TY  - THES
A1  - Waltenberger, Gabriela Maria
T1  - Gewaschene Erythrozytenkonzentrate, hergestellt mit Hilfe eines neuen Verfahrens, und ihre Qualitätsbeurteilung anhand mehrerer biochemischer Parameter
T1  - washed red blood cells produced by new procedures and the quality evaluation at tha basis of several biochemical parameter
N2  - Hintergrund: Gewaschene Erythrozytenkonzentrate (gewEK) wurden bisher durch zwei- bis dreimaliges Waschen mit je 200 ml isotoner Kochsalzlösung gewonnen. Dieses Verfahren führte zur Unterbrechung des geschlossenen Systems und zur Depletion der Additivlösung, weshalb die Haltbarkeit der Konserven auf maximal 24h beschränkt ist. Der Einsatz eines Steril-Schlauchschweißgerätes erlaubt eine sterile Produktion der gewEK. Ergänzend zu einer vorangegangenen Untersuchung der rheologischen Parameter wurde in der vorliegenden Arbeit die Qualität derart hergestellter Konserven, gewaschen mit und aufgeschwemmt in SAG-M-Lösung, anhand von mehreren biochemischen Parameter beurteilt. Material und Methoden: 16 frische EK in SAG-M-Lösung wurden jeweils halbiert , eine Hälfte unbehandelt als Kontrolle mitgeführt, die andere unter Einsatz eines Steril-Schlauchschweißgerätes zweimal mit je 200 ml SAG-M-Lösung gewaschen und in SAG-M-Lösung resuspendiert. Zu definierten Zeitpunkten wurde ATP, 2,3-DPG, Elekrolyte intra-und extrazellulär, O2, CO2, pH, Hämolysegrad sowie Sterilität bestimmt. Ergebnisse: Alle Konserven waren steril. In den unbehandelten wie in den gewaschenen Hälften der EK konnte mit zunehmender Lagerdauer ein Abfall des ATP Und 2,3-DPG-Gehaltes sowie eine gesteigerte Hämolyse mit Anstieg von extrazellulärem Kalium sowie ein Abfall des pH-Wertes nachgewiesen werden. Der stärkere extrazelluläre Abfall des pH-Wertes in den gewEK ist im wesentlichen durch das Entfernen des Plasmas und des CPD-Stabilisators zu erklären, die zu einer Reduktion der Pufferkapazität führt. Die Folge davon ist ein schnelleres Absinken des 2,3-DPG unmittelbar nach dem Waschen und im Laufe der Lagerung. Das Entfernen des phosphathaltigen CPD-Stabilisators erklärt möglicherweise aber auch im Sinne einer Substratverarmung den vergleichsweise starken ATP-Abfall zum Ende der Messperiode. Schlussfolgerung: Die Verwendung eines Sterilschlauchschweißgerätes ermöglicht die Herstellung gewEK unter sterilen Bedingungen. Unter Berücksichtigung biochemischer und rheologischer Parameter beträgt die Haltbarkeit der mit SAG-M-Lösung gewaschenen und darin aufgeschwemmten Konserven mindestens 14 Tage.
N2  - Background: A 24-hour shelf life is imposed on saline-washed red blood cell (RBC), because the closed system is broached and the preservative solution is depleted during usual processing. With the availability of sterile docking device a sterile production of wshed RBC has become possible. In addition to a previous study of rheological parameters, the qualitya of RBC washed and resuspended in SAG-M solution was elucidated by analysis of their biochemical properties. Materials and methods: 16 units of RBC in SAG-M medium were divided each into two aliquots of equal volume. One of these aloiquots was washed twice with 200 ml SAG_M solution by means of a sterile docking device and stored in SAG_M medium, the other was carried with as a control. ATP, 2,3-DPG, electrolytes intra-and extracellulär, O2, CO2, pH, hemolysis and sterility were determinated at definite times during 4 weeks. Results: No bacterial contamination could be observed in all washed products. During storage both preparations showed a decrease in ATP and 2,3 DPG and pH, and an increse in hemolysis and extracellulär potassium. The loss of phosphate-containing CPD-stabilisators explains the enormous decrease in ATP as a loss of substrate. Conclusions: From the point of View of biochemical end rheological cell properties, it appears that the shelf life of RBC washed and stored in a SAG-M-solution can be safely extended from 24 h to at least 2 weeks.
