TY  - THES
A1  - Duan, Xiaodong
T1  - Development of new channelrhodopsin versions with enhanced plasma membrane targeting and high calcium/sodium conductance
T1  - Entwicklung neuer Channelrhodopsin-Versionen mit verbessertem Plasmamembrantargeting und hoher Na+- und Ca2+-Leitfähigkeit
N2  - The technique to manipulate cells or living animals by illumination after gene transfer of light-sensitive proteins is called optogenetics. Successful optogenetics started with the use of the light-gated cation channel channelrhodopsin-2 (ChR2). After early demonstrations of the power of ChR2, further light-sensitive ion channels and ion pumps were recruited to the optogenetic toolbox. Furthermore, mutations and chimera of ChR2 improved its versatility.
However, there is still a need for improved optogenetic tools, e.g. with higher permeability for calcium or better expression in the plasma membrane. In this thesis, my work focuses on the design of highly functional channelrhodopsins with enhanced Na+ and Ca2+ conductance.
First, I tested different N-terminal signal peptides to improve the plasma membrane targeting of Channelrhodopsins. We found that a N-terminal peptide, named LR, could improve the plasma membrane targeting of many rhodopsins. Modification with LR contributed to three to ten-fold larger photocurrents (than that of the original version) of multiple channelrhodopsins, like ChR2 from C. reinhardtii (CrChR2), PsChR, Chrimson, CheRiff, CeChR, ACRs, and the light-activated pump rhodopsins KR2, Jaw, HR.
Second, by introducing point mutation, I could further improve the light sensitivity and photocurrent of different channelrhodopsins. For instance, ChR2-XXM 2.0, ChR2-XXL 2.0 and PsChR D139H 2.0 exhibited hundred times larger photocurrents than wild type ChR2 and they show high light sensitivity. Also, the Ca2+ permeable channelrhodopsins PsCatCh 2.0f and PsCatCh 2.0e show very large photocurrents and fast kinetics. In addition, I also characterized a novel bi-stable CeChR (from the acidophilic green alga Chlamydomonas eustigma) with a much longer closing time.
Third, I analysed the ion selectivity of different ChRs, which provides a basis for rational selection of channelrhodopsins for different experimental purposes. I demonstrate that ChR2, Chronos, Chrimson, CheRiff and CeChR are highly proton conductive, compared with wild type PsChR. Interestingly, Chronos has the lowest potassium conductance among these channelrhodopsins. Furthermore, I found that mutation of an aspartate in TM4 of ChR2 (D156) and PsChR (D139) to histidine obviously increased both the sodium and calcium permeability while proton conductance was reduced. PsChR D139H 2.0 has the largest sodium conductance of any published channelrhodopsin variants. Additionally, I generated PsCatCh 2.0e which exhibits a ten-fold larger calcium current than the previously reported Ca2+ transporting CrChR2 mutant CatCh.
In summary, my research work
1.) described strategies for improving plasma membrane trafficking efficiency of opsins;
2.) yielded channelrhodopsins with fast kinetics or high light sensitivity;
3.) provided optogenetic tools with improved calcium and sodium conductance.
We could also improve the performance of channelrhodopsins with distinct action spectra, which will facilitate two-color neural excitation, both in-vitro and in-vivo.
N2  - Die Technik, Zellen oder lebende Tiere nach dem Gentransfer lichtempfindlicher Proteine durch Belichtung zu manipulieren, wird als Optogenetik bezeichnet. Erfolgreiche Optogenetik begann mit der Verwendung des lichtgesteuerten Kationenkanals Channelrhodopsin-2 (ChR2). Nach frühen erfolgreichen Versuchen mit ChR2 wurden weitere lichtempfindliche Ionenkanäle und Ionenpumpen als optogenetische Werkzeuge etabliert. Darüber hinaus verbesserten Mutationen und Chimären von ChR2 seine Vielseitigkeit.
Es besteht jedoch immer noch ein Bedarf an verbesserten optogenetischen Werkzeugen, z. mit höherer Permeabilität für Calcium oder besserer Expression in der Plasmamembran. In dieser Arbeit beschäftige ich mich mit dem Design hochfunktioneller Channelrhodopsine mit verbesserter Na+- und Ca2+-Leitfähigkeit.
       Zuerst habe ich verschiedene N-terminale Signalpeptide getestet, um die Anreicherung von Channelrhodopsinen in der Plasmamembran (“Plasmamembran-Targeting”) zu verbessern. Wir fanden heraus, dass ein N-terminales Peptid namens LR das Plasmamembran-Targeting vieler Rhodopsine verbessern kann. Die Modifikation mit LR trug zu drei- bis zehnfach größeren Photoströmen (als die der Originalversion) von mehreren Channelrhodopsinen bei, wie ChR2 von C. reinhardtii (CrChR2), PsChR, Chrimson, CheRiff, CeChR, ACRs und der lichtaktivierten Pump-Rhodopsine KR2, Jaw, HR.
