venusfliegenfalle gebracht und diskutiert.
N2  - The Venus flytrap, Dionaea muscipula, is one of the most exciting carnivorous plants. Since the time of Charles Darwin, scientists are interested in the highly specialized mechanisms, which enable Dionaea plants to grow on nutrient-poor habitats. These Dionaea plants have the possibility to catch insects and to purchase the necessary nutrients from their prey. For catching the prey, the Venus flytrap evolved morphological adaptions in form of bilobed leaf traps. Trigger hairs are arranged inside the traps and by touching these mechano-sensory organs an electrical signal spreading over the lobes leads to the fast trap-closure. By continual mechanical stimulation of the trigger hairs by the caught insect, the edges of the lobes are sealed hermetically and an “external stomach” is formed. The prey digestion starts with the secretion of lytic enzymes from the glands. These glands, which are covering the inner surface of the trap-lobes, are also responsible for the nutrient-uptake. 
Insects represent an important nutrient-provider for carnivorous plants. The capture of prey mainly contributes to the nutrient-supply like nitrogen, phosphorous, potassium and sodium. Within the scope of this work, my focus was on the molecular uptake mechanism of prey-derived cations, such as potassium and sodium. 
Potassium is an essential macronutrient for plants in general. Studies on the K+ uptake systems in roots revealed a complex potassium uptake network consisting of high-affinity uptake carriers such as HAK5 and low-affinity potassium channels such as the AKT1/AtKC1 module. In glands of Dionaea muscipula a HAK5-like potassium transporter (DmHAK5) and an orthologue of AKT1 (DmKT1) were identified within the framework of my Ph.D.-thesis. Following the heterologous expression in Xenopus laevis oocytes, electrophysiological measurements revealed that DmKT1 is activated by phosphorylation through a Ca2+-sensor-protein kinase complex of the CBL/CIPK family. Its transport properties and structural homology to the Arabidopsis AKT1 K+ channel classified DmKT1 as a member of the hyperpolarisation-activated, inwardly rectifying plant Shaker potassium channel family. Due to the electrochemical gradient for K+ ions across the gland plasma membrane, the K+ selective channel DmKT1 can acquire external K+ down to concentrations of 1 mM. Thus, the peculiar electrophysiological properties assigned the low-affinity high-capacity potassium uptake system in Dionaea gland to DmKT1. 
Below 1 mM, K+ fluxes reverse their direction and the plant would lose the essential macronutrient. In root hairs of Arabidopsis high-affinity transporters (HAK5) are expressed which are believed to facilitate K+ accumulation from potassium depleted soils. Interestingly an orthologue of HAK5 was shown to be expressed also in the trap lobes of Dionaea. Thus, DmHAK5 was cloned and for the first time a HAK5-like protein could be analysed in Xenopus oocytes. Interestingly, DmHAK5 K+/H+-co-transporter was post translationally activated by the same CBL/CIPK complex just like the DmKT1 Shaker channel. Compared to DmKT1, DmHAK5 is of low selectivity and against all assumptions, the transporter is permeable for and not inhibited by NH4+. A Km value of 127 μM, describes DmHAK5 as a high-affinity transporter that is apparently the only system capable of operating at micromolar K+ concentrations. To overcome the outward-directed chemical gradient at low external K+ concentrations, DmHAK5 utilises the electrochemical gradient of protons and acts as a K+/H+-co-transporter. The reported findings demonstrate the contribution of DmKT1 and DmHAK5 in the highly regulated potassium uptake network utilizing K+ from captured insects. The high-capacity of DmKT1 and the high-affinity of DmHAK5 enable Dionaea glands to acquire potassium from high to very low levels during the digestion and resorption process. 
Taken together, these studies elucidated the molecular origin and regulation of cation uptake during prey digestion and nutrient resorption of the Venus flytrap. For efficient potassium and sodium uptake into gland cells Dionaea muscipula co-opted root-derived transport modules and the associated regulatory components rather than inventing new uptake systems during its evolution to a carnivorous plant.
KW  - Venusfliegenfalle
KW  - Dionaea muscipula
KW  - HAK5-like
KW  - AKT1-like
KW  - HKT1-like
KW  - Falle
KW  - Nährstoffaufnahme
KW  - Molekularbiologie
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-123958
ER  -