TY - THES A1 - Flechsig, Christin T1 - Untersuchung von Modifiziertem Vaccinia Ankara Virus (MVA) zur Induktion Cytomegalovirus (CMV) spezifischer T-Zell-Antworten T1 - Investigation on modified vaccinia Ankara virus (MVA) for induction of Cytomegalovirus (CMV) specific T cell responses N2 - Eine Infektion mit dem humanen Cytomegalievirus ist immer noch eine der häufigsten und bedrohlichsten Komplikationen nach einer allogenen Stammzelltransplantation (SCT), welche eine hohe Morbidität und Mortalität verursacht. Die prophylaktische oder preämptive antivirale Chemotherapie konnte den frühen Ausbruch einer CMV-Erkrankung während der ersten 100 Tage nach SCT signifikant reduzieren, jedoch kommt es dadurch häufig zu einem späten Ausbruch der CMV-Erkrankung und schwerwiegenden Nebenwirkungen wie Myelotoxizität und Nephrotoxizität. Zur Bekämpfung und Langzeitkontrolle einer CMV-Infektion ist eine effiziente zellvermittelte CMV-spezifische Immunität unabdingbar. Im Rahmen dieser Dissertation, wurden deshalb drei CMV-Vakzinkandidaten basierend auf dem hoch attenuierten Modifizierten Vaccinia Ankara Virus (MVA), welche stabil pp65 und/oder IE1 (MVA-IE1, MVA-pp65, and MVA-IE1-pp65) exprimieren und zugleich frei von Selektionsmarkern sind, auf ihre Fähigkeit hin untersucht CMV-spezifische T-Zellantworten zu induzieren. Als erstes wurden humane mononukleäre Zellen des periphären Blutes (PBMCs) und Leukozytensubpopulationen (aus Monozyten generierte dendritische Zellen (DCs), Monozyten und B-Zellen) mit MVA infiziert um deren Infektionsrate, Veränderungen in der Expression der Oberflächenmarker und der Zytokinexpression sowie deren Apoptoserate zu untersuchen. Monozyten, DCs und B-Zellen waren besonders empfänglich für eine MVA-Infektion, gefolgt von NK-Zellen. Monozyten wurden stark aktiviert, was sich durch eine erhöhte Expression der kostimulatorischen Moleküle, MHC-Komplexe und CCR7 zeigte, wohingegen DCs eine inkomplette Aktivierung vorwiesen und B-Zellen gehemmt wurden. Des Weiteren wurde die Expression von CXCL10, TNFa, IL-6 und IL-12 signifikant in den Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) erhöht, aber die von IL-1b und IL-10 blieb unverändert oder wurde sogar signifikant reduziert. MVA induzierte also eine Th1-polarisierenden Zytokinexpression in den APCs. Allerdings konnten CMV-spezifische T-Zellen nicht mit direkter Antigenpräsentation durch DCs expandiert werden, da die DCs nach Infektion mit MVA schnell durch Apoptose starben und eine unzureichende Expression der kostimulatorischen Moleküle und MHC-Komplexe aufwiesen. Vielmehr konnte gezeigt werden, dass die erfolgreiche Expansion CMV-spezifischer T-Zellen mittels Kreuzpräsentation von Antigenen MVA-infizierter Leukozyten durch DCs erfolgte. Die Phagozytose von apoptotischen Material von MVA-infizierten Leukozyten mit anschließender Antigenprozessierung induzierte eine vollständige Ausreifung der DCs in vitro einhergehend mit erhöhter IL-12-Expression, was erheblich zu einer erfolgreiche T-Zell-Stimulation und –Expansion beitrug. Neben pp65-spezifischen T-Zellen wurden auch IE1-spezifische T-Zellen expandiert, wenn auch in einem geringeren Ausmaß. Der größte Teil der expandierten T-Zellen wies einen Effektor-Gedächtnis-(EM)-Phänotyp auf. Ein kleinerer Anteil besaß jedoch einen zentralen Gedächtnis-(CM)-Phänotyp, welcher bekannt ist für eine Langzeitpersistenz und eine erfolgreiche Etablierung eines T-Zell-Gedächtnis-Pools. Darüber hinaus wurden keine Vaccinia-spezifischen T-Zellen der pockengeimpften Spender expandiert. Wodurch ist die Immunogenität der CMV-Antigene nicht beeinträchtigt ist. Die drei untersuchten MVA-CMV-Vakzinkandidaten erfüllen alle Stabilitäts-, Immunogenitäts- und Sicherheitsbestimmungen der Europäischen Arzneimittelbehörde (EMEA) für virale Vektorimpfstoffe und sind deshalb bereit für die cGMP-Produktion und anschließende klinische Prüfung. N2 - Infection with human Cytomegalovirus (CMV) remains one of the most frequent and life threatening complications after allogenic stem cell transplantation (SCT) causing serious morbidity and mortality. Prophylactic or preemptive antiviral chemotherapy could significantly reduce the early onset of CMV disease during the first 100 days after SCT but at the expense of an increasing late onset CMV disease and severe side effects like myelotoxicity and nephrotoxicity. An efficient cell mediated CMV specific immunity is crucial to eradicate CMV for long-term control of CMV infection. In the scope of this dissertation, three CMV vaccine candidates based on the highly attenuated modified vaccinia Ankara Virus (MVA) with stable expression of pp65 and/or IE1 (MVA-IE1, MVA-pp65, and MVA-IE1-pp65) without any selection marker were examined for the induction of CMV-specific T cell responses. At first, Human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and leukocyte subpopulations (monocyte derived dendritic cells (DCs), monocytes and B cells) were infected with MVA in order to evaluate their infection rate, changes in surface markers, cytokine expression and apoptosis. Monocytes, DCs and B cells were most susceptible to MVA infection followed by NK cells. Monocytes were activated strongly with upregulation of costimulatory molecules, MHC-complexes and CCR7 while DCs showed an incomplete activation and B cells were inhibited. Furthermore, expression of CXCL10, TNFa, IL-6 and IL-12 were enhanced in antigen presenting cells (APCs) but IL-1b and IL-10 were