        Zweitens konnte ich durch Mutagenese die Lichtempfindlichkeit und/oder den Photostrom verschiedener Channelrhodopsine weiter verbessern. Beispielsweise zeigten ChR2-XXM 2.0, ChR2-XXL 2.0 und PsChR D139H 2.0 hundertmal größere Photoströme als Wildtyp-ChR2 und sie zeigen eine hohe Lichtempfindlichkeit. Auch die Ca2+-permeablen Kanalrhodopsine PsCatCh 2.0f und PsCatCh 2.0e zeigen sehr große Photoströme und eine schnelle Kinetik. Außerdem habe ich ein neues bistabiles CeChR (aus der azidophilen Grünalge Chlamydomonas eustigma) mit einer viel längeren Schließzeit charakterisiert.
Drittens analysierte ich die Ionenselektivität verschiedener ChRs, die eine Grundlage für die rationale Selektion von Channelrhodopsinen für verschiedene experimentelle Zwecke bietet. Ich zeige, dass ChR2, Chronos, Chrimson, CheRiff und CeChR im Vergleich zu Wildtyp-PsChR eine hohe Protonenleitfähigkeit aufweisen. Interessanterweise weist Chronos die niedrigste Kaliumleitfähigkeit unter diesen Channelrhodopsinen auf. Außerdem fand ich, dass die Mutation eines Aspartats in TM4 von ChR2 (D156) und PsChR (D139) zu Histidin offensichtlich sowohl die Natrium- als auch die Calciumpermeabilität erhöht, während die Protonenleitfähigkeit verringert ist. PsChR D139H 2.0 weist die größte Natriumleitfähigkeit aller veröffentlichten Channelrhodopsin-Varianten auf. Zusätzlich erzeugte ich PsCatCh 2.0e, das einen zehnmal größeren Calciumstrom als die zuvor berichtete Ca2+-transportierende CrChR2-Mutante CatCh aufweist.

          Zusammenfassend ergab meine Dissertationsarbeit:
1.) Strategien zur Verbesserung der Expression von Opsinen in der Plasmamembran;
2.) Gut exprimierende Channelrhodopsine mit schneller Kinetik oder hoher Lichtempfindlichkeit;
3.) Neue optogenetische Werkzeuge mit verbesserter Calcium- und Natriumleitfähigkeit.
Auch konnte ich die Leistung von Channelrhodopsinen mit unterschiedlichen Aktionsspektren verbessern, was die zweifarbige neuronale Anregung sowohl in vitro als auch in vivo erleichtern sollte.
KW  - Optogenetik
KW  - Channelrhodopsinen
KW  - optogenetic
KW  - channelrhodopsin
KW  - molecular engineering
KW  - voltage clamp
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-188397
ER  - 
TY  - THES
A1  - Reyer, Antonella
T1  - Charakterisierung des Channelrhodopsin-2 aus Chlamydomonas reinhardtii als nicht-invasives, optogenetisches Werkzeug zur funktionellen Analyse elektrischer Signale in Pflanzen
T1  - Characterisation of Channelrhodopsin-2 from Chlamydomonas reinhardtii as a non-invasiv, optogenetic tool for the functional analysis of electical signals in plants
N2  - Ebenso wie Tiere verfügen Pflanzen über die Fähigkeit elektrische Signale zu generieren. Dabei repräsentieren elektrische Signale – Membranpotentialänderungen an der Plasmamembran – die frühesten Antworten, welche an Pflanzenzellen im Zuge veränderter externer und intrinsischer Bedingungen beobachtet werden können. Stimuli wie Kälte, Hitze, Verwundung, Herbivorie und Pathogene, aber auch physiologische Prozesse, wie Wachstum und Bestäubung führen zur Änderung des Potentials der Plasmamembran pflanzlicher Zellen. Die meisten dieser Membranpotentialänderungen bestehen aus einer schnellen Depolarisation, gefolgt von einer Repolarisation des Membranpotentials, deren Kinetik, in Abhängigkeit des Stimulus hoch variabel sein kann. Das Wissen über die molekularen Grundlagen der Generierung und Weiterleitung elektrischer Signale in Pflanzen ist im Gegensatz zu Tieren nur wenig verstanden. Eine Ausnahme stellen ‚klassisch-erregbare‘ Pflanzen wie die Venusfliegenfalle oder die Mimose dar. In diesen Pflanzen führt ein Berührungsreiz zur Auslösung eines charakteristischen Aktionspotentials, welches in der Folge zu einer, auf differentiellen Turgoränderungen basierenden, nastischen Bewegung führt. In allen anderen Pflanzen ist die Kinetik der Membranpotentialänderungen sehr variabel, abhängig vom Stimulus und dem physiologischen Zustand der Zellen und – mit Ausnahme der Reaktion auf einen Kältestimulus – lediglich nach langen Latenzzeiten wiederholbar. Dieser Umstand verhindert eine systematische Analyse der molekularen Basis elektrischer Signale in den meisten Pflanzen. Ziel dieser Arbeit war es daher, auf der Basis des Channelrhodopsin-2 (ChR2) aus der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii, welches bereits seit 2005 in der Neurobiologie genutzt wird, ein nicht-invasives Werkzeug zur