TY - THES A1 - Huang, Shouguang T1 - Role of ABA-induced Ca\(^{2+}\) signals, and the Ca\(^{2+}\)-controlled protein kinase CIPK23, in regulation of stomatal movements T1 - Rolle von ABA-abhängigen Ca\(^{2+}\) Signalen, und der Ca\(^{2+}\)-gesteuerten Proteinkinase CIPK23, bei der Regulation der Spaltöffnungsbewegungen N2 - Stomata are pores in the leaf surface, formed by pairs of guard cells. The guard cells modulate the aperture of stomata, to balance uptake of CO2 and loss of water vapor to the atmosphere. During drought, the phytohormone abscisic acid (ABA) provokes stomatal closure, via a signaling chain with both Ca2+-dependent and Ca2+-independent branches. Both branches are likely to activate SLAC1-type (Slow Anion Channel Associated 1) anion channels that are essential for initiating the closure of stomata. However, the importance of the Ca2+-dependent signaling branch is still debated, as the core ABA signaling pathway only possesses Ca2+-independent components. Therefore, the aim of this thesis was to address the role of the Ca2+-dependent branch in the ABA signaling pathway of guard cells. In the first part of the thesis, the relation between ABA-induced Ca2+ signals and stomatal closure was studied, with guard cells that express the genetically encoded Ca2+-indicator R-GECO1-mTurquoise. Ejection of ABA into the guard cell wall rapidly induced stomatal closure, however, only in ¾ of the guard cells ABA evoked a cytosolic Ca2+ signal. A small subset of stomata (¼ of the experiments) closed without Ca2+ signals, showing that the Ca2+ signals are not essential for ABA-induced stomatal closure. However, stomata in which ABA evoked Ca2+ signals closed faster as those in which no Ca2+ signals were detected. Apparently, ABA-induced Ca2+ signals enhance the velocity of stomatal closure. In addition to ABA, hyperpolarizing voltage pulses could also trigger Ca2+ signals in wild type guard cells, which in turn activated S-type anion channels. However, these voltage pulses failed to elicit S-type anion currents in the slac1/slah3 guard cells, suggesting that SLAC1 and SLAH3 contribute to Ca2+-activated conductance. Taken together, our data indicate that ABA-induced Ca2+ signals enhance the activity of S-type anion channels, which accelerates stomatal closure. The second part of the thesis deals with the signaling pathway downstream of the Ca2+ signals. Two types of Ca2+-dependent protein kinase modules (CPKs and CBL/CIPKs) have been implicated in guard cells. We focused on the protein kinase CIPK23 (CBL-Interacting Protein Kinase 23), which is activated by the Ca2+-dependent protein CBL1 or 9 (Calcineurin B-Like protein 1 or 9) via interacting with the NAF domain of CIPK23. The CBL1/9-CIPK23 complex has been shown to affect stomatal movements, but the underlying molecular mechanisms remain largely unknown. We addressed this topic by using an estrogen-induced expression system, which specifically enhances the expression of wild type CIPK23, a phosphomimic CIPK23T190D and a kinase dead CIPK23K60N in guard cells. Our data show that guard cells expressing CIPK23T190D promoted stomatal opening, while CIPK23K60N enhanced ABA-induced stomatal closure, suggesting that CIPK23 is a negative regulator of stomatal closure. Electrophysiological measurements revealed that the inward K+ channel currents were similar in guard cells that expressed CIPK23, CIPK23T190D or CIPK23K60N, indicating that CIPK23-mediated inward K+ channel AKT1 does not contribute to stomatal movements. Expression of CIPK23K60N, or loss of CIPK23 in guard cells enhanced S-type anion activity, while the active CIPK23T190D inhibited the activity of these anion channels. These results are in line with the detected changes in stomatal movements and thus indicate that CIPK23 regulates stomatal