stable or even downregulated. Thus, MVA seems to induce a Th1-polarizing cytokine expression in APCs. However, successful expansion of CMV specific T cells could not be achieved via direct antigen presentation by DCs, as the DCs died fast after infection with MVA by apoptosis and displayed an insufficient expression of costimulatory molecules and MHC-complexes. Rather, it could be shown that successful expansion of CMV specific T cells is achieved via cross presentation of antigens from MVA infected leukocytes by bystander DCs. Phagocytosis of apoptotic material from MVA infected leukocytes and subsequent antigen processing induced a full maturation of DCs in vitro with upregulation of IL-12 expression and hence, makes a considerable contribution to a successful T cell stimulation and expansion. In addition to pp65 specific T cells, also IE1 specific T cell could be expanded but to a lower extend. The major part of expanded T cells displayed an effector memory (EM) phenotype. However, the minor part of expanded T cells displayed a central memory (CM) phenotype, which is known for long-term persistence and successful establishment of a memory T cell pool. Moreover, vaccinia specific T cells of smallpox vaccinated donors could not be expanded. Thus, the immunogenicity to the CMV antigens is not impaired. The MVA-CMV vaccine candidates fulfill all terms of stability, immunogenicity, and safety of the European Medicines Agency (EMEA) for viral vector vaccines. Therefore, the MVA-CMV vaccine candidates are ready for cGMP production and subsequent clinical trials. KW - Zielzelle KW - Virologie KW - Impfstoff KW - Vaccinia-Virus KW - Cytomegalie KW - Modifiziertes Vaccinia Ankara Virus KW - IE1 KW - pp65 KW - Impfvektor KW - Kreuzpräsentation KW - Dendritische Zellen KW - Cytomegalie-Virus KW - modified vaccinia Ankara virus KW - IE1 KW - pp65 KW - vaccine vector KW - cross presentation KW - dendritic cells Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57637 ER - TY - THES A1 - Gierlich, Philipp T1 - Ausreifung humaner dendritischer Zellen durch die TLR-Agonisten Poly(I:C) und R848 mit PGE\(_2\). Auswirkungen auf Phänotyp, Zytokinproduktion, Migration und das antigenspezifische Priming von naiven CD8\(^p\)\(^o\)\(^s\) T-Zellen T1 - Maturation of human dendritic cells through TLR agonists poly(I:C) and R848 with PGE\(_2\). Effects on phenotype, cytokine production, migration and the antigen specific priming of CD8\(^p\)\(^o\)\(^s\) t-cells N2 - Gegenstand der Arbeit: Es wurde der Einfluss einer Ausreifung dendritischer Zellen mit Poly(I:C), R848 und Prostaglandin E2 (=tlrDCs) zur Verwendung im Rahmen der Tumorvakzine untersucht. Für den Einsatz einer doppelten TLR-Stimulation gibt es zahlreiche zellphysiologische Gründe, wobei PGE2 als Motilitätsförderer eingesetzt wird. Es besitzt negative Teilwirkungen auf die Zytokinsekretion, eine verbesserte Migration stellt aber die wichtigste Stellgröße zur Optimierung der Tumorvakzine dar. Ergebnisse: Für tlrDCs konnte neben einer hohen Fähigkeit zu Migration und Kostimulation eine überlegene Immunstimulation für naive CTLs und TH1/TC1-Antworten in einem antigenspezifischen Primingmodell nachgewiesen werden. Eine Ausreifungsdauer von 16 h erscheint für die Zytokinsekretion der DCs günstig. Es lässt sich eine hohe Wahrscheinlichkeit für die Generation von Central-Memory-T-Zellen und das T-Zell-Homing ins ZNS ableiten. N2 - Subject: This thesis investigated the impact of dendritic cell maturation with poly(I:C), R848 and prostaglandine E2 (=tlrDCs) for use in the context of tumor vaccines. There are several cell-physiological rationales for a dual TLR stimulation whilst PGE2 is acting as a promoter of mobility. It has partially negative effects on cytokine secretion, however improving migration is believed to be the most important variable for optimizing tumor vaccines. Results: Besides their high capacity in migration and co-stimulation tlrDCs showed superior immuno-stimulation for naive CTLs and TH1/TC1 responses in a model of antigen-specific priming. A maturation period of 16 h seemed to be favorable for cytokine secretion of DCs. A good chance for the generation of central memory T-cells and T-cell homing into the CNS can be deduced. KW - Reifung KW - Dendritische Zelle KW - Toll-like-Rezeptoren KW - Tumor KW - Impfstoff KW - Glioblastom KW - Poly(I:C) KW - TLR3 KW - R848 KW - TLR8 KW - Kostimulation KW - Zytokine KW - Migration KW - Homing KW - Priming Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-188756 ER - TY - THES A1 - Glenz, Karin T1 - Entwicklung eines Lipoprotein-Impfstoffes aus Pflanzen : Produktion des rekombinanten 'outer surface protein A' (OspA) von Borrelia burgdorferi in Tabakchloroplasten T1 - Production of vaccines in transgenic plants: Expression of the recombinant outer surface protein A (OspA) of Borrelia burgdorferi in tobacco chloroplasts N2 - Transgene Pflanzen nehmen einen wachsenden Stellenwert bei der Produktion therapeutischer Proteine, besonders von Impfstoffen, ein. Einige dieser Proteine benötigen für ihre Funktionalität verschiedenste post-translationale Modifikation und es ist nicht bekannt, ob Pflanzen zu diesen Stoffwechselleistungen befähigt sind. In der vorliegenden Arbeit sollte anhand eines bakteriellen Antigens geprüft werden, ob in Chloroplasten von Nicotiana tabacum an einem rekombinanten Protein eine besondere Form der post-translationalen Modifikation, die Lipidierung, durchgeführt