TY - THES A1 - Kellert, Marco T1 - Untersuchungen zum Metabolismus von Furan in Ratte und Maus, sowie zur Reaktivität und Gentoxizität von cis-2-Buten-1,4-dial in vitro und in Zellkultur T1 - Metabolism of furan in rats and mice and tests for the reactivity and genotoxicity of cis-2-butene-1,4-dial in vitro and in cell culture. N2 - Furan wird in einer Vielzahl von Speisen durch Hitzebehandlung gebildet und ist kanzerogen in der Leber von Ratte und Maus. Durch die hohe Flüchtigkeit von Furan ist eine Expositionsabschätzung auf Basis der Kontamination von Lebensmitteln nur bedingt möglich. Ein alternativer Ansatz dazu ist die Identifizierung von Furanmetaboliten als Expositions­biomarker. Nach der Aufnahme wird Furan zunächst zum Dialdehyd cis-2-Buten-1,4-dial oxidiert. cis-2-Buten-1,4-dial besitzt mehrere elektrophile Strukturelemente, welche eine Reaktion mit Protein und DNS wahrscheinlich machen und damit zur bekannten Toxizität von Furan beitragen können. Es stellt sich in diesem Zusammenhang die Frage, ob eine Reaktion mit Protein die Reaktion mit der DNS verhindern kann und somit keine direkt gentoxischen Effekte auftreten. Für ein kanzerogenes Agens ohne direkte gentoxische Wirkung kann eine Schwellendosis unterhalb derer kein DNS-Schaden auftritt diskutiert werden. Für eine fundierte Risikobewertung bezüglich der Aufnahme von Furan über die Nahrung ist dies unabdingbar. In der vorliegenden Arbeit wurde nach der oralen Gabe von Furan im Urin von Fischer 344 Ratten nach Metaboliten gesucht. Eine Kontrollgruppe erhielt nur die Trägersubstanz Öl. Das vor und nach Exposition über jeweils zwei 24 Stunden Perioden gesammelte Urin wurde mittels einer Tandemmassenspektrometrie-Methode analysiert. Die Methode bestand aus einem Full-Scan und einer darüber gesteuerten Aufzeichnung eines Fragmentionenspektrums. Die Full-Scan-Daten wurden mit Hilfe der Hauptkomponentenanalyse untersucht. In der ersten Sammelperiode nach der Behandlung konnten durch die erste Hauptkomponente die behandelten von den unbehandelten Tieren getrennt werden. Aus den für die Trennung relevanten Verbindungen konnten fünf Biomarker strukturell aufgeklärt werden. In einer weiteren Tierstudie an Ratten und Mäusen wurde die Kinetik und die Dosis-Wirkungs-Beziehung der identifizierten Biomarker untersucht. Die gezielte LC-MS/MS-Analyse der Urine auf die identifizierten Biomarker hin zeigte, dass in der Ratte alle und in der Maus alle bis auf einen dosisabhängig anstiegen. Die Kinetik der Ausscheidung lieferte wertvolle Hinweise auf die Entstehung der Biomarker. Die Ausscheidung der Biomarker mit Lysinstruktur erfolgte über mehr als 72 Stunden. Dies war ein Hinweis auf eine Freisetzung aus Protein. Die Ausscheidung der restlichen Verbindungen erfolgte ausschließlich in den ersten 24 Stunden. Die in der Literatur vorhandenen Daten zur Gentoxizität von Furan und cis-Buten-1,4-dial sind unschlüssig und unvollständig. In der vorliegenden Arbeit wurde cis-2-Buten-1,4-dial im Ames Stamm TA104 und in L5178Y Mauslymphomzellen auf Mutagenität und Gentoxizität untersucht. Durch starke Zytotoxizität war der Konzentrationsbereich auf 4.5 µmol/Platte limitiert. Innerhalb dieses Bereich konnte mit der Vorinkubationsvariante des Ames-Tests keine Mutagenität beobachtet werden. Die L5178Y Mauslymphomzellen wurden mit Standardprotokollen für den Mikrokern-Test, Kometen-Test und den Thymidinkinase-Test untersucht. Der Konzentrationsbereich von cis-2-Buten-1,4-dial erstreckte sich bis 100 µM, konnte aber auf Grund der starken Zytotoxizität nur bis 25 µM ausgewertet werden. Dennoch konnte bereits in diesem Bereich ein 1.7- bzw. 2.2-facher Anstieg im Kometen- bzw. Thymidinkinase-Test beobachtet werden. Verglichen mit der Positivkontrolle Methylmethansulfonat hatte cis-2-Buten-1,4-dial bei einer deutlich höheren Zytotoxizität eine ähnliche Potenz bezüglich der Mutagenität und Gentoxizität. Um das DNS-vernetzende Potential von cis-2-Buten-1,4-dial zu bestimmen wurde eine Variante des Kometen-Tests verwendet. Es wurde dabei untersucht, ob die Vorbehandlung von Zellen mit cis-2-Buten-1,4-dial die durch γ-Strahlung induzierbaren Kometen reduzieren kann. Während die Positivkontrolle Glutaraldehyd die Kometen tatsächlich verringerte, blieb dieser Effekt bei cis-2-Buten-1,4-dial aus. Im Gegenteil, bei einer Konzentration von ≥100 mM konnte durch die Zunahme von Zellen mit beginnender Apoptose ein Anstieg der Kometen beobachtet werden. Obwohl cis-2-Buten-1,4-dial sehr deutliche gentoxische und mutagene Effekte