movements by inhibiting S-type anion channels. CIPK23 thus serves as a brake to control anion channel activity. Overall, our findings demonstrate that CIPK23-mediated stomatal movements do not depend on CIPK23-AKT1 module, instead, it is achieved by regulating S-type anion channels SLAC1 and SLAH3. In sum, the data presented in this thesis give new insights into the Ca2+-dependent branch of ABA signaling, which may help to put forward new strategies to breed plants with enhanced drought stress tolerance, and in turn boost agricultural productivity in the future. N2 - Stomata sind Poren in der Blattoberfläche, die von einem Paar von Schließzellen gebildet werden. Die Schließzellen kontrollieren den Öffnungsweite der stomatären Pore, um die Aufnahme von CO2 und den Verlust von Wasserdampf in die Atmosphäre auszubalancieren. Während Trockenperioden bewirkt das Phytohormon Abscisinsäure (ABA) einen Stomaschluss über eine Signalkaskade, welche über Ca2+-abhängige und Ca2+-unabhängige Pfade verfügt. Beide Pfade aktivieren wahrscheinlich Anionenkanäle aus der SLAC1 Familie (Slow Anion Channel Associated 1), welche essentiell sind um den Stomaschluss einzuleiten. Allerdings wird über die Wichtigkeit des Ca2+-abhängigen Pfades noch immer diskutiert, da der ABA-Hauptsignalweg ausschließlich Ca2+-unabhängige Komponenten beinhaltet. Aus diesem Grund war das Ziel dieser Thesis, die Rolle des Ca2+-abhängigen Pfades im ABA-Signalweg aufzulösen. Im ersten Teil der Thesis wurde mit Schließzellen, die den genetisch kodierten Ca2+-Sensor R-GECO1-mTurquoise exprimierten, der Zusammenhang zwischen ABA-induzierten Ca2+ Signalen und dem Stomaschluss untersucht. Die Injektion von ABA in die Zellwand von Schließzellen bewirkte einen schnellen Stomaschluss, jedoch wurde nur bei drei Vierteln der Zellen auch ein zytosolisches Ca2+ Signal erzeugt. Ein kleiner Teil der Stomata (in einem Viertel der Experimente) schloss sich ohne Ca2+ Signal, was zeigt, dass die Ca2+ Signale nicht essentiell für den ABA-induzierten Stomaschluss sind. Es schlossen sich jedoch Stomata schneller, in deren Schließzellen ABA-induzierte Ca2+ Signale detektiert wurden. ABA-induzierte Ca2+-Signale verbesserten also offenbar die Geschwindigkeit des Stomaschlusses. Neben ABA konnten Ca2+ Signale in wildtypischen Schließzellen auch durch hyperpolarisierende Spannungspulse erzeugt werden, welche daraufhin S-Typ Anionenkanäle aktivierten. Diese Spannungspulse konnten jedoch in slac1/slah3 Schließzellen keine S-typischen Anionenströme hervorrufen, was darauf hindeutet, dass SLAC1 und SLAH3 zur Ca2+-aktivierten Leitfähigkeit beitragen. Zusammengefasst deuten unsere Daten darauf hin, dass ABA-induzierte Ca2+ Signale die Aktivität von S-Typ Anionenkanälen verbessern und somit den Stomaschluss beschleunigen. Der zweite Teil der Thesis befasst sich mit dem Signalweg, der den Ca2+-Signalen nachgeschaltet ist. Es wurden zwei Typen Ca2+-abhängiger Proteinkinase-Module (CPKs und CBL/CIPKs) in Schließzellen nachgewiesen. Wir haben uns auf die Proteinkinase CIPK23 (CBL-Interacting Protein Kinase 23) konzentriert, welche von den Ca2+-abhängigen Proteinen CBL1 und CBL9 (Calcineurin B-Like Protein 1 oder 9) über Interaktion mit der NAF Domäne des CIPK23 aktiviert wird. Es konnte bereits gezeigt werden, dass der CBL1/CIPK23 Komplex die stomatäre Bewegung beinflusst, jedoch sind die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen bisher weitgehend unbekannt geblieben. Wir haben dieses Thema mit einem Östrogen-induzierten Expressionssystem untersucht, welches spezifisch in Schließzellen die Expression von wildtypischem CIPK23 erhöhte. Hinzu kamen Experimente mit einer phosphomimetischen CIPK23T190D und einer CIPK23K60N mit disfunktionaler Kinasedomäne. Unsere Daten zeigen, dass CIPK23T190D exprimierende