wird und ob somit ein alternatives Produktionssystem für einen Lipoprotein-Impfstoff entwickelt werden kann. Basis für diese Untersuchungen war das bakterielle Lipoprotein OspA (outer surface protein A) aus Borrelia burgdorferi. Dieses Protein wird zur Prävention von Lyme-Borreliose eingesetzt und frühere Untersuchungen zeigten, dass OspA sowohl in B. burgdorferi als auch nach heterologer Expression in E. coli einer post-translationalen Lipidierung am N-Terminus unterliegt. Dabei wird das Protein unter Mitwirkung dreier Enzyme (Lgt, Lsp und Lnt) am N-Terminus mit einer Pam3Cys-Struktur versehen und die N-terminale Signalsequenz abgespalten. In dieser Arbeit konnten nach der Etablierung eines Expressionssystems mehrere unabhängige transplastome OspA-Tabakpflanzen generiert werden. Der Anteil an rekombinantem, plastidärem OspA (rpOspA) am löslichen Gesamtprotein wurde mit ca. 1% bestimmt. Dabei lag rpOspA sowohl in einer lipidierten, membrangebundenen als auch in einer nicht-modifizierten, löslichen Form vor. Strukturelle Untersuchungen an rpOspA ergaben, dass in Chloroplasten eine Bakterien-ähnliche Lipidierung an dem Protein durchgeführt wurde. Dabei wurde am N-Terminus ein Diacylglycerin über eine Thioetherbindung an das einzige in der Sequenz vorkommende Cystein gebunden. Anders als in Bakterien wurde die Signalsequenz in Chloroplasten jedoch nicht abgespalten und infolgedessen keine dritte Fettsäure an das Cystein gebunden. Die plastidäre Modifikation an rekombinantem OspA resultierte daher in einer Pam2Cys-Struktur mit Signalsequenz. Untersuchungen zur Immunogenität des rpOspA in Mäusen zeigten eindeutig, dass das rekombinante Protein aus Tabak die Bildung spezifischer Antikörper induziert und damit in seiner Wirkung vergleichbar dem bakteriellen Protein ist. Um die Lipidierungsrate des akkumulierten OspA in Chloroplasten zu erhöhen, wurden weitere transplastome Tabakpflanzen generiert. Diese wiesen neben dem ospA-Gen auch die Gene (lgt, lsp und lnt) der drei modifizierenden Enzyme aus E. coli auf. Durch die simultane Bildung von OspA und den drei modifizierenden Enzyme konnte eine quantitative Lipidierung von rpOspA mit einer Pam2Cys-Struktur erlangt werden. Als Grundlage für vergleichende Untersuchungen zwischen plastidärer und cytoplasmatischer Lipidmodifikation in Tabak wurden ebenfalls Transformationen des Zellkerns mit ospA durchgeführt, wobei jedoch keine heterologe ospA-Expression erreicht werden konnte. Erst durch die Anwendung eines transienten, viralen Expressionssystems war es möglich, ospA im Zellkern zu exprimieren. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass in Chloroplasten Höherer Pflanzen eine Bakterien-ähnliche Modifikation an rekombinantem OspA durchgeführt wird und das resultierende Protein eine spezifische Immunantwort in Mäusen induzieren kann. Das Potential von transgenen Pflanzen als alternatives Produktionssystem für Lipoprotein-Impfstoffe wird diskutiert. N2 - Transgenic plants play an increasing role in the production of therapeutical proteins, especially vaccines. Some of those proteins need a posttranslational modification for their activity of immunogenicity and it is still ambiguous if plants are capable of performing these modifications. In the present study it was investigated by the use of a bacterial antigen if a particular form of posttranslational modification, the lipidation of proteins, is performed in chloroplasts of Nicotiana tabacum and if the resulting plants could be further developed into an alternative production system for lipoprotein-vaccines. For this investigation, the bacterial lipoprotein OspA (outer surface protein A) of Borrelia burgdorferi was chosen, a protein used as a vaccine against Lyme disease. Previous studies have been shown that OspA is lipidated on its N-terminus both in B. burgdorferi and when expressed in Escherichia coli. This modification is performed by three different enzymes (Lgt, Lsp and Lnt) which build up a Pam3Cys-structure at the N-terminus of the protein while the N-terminal signal sequence is cleaved. In the present study several independent transgenic plant lines could be generated by the use of a suitable expression system. Analysis showed that the fraction of recombinant plastidal OspA (rpOspA) in transplastomic plants reached approx. 1% of the total soluble protein. Moreover, a lipid modification could be detected in a fraction of the rpOspA which resulted in the membrane association of a portion of the recombinant protein. The structural analysis of rpOspA revealed that in chloroplasts, rpOspA is lipidated in a bacteria-like manner, including the attachment of a diacylglycerol moiety to the sole cysteine via a thioether linkage. Other than in bacteria, the signal peptide is not cleaved in chloroplasts; thus, no additional fatty acid is attached to the cysteine. The plastidal modification on recombinant OspA therefore resulted in a Pam2Cys-structure including the signal sequence. Furthermore, the rpOspA from tobacco showed similar immunogenic properties as the recombinant protein from bacteria when tested in mice, showing the potential of plants as a production system for lipoprotein-vaccines. To further increase and modify the lipidation rate and pattern of tobacco-derived OspA, a new set of transplastomic tobacco plants were generated. These plants not only carried the ospA gene, but also the genes encoding for the three modifying enzymes (lgt, lsp and lnt). This