TY - THES A1 - Graus, Dorothea T1 - Auswirkungen einer V-PPase-Überexpression auf Nicotiana benthamiana Blattzellen und deren physiologische Bedeutung unter Salzbelastung T1 - The Effects of V-PPase overexpression on Nicotiana benthamiana leaf cells and their physiological significance under saline load N2 - Vakuoläre PPasen (V-PPase) in Landpflanzen dienen dem Transport von Protonen in die Vakuole und dem Aufbau eines elektrochemischen Gradienten, während sie gleichzeitig durch Hydrolyse eine Anreicherung des toxischen PPi im Cytosol verhindern. Zahlreiche Publikationen bewiesen bereits positive Effekte der stabilen V-PPase-Überexpression in Pflanzen. Unter anderem zeigte die Ackerschmalwand, Tabak, Reis und Tomate eine erhöhte Biomasse und gesteigerte Stresstoleranz auf Grund einer erhöhten stabilen V-PPase Ex-pression. Um die zugrundeliegenden Prozesse ohne potenzielle pleiotropische Effekte während der Pflanzenentwicklung zu analysieren, wurden in der vorliegenden Dissertation die physiologischen Auswirkungen einer transienten V-PPase-Überexpression in Nicotiona benthamiana Blättern und die Einflussnahme von NaCl quantitativ erfasst. Zu diesem Zweck wurden zwei endogene V-PPasen (NbVHP1 und NbVHP2) aus N. bentha-miana zunächst bioinformatisch und dann auf Transkriptionsebene mittels quantitativer Real-Time-PCR identifiziert. Die endogenen V-PPasen wurden mittels der Agrobakterien-Infiltrationstechnik transient in N. benthamiana Blättern und ihre vakuoläre Lokalisation mit Hilfe von Fluoreszenzmarkern bestätigt. Die Protonenpump-Funktion der überexprimierten NbVHPs konnte mit der Patch-Clamp-Technik anhand des vier-fach erhöhten Protonenpump-stroms in den isolierten Mesophyllvakuolen verifiziert werden. Im Zuge der elektro-physiologischen Charakterisierung der endogenen N. benthamiana V-PPasen konnte die für V-PPasen typische Sensitivität gegenüber cytosolischem Calcium bestätigt werden, welche sich bei einem erhöhten Calcium-Spiegel in einer Hemmung der Pumpströme äußerte. Ferner wurde ihre gleichartige Substrataffinität (Km von 65 µM PPi) unabhängig des vakuolären pHs zwischen 5,5 und 7,5 festgestellt. Der Vergleich dieser Ergebnisse mit analog durchgeführten Messungen an der bereits publizierten AtVHP1 von A. thaliana bestätigte die große Homo-logie der V-PPasen von Landpflanzen. Im Gegensatz zu den erwünschten Auswirkungen der stabilen V-PPase Überexpression resultierte diese starke transiente Überexpression nach drei Tagen im Absterben makroskopischer Blattbereiche. Das Ausmaß dieser Nekrosen wurde anhand des vorhandenen PhotosystemII in den transformierten Blättern mit der Puls-Amplituden-Modulations-Technik quantifiziert. Die analoge transiente Überexpression einer löslichen PPase (IPP1) führte allerdings zu keinerlei negativen Effekten für die Pflanze, wodurch die erhöhte Protonentransportaktivität im Gegensatz zur Hydrolyseaktivität der V-PPasen als Ursache des Zellsterbens verifiziert werden konnte. Aufgrund dieser unerwarteten negativen Auswirkungen der transienten V-PPase-Überex-pression auf die Blattvitalität wurde zusätzlich die Salzstresstoleranz der Blätter untersucht. Unter Berücksichtigung des kurzen Transformations- und damit Beobachtungszeitfensters wurde ein Salzapplikationsverfahren etabliert, bei dem simultan mit der Agrobakterien-infiltration 200 mM NaCl direkt in den Blattapoplasten eingeführt wurde. Anhand einer Zu-nahme in sowohl der Transskriptmenge der V-PPase als auch des PPi-induzierten Protonen-pumptransportes über den Tonoplasten wurde gezeigt, dass die NaCl-Anwesenheit im Blatt eine erhöhte Aktivität der endogenen V-PPasen des N. benthaminan Pflanzen bewirkte. Der gleichzeitige tendenzielle Rückgang der V-ATPase-Pumpaktivität in salzbehandelten Mesophyllvakuolen lässt vermuten, dass die V-PPasen eine größere Rolle bei der Bewahrung des vakuolären pH-Wertes und der protonenmotorische Kraft (PMF) unter Salzstress ein-nimmt. Interessanterweise führte die Salzapplikation bei einer V-PPase-Überexpression zu keinen additiven negativen Effekten, sondern verhinderte sogar das Auftreten der Nekrosen. Um dieses Phänomen zu ergründen, wurde zunächst mit Hilfe von Apoplastenwaschungen und Natrium-Konzentrationsmessungen bestätigt, dass das injizierte NaCl im Blatt verblieb und von den Blattzellen aufgenommen wurde. Für weitere Studien der Ursachen der Nekrosen wurden in-vivo-pH-, Membranpotenzial- und Metabolitmessungen durchgeführt. Während in V-PPase-überexprimierenden Zellen der vakuoläre pH-Wert zu Kontrollvakuolen signifikant