Schließzellen eine verbesserte Stomaöffnung aufwiesen, während CIPK23K60N den ABA-induzierten Stomaschluss förderte, was auf eine negativ regulierende Rolle von CIPK23 beim Stomaschluss hindeutet. Elektrophysiologische Messungen zeigten, dass die einwärtsgerichteten K+-Ströme in CIPK23-, CIPK23T190D- oder CIPK23K60N-exprimierenden Schließzellen vergleichbar waren, was darauf hindeutet, dass die Aktivierung von AKT1 durch CIPK23 nicht zur stomatären Bewegung beiträgt. Allerdings führte die Expression von CIPK23K60N, wie auch der Verlust von CIPK23, in Schließzellen zu einer erhöhten S-typischen Anionenkanalaktivität, während eine CIPK23T190D-Expression diese Anionenkanalaktivität inhibierte. Diese Ergebnisse stimmen mit den Beobachtungen zu den gezeigten Veränderungen der stomatären Bewegung überein und deuten daher auf eine regulierende Rolle von CIPK23 für die stomatäre Bewegung durch die Inhibierung von S-Typ Anionenkanälen hin. Insgesamt beweisen unsere Befunde, dass die CIPK23-vermittelte stomatäre Bewegung nicht durch eine Interaktion von CIP23 mit AKT1, sondern durch die Regulierung der S-Typ Anionenkanäle SLAC1 und SLAH3 vermittelt wird. Zusammengefasst ergeben die in dieser Thesis präsentierten Daten neue Einblicke in den Ca2+-abhängigen Pfad des ABA-Signalwegs. Dies könnte in Zukunft helfen neue Strategien zur Zucht von Pflanzen mit verbesserter Trockenstresstoleranz zu entwickeln und somit die agrarwirtschaftliche Produktivität zu erhöhen. KW - Stomata KW - guard cells KW - ABA KW - OST1 KW - SLAC1 KW - anion channels KW - Ca2+ signal KW - CIPK23 KW - AKT1 KW - K+ channels KW - drought stress Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204737 ER - TY - THES A1 - Grebner, Wiebke T1 - Organspezifische Bildung und Funktion von Oxylipinen in Arabidopsis thaliana T1 - Organ specific synthesis and function of oxylipins in Arabidopsis thaliana N2 - Oxylipine sind Signalmoleküle, welche durch die enzymatische oder nicht-enzymatische Oxidation von Fettsäuren gebildet werden. Eine bedeutende Gruppe von Oxylipinen in Pflanzen sind die Jasmonate. Dazu zählen Jasmonsäure (JA), deren Vorstufe 12-Oxophytodiensäure (OPDA) sowie deren Metabolite. Ein bedeutender Metabolit von JA ist das Aminosäure-Konjugat JA-Isoleucin (JA-Ile), welches hohe biologische Aktivität besitzt. Besonders für die oberirdischen Organe von Pflanzen wurden bisher vielfältige Funktionen von Jasmonaten beschrieben. Sie sind beteiligt an verschiedenen Entwicklungsprozessen wie der Fertilität von Blüten, aber auch an der Abwehr von Pathogenen und Herbivoren und bei der Reaktion von Pflanzen auf abiotische Stressoren wie hohe Salzkonzentrationen oder Trockenheit. Über die Bildung und Funktion von Oxylipinen in Wurzeln ist bisher jedoch nur wenig bekannt. Aus diesem Grund wurden in der vorliegenden Arbeit die Gehalte von Galaktolipiden und Jasmonaten in Spross und Wurzel von Arabidopsis thaliana Pflanzen verglichen. Mit Hilfe verschiedener JA Biosynthese-Mutanten konnte zudem die Bildung von Jasmonaten in der Wurzel und deren biologische Funktion in diesem Pflanzenorgan untersucht werden. Um die Wurzeln der Arabidopsis Pflanzen einfach behandeln zu können und um schnell und stressfrei größere Mengen von Wurzelmaterial ernten zu können, wurde ein hydroponisches Anzuchtsystem etabliert. Die Analyse von Galaktolipiden zeigte, dass in der Wurzel deutlich geringere Galaktolipid Gehalte als im Spross vorhanden sind. Da Galaktolipide den Hauptbestandteil plastidärer Membranen ausmachen, in den Wurzeln insgesamt jedoch weniger Plastiden vorkommen als in Blättern, wäre dies ein möglicher Grund für den beobachteten Unterschied. Das Vorkommen von mit OPDA oder dnOPDA veresterten Galaktolipiden (Arabidopsiden) wird in der Literatur für die Thylakoidmembranen der Chloroplasten beschrieben. Die