simultaneous expression shifted the ratio between lipidated and non-lipidated rpOspA almost quantitatively to the lipidated form. For further comparisons of the OspA-lipidation either in plastids or in the cytosol transgenic tobacco plants were established. However, after stable integration of ospA into the nuclear genome, no detectable heterologeous expression could be achieved. Only by using a transient viral expression system the nuclear ospA expression was feasible. In this study it has been shown, that in chloroplasts of higher plants a bacteria-like modification on recombinant OspA was performed and that the resulting protein induced a specific immune response in mice. The potential of transgenetic plants as an alternative production system for lipoprotein-vaccines is discussed. KW - Lyme-Krankheit KW - Impfstoff KW - Tabak KW - Chloroplast KW - Lipoprotein KW - pflanzliche Vaccine KW - Lyme-Borreliose KW - lipoproteins KW - plant-derived vaccines Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15884 ER - TY - THES A1 - Jördens, Markus Sebastian T1 - Einfluss des Komplementsystems und der neuartigen Meningokokken-Vakzine 4CMenB auf cnl-Meningokokken T1 - Influence of the complement system and the novel meningococci-vaccine 4CMenB on cnl-meningococci N2 - In dieser Arbeit wurden verschiedene Vakzine-relevante Oberflächenantigene von cnl-Meningokokken typisiert und die Interaktion von cnl-Meningokokken mit dem Komplementsystem, v.a. mit dessen Hauptregulatoren fH und C4bp, analysiert. Mit den gewonnenen Daten sollten Schlussfolgerungen bzgl. der erwarteten Wirkung von 4CMenB, einem 2013 in Deutschland eingeführten und auf Meningokokken der Serogruppe B abzielenden Impfstoff, auf cnl-Meningokokken gezogen werden. Des Weiteren sollte die Interaktion der natürlicherweise unbekapselten cnl-Meningokokken, die als apathogen und möglicherweise günstig für die Entwicklung einer natürlichen Immunität eingeschätzt werden, untersucht werden. Eine Auswahl von cnl-Meningokokken-Stämmen, die die genetische Variabilität dieser Bakterienpopulation abbilden, wurde mittels PCR (porA, porB, fetA, opc, fHbp, nhba und nadA) oder Western Blot-Analyse (Opc) typisiert. Hierbei konnte eine deutliche Assoziation einzelner Allele zu klonalen Komplexen gezeigt werden. Allerdings lässt die Analyse bezweifeln, dass cnl-Meningokokken durch Bexsero-induzierte Antikörper erkannt werden, da ihr Antigenmuster stark von den Vakzineantigenen abweicht. Unklarheit herrscht lediglich bzgl. des Antigens NhbA. In der Folge wurde die fH- und C4bp-Bindung bei cnl-Meningokokken mittels Durchflusszytometrie untersucht. Es konnte beobachtet werden, dass im Vergleich zu fH bzw. C4bp bindenden Kontrollstämmen die Bindung der Hauptregulatoren des Komplementsystems an cnl-Meningokokken sehr gering ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass cnl-Meningokokken eine sehr geringe Serumresistenz in vitro haben, was ebenfalls für eine schwache Akquirierung der Komplementregulatoren spricht. Dieser Befund unterstreicht die apathogene Natur der Bakterien. Er zeigt aber auch, dass mit herkömmlichen Methoden wie dem Serumbakterizidietest, der bei bekapselten Stämmen angewendet wird, funktionelle Aussagen bzgl. der Wirkung bakterizider Antikörper, die durch Impfstoffe auf Proteinbasis induziert werden, nur schwer zu tätigen sein werden. Sehr geringe Komplementmengen müssten eingesetzt werden oder alternative Verfahren wie die Opsonophagozytose Anwendung finden. N2 - In this study we typed Vaccine-relevant outer membrane antigens of cnl-meningococci. Furthermore we analysed the interactions of cnl-meningococci with the complement System, especially with the main Regulators factor H and C4bp. The data should help to estimate the impact of 4CMenB, a vaccine against meningococci of serogroup B which was introduced to the german market in 2013, on cnl-meningococci. In addition we examined the interactions of the complemet system with cnl-meningocicci, which are supposed to be apathogen and maybe beneficial for the development of natural immunity. A selection of cnl-meningococci which represent the genetical variability of that bacteria Population was typed for outer membrane Proteins by PCR (porA, porB, fetA, opc, fHbp, nhba, nadA) or western-blot (opc). A close assotiation of allels to clonal complexes could be shown. It is likely that cnl-meningococci are not detected by Bexsero-induced antibodies as their antigen pattern differs from the vaccine Antigens. The only Antigen which ould be detected is NhbA. Factor H and C4bp-binding to cnl-meningococci was examined using flow cytometry Analysis. The binding of fH or C4bp to cnl-meningococci was significantly lower as to fH- or C4cb-binding controll strains. Furthermore serum resistance of cnl-meningococci in vitro is low, which is also an indicator for weak binding of Regulators of the complement System. This finding underlines the apathogen nature of cnl-meningococci. It also indicates the problem of serum bactericidity tests to assess the impact of antibodies induced by protein based vaccines. KW - Meningoencephalitis KW - Komplement KW - Impfstoff KW - Faktor H KW - C4bp KW - cnl-Meningokokken KW - fHbp KW - nhba Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-147071 ER - TY - THES A1 - Löffler, Daniela Inge Martina T1 - Untersuchungen virulenzattenuierter Listeria monocytogenes Stämme als Impfstoffträger im Mausmodell T1 - Virulence-attenuated Listeria monocytogenes