TY - THES A1 - Wagner, Martin T1 - Zyto- und Gentoxizität von Zinkoxid-Nanopartikeln in humanen mesenchymalen Stammzellen nach repetitiver Exposition und im Langzeitversuch T1 - Time-Dependent Toxic and Genotoxic Effects of Zinc Oxide Nanoparticles after Long-Term and Repetitive Exposure to Human Mesenchymal Stem Cells N2 - Zinkoxid-Nanopartikel (ZnO-NP) finden in vielen Produkten des täglichen Verbrauchs Verwendung. Daten über die toxikologischen Eigenschaften von ZnO-NP werden kontrovers diskutiert. Die menschliche Haut ist in Bezug auf die ZnO-NP Exposition das wichtigste Kontakt-Organ. Intakte Haut stellt eine suffiziente Barriere gegenüber NP dar. Bei defekter Haut ist ein Kontakt zu den proliferierenden Stammzellen möglich, sodass diese als wichtiges toxikologische Ziel für NP darstellen. Das Ziel dieser Dissertation war die Bewertung der genotoxischen und zytotoxischen Effekte an humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC) durch niedrig dosierte ZnO-NP nach 24 stündiger Exposition, repetitiven Expositionen und im Langzeitversuch bis zu 6 Wochen. Zytotoxische Wirkungen von ZnO-NP wurden mit 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid-Test (MTT) gemessen. Darüber hinaus wurde die Genotoxizität durch den Comet-Assay bewertet. Zur Langzeitbeobachtung bis zu 6 Wochen wurde die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) verwendet. Zytotoxizität nach 24-stündiger ZnO-NP-Exposition war ab einer Konzentration von 50 µg/ml nachweisbar. Genotoxizität konnten bereits bei Konzentrationen von 1 und 10 µg/ml ZnO-NP beschrieben werden. Wiederholte Exposition verstärkte die Zyto-, aber nicht die Genotoxizität. Eine intrazelluläre NP-Akkumulation mit Penetration der Zellorganelle wurde bei einer Exposition bis zu 6 Wochen beobachtet. Die Ergebnisse deuten auf zytotoxische und genotoxisches Effekte von ZnO-NP hin. Bereits geringe Dosen von ZnO-NP können bei wiederholter Exposition toxische Wirkungen hervorrufen sowie eine langfristige Zellakkumulation. Diese Daten sollten bei der Verwendung von ZnO-NP an geschädigter Haut berücksichtigt werden. N2 - Zinc oxide nanoparticles (ZnO-NP) are widely used in many products of daily consumption. Data on the toxicological properties of the ZnO-NP used are discussed controversially. Human skin is the most important organ in terms of ZnO-NP exposure. Intact skin has been shown to provide an adequate barrier against NPs, while defective skin allows NP contact with proliferating cells. Among proliferating cells, stem cells are the main toxicological target for NPs. Therefore, the aim of this dissertation was to evaluate the genotoxic and cytotoxic effects of human mesenchymal stem cells (hMSC) by low-dose ZnO-NP after 24 hours of exposure, repetitive exposures and in long-term experiments up to 6 weeks. Cytotoxic effects of ZnO-NP were measured with 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide test (MTT). In addition, genotoxicity was assessed by the comet assay. Transmission electron microscopy (TEM) was used for long-term observation after 6 exposure periods. The results of the study show that ZnO-NP has a cytotoxic effect starting at high concentrations of 50 µg/mL and could demonstrate genotoxic effects in hMSC exposed to 1 and 10 µg/ml ZnO-NP. Repeated exposure enhanced cytotoxicity but not genotoxicity. Intracellular NP accumulation with penetration of the cell organelles was observed at exposure up to 6 weeks. The results indicate the cytotoxic and genotoxic potential of ZnO-NP. Even small doses of ZnO-NP can cause toxic effects with repeated exposure and long-term cell accumulation. These data should be considered when using ZnO-NP on damaged skin. KW - nanoparticle KW - zinc oxid KW - stem cells KW - nanotoxicology KW - human skin KW - Nanopartikel KW - humane mesenchymale Stammzellen KW - Genotoxizität KW - Zytotoxizität KW - Repetitive Exposition KW - Elektronenmikroskopie Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-275726 ER - TY - THES A1 - Koch, Roland T1 - Modulation Nikotin induzierter DNA-Schäden an humanen Lymphozyten und nasaler Mukosa T1 - Modulation of nicotine induced DNA damage in human lymphocytes and nasal mucosa cells N2 - Beim Zigarettenrauchen als der häufigsten Form des Tabakkonsums stellt das respiratorische Epithel des oberen und unteren Aerodigestivtraktes das primäre Kontaktorgan der zyto- und genotoxischen Inhaltsstoffe dar. Nikotin, das Hauptalkaloid des Tabaks, ruft nicht nur eine starke Abhängigkeit hervor, sondern kann in Anbetracht früherer Studien auch zum Tabak assoziierten Krebsrisiko beitragen. Neben tumorproliferativen Effekten wie etwa der Angioneogenese, der Zellproliferation oder einer Apoptoseinhibition ist die Rolle der tumorinitiierenden Wirkung von Nikotin durch eine direkte Schädigung der DNA noch unzureichend untersucht. Ziele dieser experimentellen Arbeit waren deshalb, Nikotin induzierte DNA-Schäden an frisch isolierten sowie rekultivierten humanen Lymphozyten mit Hilfe des alkalischen Einzelzell-Mikrogelelektrophorese (Comet) Assays darzustellen, den Nachweis dieser Schäden durch Koinkubation mit dem Reparaturenzyminhibitor Aphidicolin (APC) zu sensitivieren sowie oxidativ geschädigte Basen durch die Formamidopyrimidin-Glykosylase (Fpg) aufzuzeigen. Durch Koinkubation mit Epibatidin, einem Subtyp spezifischen und kompetitiven Agonisten am nikotinergen Acetylcholinrezeptor (nAChR), wurde die Rolle der rezeptorvermittelten Mechanismen Nikotin induzierter DNA-Schäden an Lymphozyten und nasalen Mukosazellen untersucht. Auch der Frage, ob Rauchen zu einer erhöhten basalen Schädigung an nasalen Mukosazellen führe, wurde nachgegangen. Nach der Zellisolierung der humanen nasalen Schleimhautzellen und peripheren Lymphozyten erfolgte zum Ausschluss zytotoxischer Effekte jeweils vor und nach der einstündigen Fremdstoffinkubation mit Nikotin (1 µM bis 1000 µM), APC (2,5 µg/ml), Epibatidin (1 µM bis 100 µM) und MMS (100 µM) die Bestimmung der Zellvitalität mit dem Trypanblau-Ausschlusstest. Durch Inkubation mit Fpg nach der Lyse zellulärer Membranen erfolgte die Augmentation oxidativ geschädigter Basen. Potentielle DNA-Schäden in Form von Einzelstrangbrüchen und alkalilabilen Stellen der DNA wurden mit dem Comet Assay erfasst. An frisch isolierten Lymphozyten konnte nach ein-stündiger Inkubation mit Nikotin ab 100 µM ein signifikanter DNA-Schaden festgestellt werden. Mit dem Einsatz von Fpg kam es ab 10 µM Nikotin zu einem signifikanten Anstieg der DNA-Fragmentierung. An rekultivierten Lymphozyten konnte nach Kryokonservierung bei einstündiger Inkubation mit Nikotin bereits ab 1 µM eine signifikante DNA-Schädigung nachgewiesen werden, die sich ebenfalls bei Koinkubation mit APC ab 1 µM darstellte. Durch Koinkubation von Nikotin (1000 µM) mit Epibatidin in aufsteigender Konzentration konnte an frisch isolierten Lymphozyten nur in einer Konzentration (10 µM) die Nikotin induzierte DNA-Fragmentierung gesenkt werden. Hierbei zeigte Epibatidin selbst einen DNA-Schaden in niedriger Konzentration (1 µM und 10 µM). An nasalen Mukosazellen konnte der Nikotin induzierte DNA-Schaden durch die Koinkubation mit Epibatidin nicht gesenkt werden. Auch an nasaler Mukosa rief Epibatidin ab 1 µM einen signifikanten DNA-Schaden hervor. Bezüglich einer Einflussgröße durch das Rauchen auf die Ergebnisse im Comet Assay konnte kein Unterschied der basalen als auch der durch Nikotin induzierten DNA-Fragmentierung zwischen der Gruppe der Raucher und Nichtraucher festgestellt werden. Nikotin verursachte bereits bei einer einstündigen Expositionsdauer DNA-Schäden an humanen Lymphozyten und nasalen Mukosazellen. Der Nachweis oxidativ geschädigter Basen an Lymphozyten zeigt auf eine Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) durch Nikotin hin. Die Aktivierung des homomeren α7 nAChR durch Nikotin soll hierbei eine wichtige Rolle als Auslöser der intrazellulären Signaltransduktion der Radikalbildung spielen. Epibatidin als ein starker Agonist am α7 Rezeptor führte