zeigte, beschränkte die hohe Zytotoxizität den auswertbaren Bereich. Möglicherweise kann diese Problematik einen Teil der unschlüssigen Ergebnisse erklären, sicher ist jedoch, dass für die Untersuchung der Mechanismen der Toxizität und Kanzerogenität ein Beitrag von nicht gentoxischen Effekten diskutiert werden muss. N2 - Furan has been found in a number of heated food items and is carcinogenic in the liver of rats and mice. Estimates of human exposure on the basis of concentrations measured in food are not reliable because of the volatility of furan. A biomarker approach was therefore indicated. Metabolism of furan includes the formation of an unsaturated dialdehyde, cis-2-butene-1,4-dial. In view of the multifunctional electrophilic reactivity of cis-2-butene-1,4-dial, adduct formation with protein and DNA may explain some of the toxic effects. DNA-adduction is a direct genotoxic effect. The major question was weather a direct genotoxicity of cis-2-butene-1,4-dial could be prevented by the reaction with protein structures. If so, the genotoxic and mutagenic effects are likely to show a threshold dose, reducing the cancer risk for low exposure levels. We searched for metabolites excreted in the urine of male Fischer 344 rats treated by oral gavage with 40 mg furan per kg body weight. A control group received the vehicle oil only. Urine collected over two 24-hour periods both before and after treatment was analyzed by a column-switching LC-MS/MS method. Data were acquired by a full scan survey scan in combination with information dependent acquisition of fragmentation spectra by the use of a linear ion trap. The full scan data was analyzed by principal component analysis (PCA). The first principal component fully separated the samples of treated rats from the controls in the first post-treatment sampling period. Five of the compounds that are responsible for the separation could be identified as the reaction product of cis-2-butene-1,4-dial with either glutathion or lysine (protein). In a second animal study rats and mice were treated with seven different doses of furan in the range from 125 µg to 8 mg per kg body weight. Dose-response and kinetic over 72 h of the seven identified biomarkers was examined by LC-MS/MS in the urine. In the rats all biomarkers showed a dose-dependent increase. In the mice one biomarker lacked of dose dependency. Different excretion profiles were attributed to the formation of either protein adducts or glutathione conjugates. Whereas the protein-derived biomarkers with a lysin moiety showed a slow excretion over more than 72 h, the glutathion-dervived biomarkers were only excreted within the first 24 h. Short-term tests for genotoxicity of furan in mammalian cells are inconclusive, little is known for cis-2-butene-1,4-dial. We investigated cis-2-butene-1,4-dial generated by hydrolysis of 2,5-diacetoxy-2,5-dihydrofuran for genotoxicity and mutagenicity in Salmonella typhimurium (Strain TA104) and in L5178Y mouse lymphoma cells. The Ames Test was negative in the preincubation assay with and without reduction of cytotoxicity by addition of glutathione after preincubation phase. Remarkable cytotoxicity limited the analysis range up to 4.5 µmol/plate. Mutagenicity and genotoxicicty in L5178Y mouse lymphoma cells was evaluated using standard procedures for the comet assay, the micronucleus test, and the mouse lymphoma thymidine kinase gene mutation assay. cis-2-butene-1,4-dial was tested at 0, 6.25, 12.5, 25, 50, and 100 µM. Cytotoxicity was remarkable; cell viability at 50 µM was reduced to <50%. Up to 25 µM, cell viability was >90%, and measures of comet assay and thymidine kinase mutations were increased over control about 1.7 an 2.2-fold, respectively. Compared to methyl methanesulfonate used as positive control, cis-2-butene-1,4-dial was of similar potency for genotoxicity but much more cytotoxic. A potential cross-linking activity of cis-2-butene-1,4-dial was investigated by checking whether gamma radiation-induced DNA migration in the comet assay could be reduced by pretreatment with cis-2-butene-1,4-dial. As opposed to the effect of the positive control glutaraldehyde, cis-2-butene-1,4-dial treatment did not reduce the comets. On the contrary, an increase was observed at ≥100 µM cis-2-butene-1,4-dial, which was attributable to early apoptotic cells. Although cis-2-butene-1,4-dial was found to be a relatively potent genotoxic agent in terms of the concentration necessary to double the background