funktionellen Analyse elektrischer Signale in Pflanzen zu etablieren. ChR2 ist ein Blaulicht-aktivierter Kationenkanal, der für seine Funktion all trans-Retinal als Cofaktor benötigt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Varianten des ChR2, mit einem Schwerpunkt auf ChR2-C128T und vor allem ChR2-D156C, auch bekannt als ChR2-XXL eingesetzt. ChR2 konnte bereits durch M. Baumann im Rahmen ihrer Dissertation funktionell im transienten Expressionssystem Nicotiana benthamiana dargestellt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde das System weiter ausgebaut und die besonders aussichtsreichen ChR2-Varianten nicht nur in N. benthamiana, sondern auch in stabilen Arabidopsis thaliana Linien funktionell charakterisiert. Dabei konnte mit dem ChR2-XXL ein geeignetes optogenetisches Werkzeug zur Untersuchung elektrischer Signale in Pflanzen identifiziert werden. ChR2-XXL bietet die Möglichkeit das Membranpotential durch kurze, 5 s Blaulichtpulse im Mittel um 95 mV zu depolarisieren und im Anschluss die Repolarisationsphase zu untersuchen. Blaulicht-induzierbare, ChR2-XXL-vermittelte Depolarisationen konnten, reproduzierbar und beliebig oft an den gleichen Zellen wiederholt ausgelöst werden. Dadurch ermöglicht ChR2-XXL die bisher nur unzureichend bekannten molekularen Komponenten der Repolarisation des Membranpotentials in Pflanzen zu erforschen. In tierischen Zellen generieren spannungsabhängige Natriumkanäle die Depolarisation, während spannungsabhängige Kaliumkanäle die Depolarisationskinetik bestimmen. Die im Vergleich zu tierischen Zellen veränderten Ionengradienten lassen vermuten, dass die pflanzliche Depolarisation im Wesentlichen durch Ca2+-abhängige Anionenkanäle vermittelt wird, die durch den Efflux von Cl- das Membranpotential depolarisieren. Für die Repolarisation wird zum einen die Beteiligung von auswärtsgleichrichtenden Kaliumkanälen postuliert. Zum anderen wird auch eine Beteiligung der Plasmamembran (PM) H+-ATPasen vermutet, welche gleichzeitig einen essentiellen Beitrag zur Generierung des Ruhepotentials leisten. In der vorliegenden Arbeit wurde es durch den Einsatz von ChR2-XXL möglich, beide potentiellen Komponenten der Repolarisationsphase, Kaliumkanäle und PM H+-ATPasen, erstmals durch eine nicht-invasive, Anionen-unabhängige Methode der Depolarisation zu untersuchen. Durch den Einsatz von Mutanten und Kaliumkanalinhibitoren konnte ein möglicher Beitrag des auswärtsgleichrichtenden Kaliumkanals Arabidopsis thaliana GUARD CELL OUTWARD RECTIFYING K+ CHANNEL (AtGORK) an der Repolarisationsphase in Arabidopsis Mesophyllzellen nahezu ausgeschlossen werden. Der auswärtsgleichrichtende Kaliumkanal GORK öffnet erst bei Membranpotentialen positiv vom Gleichgewichtspotential für Kaliumionen (EK (-118 mV)). Da die ChR2-induzierbaren Depolarisationen ebenso wie viele natürliche Stimuli, diesen Wert kaum erreichen oder nur geringfügig überschreiten, leistet der GORK einen geringfügigen Beitrag bei der Repolarisation. Dies ließ vermuten, dass die Repolarisation von EK bis zum Ruhepotential bei ca. -180 mV dagegen möglicherweise durch die PM H+-ATPasen bewerkstelligt wird. Die Wirkung des PM H+-ATPase Inhibitors Natriumorthovanadat, sowie des PM H+-ATPase Aktivators Fusicoccin auf die Repolarisationsphase konnten diese Hypothese unterstützen. Die Hemmung der PM H+-ATPasen verlangsamte die Repolarisationskinetik während eine Aktivierung der PM H+-ATPasen diese beschleunigte. So wurde es erstmals möglich den genauen Einfluss der PM H+-ATPasen auf Wiederherstellung des Membranpotentials während der Repolarisation in Mesophyllzellen zu studieren. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass in Gegenwart des Kaliumkanalblockers Ba2+ die Repolarisation ebenfalls beschleunigt werden konnte. In Übereinstimmung mit dem ‚Pump-and-Leak‘-Modell (Alberts et al. 2002) deutet dies darauf hin, dass schwach einwärtsgleichrichtende Kaliumkanäle, wie der ARABIDOPSIS K+ TRANSPORTER 2 (AKT2) dem PM H+-ATPasen Protonengradienten entgegenwirken und somit das Ruhepotential aus der Summe der bewegten Ladungen von Pumpen und Kaliumkanälen bestimmt wird. Das mögliche Potenzial optogenetischer, Rhodopsin-basierter Werkzeuge für die molekulare Analyse elektrischer Signale, insbesondere unter Einsatz der breiten Palette lichtgesteuerter Pumpen und Kanäle, ihrer spektralen Diversität und ihrer Einkreuzung in ausgewählte Arabidopsis Mutanten wird diskutiert.