strains as vaccine carrier in vivo N2 - Virulenzattenuierte Stämme des Gram-positiven Pathogens Listeria monocytogenes (Lm) stellen optimale Kandidaten als Träger für heterologe Proteinantigene in die Maus dar. Lm repliziert nach Befreiung aus dem primären phagosomalen Kompartiment sehr effizient und schnell im Zytosol sehr vieler nicht-phagozytischer Wirtszellen als auch in professionellen antigenpräsentierenden Zellen (APC). Diese Fähigkeit in relevante immunologische APCs einzudringen und zu replizieren, erlaubt die zielgerichtete Übertragung heterologer Antigene in die MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Präsentationswege, um so eine effektive zelluläre Immunität zu etablieren. In der vorliegenden Arbeit wurden die in vivo Effizienzen der Aktivierung von antigen-spezifischen CD8+ and CD4+ T-Zellen miteinander verglichen, sobald das plasmidkodierte Proteinantigen Ovalbumin (OVA) in Form von bakteriell exprimierten und exportierten Proteinen, von cDNA oder mRNA durch die jeweiligen virulenzattenuierten Lm trpS Stämme in das Zytosol von antigenpräsentierenden Zellen freigesetzt wurde. Die Freisetzung wurde durch ein Listeria-spezifisches Phagenlysin, welches von den Bakterien vorwiegend im Zytosol der Wirtszelle exprimiert wird, unterstützt. Die Übertragung dieser unterschiedlichen biologisch-aktiven Moleküle durch die autolysierenden Listerien führte im Falle des Proteins und der mRNA erfolgreich zu einer MHC-Klasse-I-Präsentation eines Ovalbumin-Peptides (SIINFEKL), welche letztendlich eine adaptive zelluläre Immunität unter Beteiligung von T-Gedächtniszellen induzierte. Dabei stellte sich die Übertragung des Proteins durch Lm als die effizienteste Strategie im Induzieren einer zellulären adaptiven Immunantwort mit gegen Ovalbumin gerichteten CD8 und CD4 T-Gedächtniszellen heraus. Autolysierende Listerien, welche die plasmidkodierende OVA-DNA übertrugen, lösten dagegen keine OVA-spezifische T-Zellantwort aus. Da sich der Trägerstamm Lm trpS aufgrund der Autolysiskassette zwar als virulenzattenuiert herausgestellt hatte, jedoch bei höher Applikationsdosis dieses Stammes es nur zu einer unvollständigen Lysis kam, wurden die jeweiligen Effizienzen weiterer noch stärker attenuierter autolysierender Lm Stämme als Überträger des Ovalbumins (Lm Mutanten trpS hlyW491A und (trpS aroA aroB)) bestimmt. Beide ermöglichten die OVA-Präsentation über MHC-Klasse-I-Moleküle mit nachfolgender klonaler Expansion spezifischer CD8+ T-Zellen in vergleichbaren signifikanten Werten zum WT Stamm trpS. Ferner wurde zum ersten Mal eine signifikante Präsentation des OVAs über MHC-Klasse-I-Moleküle durch die autolysierende Mutante trpS hlyW491A, welche die plasmidkodierende DNA freisetzte, nachgewiesen. Die autolysierende Lm (trpS aroA aroB) Mutante in hoher CFU (5107) stellte sich dabei als ein sehr vielversprechender Träger des heterologen Proteinantigens heraus, da sie im Gegensatz zum autolysierenden Stamm Lm trpS eine sehr geringe Leberschädigung hervorrief. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, das durch Freisetzung von OVA Antigenen in das Zytosol oder ins Phagosom von APCs, welche von den jeweiligen Lm (trpS aroA aroB) Stämmen als exportiertes, zellwandverankertes oder intrazellulär verbleibendes Protein exprimiert wurden, vergleichbare Häufigkeiten an proliferierten OVA-spezifischen CD8+ T-Zellen induzierten werden konnten. Es zeigten sich jedoch deutliche Unterschiede in der Aktivierung antigen-spezifischer CD4+ T-Zellen durch diese Lm (trpS aroA aroB) OVA-Trägerstämme. Die Strategie der Übertragung exportierter Proteine ins Phagosom oder ins Zytosol antigenpräsentierender Zellen war die wirkungsvollste, um gleichzeitig effiziente MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-restringierte Antigenpräsentationen in vivo zu induzieren. Es wurden alternative plasmidkodierende Lysiskassetten für die Freisetzung von DNA-Vakzinen (Baktofektion) aus den Bakterien konstruiert, die alle aus Lyseproteinen eines Listeria-spezifischen Phagens und einem vorangestellten zytosolischen listeriellen Promotor bestehen. Diese wurden in ihrer Effizienz mit der ursprünglich eingesetzten Lysiskassette PactA-ply118 verglichen. Dabei wurde beobachtet, dass zwei von den vier neukonstruierten Lysiskassetten in einige Zellinien vergleichbare Baktofektionsraten erzielten. Jedoch ist die ursprüngliche Phagenlysin-Kassette PactA-ply118 für die Übertragung von Plasmid-DNA in das Zytosol von Wirtszellen die wirksamste, da diese in vivo zu einer besonders hohen Attenuation der Bakterien führte. N2 - Virulence-attenuated strains of the Gram positive pathogen Listeria monocytogenes (Lm) are optimal candidates for the delivery of heterologous antigens into mammalian hosts. Lm escapes the phagosome, replicates efficiently within the cytosol of many host cells including appropriate cells of the immune system like macrophages and dendritic cells (antigen presenting cells, APCs). These natural biological properties of Lm to enter and replicate in relevant immunological APCs allow the targeted delivery of heterologous antigens into the antigen-processing pathway of MHC class I and MHC class II molecules leading to a strong cellular immunity. In this work, the in vivo efficiences of activation of antigen-specific CD8 and CD4 T cells were compared when the plasmid-encoded protein antigen ovalbumin was secreted by the bacteria as a protein or delivered as cDNA or as mRNA. Delivery was