TY - THES A1 - Englbrecht, Clemens T1 - Biochemische Rekonstitution und funktionelle Charakterisierung der Zusammenlagerungsmaschinerie spleißosomaler U snRNPs T1 - Biochemical reconstitution and functional characterization of the spliceosomal U snRNP assembly machinery N2 - Das Spleißen von prä-mRNAs stellt in der Expression eukaryontischer Gene einen essentiellen Reifungsschritt dar. Erst durch das exakte Entfernen von nicht-kodierenden Introns und Verbinden der kodierenden Exons kann die genetische Information am Ribosom in funktionelle Proteine umgesetzt werden. Spleißen wird durch das Spleißosom katalysiert, welches sich aus den small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) U1, U2, U4, U5 und U6 und einer großen Anzahl weiterer Proteinfaktoren zusammensetzt. Die snRNPs bestehen aus einer Uridin-reichen snRNA, spezifischen und generellen (Sm-)Proteinen. Die Sm-Proteine B/B`, D1, D2, D3, E, F, und G bilden einen heptameren Ring um die sog. Sm-Bindungsstelle der snRNAs. Während die Zusammenlagerung von Sm-Proteinen mit der RNA in vitro spontan ablaufen kann, wird dieser Prozess in vivo von zwei makromolekularen Proteinkomplexen assistiert, die als PRMT5- bzw. SMN-Komplex bezeichnet werden. Der PRMT5-Komplex (bestehend aus PRMT5, WD45 und pICln) agiert in der frühen Phase der Zusammenlagerung. Seine Hauptfunktion ist die symmetrische Dimethylierung der Sm-Proteine und die Stabilisierung von Sm-Proteinkomplexen durch das Chaperon pICln in zwei Intermediaten. Einhergehend mit dieser Aktivität werden auch Aggregation bzw. unspezifische Wechselwirkungen der Sm-Proteine mit RNAs verhindert. In der späten Phase der Zusammenlagerung löst der SMN-Komplex (bestehend aus SMN, Gemin2-8 und unrip) pICln-Intermediate auf, wobei dieser die Sm-Proteine en bloc übernimmt und sie auf die snRNA überträgt. Während dieser Reaktion wird pICln aus den Komplexen verdrängt. Ein Fehlen des SMN-Proteins, einer Schlüsselkomponente des SMN-Komplexes, führt zur autosomal rezessiven Erbkrankheit `Spinale Muskelatrophie` (SMA) wobei der Schweregrad der Krankheit invers mit der Menge an funktionellem SMN-Protein korreliert. Es wird vermutet, dass eine gestörte snRNP-Biogenese die Ursache der SMA ist. In der vorliegenden Arbeit sollte die U snRNP-Zusammenlagerungsmaschinerie aus rekombinanten Bausteinen rekonstituiert werden und so funktionellen und strukturellen Studien zugänglich gemacht werden. Folgende Resultate wurden in dieser Arbeit erhalten: 1) Im ersten Teil der Arbeit wurde eine experimentelle Strategie etabliert, welche die Rekonstitution des humanen SMN-Komplexes aus rekombinanten Untereinheiten erlaubte. Entscheidend hierfür war die Definition von Subkomplexen aufgrund einer Protein-Interaktionskarte. Die Subkomplexe konnten separat hergestellt und anschließend zum Gesamtkomplex vereinigt werden. 2) Die erfolgreiche Etablierung eines rekonstitutiven Systems erlaubte eine detaillierte biochemische Charakterisierung des SMN-Komplexes. Es konnte gezeigt werden, dass der rekombinante Komplex alle für die Biogenese von U snRNPs nötigen Schritte bewerkstelligen konnte. Dies schließt sowohl die Übernahme der Sm-Proteine aus den pICln-Intermediaten als auch das Verdrängen des Chaperons pICln und die Übertragung der Sm-Proteine auf die snRNAs ein. 3) Durch die Reduzierung des SMN-Gesamtkomplexes um Gemin3-5 auf einen SMN-Pentamer konnte dieser als ein funktioneller Kernbereich identifiziert werden, der die einzelnen Schritte der U snRNP-Biogenese vergleichbar mit dem gesamten Komplex bewerkstelligen konnte. Zudem agierte dieser reduzierte Komplex als notwendiger und ausreichender Spezifitätsfaktor der RNP-Zusammenlagerung. 