sank, blieb er mit zusätzlicher Salzbehandlung auf Kontrollniveau. Des Weiteren schwächte die Salzapplikation die starke Depolarisation der Plasmamembran nach V-PPase-Über-expression um mehr als die Hälfte ab. Hingegen konnten keine nennenswerten Ver-änderungen im Metabolit- und Ionengehalt des Blattgewebes bei V-PPase-Überexpression festgestellt werden. Lediglich der Natrium- und Chlorid-Spiegel waren bei salz-behandelten Blättern erwartungsgemäß erhöht. Diese Ergebnisse bekräftigten, dass der stark erhöhte V-PPase-vermittelte Protonenpumpstrom und weniger metabolische Veränderungen für die Nekrosen von V-PPase-überexprimierte Pflanzen verantwortlich ist. Diese negativen Auswirkungen werden offensichtlich durch die Salzbehandlung stark vermindert, da die Aufnahme der Salz-ionen über Protonen-Na+/K+-Antiporter wie NHX antagonistisch auf die V-PPase verursachte Protonenanreicherung und die daraus folgende Veränderung des Membran-potentials und der PMF entgegenwirkt. In diese Arbeit wurde in einem neuen Blickwinkel deutlich, dass die natürliche Expressions-kontrolle der V-PPase in ausdifferenzierten Pflanzenzellen sich den Umweltbedingungen anpasst, um das Gleich-gewicht zwischen den positiven und negativen Auswirkungen der Pumpaktivität zu halten. N2 - The plant vacuolar PPases (V-PPase) transport protons across the tonoplast from the cytosol into the vacuole. This establishes a trans-tonoplast electrochemical gradient and prevents the accumulation of toxic PPi in the cytosol. Many publications have already shown positive effects of stable V-PPase overexpression in plants. Arabidopsis, tobacco, rice and tomato for example, all showed increased biomass and greater stress tolerance with stable V-PPase overexpression. To understand the underlying processes without potential pleiotropic effects during plant development, we characterised V-PPase in Nicotiana benthamiana leaves using an electrophysiological approach, and investigated its physiology in overexpressing plants, concentrating on its regulation by NaCl. Two endogenous V-PPases (NbVHP1 and NbVHP2) from N. benthamiana were identified using bioinformatics and quantified with real-time PCR. Endogenous V-PPases were transiently overexpressed using Agrobacteria in N. benthamiana leaves, with their vacuolar localisation confirmed by fluorescence labelling. The proton pump activity of the NbVHPs was verified by a fourfold increase in the patch clamp-recorded proton current response of isolated mesophyll vacuoles. For the electrophysiological characterisation of the endogenous V-PPases, the V-PPase-typical cytosolic calcium sensitivity was confirmed; the proton pump became inhibited with increased calcium levels. Furthermore, their similar substrate affinity, a Km of 65 μM PPi, was found to be independent of the vacuolar pH between 5.5 and 7.5. Both attributes were comparable to the already published AtVHP1 of Arabidopsis thaliana, showing a high homology of plant V-PPases. The physiological effects of V-PPase overexpression was obvious from the time-delayed death of transformed cells. In contrast to the desired effects of stable V-PPase over-expression, this strong transient overexpression resulted in macroscopic dead leaf areas after three days. The extent of these necroses was quantified by counting the existing photosystems in the transformed leaves using the pulse-amplitude modulation technique (PAM). In contrast, no necrosis was found in plants where a soluble PPase (IPP1) was over-expressed. This supports the hypothesis that the increased proton transport activity of V-PPases, not the hydrolysis activity, is the cause of cell death. Because of these unexpected negative effects of transient V-PPase over-expression on leaf vitality, the salt stress tolerance of the leaves was also examined. The short transformation and observation time window meant we needed to establish a new way of salt application; we injected 200 mM NaCl directly into the leaf apoplast simultaneously with the agrobacterial material. Absorption of NaCl by leaf cells was confirmed by apoplast washing and sodium concentration measurements. The NaCl treatment increased the amount of transcripts of endogenous V-PPases in tobacco and increased the PPi-induced proton transport across the vacuolar membrane. The concomitant decline in V-ATPase pumping activity in saline-treated mesophyll vacuoles indicates that V-PPases have a significant role in maintaining the vacuolar pH and proton motive force (PMF) under saline conditions. Interestingly, simultaneous