supported also by a specific endolysin produced by the bacteria. Listeriae harbouring this transcriptional unit undergo lysis when they reach the cytosol. In the case of OVA as protein or as mRNA, delivery of these different biological active molecules by autolysing Listeria resulted in significant OVA peptide (SIINFEKL) presentation in the context of MHC class I molecules, which also induced an adaptive cellular immunity with memory T cells. Secretion of OVA by the carrier bacteria yielded the strongest immune response involving OVA-specific memory CD8 and CD4 T cells. In contrast, infection with autolysing Listeria delivering OVA-encoded DNA failed to generate OVA-specific T cells. Due to its harbouring of the autolysing cassette, carrier strain Lm trpS was virulence-attenuated, but infection with 5107 bacteria of this strain resulted in a partial lysis. Therefore investigation of other attenuated and also autolysing strains (Lm mutants trpS hlyW491A and (trpS aroA aroB)) was necessary. Both these strains facilitated OVA presentation via MHC-class-I molecules resulting in clonal expansion of specific CD8+ T cells in comparable frequencies as the wild-type strain. Furthermore, autolysing Lm trpS hlyW491A delivering OVA-encoded DNA led to specific presentation of OVA in the context of MHC class I molecules. Additionally, autolysing Lm (trpS aroA aroB) strain with high infection dose (5107) is a promising carrier for heterologous protein antigens because this mutant exhibited only marginal liver toxicity in contrast to the strain Lm trpS. In this regard, comparable frequencies of proliferated OVA-specific CD8+ T cells were induced through the delivery of OVA antigens into phagosome or cytosol of APCs that were expressed as secreted proteins, as anchored-proteins or as intracellular proteins by the respective carrier Lm strains (trpS aroA aroB). Activation of antigen-specific CD4+ T cells by these OVA-carrier Lm (trpS aroA aroB) was different compared to activation of antigen-specific CD8+ T cells. Secretion of OVA by the carrier bacteria yielded the strongest activation of both MHC-class I and II restricted antigen presentation in vivo. Different lysis cassettes were tested consisting of Listeria-specific phage lysis proteins and an intracellular promoter of Listeria for the delivery of DNA vaccines (bactofection). The efficiency of these cassettes was compared to the original cassette (PactA-ply118). Two of the four new cassettes achieved comparable bactofection rates in some cell lines as the originally used cassette. However, the Lm strain containing the cassette PactA-ply118 was found to be the most effective due to high attenuation in mice. KW - Listeria monocytogenes KW - Attenuierung KW - Impfstoff KW - Maus KW - Listeria monocytogenes KW - Impfstoffe KW - Mausmodell KW - Listeria monocytogenes KW - vaccines KW - in vivo Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18728 ER - TY - THES A1 - Racek, Tomáš T1 - Entwicklung und Erprobung eines Impfkonstrukts für das Humane Immundefektvirus (HIV) auf der Basis eines replikationsinkompetenten HIV-Vektors T1 - Development and testing of HIV-1 vaccine based on replication-incompetent HIV vector N2 - Immunogenität von retroviralen und lentiviralen Vektoren wurde als ein Haupthindernis für deren Applikation in der Gentherapie betrachtet worden. Dies kann jedoch als Vorteil für den Einsatz dieser Vektoren als Impfstoffkandidaten gegen HIV-Infektion und AIDS genutzt werden. Um das Potenzial von lentiviralen Vektoren eine humorale und zelluläre Immunantwort zu induzieren zu prüfen, wurde eine Reihe VSV-G-pseudotypisierter replikations-inkompetenter HIV-1-Vektoren hergestellt, die entweder ein Kodon-optimiertes HIV-p17/p24 (hgag)- oder das Grün fluoreszierende Protein (GFP)-Transgen enthalten. Die Infektion mit dem VSV-G pseudotypisierten HIV-1-Vektor pGJ2 führte in allen getesteten Zelllinien und auch in primären humanen und murinen Zellen zur Transgenexpression. Ebenfalls konnte eine direkte Expression des Transgens in vivo nachgewiesen werden. Balb/c-Mäuse wurden in einem Vektoren- oder DNA-Prime und Vektoren-Boost-Verfahren immunisiert und die humorale und zelluläre Immunantwort wurde untersucht. Die Primärimmunisierung mit DNA und Boosting mit den lentiviralen Vektoren induzierte eine Gag-spezifische humorale Immunantwort, hohe Titer von VSV-G-neutralisierenden Antikörpern und eine Gag- und EGFP-spezifische zytotoxische T-Zell-Antwort. Dabei wurde festgestellt, dass sowohl Strukturbestandteile des lentiviralen Vektors als auch die Transgenexpression zur Aktivierung der Immunantwort beitrugen. So machen die einzigartigen biologischen und immunologischen Eigenschaften der replikationsdefizienten HIV-Vektoren aus diesen Konstrukten wertvolle Werkzeuge, um weiter die Immunmechanismen, die für den Schutz gegen HIV-Infektion und Krankheit bedeutsam sind, zu studieren. Im Rahmen der hierzu durchgeführten Arbeiten wurden außerdem Vacciniavirus/HIV-1-Hybridvektoren hergestellt und analysiert. Um die Transkription der lentiviralen Vektor-Kassette durch das Vacciniavirus zu ermöglichen, wurde vor den Transkriptionsstart ein Vaccinia-Promotor gesetzt und an das 3’-Ende das Transkription-Stoppsignal angehängt. Obwohl die genomische Analyse eine erfolgreiche Herstellung der Hybridvektoren bestätigen konnte, muss die Produktion der lentiviralen Vektoren nach der Vaccinia-Infektion weiter optimiert werden. Nichtsdestotrotz könnte die