bereits in geringen Konzentrationen zu einer signifikanten DNA-Fragmentierung. Bei fehlender Reparatur dieser DNA-Schäden und einer ausbleibenden Elimination der geschädigten Zelle können diese Mutationen akkumulieren und zur Tabak assoziierten Krebsentstehung beitragen. Eine Substitutionstherapie mit Nikotin zur Raucherentwöhnung muss bei solchen Ergebnissen äußerst kritisch betrachtet werden. N2 - Respiratory epithelia of the upper and lower aero digestive tract are in first contact with cyto- and genotoxic components of tobacco smoke. Nicotine, being the main alkaloid of tobacco, is responsible for addiction to tobacco and contributes to tobacco carcinogenesis, too. While mechanisms of tumor proliferation caused by nicotine, such as stimulation of angiogenesis and cell proliferation or inhibition of apoptosis, are well accepted, the role of direct DNA damage by nicotine as a potentially tumor initiating factor is in focus of the present study. This experimental study demonstrates DNA damage in freshly isolated and cryo-preserved human lymphocytes after exposure to nicotine with the alkaline single-cell microgel electrophoresis (comet) assay. Co-incubations with aphidicolin (APC), an inhibitor of repair enzymes, and formamidopyrimidine-glycosylase (Fpg), an enzyme to detect oxidative damaged bases, were performed. Epibatidine as a subtype-specific and competitive agonist of the nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) correspondent to nicotine was implemented to evaluate the role of receptor associated mechanisms of DNA damage. Furthermore, the influence of the smoking-status on the DNA damage of nasal mucosa cells was evaluated. Cytotoxic effects were investigated before and after one hour of exposure to nicotine (1 µM to 1000 µM), APC (2,5 µg/ml), epibatidine (1 µM to 100 µM) and methyl methane sulfonate as control (100 µM) in the trypan blue exclusion test. After lysis of cellular membranes, oxidative damaged bases of DNA were detected by incubation with Fpg. DNA damage like single strand brakes and alkali labile sites of DNA were investigated with the aid of the comet assay. Freshly isolated lymphocytes showed at 100 µM nicotine a significant DNA damage. Applying Fpg, a significant increase in DNA fragmentation could already be detected at 10 µM nicotine. Cryopreserved lymphocytes showed a significant DNA damage at 1 µM nicotine both with and without the co-incubation of APC. The co-incubation of 1000 µM nicotine with epibatidine showed in a single concentration (10 µM) a reduction of nicotine induced DNA damage in lymphocytes. Epibatidine itself caused DNA damage at lower concentrations (1 µM and 10 µM) in lymphocytes. In nasal mucosa cells epibatidine did not reduce the nicotine induced DNA damage but caused itself DNA damage at 1 µM. The smoking-status of the participants had no influence on basal and nicotine induced DNA fragmentation. Nicotine induced DNA damage to cells of human blood and nasal mucosa just after one hour of exposure. The evidence of oxidative damaged bases of DNA in lymphocytes shows the development of reactive oxygen species (ROS) by nicotine. The activation of the homomeric α7 nAChR by nicotine seems to be relevant to the intracellular transduction for generating ROS. Epibatidine, as a strong agonist on the α7 nAChR, caused significant DNA fragmentation in low concentrations, already. By insufficient repair of the DNA damage and inhibited elimination of damaged cells, mutations can accumulate and contribute to tobacco carcinogenesis. Hence, nicotine in a replacement therapy should be considered very critically. KW - Nicotin KW - Epibatidin KW - Comet Assay KW - Lymphozyt KW - Schleimhaut KW - Tabakrauch KW - Genotoxizität KW - Nicotine KW - Edibatidine KW - Tobacco smoke KW - Comet Assay KW - Lymphocyte KW - Nasal mucosa KW - Genotoxicity Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53191 ER - TY - THES A1 - Moratin, Helena Anne T1 - Mechanismen Zinkoxid-Nanopartikel-assoziierter Toxizität