Analyse der Arabidopsid Gehalte von Wurzeln konnte diese Aussage stützen, da in Wurzeln, welche normalerweise keine Chloroplasten besitzen, nahezu keine Arabidopside detektiert werden konnten. Die Analyse der Jasmonate zeigte anhand von Pfropfungsexperimenten mit der Jasmonat-freien dde2 Mutante, dass die Wurzeln unabhängig vom Spross in der Lage sind Jasmonate zu bilden, obwohl die Expression vieler JA-Biosynthese-Gene in den Wurzeln sehr gering ist. Zudem zeigten diese Experimente, dass es keinen direkten Transport von Jasmonaten zwischen Spross und Wurzel gibt. Die Bildung von Jasmonaten in der Wurzel konnte durch verschiedene Stresse wie Verwundung, osmotischen Stress oder Trockenheit induziert werden. Kälte und Salzstress hatten hingegen keinen Jasmonat-Anstieg in den Wurzeln zur Folge. Anders als bei osmotischem Stress und Trockenheit, wo sowohl die Gehalte von OPDA als auch von JA und JA-Ile anstiegen, konnte bei Verwundung keine Zunahme der OPDA-Spiegel detektiert werden. Hier kam es zu einer deutlichen Abnahme, wohingegen die JA und JA-Ile Spiegel sehr stark anstiegen. Dies deutet darauf hin, dass es sehr komplexe und vielfältige Regulationsmechanismen hinsichtlich der Bildung von Jasmonaten gibt. Der erste Schritt der JA-Biosynthese, die Bildung von 13-Hydroperoxyfettsäuren (HPOTE), wird durch 13-Lipoxygenase (LOX) Enzyme katalysiert. In Arabidopsis sind vier unterschiedliche 13-LOX Isoformen bekannt. Die Untersuchung verschiedener 13-LOX-Mutanten ergab, dass nur die LOX6 an der Biosynthese von Jasmonaten in der Wurzel beteiligt ist. So konnten in Wurzeln der lox6 Mutante weder basal noch nach verschiedenen Stressen bedeutende Mengen von Jasmonaten gemessen werden. Im Spross dieser Mutante war basal kein OPDA vorhanden, nach Stresseinwirkung wurden jedoch ähnliche Jasmonat Gehalte wie im Wildtyp detektiert. Um Hinweise auf die biologische Funktion von Jasmonaten in Wurzeln zu erhalten, wurden Untersuchungen mit einer lox6 KO Mutante durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass abgeschnittene lox6 Wurzeln, welche keine Jasmonate bilden, im Vergleich zum Wildtyp von saprobiont lebenden Kellerasseln (Porcellio scaber) bevorzugt als Futter genutzt werden. Blätter dieser Mutante, welche nach Stress annähernd gleiche Jasmonat Gehalte wie der Wildtyp aufweisen, wurden nicht bevorzugt gefressen. Von der Jasmonat-freien dde2 Mutante wurden hingegen sowohl die Wurzeln als auch die Blätter bevorzugt gefressen. Neben den Experimenten mit Kellerasseln wurden auch Welke-Versuche mit lox6 und dde2 Pflanzen durchgeführt. Hierbei wiesen die lox6 Pflanzen, nicht aber die dde2 Pflanzen, eine erhöhte Suszeptibilität gegenüber Trockenheit auf. dde2 Pflanzen haben im Gegensatz zu LOX Mutanten unveränderte 13-HPOTE Gehalte, aus denen auch andere Oxylipine als Jasmonate gebildet werden können. Dies zeigt, dass durch LOX6 gebildete Oxylipine, im Falle von Trockenheit aber nicht Jasmonate, an der Reaktion von Arabidopsis Pflanzen auf biotische und abiotische Stresse beteiligt sind. N2 - Oxylipins are signaling molecules derived by enzymatic or non-enzymatic oxidation of fatty acids. Jasmonates are one important group of oxylipins in plant. This group includes jasmonic acid (JA), its precursor 12-oxophytodienoic acid, and all JA metabolites. The amino acid conjugate JA-isoleucine (JA-Ile) is one relevant metabolite of JA which shows high biological activity. For the aerial parts of plants, many different functions of jasmonates have been described. Jasmonates are involved in developmental processes like the flower fertility. Furthermore, these compounds function as signals in defense reactions against pathogens and herbivores and in the response to abiotic stress like high salt concentrations or drought. For roots, much less is known about the