Kombination von replizierenden Vacciniaviren und replikationsinkompetenten HIV-Vektoren ein neuartiges Impfkonzept darstellen. Die Expression von HIV-Strukturgenen würde in der ersten Phase der Infektion mit dem Vacciniavirus/HIV-1-Hybridvektor zu einer starken humoralen und zellulären Immunantwort führen. Die Bildung von lentiviralen Vektoren würde diese Immunantwort weiter boosten, und falls die lentivirale Vektorkassette dann ein entsprechendes Transgen enthalten würde, würde dies weiter die Immunantwort verstärken und vor allem könnte diese Art des Impfstoffes eine langzeitige falls nicht dauerhafte HIV-spezifische Immunantwort erzeugen. N2 - Immunogenicity of retroviral and lentiviral vectors has been regarded as a major impediment to the use of these constructs in gene therapy. However, this may be exploited for the design of vaccine candidates against HIV infection and AIDS. To test the specific potential to induce antibody and cytotoxic T lymphocyte responses to HIV-derived vectors, a set of VSV-G-pseudotyped replication-defective vectors that contain a codon-optimized p17/p24 HIV-1 Gag or the green fluorescent protein (GFP) gene as transgene were constructed. Infection with the gag or gfp gene-containing vector particles resulted in transgene expression in cell lines and primary human and murine cells. Moreover, the direct transgene expression mediated by this lentiviral vector was also detected after in vivo application. Balb/c mice were immunised in a vector or DNA prime vector boost fashion and humoral and cellular immune responses were examined. Immunisation with DNA as prime, and the lentiviral vectors as boost, induced a Gag-specific antibody response, high titers of neutralising antibodies directed against the VSV-G protein and Gag- and EGFP-specific cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses. CTL responses were induced by both structural proteins contained in the vector preparation and through expression of the transgene. Thus, the unique biological and immunologic properties of single-cycle HIV vectors make the constructs valuable tools to further study immune mechanisms relevant to protection from HIV infection and disease. Moreover, to develop a novel HIV vaccine strategy, recombinant vaccinia viruses that express functional HIV-based vector genomes, were constructed. For this purpose, the proviral lentiviral genome, engineered into the vaccinia virus, was subjected to several modifications, including the replacement of retroviral promoter sequences by vaccinia virus sequences and the precise fusion of the transcription stop signal downstream of the transcription unit, allowing cytoplasmic transcription of distinct full-length lentiviral transcripts. The developed chimeric vector should be able to produce the transduction-competent lentiviral particels after single infection of the host cells. However, the genome analysis confirm the successful construction of vaccinia/HIV hybrid vector, the generation of lentiviral particles after vaccinia infection have to be optimized. Nevertheless, due to the favorable properties of vaccinia vectors, including high coding capacity, stability, and wide host range, vaccinia viral/HIV chimeric vectors can be promising HIV vaccine candidate. The expression of HIV-structural genes would lead in the first phase of the infection with the vaccinia/HIV-1 hybrid vector to strong humoral and cellular immunity. The generation of lentiviral vectors would boost this immune response, especially if the lentiviral vector cassette will contain an appropriate transgene. This kind of the vaccine could induce strong long-term or lasting HIV-specific immune response. KW - HIV KW - Impfstoff KW - Vektor KW - HIV-1 KW - Vakzine KW - HIV-Vektor KW - Pseudovirion KW - HIV-1 KW - vaccine KW - HIV-vector KW - pseudovirion Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22014 ER - TY - THES A1 - Schoen, Christoph T1 - Entwicklung neuartiger bakterieller Vektoren zur Übertragung von zellassoziierten Antigenen, DNA und RNA auf der Basis virulenzattenuierter L. monocytogenes T1 - Development of novel bacterial carrier strains for the delivery of cell wall associated antigens, DNA and RNA on the basis of virulence attenuated Listeria monocytogenes N2 - Listeria monocytogenes ist ein fakultativ humanpathogenes Bakterium und aufgrund seiner Fähigkeit, in Zellen des Wirtes einzudringen und sich im Zytoplasma der befallenen Wirtszelle zu vermehren, ein attraktiver Träger, um heterolog exprimierte Antigene in den MHC-I- und -II-Präsentationsweg antigenpräsentierender Zellen (APC) einzuschleusen und so eine effektive zelluläre Immunreaktion zu erzeugen. Dabei hat die Art und Weise der Antigenexpression einen wesentlichen Einfluss auf die Erzeugung der antigenspezifischen Immunität. So konnte unter Verwendung extrazellulärer Trägerbakterien gezeigt werden, dass insbesondere die Verankerung von Antigenen auf der Zelloberfläche der Bakterien zu einer effektiven Induktion einer humoralen Immunantwort führt. Mit dem Ziel, mit einem derartigen Ansatz auch eine zelluläre Immunität zu erzeugen, wurde ein Plasmidsystem für die Expression von heterologen Proteinen in der Zellwand von L. monocytogenes entwickelt. Dabei gelang die Verankerung zahlreicher Proteine eukaryontischer wie auch prokaryontischer Herkunft über das LPXTG-Ankermotiv von Internalin A. Die so erzielte starke Expression in der Zellwand setzte aber sowohl die Fitness der Bakterien