am Beispiel einer humanen Plattenepithelkarzinom-Zelllinie und primärer humaner mesenchymaler Stammzellen T1 - Analysis of zinc oxide nanoparticle-associated mechanisms of toxicity using the example of a human squamous cell carcinoma cell line and primary human mesenchymal stem cells N2 - Einleitung: Zinkoxid (ZnO) ist eines der am häufigsten für industrielle Produktionen und Konsumgüter eingesetzten Nanomaterialien. Zytotoxizität von ZnO-Nanopartikeln (NP) war bereits Gegenstand einiger Studien, jedoch sind die molekularen Schädigungsmechanismen nicht gänzlich geklärt. Über genotoxische Eigenschaften, die bereits bei sub-zytotoxischen Dosen auftreten können, ist im Allgemeinen weniger bekannt. Ziel dieser Studie war die Erstellung eines umfassenden Toxizitätsprofils von ZnO-NP durch Einsatz multipler Testsysteme. Methoden: Neben der Plattenepithelkarzinom-Zelllinie FaDu wurden humane mesenchymale Knochenmarkstammzellen (BMSC) für unterschiedliche Zeiträume und Konzentrationen mit ZnO-NP behandelt. Zytotoxizität, Apoptoseinduktion und Zellzyklusalteration wurden durch MTT-Test, PCR und Durchflusszytometrie analysiert. Mit dem fpg-modifizierten Comet Assay wurden der Einfluss von oxidativem Stress auf das Gesamtausmaß der DNA-Schädigung untersucht. Ergebnisse: ZnO-NP führten im MTT-Test ab 8 µg/ml zu einer Reduktion der Vitalität in FaDu-Zellen. Durchflusszytometrisch wurden eine dosis- und zeitabhängige Zunahme von Apoptose sowie Veränderungen des Zellzyklus nachgewiesen. Im Comet Assay konnte nach Inkubation mit 5 µg/ml ZnO-NP eine signifikante DNA-Fragmentierung in BMSC nachgewiesen werden. Bei allen getesteten Konzentrationen wurde oxidativer Stress als wichtiger Einflussfaktor der Schädigung nachgewiesen. Diskussion: Vorliegende Studie liefert Hinweise dafür, dass ZnO-NP toxisch sind. Gegenwärtig ist eine definitive Aussage über das schädigende Potenzial von NP nicht zu treffen, da der Vergleich verschiedener Studien kaum möglich ist. Gerade die Verwendung von ZnO-NP als Bestandteil von Kosmetikprodukten, die repetitiv in geringen Mengen von Verbrauchern appliziert werden, sollte jedoch kritisch betrachtet werden. N2 - Introduction: Zinc oxide (ZnO) is among the most commonly used nanomaterials for consumer products. Cytotoxicity of ZnO-nanoparticles (ZnO-NP) has already been addressed in several studies; however, there is still a lack of knowledge concerning the molecular mechanisms of toxicity. As to genotoxicity, which can already occur at sub-toxic doses, data is generally rare. It was therefore the aim of this study to establish a broad profile of toxicity for ZnO-NP by applying multiple test systems. Methods: Besides the head and neck squamous cell carcinoma-derived cell line FaDu, primary human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSC) were treated with ZnO-NP with variable doses and for different time periods. Cytotoxicity, induction of apoptosis and cell cycle alteration were assessed by MTT-Test, PCR and flow cytometry. Fpg-modified Comet Assay was used to determine the influence of oxidative stress with regard to the total DNA-damage. Results: 8 µg/ml ZnO-NP reduced cell viability in FaDu cells in the MTT-Test. Dose- and time-dependent increase of apoptosis and alterations of the cell cycle were verified by flow cytometry. After incubation with 5 µg/ml ZnO-NP a significant DNA-fragmentation was measured in BMSC with the Comet Assay. In all tested concentrations oxidative stress could be identified as an important factor of cell damage. Discussion: This study provides evidence that ZnO-NP are toxic. At the current point a definite statement concerning the damaging potential of ZnO-NP is not to be made because the comparison between different studies is not possible. Yet especially the repetitive low-dose application of ZnO-NP as component of cosmetic products should be investigated toxicologically. KW - Zinkoxid KW - Nanopartikel KW - Zytotoxizität KW - Genotoxizität KW - Toxizität KW - Plattenepithelkarzinom