N2  - Like animals, plants have the ability to generate electrical signals – membrane potential changes on the plasma membrane. Electrical signals represent the earliest answers that can be observed in plant cells in the course of changing external and internal conditions. Stimuli such as cold, heat, wounding, herbivory and pathogens, as well as physiological processes such as growth and pollination, lead to changes in the potential of the plasma membrane of plant cells. Most of these membrane potential changes consist of rapid depolarization, followed by repolarization of the membrane potential, the kinetics of which can be highly variable depending on the stimulus. In contrast to animals, knowledge about the molecular basis of the generation and transmission of electrical signals in plants is poorly understood. Exceptions include "classically excitable plants" such as the Venus fly trap or mimosa, in which a touch stimulus leads to the triggering of a characteristic action potential, which subsequently leads to an elastic movement based on differential turgor changes. In all other plants, the kinetics of membrane potential changes are highly variable, depending on the stimulus and the physiological state of the cells and – with the exception of the reaction to a cold stimulus – can only be repeated after long latency periods. This prevents a systematic analysis of the molecular basis of electrical signals in most plants. The aim of this work was therefore to establish a non-invasive tool for the functional analysis of electrical signals in plants based on the channelrhodopsin-2 ChR2 from the green alga Chlamydomonas reinhardtii, which has been used in neurobiology since 2005. ChR2 is a blue light-activated cation channel that needed all-trans retinal as a cofactor in order to function. In this work, different variants of the ChR2, with a focus on C128T and especially D156C, also known as ChR2-XXL, were used. ChR2 could already be functionally represented by M. Baumann in the context of her dissertation in the transient expression system Nicotiana benthamiana. In the present work, the system was expanded and particularly promising ChR2 variants were characterized not only in N. benthamiana, but also in stable Arabidopsis thaliana lines. The ChR2-XXL identified a suitable optogenetic tool for examining electrical signals in plants. ChR2-XXL offers the possibility to depolarize the membrane potential by short, 5 s blue light pulses on average by 95 mV and then to investigate the repolarization phase. Blue light-inducible, ChR2-XXL-mediated depolarizations could be triggered reproducibly and repeatedly on the same cells as often as desired. ChR2-XXL enables research into the previously inadequate molecular components of the repolarization of the membrane potential in plants. In animal cells, voltage-dependent sodium channels generate depolarization, while voltage-dependent potassium channels determine the depolarization kinetics. The ion gradients changed compared to animal cells suggest that plant depolarization is essentially due to Ca2+-dependent anion channels, which depolarize the membrane potential through the efflux of Cl-. For repolarization, the involvement of outward rectifying potassium channels is postulated. On the other hand, participation of PM H+-ATPases is also suspected, which at the same time make an essential contribution to the generation of the resting potential. In the present work, the use of ChR2-XXL made it possible for the first time to investigate both potential components of the repolarization phase, potassium channels and PM H+-ATPases, using a non-invasive, anion-independent method of depolarization. Through the use of mutants and potassium channel inhibitors, a possible contribution of the outward rectifying potassium channel Arabidopsis thaliana GUARD CELL OUTWARD RECTIFYING K+ CHANNEL (GORK) to the repolarization phase in Arabidopsis mesophyll cells could almost be excluded. The outward-rectifying potassium channel GORK only opens at membrane potentials more positive than the equilibrium potential for potassium ions (EK (-118 mV)). Since the ChR2-inducible depolarizations, like many natural stimuli, hardly reach this value or only exceed it slightly, GORK makes a minor contribution to repolarization. This suggested that the repolarization from EK to the resting potential at approximately -180 mV, on the other hand, may be accomplished by PM H+-ATPases. The effects of the PM H+-ATPase inhibitor sodium orthovanadate and the PM H+-ATPase activator fusicoccin on the repolarization phase supported this hypothesis. The repolarization kinetics were slowed by inhibition of the PM H+-ATPases and accelerated by their activation. This made it possible for the first time to study the exact influence of the PM H+-ATPases on restoring the membrane potential during repolarization in mesophyll cells. It was also observed that repolarization could be accelerated in the presence of the potassium channel blocker Ba2+. In accordance with the 'pump-and-leak' model, this indicates that weakly inwardly-rectifying potassium channels, such as the Arabidopsis K+ Transporter 2 (AKT2) counteract the PM H+-ATPase-generated proton gradient and thus the resting potential from the sum of the moving charges of pumps and potassium channels is determined. The potential of optogenetic, rhodopsin-based tools for the molecular analysis of electrical signals, in particular using the wide range of light-controlled pumps and channels, their spectral diversity and their intersection with selected Arabidopsis mutants is discussed.