measures, cytotoxicity strongly limited the concentration range that produced interpretable results. This may explain some of the inconclusive results and indicates that nongenotoxic effects must be taken into account in the discussion of modes of toxic and carcinogenic action of furan. KW - Metabolismus KW - Mutagenität KW - Biomarker KW - Furan KW - LC-MS KW - Harn KW - cis-2-Buten-1 KW - 4-dial KW - Gentoxizität KW - furan KW - metabolism KW - biomarker KW - mutagenicity KW - genotoxicity Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28716 ER - TY - THES A1 - Page, Lukas T1 - Entwicklung und präklinische Evaluation immunologischer und nuklearmedizinischer diagnostischer Tests für Schimmelpilz-assoziierte Hypersensitivität und invasive Mykosen T1 - Development and preclinical evaluation of immunological and nuclear medical diagnostic assays for mould-associated hypersensitivity and invasive mycoses N2 - Schimmelpilze können in Abhängigkeit des Immunstatus und der Vorerkrankungen betroffener Patienten unterschiedliche Krankheitsbilder wie Hypersensitivitäts-erkrankungen oder lebensbedrohliche invasive Infektionen hervorrufen. Da die Diagnosestellung dieser Erkrankungen mitunter komplex und insensitiv ist, sollten im Rahmen dieser Arbeit unterschiedliche Ansätze neuer diagnostischer Assays untersucht werden. In den letzten Jahren wurden Assays entwickelt, die auf Basis durchflusszytometrisch quantifizierter Pilz-spezifischer T-Zellen aus peripherem Blut einen supportiven Biomarker zur Diagnostik invasiver Mykosen liefern könnten. Da die hierfür isolierten T-Zellen anfällig gegenüber präanalytischer Lagerzeiten und immunsuppressiver Medikation sind, wurden hier Protokolloptimierungen vorgenommen, um anhand eines Vollblut-basierten Assays mit zusätzlicher CD49d-Kostimulation diesen Limitationen entgegen zu wirken. In einer Studie an gesunden Probanden konnte dabei gezeigt werden, dass die Kombination der Durchflusszytometrie mit ausgewählten Zytokin-Messungen (IL-5, IL-10 und IL-17) zu einer verbesserten Erkennung vermehrt Schimmelpilz-exponierter Personen beitragen könnte. Neben Infektionen könnten dabei im umwelt- und arbeitsmedizinischen Kontext Polarisationen der T-Zell-Populationen detektiert werden, welche mit Sensibilisierungen und Hypersensitivität assoziiert werden. Zusätzlich wurde ein in vitro Transwell® Alveolarmodell zur Simulation pulmonaler Pilzinfektionen für Erreger der Ordnung Mucorales adaptiert, durch Reproduktion wichtiger Merkmale der Pathogenese von Mucormykosen validiert, und für Untersuchungen der Immunpathologie und Erreger-Invasion verwendet. Das Modell wurde anschließend zur in vitro Evaluation von radioaktiv markiertem Amphotericin B mit 99mTc oder 68Ga als nuklearmedizinischen Tracer verwendet. Die untersuchten Schimmelpilze zeigten dabei eine zeit- und dosis-abhängige Aufnahme der Tracer, während bakteriell infizierte Proben nicht detektiert wurden. Die erhobenen Daten dokumentieren ein vielversprechendes Potenzial von Amphotericin B-basierten Tracer, das in zukünftigen in vivo Studien weiter evaluiert werden sollte. N2 - Depending on the immune constitution and predisposing illnesses, moulds can cause a variety of diseases ranging from hypersensitivity syndromes to life-threatening invasive infections. As the diagnosis of mould-associated diseases remains challenging, this work aimed to refine immunological assays and to develop molecular imaging protocols for pulmonary mould infections. Recently, a flow cytometric assay for mould specific T cell quantification has been proposed as a novel supportive biomarker to diagnose invasive mycoses. As these assays are susceptible to pre-analytic delays and immunosuppressive drugs, a whole blood-based protocol with enhanced CD28 plus CD49d co-stimulation was developed and was shown to be less prone to these limitations. In addition, a study on healthy volunteers demonstrated the applicability of flow cytometric antigen-reactive T cell quantification as a surrogate of environmental mould exposure, especially when combined with T-cellular cytokine measurements (specifically, IL-5, IL-10, and IL-17). Therefore, these assays could potentially be used to detect polarizations of T-cell populations associated with sensitization and hypersensitivity, e. g. in allergology and occupational medicine. Moreover, an in vitro Transwell® alveolar model of invasive pulmonary mould infections has been adapted to study mucormycoses, validated by recapitulation of known pathogenicity factors, and