salt administration with V-PPase overexpression did not result in an additive negative effect but did prevent the occurrence of necrotic leaf areas. For further analysis of the necrosis, in vivo pH, membrane potential and metabolite measurements were performed. Under V-PPasen over-expression and salt treatment, the vacuolar pH remained constant and did not decrease as it did in non-salt-treated V-PPase over-expressing cells. Furthermore, the salt application attenuated the strong depolarisation of the plasma membrane by more than a half in V-PPase overexpressing plants, but no noteworthy changes in cell metabolism could be detected by metabolite and ion concentration measurements. Only the Na+ and Cl- levels were, as expected, increased in salt-treated leaves. This decrease in vacuolar pH alongside a membrane depolarisation confirms that the strong proton pump current of the V-PPase overexpressing vacuoles is the cause of the observed necrosis. These negative effects are obviously greatly reduced by salt treatment, since the uptake of the salt ions via proton:Na+/K+ antiporters such as NHX acts as an antagonist to V-PPase-induced proton accumulation in the vacuole and the consequent change in membrane potential and PMF. This work reveals in a new perspective, that the natural expression control of V-PPase in differentiated plant cells adapts to environmental conditions to balance the positive and negative effects of pumping activity. KW - Pyrophosphatase KW - Vakuole KW - Nicotiana benthamiana KW - Membrantransport KW - Salzstress KW - transiente Transformation Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-193676 ER - TY - THES A1 - Kemmer, Gabriele T1 - Charakterisierung der initialen Aufnahme des Kofaktors V (NAD) bei Haemophilus influenzae T1 - Characterization of the initial uptake of the cofactor V (NAD) in Haemophilus influenzae N2 - H. influenzae ist ein fakultativ anaerobes, Gram-negatives Bakterium und wird in die Familie der Pasteurellacaea eingeordnet. Das Bakterium zeigt Auxotrophien für Hämin unter aeroben Bedingungen und für Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD) bei aeroben wie anaeroben Wachstum. Es können zwei Unterarten unterschieden werden: die bekapselten Stämme, die systemische Erkrankungen hervorrufen und die unbekapselten bzw. nicht-typisierbaren Stämme, die für Oberflächeninfektionen verantwortlich sind. Da bei H. influenzae bisher nur wenig über die NAD-Aufnahme bekannt war, sollten in dieser Arbeit Proteine identifiziert und charakterisiert werden, die an der NAD-Aufnahme beteiligt sind. Das Außenmembranprotein e(P4), kodiert von dem hel-Gen, wurde als eine Komponente des Häminaufnahmesystems beschrieben. In dieser Arbeit wurde eine hel-Deletionsmutante hergestellt, anhand der nachgewiesen wurde, daß e(P4) als saure Phosphatase nicht an der Hämin-, sondern an der NAD-Aufnahme beteiligt ist. Mit Hilfe von verschiedenen Phosphatase-Assays und dem Malat-Enzym-Assay konnten NADP und Nikotinamid-Mononukleotid (NMN) als physiologisch relevante Substrate identifiziert werden. Die biologische Relevanz von e(P4) für die NAD-Aufnahme wurde durch Mutantenanalyse in Wachstumstests und Transport-Assays nachgewiesen. Es wurde gezeigt, daß die hel-Deletionsmutante mit NAD und NMN ein signifikantes Wachstumsdefizit hatte und nicht fähig war, beide Nikotinamid-Nukleotid-Quellen aufzunehmen, während die Nutzung von Nikotinamid-Ribosyl (NR) keinen Unterschied zum Wildtyp aufwies. Um die Frage zu klären, ob die Lokalisation von e(P4) als Lipoprotein an der Außenmembran wichtig für die NMN-Spaltung ist, wurden zwei Mutanten hergestellt, bei denen im hel-Gen der Lipidanker Cystein durch ein Glycin ausgetauscht wurde, um das Protein im Periplasma zu exprimieren. Die Periplasma-Extrakte dieser Cystein-Mutanten zeigten in Phosphatase-Assays keine Aktivität. Um zu untersuchen, ob die Phosphatase-Aktivität die einzige für die NAD-Aufnahme relevante Funktion von e(P4) ist, wurden Phosphatase-Mutanten hergestellt und charakterisiert. Sie exprimierten ein mutiertes e(P4)-Protein, das durch einen Aminosäureaustausch die Phosphatase-Aktivität verloren hatte. Es zeigte sich, daß die Phänotypen der Phosphatase-Mutanten in Bezug auf die Fähigkeit NMN zu spalten, NAD und NMN aufzunehmen und als Faktor V-Quelle zum Wachstum zu nutzen, exakt mit den Phänotypen der Deletionsmutante korrelierten. Es konnten daher keine weiteren Funktionen von e(P4) festgestellt werden. Das periplasmatische Protein NadN wurde als Pyrophosphatase beschrieben, die