KW  - pflanzliche Elektrophysiologie
KW  - Channelrhodopsin-2
KW  - elektrische Signale
KW  - Arabidopsis thaliana
KW  - Optogenetik
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-218671
ER  - 
TY  - THES
A1  - Beck, Sebastian
T1  - Using optogenetics to influence the circadian clock of \(Drosophila\) \(melanogaster\)
T1  - Die Verwendung der Optogenetik zur Beeinflussung der circadianen Uhr von \(Drosophila\) \(melanogaster\)
N2  - Almost all life forms on earth have adapted to the most impactful and most predictable recurring change in environmental condition, the cycle of day and night, caused by the axial rotation of the planet. As a result many animals have evolved intricate endogenous clocks, which adapt and synchronize the organisms’ physiology, metabolism and behaviour to the daily change in environmental conditions. The scientific field researching these endogenous clocks is called chronobiology and has steadily grown in size, scope and relevance since the works of the earliest pioneers in the 1960s.
The number one model organism for the research of circadian clocks is the fruit fly, Drosophila melanogaster, whose clock serves as the entry point to understanding the basic inner workings of such an intricately constructed endogenous timekeeping system. In this thesis it was attempted to combine the research on the circadian clock with the techniques of optogenetics, a fairly new scientific field, launched by the discovery of Channelrhodopsin 2 just over 15 years ago. Channelrhodopsin 2 is a light-gated ion channel found in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. In optogenetics, researches use these light-gated ion channels like Channelrhodopsin 2 by heterologously expressing them in cells and tissues of other organisms, which can then be stimulated by the application of light. This is most useful when studying neurons, as these channels provide an almost non-invasive tool to depolarize the neuronal plasma membranes at will. The goal of this thesis was to develop an optogenetic tool, which would be able to influence and phase shift the circadian clock of Drosophila melanogaster upon illumination. A phase shift is the adaptive response of the circadian clock to an outside stimulus that signals a change in the environmental light cycle. An optogenetic tool, able to influence and phase shift the circadian clock predictably and reliably, would open up many new ways and methods of researching the neuronal network of the clock and which neurons communicate to what extent, ultimately synchronizing the network.
The first optogenetic tool to be tested in the circadian clock of Drosophila melanogaster was ChR2-XXL, a channelrhodopsin variant with dramatically increased expression levels and photocurrents combined with a prolonged open state. The specific expression of ChR2-XXL and of later constructs was facilitated by deploying the three different clock-specific GAL4-driver lines, clk856-gal4, pdf-gal4 and mai179-gal4. Although ChR2-XXL was shown to be highly effective at depolarizing neurons, these stimulations proved to be unable to significantly phase shift the circadian clock of Drosophila. The second series of experiments was conducted with the conceptually novel optogenetic tools Olf-bPAC and SthK-bPAC, which respectively combine a cyclic nucleotide-gated ion channel (Olf and SthK) with the light-activated adenylyl-cyclase bPAC. These tools proved to be quite useful when expressed in the motor neurons of instar-3 larvae of Drosophila, paralyzing the larvae upon illumination, as well as affecting body length. This way, these new tools could be precisely characterized, spawning a successfully published research paper, centered around their electrophysiological characterization and their applicability in model organisms like Drosophila. In the circadian clock however, these tools caused substantial damage, producing severe arrhythmicity and anomalies in neuronal development. Using a temperature-sensitive GAL80-line to delay the expression until after the flies had eclosed, yielded no positive results either. The last series of experiments saw the use of another new series of optogenetic tools, modelled after the Olf-bPAC, with bPAC swapped out for CyclOp, a membrane-bound guanylyl-cyclase, coupled with less potent versions of the Olf. This final attempt however also ended up being unsuccessful. While these tools could efficiently depolarize neuronal membranes upon illumination, they were ultimately unable to stimulate the circadian clock in way that would cause it to phase shift. 