used to characterize the immunopathology and epithelial invasion of Mucorales. The Transwell® model was subsequently used to evaluate radioactively labelled Amphotericin B with either 99mTc or 68Ga as a potential nuclear medical tracer. Time- and dose-dependent enrichment of the tracers was found in both Aspergillus and Mucorales, whereas samples infected with bacteria showed negligible uptake. These in vitro data document a promising potential of radiolabeled amphotericin B for molecular imaging of invasive mycoses and encourage further evaluation in animal models. KW - Schimmelpilze KW - Diagnostik KW - Biomarker KW - Tracer KW - Zellkultur KW - Antimykotika KW - Mucorales KW - Aspergillus KW - T-Zellen KW - Immunsuppressiva KW - Antifungal KW - Mucormycosis KW - Aspergillosis KW - T cells KW - Immunosuppressant Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-252459 ER - TY - THES A1 - Slopianka, Markus T1 - Evaluation von Gallensäuren als Biomarker für Lebertoxizität in der präklinischen Arzneimittelentwicklung T1 - Evaluation of Bile acids as Biomarkers for Liver Toxicity in Preclinical Drug Development N2 - Die Detektion Arzneimittel-induzierter Leberschädigung (engl. DILI – Drug induced liver injury) stellt eine Herausforderung in der präklinischen Entwicklung von Arzneistoffen dar. Die zur Verfügung stehenden konventionellen klinisch-chemischen Marker, wie Alanin-Aminotransferase (ALAT), Aspartat-Aminotransferase (ASAT) und Alkalische Phosphatase (APh), zeigen z. B. bei minimaler bis leichter Leberpathologie keine Veränderungen im Serum an und besitzen somit nur eine geringe Sensitivität für den frühzeitigen Nachweis einer Lebertoxizität. Des Weiteren besitzen klinisch-chemische Serummarker gleichzeitig eine geringe Spezifität und sind somit für die Differenzierung unterschiedlicher Lebertoxizitäten nur limitiert geeignet. Neben den beschriebenen diagnostischen Herausforderungen können u. a. auch histopathologische Befunde in der Leber, ohne eine Veränderung der klinisch-chemischen Serummarker auftreten und umgekehrt. Die Histopathologie ist als Goldstandard zwar spezifisch, als invasive Technik für eine Verlaufskontrolle in toxikologischen und klinischen Studien aber ungeeignet. In den vergangenen Jahren lieferten Studien zum Gallensäure-Profiling mittels Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) mit Modellsubstanzen, die unterschiedliche Formen einer Lebertoxizität in Ratten induzierten Hinweise, dass individuelle Gallensäuren ein diagnostisches Potential für die Bewertung einer Leberschädigung besitzen. Ziel dieser Arbeit ist es, dass Gallensäure-Profiling in die vorgeschriebene Diagnostik der Lebertoxizität in der präklinischen Arzneimittelentwicklung zu implementieren und zu bewerten, ob diese Marker einen wertvollen Beitrag zur Charakterisierung einer Lebertoxizität leisten können. Hierzu wurde eine quantitative LC-MS/MS-Methode etabliert und validiert, die es ermöglicht, 20 verschiedene endogene Gallensäuren in Ratten zu analysieren. Die quantitative Analytik ermöglichte eine selektive Bestimmung von primären, konjugierten und sekundären Gallensäuren. Für die Quantifizierung der individuellen Gallensäuren wurden 2 MRM-Übergänge bestimmt. Zur Bestimmung des Arbeitsbereiches wurden 20 Referenzstandards von Gallensäuren verwendet. Eine Kalibrierung mit sieben Kalibrierpunkten in aufsteigender Konzentration wurde für die Bestimmung der endogenen Konzentrationen genutzt. Zur Kompensation des Matrixeffektes wurden 10 isotopenmarkierte interne Standards in die Analytik eingefügt. Die Reproduzierbarkeit laufender Messungen wurde durch eingefügte Qualitätskontrollen (QCs) in drei verschiedenen Konzentrationsbereichen überwacht. Es wurde ein Gallensäure-Profiling mittels LC-MS/MS im Plasma und Lebergewebe von Ratten, die mit verschiedenen Arzneimitteln behandelt wurden, durchgeführt. Histopathologische Zusammenfassung Untersuchungen konnten aufzeigen, dass sich in den Lebern von männlichen Ratten, die mit dem Arzneimittel Amitriptylin über 14 Tage behandelt wurden, eine makrovesikuläre Steatose in der Leber manifestierte. Die klassischen Serummarker, wie ALAT, ASAT und Gamma-Glutamyltransferase (γGT), konnten diese Art des Leberschadens nicht detektieren. Dagegen erhöhten sich die Konzentrationen Glycin-konjugierter Gallensäuren mit parallel absinkenden Konzentrationen von Taurin-konjugierten Gallensäuren im Lebergewebe behandelter Ratten. Gleichzeitig ergaben sich signifikant erhöhte Konzentrationen der primären