formation and function of jasmonates. Therefore, in this work the levels of galactolipids and jasmonates in roots of Arabidopsis thaliana in comparison to leaves were analyzed. Using mutants in different steps of jasmonate biosynthesis the formation and biological function of jasmonates in roots were investigated. For easy handling, treatment, and harvest of root material a hydroponic system was established. The analysis of galactolipids showed reduced contents of these compounds in roots in comparison to the shoots. These differences might occur due to the fact that galactolipids are the main compounds of plastid membranes and that roots in general contain less plastids than the leaves. In the literature it is described, that galactolipids esterified with OPDA or dnOPDA (arabidopsides) only occur in the thylakoid membranes of chloroplasts. The analysis of arabidopsid contents in roots supports this statement since nearly no arabidopsides were detectable in roots, which do normally not have chloroplasts. The analysis of jasmonates with different grafting experiments using the jasmonate free dde2 mutant showed that roots were able to synthesize jasmonates independently of the shoot although the expression of several JA biosynthesis genes is very low. These experiments also pointed out that there is no transport of jasmonates between the shoot and the root. Jasmonates accumulated in roots upon different stresses such as wounding, osmotic stress, or drought. Cold and salt stress did not lead to increased jasmonate levels in the roots. Osmotic and drought stress resulted in an increase of all three analyzed jasmonates whereas after wounding only JA and JA-Ile showed higher concentrations. OPDA levels strongly decreased after this type of stress. This suggests the existence of diverse and complex regulatory mechanisms of stress-induced jasmonate synthesis. 13-lipoxygenase (13-LOX) enzymes are involved in the first step of the JA biosynthesis, the formation of 13-hydroperoxy fatty acids (HPOTE), and four 13-LOX isoforms exist in Arabidopsis. Investigation of different 13-LOX mutants revealed that only the LOX6 enzyme is involved in the biosynthesis of jasmonates in roots. In roots of the lox6 mutant no jasmonate levels were detectable, neither basal nor after different stress treatments. In the shoot of this mutant no basal OPDA was measurable. However, after stress treatment nearly the same amounts of jasmonates were detected. To investigate the function of jasmonates in roots a lox6 KO mutant was used. The experiments showed that detached roots of the lox6 mutant which do not produce jasmonates were the preferred food of the detritivorous crustacean Porcellio scaber in comparison to roots of the wild type. Detached leaves of this mutant which show nearly the same amount of jasmonates after stress like the wild type were not eaten faster. However, detached roots and leaves of the jasmonate free dde2 mutant were both preferred in comparison to the wild type. Besides the investigations with P. scaber also drought experiments were carried out. The lox6 mutant but not dde2 was more susceptible to drought. In contrast to LOX mutants, dde2 plants show unaltered levels of 13-HPOTE which can also be converted to other oxylipins than jasmonates. This indicates that LOX6 derived oxylipins are important for the response to biotic and abiotic factors. However, concerning to drought this is not the case for jasmonates. KW - Oxylipine KW - Ackerschmalwand KW - Jasmonate KW - Wurzel KW - Kellerassel KW - Trockenheit KW - Lipoxygenase 6 KW - Arabidopsis thaliana KW - Jasmonatbiosynthese KW - oxylipins KW - Arabidopsis thaliana KW - jasmonates KW - root KW - drought stress KW - rough woodlouse KW - lox6 Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76730 ER -