Taken together, these mostly negative results indicate that an optogenetic manipulation of the circadian clock of Drosophila melanogaster is an extremely challenging subject. As light already constitutes the most impactful environmental factor on the circadian clock, the combination of chronobiology with optogenetics demands the parameters of the conducted experiments to be tuned with an extremely high degree of precision, if one hopes to receive positive results from these types of experiments at all.
N2  - Nahezu alle Lebewesen der Erde haben sich an den Tag-Nacht-Zyklus angepasst, die einflussreichste und verlässlichste wiederkehrende Veränderung der Umwelt-bedingungen, verursacht durch die axiale Rotation des Planeten. Daraus resultierend haben viele Tiere komplizierte innere Uhren entwickelt, welche ihre Physiologie, ihren Stoffwechsel und ihr Verhalten an die tägliche Veränderung der natürlichen Bedingungen anpassen. Das Wissenschaftsfeld, das sich der Erforschung dieser inneren Uhren widmet, wird Chronobiologie genannt und hat seit der Arbeit der ersten Pioniere ab 1960 stetig an Größe und Relevanz gewonnen. Der prominenteste Modellorganismus für die Erforschung der circadianen Uhr ist Drosophila melanogaster, deren Uhr als Ansatzpunkt dient, die grundlegenden Vorgänge eines derart komplexen, endogenen Taktsystems zu verstehen. 
In dieser Thesis wurde versucht die Forschung an der circadianen Uhr mit den Techniken der Optogenetik zu kombinieren, eines jungen Forschungsfeldes, welches durch die Entdeckung von Channelrhodpsin 2 vor über 15 Jahren eröffnet wurde. Channelrhodopsin 2 ist ein Licht-gesteuerter Ionenkanal, der in der Grünalge Chlamydomonas reinhardtii entdeckt wurde. In der Optogenetik nutzen Forscher diese Licht-gesteuerten Ionenkanäle, indem sie sie in den Zellen anderer Organismen exprimieren, welche dann durch Licht stimuliert werden können. Dies ist besonders nützlich bei der Untersuchung von Neuronen, da diese Kanäle ein nahezu nicht-invasives Werkzeug zur Depolarisation neuronaler Membranen bieten. Das Ziel dieser Thesis war es, ein optogenetisches Werkzeug zu entwickeln, welches die circadiane Uhr von Drosophila melanogaster durch Licht manipulieren und deren Phase verschieben kann. Eine Phasenverschiebung ist die adaptive Antwort der circadianen Uhr auf einen äußeren Reiz, welcher eine Veränderung des natürlichen Lichtzyklus signalisiert. Ein optogenetisches Werkzeug, das die Phase der inneren Uhr verlässlich verschieben kann, würde viele neue Möglichkeiten zur Erforschung des neuronalen Uhrnetzwerks eröffnen und wie die Neuronen miteinander kommunizieren um das Netzwerk zu synchronisieren. 
Das erste optogenetische Werkzeug das in der circadianen Uhr von Drosophila melanogaster getestet wurde war „ChR2-XXL“, eine Channelrhodopsin-Variante mit erhöhter Expression und Photoströmen, gepaart mit einem verlängerten geöffneten Zustand. Die spezifische Expression von ChR2-XXL und auch die späterer Konstrukte wurde durch die Verwendung der drei Uhr-spezifischen GAL4-Treiberlinien clk856-gal4, pdf-gal4 und mai179-gal4 bewerkstelligt. Obwohl bereits gezeigt wurde, dass ChR2-XXL höchst effektiv die Depolarisierung von Neuronen bewirkt, waren diese Stimulationen jedoch nicht in der Lage die Phase der circadianen Uhr von Drosophila signifikant zu verschieben. Die zweite Serie an Versuchen wurde mit den konzeptionell neuartigen optogenetischen Werkzeugen Olf-bPAC und SthK-bPAC durchgeführt, welche jeweils einen durch zyklische Nukleotide gesteuerten Ionenkanal (Olf und SthK) mit der Licht-gesteuerten Adenylatcyclase bPAC kombinieren. Diese Werkzeuge erwiesen sich als äußert nützlich, solange sie in den Motoneuronen von Drosophila-Larven im dritten Larvenstadium exprimiert wurden, wo sie bei Beleuchtung die Larven sowohl paralysierten, als auch deren Körperlänge beeinflussten. Auf diese Weise konnten diese neuen Werkzeuge präzise charakterisiert werden, was in der erfolgreichen Veröffentlichung eines Forschungsartikels mündete, welcher hauptsächlich von der elektrophysiologischen Charakterisierung der Werkzeuge handelte und von deren Anwendungsmöglichkeiten in Modellorganismen wie Drosophila. In der circadianen Uhr verursachten diese Werkzeuge jedoch substantielle Schäden und produzierten schwere Arrhythmie und Anomalien in der neuronalen Entwicklung. Die Verwendung einer temperatur-sensitiven GAL80-Linie um die Expression zu verzögern, erzeugte ebenfalls keinerlei positive Ergebnisse. Für die letzte Serie an Experimenten wurde eine weitere Reihe neuer optogenetischer Werkzeuge verwendet, orientiert an Olf-bPAC und SthK-bPAC, wobei bPAC durch die membrangebundene Guanylatcyclase „CyclOp“ ausgetauscht wurde, welche wiederrum mit weniger wirkstarken Olf-Varianten kombiniert wurde. Dieser letzte Ansatz scheiterte jedoch ebenfalls. Obwohl diese neuen Werkzeuge in der Lage waren die Neuronenmembran bei Beleuchtung effektiv zu depolarisieren, vermochten sie es letztendlich nicht eine Phasenverschiebung zu bewirken.