als auch deren Invasivität in vitro deutlich herab und verhinderte damit eine effektive MHC-I-Präsentation des verwendeten Modellantigens. Alternativ wurde L. monocytogenes bereits erfolgreich zur Übertragung von DNA-Vakzinen eingesetzt, um so auch die Synthese gegebenenfalls posttranslationell modifizierter Antigene in ihrer korrekten Konformation durch die infizierte Wirtszelle zu erzielen. Allerdings erfolgte die Expression des als Reporterprotein verwendeten EGFP insbesondere in APC sehr langsam und war von geringer Effizienz. Dabei konnte in der vorliegenden Arbeit erstmals gezeigt werden, dass nach bakterieller Übertragung von DNA-Vakzinen der Import der Plasmidmoleküle in den Kern insbesondere sich nicht teilender Zellen einen der wichtigsten Engpässe für eine möglichst frühzeitige und effektive Reportergenexpression darstellt. Einen Ausweg bietet die bakterielle Übertragung codierender mRNA, die unmittelbar nach der Freisetzung aus der Bakterienzelle im Zytoplasma der infizierten Wirtszelle zur Translation zu Verfügung steht. Dazu wurde das 5’-Ende der EGFP-codierenden Sequenz mit dem IRES-Element des Encephalomyocarditisvirus genetisch fusioniert. Um eine möglichst hohe Syntheserate zu erzielen und damit dem Abbau der mRNA in der Bakterienzelle entgegenzuwirken, erfolgte die Synthese der mRNA in L. monocytogenes mit Hilfe eines T7-RNA-Polymerase-basierten Transkriptionssystems. Im Gegensatz zur bakteriellen Übertragung von Plasmid-DNA konnte so bereits 4 h nach Infektion sowohl in epithelialen als auch in APC wie Makrophagen und humanen dendritischen Zellen eine deutliche EGFP-Expression nachgewiesen werden sowie bei Verwendung von Ovalbumin als Reporterprotein eine effektive MHC-I-Präsentation in vitro. Damit stellt die bakterielle Übertragung von mRNA einen vielversprechenden neuartigen Ansatz dar zur Erzeugung einer zellulären und gegebenenfalls auch humoralen Immunantwort gegen posttranslational modifizierte Antigene. N2 - Listeria monocytogenes is a facultative intracellular bacterium that enters the cell by phagocytosis after which it colonizes the cytosol of the host cell. It is thus a potent vaccine vector for the presentation of passenger antigens to the major histocompatibility complex class II and class I pathways. The mode of antigen expression has a major impact on the generation of a specific immune response. Compared to the expression of antigens in a secreted form or localized inside the bacterial cell, the display of heterologous antigens on the surface of bacteria has shown to be a potent strategy for the elicitation of efficient immune responses. Therefore, a plasmid system for the expression of heterologous proteins covalently linked to the cell wall of L. monocytogenes via the LPXTG cell wall anchor of Internalin A was developed. Although efficient expression of a number of proteins could be achieved by this approach the resulting high expression levels in turn reduced the invasiveness and overall fitness of the carrier Listeria and thus impaired the delivery efficiency of the encoded antigen to the antigen processing machinery of the infected host cell. As an alternative approach to the delivery of protein antigens synthetisized by the prokaryotic cell Listeria might also be exploited for the delivery of DNA vaccines enabling the correct expression also of posttranslationally modified passenger antigens by the eukaryotic cell. However, it is demonstrated that the uptake of the plasmid DNA into the nucleus is a major limiting step for achieving early and efficient gene expression in non-dividing and therefore also in antigen presenting cells. Comparable to other non-viral transfection techniques like lipofection, the limited access to the nuclear compartment may thus constitute a major barrier also after bacteria-mediated expression plasmid DNA delivery. To overcome this bottleneck, a self-destructing L. monocytogenes strain was employed for the release of translation-competent mRNA directly into the cytosol of epithelial cells, macrophages and human dendritic cells. EGFP-encoding mRNA, adapted for translation in mammalian cells by linking an IRES element to the 5´- end of the egfp coding sequence, was produced by T7 RNA polymerase in the carrier bacteria upon entry into the cytosol where the mRNA is efficiently released from the lysed bacteria and immediately translated in eukaryotic host cells. Besides the much earlier expression of EGFP being detectable already 4 h after infection, the number of EGFP expressing mammalian cells obtained with this novel RNA delivery technique is comparable to or - especially in phagocytic cells - even higher than that obtained with the expression plasmid DNA delivery strategy. Accordingly, bacteria-mediated delivery of ovalbumin-encoding mRNA to macrophages resulted in efficient antigen processing and presentation in vitro. In conclusion, this approach might also be adapted for the in vivo delivery of antigen-encoding mRNA leading to a more efficient immune response also against posttranslationally modified antigens such as viral envelope proteins and thus might lead to the development of novel vaccines. KW - Listeria monocytogenes KW - Impfstoff KW - DNS KW - Listeria monocytogenes KW - Impfstoffe KW - RNA delivery KW - DNA delivery KW - Listeria monocytogenes KW - recombinant vaccines KW - RNA delivery KW - DNA delivery KW - antigen delivery Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-16560 ER -