KW - MSC Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204237 ER - TY - THES A1 - Uebelacker, Lukas T1 - In vitro-Exposition von Glycerin als Bestandteil des Shisha-Tabaks an humanen Nasenschleimhautzellen und Lymphozyten T1 - In vitro exposure of glycerol as an ingredient of shisha tobacco to human nasal mucosa cells and lymphocytes N2 - Shisha-Tabak benötigt im Vergleich zur Zigarette höhere Konzentrationen des Feuchthaltemittels Glycerin. Seit Mai 2016 ist die bis dahin gültige Limitierung von Feuchthaltemitteln in Tabak auf 5 % aufgehoben. Derzeit ist das toxikologische Profil des Glycerins jedoch noch nicht hinreichend erforscht. Ziel dieser Arbeit war es, Glycerin auf mögliche zyto- und genotoxische Effekte zu untersuchen, um so das Gefährdungspotenzial durch Glycerin im Shisha-Tabak zu beurteilen und die tabakkontrollpolitische Situation in Deutschland zu diskutieren. Dafür wurden Lymphozyten sowie Nasenschleimhautzellen von 10 Patienten für eine Stunde Glycerin (0,001 mol/l bis 6,0 mol/l) exponiert. Durch den Trypanblau-Ausschlusstest wurden die Zellen auf Zytotoxizität, mittels Einzelzellgelelektrophorese (Comet Assay) und Mikrokern-Test auf Genotoxizität untersucht. Im Trypanblau-Ausschlusstest traten bei Lymphozyten sowie nasalen Mukosazellen signifikante Vitalitätsabfälle ab Glycerin-Konzentrationen von 1,0 mol/l auf. Im Comet Assay konnten für beide Zellgruppen signifikante Unterschiede des Olive Tail Moments (OTM) ab 1,0 mol/l nachgewiesen werden. Beim Mikrokern-Test zeigten sich keine signifikanten Zunahmen der Mikrokern-Anzahl. Es konnten zyto- und genotoxische Effekte ab Konzentrationen von 1,0 mol/l nachgewiesen werden. Dies überschreitet die reale Glycerin-Belastung im Hauptstromrauch der Shisha jedoch deutlich. Dennoch handelt es sich bei Genotoxizität um ein stochastisches Risiko. Ebenso sind toxische Effekte, beispielsweise durch Erhitzung, bereits bei geringeren Konzentrationen denkbar. Für eine umfangreichere Beurteilung von Feuchthaltemitteln im Shisha-Tabak sind weitere Untersuchungen indiziert. Darüber hinaus besteht enormer Handlungsbedarf zur weiteren Einführung tabakkontrollpolitischer Maßnahmen in Deutschland. N2 - Shisha tobacco has a higher amount of glycerol than cigarette tobacco. Moreover, new legislation in Germany cancels the old limitation of humectants in shisha tobacco. Although higher amounts of glycerol in tobacco are expected, the knowledge of the toxicological profile of glycerol regarding human cells is incomplete. Aim of the study was to test glycerol for cytotoxic and genotoxic effects and to discuss the risk of humectants in shisha tobacco and the situation of German tobacco control. Lymphocytes and nasal mucosa cells of 10 patients were exposed to different glycerol levels (0.001 mol/l to 6.0 mol/l). Cytotoxic effects were examined by trypan blue exclusion test, genotoxic effects by comet assay and micronucleus test. The trypan blue exclusion test revealed significant cytotoxic effects on lymphocytes and nasal mucosa cells for glycerol concentrations of 1.0 mol/l and higher. In the comet assay a significant DNA damage could be shown for glycerol levels of 1.0 mol/l and higher. No significant micronucleus formation was monitored. While the geno- and cytotoxicity were seen in concentrations of glycerol clearly exceeding the concentrations in main stream smoke of shishas, genotoxicity is a stochastic risk occurring even at subtoxic levels. Furthermore, toxicity in lower levels could result from tobacco combustion or interactions with other smoke components. For an extensive evaluation of the risks of humectants in shisha tobacco further studies are needed. In addition, there is an enormous need for introducing further measures of tobacco control policy in Germany. KW - Glycerin KW - Zytotoxizität KW - Genotoxizität KW - Shisha KW - Wasserpfeife KW - Comet Assay KW - Feuchthaltemittel KW - Mikrokerntest KW - Trypanblautest Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184443 ER -