Gallensäuren CA und CDCA im Plasma behandelter Ratten. Andere Gallensäure-Profile konnten nach einer Methapyrilen-induzierten Leberzellnekrose mit hepatobiliärer Schädigung beobachtet werden. Nach einer 14-tägigen Behandlungsphase mit 80 mg/kg KG Methapyrilen, erhöhten sich die Konzentrationen von 11 Gallensäuren im Lebergewebe behandelter Tiere. Gleichzeitig stiegen die Konzentrationen von allen 20 individuellen Gallensäuren im Plasma behandelter Ratten an. Zusätzlich zur quantitativen Analyse von Gallensäuren mittels LC-MS/MS wurde die Expression von Genen der Gallensäure-Biosynthese, des Gallensäure-Transports und die Regulation der Gallensäure-Homöostase mittels Multiplex-Analyse untersucht. Die erhöhte Expression von Genen für Efflux-Transporter der Multidrug Resistance-Related Protein (MRP)-Familie deutet auf einen gesteigerten Abtransport von Gallensäuren ins Blut hin und korrespondierte mit erhöhten Gallensäure-Konzentrationen im Plasma der behandelten Ratten. Des Weiteren wurden die Erkenntnisse der Gallensäure-Profile aus den tierexperimentellen Studien als Grundlage genutzt, um Arzneimittel-induzierte Lebertoxizität auf ein zellbiologisches In-vitro-System zu übertragen. Es wurden In-vitro-Experimente mit primären Rattenhepatozyten zwischen zwei Kollagenmatrices (Sandwich-Kultivierung) durchgeführt. Dieses etablierte System wird u. a. für Untersuchungen an hepatobiliären Transportsystemen (z. B. Bile Salt Export Pump, BSEP) genutzt. Das Gallensäure-Profiling in den Zellkulturüberständen belegt, dass die primären Hepatozyten konjugierte Gallensäuren bilden, dass sie bei einer Inkubation mit primären Gallensäuren diese verstoffwechseln und dadurch, neben den bereits vorhandenen Gallensäuren, weitere konjugierte Gallensäuren produzieren. Eine Exposition mit den Hepatotoxinen Troglitazon und Methapyrilen führte zu Veränderungen in der Gallensäure-Homöostase der Hepatozyten. In den In-vivo-Experimenten wurde eine Methapyrilen-induzierte Nekrose mit hepatobiliärer Schädigung in den behandelten Ratten festgestellt. Bei der Behandlung mit Methapyrilen ergaben sich starke Konzentrationsanstiege der Gallensäuren im Plasma (u. a. von GCA und TCA), die mit den histopathologischen Befunden korrelierten. Anhand dieser Daten und der Zusammenfassung pharmakokinetischen Eigenschaften von Methapyrilen wurde ein Studiendesign für Rattenhepatozyten in Sandwich-Kulturen entwickelt, um eine initiale Abschätzung der Konzentrationsveränderungen von Gallensäuren im In-vitro-Testsystem durchzuführen. Ab Tag 8 der Behandlung kam es zu einem erhöhten Anstieg der GCA- und TCA-Konzentrationen im Zellkulturmedium. Daher besitzt das In-vitro-Testsystem möglicherweise das Potential, tierexperimentelle Studien bei der Bewertung einer Hepatotoxizität zu unterstützen oder sogar zu reduzieren. Insgesamt zeigen diese Ergebnisse aus dieser Arbeit, dass Gallensäure-Profiling in männlichen und weiblichen Ratten eine geeignete Methode zur Detektion und Differenzierung von Leberschäden ist. Die Technologie ist flexibel einsetzbar und kann bereits etablierte Testverfahren, wie die Bestimmung von Serummarkern in der Klinischen Chemie und die Histopathologie unterstützen. Damit besitzt das Gallensäure-Profiling das Potential, die Bewertung beim Nachweis und bei der Charakterisierung einer Lebertoxizität im Rahmen der Evaluierung von präklinischen Arzneimittelkandidaten zu verbessern. N2 - Drug-induced liver injury (DILI) remains a significant challenge in preclinical drug development. Nonclinical studies provide an opportunity to correlate the biochemical and morphological findings; however, liver injury is often complex and heterogeneous, confounding the ability to relate biochemical changes to specific, histopathological patterns of liver injury. The diagnostic performance of the available hepatobiliary markers, such as alanine aminotransferase (ALAT), aspartate aminotransferase (ASAT) or alkaline phosphatase (APh), for specific manifestations of liver injury, is often limited and insensitive, e.g. minimal to slight liver pathology might not result in changes to the serum marker. Furthermore, histopathological findings in the liver can occur without there being significant changes in the serum markers and vice versa. Although histopathology is the gold standard, its invasive nature makes it unsuitable for monitoring liver injury in toxicological and non-clinical studies. In recent years, study results of bile acid profiling, using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), indicated diagnostic potential regarding the detection of hepatotoxicity. This work aims to establish bile acid profiling in preclinical drug development and to demonstrate that bile acids can provide a valuable contribution to characterizing liver injury in preclinical safety diagnostics. For this purpose, a quantitative LC-MS/MS method was established and validated, in order to analyze 20 different endogenous bile acids in rats. The quantitative analysis enabled the selective determination of primary, conjugated and secondary bile acids. 