4) Das rekombinante System ermöglichte erstmals SMN-Komplexe mit SMA-pathogenen Mutationen herzustellen und einer eingehenden funktionellen und strukturellen Untersuchung zu unterziehen. Die detaillierte Analyse der SMA-verursachenden Punktmutation SMN(E134K) offenbarte spezifische Defekte im Zusammenlagerungsprozess und damit Einblicke in die Pathophysiologie der Krankheit. Mit der im Rahmen dieser Arbeit etablierten Rekonstitution des rekombinanten SMN-Komplexes wurde die Grundlage für die detaillierte biochemische und strukturbiologische Untersuchung der Zusammenlagerungsmaschinerie spleißosomaler U snRNPs gelegt. Dieses experimentelle System wird auch bei der Aufdeckung der biochemischen Defekte hilfreich sein, die zur neuromuskulären Krankheit SMA führen. N2 - The splicing of pre-mRNAs is an essential step in the expression of eukaryotic genes. The precise excision of non-coding introns and joining of coding exons ensures that the genetic information can be translated into functional proteins at the ribosome. The spliceosome, which catalyzes the splicing reaction, is composed of the small nuclear ribonucleoprotein particles (snRNPs) U1, U2, U4, U5 and U6 and a large number of additional proteins. These RNPs consist of a uridine-rich snRNA, individual and common (Sm) proteins. The Sm proteins, termed B/B', D1, D2, D3, E, F and G form a heptameric ring around the so-called Sm-site of snRNAs and thus form a structural framework of all snRNPs termed Sm core. Although the assembly of the Sm core occurs spontaneously in vitro, this process is assisted by two macromolecular protein complexes in vivo referred to as PRMT5 and SMN complexes. The PRMT5 complex (consisting of PRMT5, WD45 and pICln) acts in the early phase of assembly. Its main functions are the symmetric dimethylation of Sm proteins and the stabilization of Sm protein complexes within two intermediates via the chaperone pICln. Along with this activity also aggregation and non-specific interactions of Sm proteins with RNAs are prevented. In the late phase of assembly, the SMN complex (consisting of SMN, Gemins 2-8 and unrip) binds to pICln-Sm intermediates, thereby taking over the Sm proteins en bloc and transfers them onto the snRNA. During this reaction pICln is displaced from the complexes. Reduced levels of the SMN protein are associated with the autosomal recessive disease `spinal muscular atrophy` (SMA) and the severity of the disease correlates inversely with the amount of functional SMN protein. It is therefore believed that the impaired biogenesis of snRNP is directly linked to the etiology of the disease. The aim of this thesis was to reconstitute the SMN complex from recombinant sources, thereby providing the basis for mechanistic and structural studies of this unique assembly machinery. The following results were obtained in the context of this study: 1) An experimental strategy was established, which allowed the reconstitution of the human SMN complex from recombinant subunits. To accomplish this goal, defined subcomplexes were identified based on a previously published protein interaction map. Components of these subcomplexes were co-expressed, purified and could eventually be combined to the complete SMN complex. 2) The successful establishment of a reconstitution system allowed the detailed biochemical characterization of the SMN complex. It was shown that the recombinant complex executed all necessary steps in the biogenesis of U snRNPs. This included proper transfer of Sm proteins from the pICln intermediates, the displacement of the chaperone pICln and the transfer of Sm proteins onto snRNAs. 3) The reconstitution of a SMN complex lacking Gemin3-5 allowed the definition of a minimal functional core, which was sufficient to commit all individual steps of the U snRNP biogenesis in vitro. This minimal complex was also necessary and sufficient to confer specificity of the assembly reaction. 