Zusammengenommen zeigen diese überwiegend negativen Ergebnisse, dass die optogenetische Manipulation der circadianen Uhr von Drosophila melanogaster ein extrem anspruchsvolles Thema ist. Da Licht bereits ohnehin den einflussreichsten Umweltfaktor für die circadiane Uhr darstellt, verlangt die Kombination von Chronobiologie und Optogenetik eine extrem präzise Feinabstimmung der Versuchsparameter, um überhaupt darauf hoffen zu dürfen, positive Ergebnisse mit derlei Versuchen zu erzeugen.
KW  - Chronobiologie
KW  - Optogenetik
KW  - Taufliege
KW  - Optogenetics
KW  - Chronobiology
KW  - Channelrhodopsin
KW  - Drosophila melanogaster
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184952
ER  - 
TY  - THES
A1  - Gao, Shiqiang
T1  - Characterizing new photoreceptors to expand the Optogenetic toolbox
T1  - Charakterisierung neuer Photorezeptoren zur Erweiterung der Optogenetik
N2  - Optogenetics is a method to control the cell activity with light by expression of a natural or engineered photoreceptor via genetic modification technology. Optogenetics early success came with the light-gated cation channel "Channelrhodopsin-2" in neurons and expanded from neuroscience to other research fields such as cardiac research and cell signaling, also due to the enrichment by new photoreceptors. In this study, I focus on searching and characterizing new photoreceptors to expand the optogenetic tool box. In this work I characterize three newly discovered microbial rhodopsins and some engineered mutants of them.
The first rhodopsin is a proton pump from the diatom Fragilariopsis cylindrus, Fragilariopsis Rhodopsin or abbreviated: FR. I cloned the full-length FR and proved it to be a light-activated proton pump with high efficacy in comparison to Bacteriorhodopsin (BR). During this study, I also developed a new method to improve the plasma membrane targeting of several microbial rhodopsins. I also obtained a FR mutant (channel-like FR or chFR) which behaves like a light-gated proton channel. FR can be used for optogenetic hyperpolarization or alkalization of a cell while the chFR could be used for depolarization or lowering of the cellular pH. The induction of FR expression under iron-limited conditions in the diatom indicated an alternative energy generation mechanism of F. cylindrus when iron-containing enzymes are scarce. 
I then characterized a new microbial rhodopsin with novel light-regulated Guanylyl Cyclase (GC) activity. This rhodopsin guanylyl cyclase from the fungus Blastocladiella emersonii (B.e. CyclaseOpsin or BeCyclOp) has been proven by me to be an efficient light-gated GC with high specificity and fast kinetics. BeCyclOp also has a novel structure with eight transmembrane helices, containing a long cytosolic N-terminus which participates in the tight regulation of the GC activity. In collaboration with Prof. Alexander Gottschalk (Univ. Frankfurt/M.), BeCyclOp has been tested in muscle cells and sensory neurons of Caenorhabditis elegans and proven to be a powerful optogenetic tool in a living animal. I also generated a BeCyclOp mutant with enhanced light sensitivity.
Already more than ten years ago, guanylyl cyclase rhodopsins were suggested to exist in Chlamydomonas reinhardtii by analyzing genomic sequence data. But until now no functional proof existed. By further cloning and sequencing I discovered such a rhodopsin with light-regulated guanylyl cyclase activity. This functional Cyclaseopsin (COP6c) is quite different to BeCyclOp, as it was proven to be a light-inhibited GC. Cop6c is much larger than BeCyclOp with a His-Kinase and a response regulator domain between the rhodopsin and the cyclase domain.
I also introduced a new strategy for generating optogenetic tools by fusing the photoactivated adenylyl cyclase bPAC to two different CNG channels. These new tools function via light-gated cAMP production and subsequent CNG channel activation. These tools combined the properties of bPAC (highly sensitive to blue light) and CNG channels (high single-channel conductance and high Ca2+ permeability), as demonstrated by expression in Xenopus oocytes. As a further benefit the fusing of bPAC to CNG channels leads to a bPAC with a more than tenfold reduced dark activity which is a valuable improvement for bPAC itself as an optogenetic tool.