2 MRM-transitions for qualitative and quantitative analysis were used for the quantification of the individual bile acids. Twenty bile acid reference standards were used for the calibration range. A seven-point calibration, in ascending concentration, was performed to quantify the absolute endogenous bile acid concentrations. Ten isotopically labeled internal standards were employed in the analyses to compensate for matrix effects. The reproducibility of the current measurements was monitored by quality controls (QCs) inserted into three different concentration ranges. Bile acid profiling was performed by LC-MS/MS of plasma and liver tissue of rats that had been treated with different hepatotoxins. The results of the bile acid profiling and histopathological evaluation revealed correlation between bile acid profiles and histopathological graded liver toxicity, e.g., the quantitative analysis and histopathological examination showed that macrovesicular steatosis was induced in the livers of male rats which had been treated with amitriptyline for 14 days. Classic serum markers, such as ALAT, ASAT, and gamma-glutamyltransferase (γGT), were unable to detect this specific manifestation of liver injury. In contrast, the concentrations of glycine-conjugated bile acids Summary increased while there was a parallel decrease in the levels of taurine-conjugated bile acids in the treated rats’ liver tissue. At the same time, there was a significant increase in the concentration of primary bile acids, CA and CDCA, in plasma of treated rats. Different bile acid profiles were observed following methapyrilene-induced liver cell necrosis with hepatobiliary damage. After a 14-day treatment phase with 80 mg/kg body weight methapyrilene, the concentrations of 11 bile acids increased in liver tissue of treated animals. At the same time, the levels of all 20 individual bile acids increased in plasma of treated rats. In addition to the quantitative analysis of bile acids with LC-MS/MS, the expression of specific genes associated with bile acid biosynthesis, and the transport and regulation of bile acid homeostasis, was analyzed using multiplex analysis of targeted mRNA. The increased expression of efflux transporter genes belonging to the multidrug resistance-related protein (MRP) family, indicated an increase in the efflux transport of bile acids into blood, and corresponded to increased bile acid concentrations in the plasma of treated rats. Furthermore, bile acid profiles originated from the animal studies, were used as reference to evaluate bile acid profiles regarding liver toxicity on a liver cell-based biological system. In vitro experiments were performed using primary rat hepatocytes between two collagen matrices (sandwich cultivation). This traditional in vitro model is used to study of hepatobiliary transport alterations (e.g., Bile Salt Export Pump, BSEP). Bile acid profiling of the cell culture supernatants demonstrated that the primary hepatocytes produced conjugated bile acids. Incubation with primary bile acids resulted in an improvement of the in vitro system by producing conjugated bile acids, in addition to those already existed. Exposure to troglitazone and methapyrilene resulted in changes in the hepatocytes’ bile acid homeostasis. In the in vivo experiments, methapyrilene treatment induced necrosis and hepatobiliary damage in the treated rats. There was a substantial increase in the concentration of plasma bile acids in the methapyrilene treatment group (including GCA and TCA), which correlated with the histopathological findings. Based on these data and the pharmacokinetic properties of methapyrilene, a study design was developed that used rat hepatocytes in sandwich cultures to provide an initial estimate of bile acid concentration changes in the in vitro test system. There was an increase in GCA and TCA concentrations in the cell culture medium from day 8 of the methapyrilene treatment. Therefore, the