4) The recombinant system established in this thesis further opened the possibility to analyze mutant SMN proteins implicated in SMA. The investigation of the SMA-causing missense mutation SMN(E134K) revealed specific defects in the assembly process, shedding light on the etiology of the disease. The reconsitutive system established in this thesis provides the basis for a detailed biochemical and structural investigation of the assembly machinery. It will also help to uncover biochemical defects directly linked to the neuromuscular disorder SMA. KW - Small nuclear RNP KW - Spleißosom KW - SMN-Komplex KW - pICln KW - SMN complex KW - pICln Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-98168 ER - TY - THES A1 - Kroiß, Matthias T1 - Reinigung und funktionelle Charakterisierung des SMN-Komplexes von Drosophila melanogaster T1 - Purification and functional characterization of the SMN-complex in Drosophila melanogaster N2 - Die Zusammenlageurng spleißosomaler UsnRNPs erfolgt beim Menschen und anderen Vertebraten durch den makromolekularen SMN-Komplex. Dieser besteht aus insgesamt neun Proteinen, genannt SMN und Gemin2-8. In dieser Arbeit wurde die Evolution dieser molekularen Maschine untersucht. Dazu wurden die Genome mehrerer Modellorganismen bioinformatisch nach Orthologen von SMN und seinen Komplexpartnern durchsucht. Es zeigte sich, dass SMN und Gemin2 die Kernkomponenten des Komplexes darstellen. Von diesen ausgehend kamen weitere Komponenten im Laufe der Evolution hinzu und zwar blockweise, wie es ihrer physischen Assoziation im humanen Komplex entspricht. Um diese Befunde einer biochemischen Überprüfung zu unterziehen, wurde ein neues Affinitätsepitop, das TagIt-Epitop, entwickelt. Nach stabiler Transfektion von Drosophila Schneider2-Zellen konnte das Fusionsprotein effizient exprimiert und der Drosophila-SMN-Komplex nativ aufgereinigt werden. Die massenspektrometrische Untersuchung des Komplexes zeigte, dass SMN und Gemin2 seine einzigen stöchiometrischen Komponenten sind. Dies ist in eindrucksvoller Übereinstimmung mit den bioinformatischen Daten. Der aufgereinigte Komplex lagert in vitro Sm-Proteine mit der entsprechenden UsnRNA zum UsnRNP-core-Komplex zusammen. Diese Ergebnisse ließen sich nach rekombinanter Rekonstitution des SMN/Gemin2-Dimers rekapitulieren. Dabei zeigte sich, dass der SMN-Komplex die unkoordinierte Bindung der Sm-Proteine an „falsche“ RNAs verhindert. Folglich genügen SMN und Gemin2 zur Zusammenlagerung des Sm-core-Komplexes, während die übrigen Gemine weitere Funktionen im Kontext der UsnRNP-Biogenese spielen könnten. Aus evolutionsbiologischer Sichtweise ist der SMN-Komplex aus Drosophila ein eindrückliches Beispiel, wie die Vereinfachung eines biochemischen Prozesses zur Kompaktierung des Genoms beitragen kann. N2 - In vertebrates, assembly of spliceosomal UsnRNPs is mediated by the SMN-complex, a macromolecular entity composed of the proteins SMN and Gemins 2-8. In this study, the evolution of this machinery has been investigated using complete genome assemblies of multiple model organisms. The SMN-complex has gained complexity in evolution by a block-wise addition of Gemins onto an ancestral core complex composed of SMN and Gemin2. In contrast to this overall evolutionary trend to higher complexity in metazoans, orthologs of most Gemins are missing in dipterans. In order to challenge these findings by biochemical means, I have developed a novel affinity epitope suitable for use in transfected Drosophila Schneider2-cells. Using protein mass spectrometry, the composition of the Drosophila SMN-complex has been determined. In accordance with the bioinformatic data, it consists of the core components SMN and Gemin2 only. Purified complex mediates assembly of UsnRNP core complexes in a manner very similar to its vertebrate counterpart. These results were recapitulated after recombinant reconstitution of the dSMN/dGemin2-dimer, demonstrating that the Drosophila complex also prevents mis-assembly of Smproteins onto non-target RNAs. Hence, only a minority of Gemins is required for the assembly reaction per se, whereas others may serve additional functions in the context of UsnRNP biogenesis. From a more general point of view, the evolution of the SMN-complex is an interesting example of how the simplification of a biochemical process contributes to genome compaction. KW - Taufliege KW - Epitop KW - Antikörper KW - Biochemische Evolution KW - SMN-Komplex KW - Spinale Muskelatrophie KW - Affinitätsreinigung KW - Epitop-Tag KW - SMN-complex KW - spinal muscular atrophy KW - affinity purification KW - epitope tagging Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28840 ER -