fähig ist, NAD zu NMN zu hydrolysieren. Weiter wurde eine 5´-Nukleotidase-Aktivität nachgewiesen, mit der NadN NMN zu NR dephosphorylieren kann. Die Relevanz von NadN für die NAD-Aufnahme wurde anhand einer nadN-Knockout-Mutante untersucht. In Wachstumskurven und Transport-Assays zeigte sich, daß die nadN-Mutante nicht fähig war, NAD aufzunehmen und zum Wachstum zu verwenden. Auch die Nutzung von NMN war bei der Mutante eingeschränkt, während mit NR als Faktor V-Substrat kein Unterschied zum Stamm Rd erkennbar war. Durch die Charakterisierung einer hel nadN-Doppelmutante konnte nachgewiesen werden, daß keine weiteren Enzyme außer e(P4) und NadN an der Prozessierung von NAD zu NR beteiligt sind. Es zeigte sich auch, daß nur NR über einen putativen Transporter ins Zytoplasma aufgenommen wird. Das Protein OmpP2 stellt ein Hauptporin der äußeren Membran dar. Durch eine ompP2-Deletionsmutante konnte mit Hilfe von Wachstumskurven und Transport-Assays nachgewiesen werden, daß NAD, NMN und NR durch diese Pore ins Periplasma diffundieren. N2 - H. influenzae is a facultativ anaerobic, Gram-negative bacterium and belongs to the familiy of Pasteurellaceae. This bacterium shows auxotrophies for hemin under aerobic conditions and for nicotinamid adenine dinucleotide (NAD) at aerobic and anaerobic growth. Two subspecies are distinguishable: the encapsulated strains, the causative agents for systemic and invasive diseases and the unencapsulated or nontypeable strains, responsible for inflammation of the respiratory tract. In H. influenzae little is known about the utilization of NAD, therefore this work was aimed to identify and characterize gene products which are involved in the uptake of NAD. The outer membrane protein e(P4), encoded by the gene hel, was described as a component of the hemin uptake system. In this work a hel deletion mutant was constructed to proof that the acid phosphatase e(P4) is not involved in the uptake of hemin but in the uptake of NAD. With the aid of different phosphatase assays and the maleic enzyme assay NADP and NMN could be identified as the physiological relevant substrates. The biological relevance of e(P4) was proofed by mutant analysis in growth tests and transport assays. It was shown that the hel deletion mutant had a significant growth deficiency with NAD and NMN and was not able to take up both nicotinamide nucleotide sources, whereas the utilization of nicotinamide ribosyl (NR) showed no difference compared to the wildtype. To address the question, wether the localization of the lipoprotein e(P4) at the outer membrane is important for the hydrolysis of NMN, two mutants were constructed which had a Cystein-Glycin replacement in the lipid anchor of the hel gene to express the protein in the periplasm. The periplasm extracts of these Cystein mutants showed no activity in phosphatase assays. To investigate wether the phosphatase acitivty of e(P4) is the only relevant function for the uptake of NAD, phosphatase mutants were constructed and characterized. They expressed a mutated e(P4) protein which had lost the phosphatase activity by an amino acid replacement. The phenotypes of the phosphatase mutants correlated exactly with the phenotype of the deletion mutant concerning the ability to cleave NMN, to take up NAD and NMN and to use them as factor V sources. The periplasmic protein NadN was described as a pyrophosphatase which is able to hydrolase NAD to NMN. Further a 5´-nucleotidase function was identified enabling NadN to dephosphorylate NMN to NR. The relevance of NadN for the utilization of NAD was investigated with a nadN knockout mutant. Growth curves and transport assays revealed that the nadN mutant was not able to take up NAD and to use it for growth. The utilization of NMN was reduced, whereas the utilization of NR showed no difference compared to the wildtype. By characterizing a hel nadN double mutant it was shown that no further enzymes than e(P4) and NadN are involved in the processing of NAD to NR and that only NR is taken up into the cytoplasm through a putativ transporter. The protein OmpP2 is the major porin of the outer membrane. Growth curves and transport assays with an ompP2 deletion mutant revealed that NAD, NMN and NR diffuse through this porin into the periplasm. KW - Haemophilus influenzae KW - NAD KW - Haemophilus influenzae KW - NAD KW - Pyrophosphatase KW - 5`-Nukleotidase KW - Haemophilus influenzae KW - NAD KW - pyrophosphatase KW - 5`-nucleotidase Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1548 ER -