in vitro test system may have the potential to support or even reduce animal studies for evaluating hepatotoxicity. Bile acid profiling in male and female rats is a suitable method for detecting and differentiating liver injury. The technology can be used flexibly and can support already established test procedures, such as the determination of serum markers in clinical chemistry and histopathology. Summary Thus, bile acid profiling has the potential to fill the gap in the detection and characterization of hepatotoxicity, as part of the evaluation of preclinical drug candidates. KW - Hepatotoxizität KW - Biomarker KW - Gallensäuren KW - UHPLC-ESI-MS/MS KW - Biomarker KW - Gallensäuren KW - UHPLC KW - Lebertoxizität KW - Instrumentelle Analytik Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204627 ER - TY - THES A1 - Wagner, Silvia T1 - Identifizierung von Biomarkern mittels LC-MS-basiertem Metabonomics - Merkaptursäuren als Indikatoren für die Bildung toxischer Intermediate T1 - Identification of biomarkers via LC-MS-based metabonomics – mercapturic acids as indicators for the formation of toxic intermediates N2 - Metabonomics bildet das Ende der Omics-Kaskade und stellt eine top-down-Strategie zur Erfassung und Interpretation des Metaboloms, d. h. der Gesamtheit aller niedermolekularen Metaboliten in einem intakten Organismus, dar. Ziel der Technik ist es, mittels geeigneter ungerichteter Screeningverfahren in nicht-invasiv zu gewinnenden biologischen Proben wie Urin oder Blut charakteristische Metabolitenprofile zu bestimmen. Im Kontext des Metabonomics wurde in Anlehnung an den Geno- bzw. Phänotyp hierfür der Begriff „Metabotyp“ geprägt. Durch biostatistische Methoden, die auf Mustererkennung (pattern recognition) basieren, können Signaturen gegenübergestellt und auf diesem Weg gruppenspezifische Metaboliten, d. h. Biomarker bzw. Metabolitenmuster, extrahiert werden. Metabonomics kann folglich als Fusion klassischer bioanalytischer und biostatistischer Verfahren aufgefasst werden. Seit der Einführung im Jahr 1999 hat sich das Konzept des Metabonomics in mehrere Richtungen weiterentwickelt. So gab es Bestrebungen, die Technik, die ursprünglich zur Prädiktion von toxischen Effekten bei der Arzneistoffentwicklung etabliert wurde, auf Fragestellungen zu übertragen, die den Menschen im Mittelpunkt haben. Neben präklinischen Anwendungen verfolgt man mit Metabonomics zunehmend das Ziel, einer personalisierten Medizin und Ernährung einen Schritt näher zu kommen. Da sich die ursprünglich eingesetzte NMR-Technik als zu unempfindlich und die resultierenden Metabolitenprofile als zu anfällig gegenüber biologischen und analytischen Einflussgrößen (Confoundern) erwiesen haben, wurde parallel auf sensitivere Verfahren wie die Massenspektrometrie gesetzt. Insbesondere die Kopplung mit der Hochdruckflüssigchromatographie erwies sich hierbei für das Metabolitenscreening als geeignet. Schnell wurde allerdings klar, dass aus den klassischen full scan/TOF-Methoden Datensätze resultierten, die häufig zu komplex waren, um mit nachgeschalteten chemometrischen Verfahren die „Spreu vom Weizen trennen“ zu können. Da sich Metabolitendatenbanken bisher noch im Aufbau befinden, ist die Identifizierung der Marker mit zusätzlichen Schwierigkeiten verbunden und bedarf aufwändiger analytischer Verfahren. Eine Strategie stellt daher die Beschränkung auf ein Metabolitensubset dar. Indem man sich auf Metabolitenklassen fokussiert, die einen Bezug zum untersuchten Mechanismus haben, können die Erfolgsaussichten bei der Identifizierung charakteristischer Biomarker deutlich erhöht werden. Aufgrund zahlreicher exogener und endogener Faktoren (Arzneistoffe, Industriechemikalien, Nahrungsbestandteile, Tabakrauchbestandteile, Produkte der Lipidperoxidation etc.) ist der menschliche Organismus stets einer Vielzahl an elektrophilen Verbindungen ausgesetzt. Oxidative Schädigungen an Strukturen wie der DNA, Proteinen und Lipiden werden mit einer Reihe von Krankheitsbildern in Zusammenhang gebracht, darunter Parkinson, Alzheimer, Krebs und Volkskrankheiten wie Arteriosklerose, Allergien und koronare Herzerkrankungen. Mit dem Glutathionsystem verfügt der Körper über einen wirksamen Detoxifizierungsmechanismus. Das Tripeptid Glutathion reagiert als Nukleophil mit den exogen oder endogen gebildeten elektrophilen Intermediaten. Endprodukte sind Merkaptursäuren (N-Acetyl-L-Cystein-Addukte) bzw. deren Sulfoxide, die in erster Linie mit dem Urin ausgeschieden werden. Folglich