N2  - Als Optogenetik wird die Technik bezeichnet, durch genetische Veränderung Photorezeptoren in Zellen einzubringen, um die Zellaktivität mit Licht zu steuern. Frühe Erfolge der Optogenetik wurden mit dem Licht-gesteuerten Kationenkanal "Channelrhodopsin-2" in Neuronen von lebenden Tieren erzielt. Die Anwendung erweiterte sich von den Neurowissenschaften zu anderen Forschungsfeldern, wie Herzforschung und Zellbiologie, auch durch die Bereicherung mit neuen Photorezeptoren. Hier konzentriere ich mich auf die Suche und Charakterisierung neuer Photorezeptoren. In dieser Arbeit werden drei neu entdeckte, natürliche mikrobielle Rhodopsine, sowie ausgewählte Mutanten, charakterisiert.
Das erste Rhodopsin ist eine Protonenpumpe aus der Kieselalge (Diatomee) Fragilariopsis cylindrus, Fragilariopsis-Rhodopsin, abgekürzt FR. Ich klonierte FR und bewies, dass FR eine Licht-aktivierte Protonenpumpe mit hoher Wirksamkeit ist. In dieser Studie zeige ich auch eine Methode, um die Plasmamembran-Lokalisation von FR und mehreren anderen Rhodopsinen zu verbessern. Ich identifizierte eine FR-Mutante (chFR), die sich wie ein Licht-gesteuerter Protonenkanal verhält. FR kann für die Licht-gesteuerte Hyperpolarisation oder Alkalisierung der Zelle verwendet werden, während chFR möglicherweise verwendet werden könnte, um den zellulären pH Licht-gesteuert abzusenken. Die Induktion der FR-Expression unter Eisenmangel-Bedingungen legt einen neuen Energieerzeugungsmechanismus von F. cylindrus nahe, wenn Eisen-haltige Enzyme in den Chloroplasten fehlen.
Ich habe dann ein neues mikrobielles Rhodopsin mit Licht-geregelter Guanylylcyclase (GC) Aktivität untersucht. Für dieses Cyclaseopsin aus dem Pilz Blastocladiella emersonii (BeCyclOp) konnte ich zeigen, dass es sich um eine effiziente lichtgesteuerte GC mit hoher Spezifität und schneller Kinetik handelt. BeCyclOp hat eine für ein Opsin neuartige Struktur mit acht Transmembranhelices. Für den langen cytosolischen N-Terminus zeigte ich eine Beteiligung an der Regulierung der GC-Aktivität. BeCyclOp wurde im Labor von Prof. A. Gottschalk (Univ. Frankfurt/M.) in den Muskelzellen und sensorischen Neuronen von Caenorhabditis elegans getestet und erwies sich als ein leistungsfähiges Werkzeug in optogenetisch veränderten, lebenden Tieren. Ich habe dann auch eine BeCyclOp Mutante mit verbesserter Lichtempfindlichkeit hergestellt.
Bereits vor über zehn Jahren wurden anhand genomischer Daten Guanylylcyclase-Rhodopsine in Chlamydomonas reinhardtii postuliert, konnten aber funktionell bisher nicht nachgewiesen werden. Durch Klonieren von verschiedenen Chlamydomonas reinhardtii Stämmen gelang es mir, solch ein Opsin (Cop6c) zu entdecken, dessen Guanylylcyclase-Aktivität eindeutig Licht-reguliert ist. COP6c ist ganz anders als BeCyclOp, nicht nur weil die GC-Aktivität durch Licht inhibiert wird. Außerdem ist Cop6c ein viel größeres Protein mit einer zusätzlichen His-Kinase-, sowie einer Transducer-Domäne zwischen der Rhodopsin- und der Cyclase-Domäne.
Schlussendlich zeige ich auch eine neue Strategie zur Erzeugung von optogenetischen Werkzeugen durch Fusion der Licht-aktivierten Adenylyl-Cyclase (AC) bPAC mit CNG-Kanälen. Diese neuen "Werkzeuge" funktionieren über Licht-gesteuerte cAMP-Produktion und die anschließende Aktivierung eines cAMP-sensitiven Kationen-(CNG-) Kanals. Hierbei werden die positiven Eigenschaften von bPAC (sehr empfindlich auf blaues Licht) und CNG-Kanälen (hohe Leitfähigkeit bei hoher Ca2+-Durchlässigkeit) kombiniert. Darüber hinaus konnte ich demonstrieren, dass  die Fusion der bPAC an den CNG-Kanal zu einer bPAC mit stark reduzierter AC-Aktivität im Dunkeln führte, was allein schon eine gute Verbesserung der bPAC als optogenetische Werkzeug ist.
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Y1  - 2017
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-112941
ER  -