besteht zwischen diesen Merkaptursäurederivaten und der elektrophilen Belastung eines Organismus ein direkter Zusammenhang. Vor diesem Hintergrund war es das Ziel der Arbeit, einen nicht-invasiven Metabonomicsansatz zur Anwendung am Menschen zu entwickeln. Durch die Fokussierung des Metabolitenscreenings auf die Effekt-, Dosis- und Suszeptibilitätsmarkerklasse der Merkaptursäuren sollten hierbei die Erfolgsaussichten im Hinblick auf die Identifizierung potentieller Biomarker für diverse toxikologische sowie medizinische Endpunkte erhöht werden. N2 - Metabonomics forms the end of the omics-cascade and represents a top-down strategy for the interpretation of the metabolome, i. e. all the low molecular weight metabolites in an intact organism. The aim of the approach is to analyse characteristic metabolite profiles by suitable untargeted screening methods in biological samples like urine or blood that can be obtained in a non-invasive manner. In the context of metabonomics, the term “metabotype” was defined according to the geno- and phenotype, respectively. Biostatistical methods based on pattern recognition techniques allow comparing metabolic signatures and extracting group specific metabolites and biomarkers. Therefore, metabonomics can be regarded as the fusion of bioanalytical and biostatistical techniques. Since its introduction in 1999, the concept of metabonomics has permanently gained importance in many fields of scientific research. One aim was to transfer the methodology, which was originally established to predict toxic effects in drug development processes, to human issues. Apart from preclinical questions, metabonomics is increasingly applied in the area of personalised medicine and nutrition. As the NMR technique used by pioneers of the field was too insensitive and the resulting metabolite profiles were too susceptible to biological and analytical confounders, more sensitive techniques like mass spectrometry were more and more applied. Especially mass spectrometry in combination with high performance liquid chromatography showed great promise for the screening of metabolites. However, after a very short time, it was clear that the data sets resulting from full scan/TOF-methods were too complex to “separate the wheat from the chaff” with chemometric procedures. Metabolite databases are still under construction, and therefore marker identification is challenging and requires complex analytical techniques. Thus, one strategy is to concentrate on a certain metabolite subset. The focus on a metabolite class with a close relation to the mechanism under investigation can considerably increase the prospects of success in the biomarker identification process. Due to a variety of exogenous and endogenous factors (drugs, industrial chemicals, food ingredients, and tobacco smoke) the human organism is steadily confronted with a multitude of electrophilic compounds. Oxidative damage of the DNA, proteins, and lipids is associated with the development of diseases like Parkinson’s, Alzheimer’s, cancer and widespread diseases like arteriosclerosis, allergies and coronary heart diseases. With the glutathione system the human organism is equipped with an efficient detoxification mechanism. The tripeptide glutathione reacts as nucleophile with exogenously and endogenously formed electrophilic intermediates. End products are mercapturic acids (N-acetyl-L-cysteine-adducts) and respective sulfoxides that are predominantly excreted with urine. Therefore, there is a close relationship between these mercapturic acid patterns and the electrophilic burden of an organism. In this context, the aim of this thesis was to develop a non-invasive human metabonomics approach that focuses the metabolite screening on the effect, dose and susceptibility marker class of the mercapturic acids. Thus, the prospects of success regarding the identification of potential biomarkers for various toxicological and pathological endpoints should be increased. KW - Metabolom KW - Biomarker KW - Datenanalyse KW - Paracetamol KW - Validierung KW - Tetrachlormethan KW - Raucher KW - Tabakrauch KW - Zigarettenrauch KW - Biostatistik KW - Chemometrie KW - Hauptkomponentenanalyse KW - Methode der partiellen kleinsten Quadrate KW - Diskriminanzanalyse KW - Fl KW - Merkaptursäuren KW - Metabonomics KW - Metabolomics KW - Expositionsmarker KW - mercapturic acids KW - metabonomics KW - metabolomics KW - markers of exposure Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35760 ER -