KW  - Gewaschene Erythrozytenkonzentrate
KW  - SAterilschlauchschweißgerät
KW  - ATP
KW  - 2
KW  - 3-DPG
KW  - osmotische Resistenz
KW  - pH
KW  - washed erythrocytes
KW  - sterile docking
KW  - ATP
KW  - 2
KW  - 3-DPG
KW  - osmotic resistence
KW  - pH
Y1  - 2002
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5413
ER  - 
TY  - THES
A1  - Zeller, Daniel
T1  - Konsequenzen progressiver trunkierender Mutationen des Transkriptionsfaktors RIM101 in Candida albicans für Wachstum und pH-abhängigen Dimorphismus
T1  - Effects of successively truncated RIM101 allels in Candida albicans point to the role of a newly defined domain in regulating filamentation
N2  - Candida albicans ist ein opportunistischer Hefepilz, den die meisten gesunden Menschen als harmlosen Kommensalen des Verdauungstraktes beherbergen. Bei einer Schwächung des Immunsystemes kann es jedoch zu schweren Candida-Infektionen bis hin zur lebensbedrohlichen Pilzsepsis kommen. Neben anderen Virulenzfaktoren spielt offenbar der Polymorphismus, also die Fähigkeit, sowohl in einer sprossenden Hefeform als auch in einer filamentösen Hyphenform zu wachsen, eine bedeutende Rolle in der Pathogenität von C._albicans. Welche Wachstumsform überwiegt, hängt entscheidend von den Wachstumsbedingungen, insbesondere auch vom pH-Wert, ab. Im Zentrum des pH-abhängigen Transduktionsweges steht der alkalisch-exprimierte Transkriptionsfaktor RIM101, dessen inaktive Vorläuferform unter neutralen bzw. alkalischen Wachstumsbedingungen vermutlich durch eine zweistufige proteolytische Prozessierung des C-Terminus in (mindestens) eine aktive Form übergeführt wird. Diese wiederum hat mindestens zwei Funktionen: Erstens induziert sie im Rahmen der pH-abhängigen Genexpression unter anderem PHR1 und reprimiert PHR2, die beide für den Zellwandaufbau erforderliche, funktionell homologe Proteine kodieren. Zweitens steuert sie bei gleichzeitig vorliegender Temperaturerhöhung auf ca. 37°C auf noch unbekannte Weise den Übergang der Zelle in die filamentöse Wachstumsform. Ziel dieser Arbeit ist es, die Folgen C-terminaler Verkürzungen von Rim101 auf das Wachstum, die PHR1-Induktion und die Filamentierung, jeweils in Abhängigkeit vom extrazellulären pH-Wert, zu untersuchen. Daraus können neue Einsichten über die Bedeutung von RIM101, den Mechanismus seiner Aktivierung und seine Funktion im Geflecht der Transduktionskaskaden gewonnen werden. Hierzu wurden zunächst 14 phr2∆-Suppressormutanten isoliert, die trotz der phr2∆-Nullmutation in der Lage waren, bei saurem pH-Wert zu wachsen. Es zeigte sich, dass diese Stämme im sauren Milieu nicht nur eine starke PHR1-Induktion aufwiesen, sondern darüber hinaus unabhängig vom pH-Wert des Mediums in hohen Raten zur Filamentierung fähig waren. Die molekulargenetische Analyse beider RIM101-Allele in diesen Revertanten ergaben, dass in jedem der Stämme ein RIM101-Allel eine Nonsense-Mutation enthielt, die offensichtlich zur Synthese eines trunkierten und damit konstitutiv aktiven Rim101p führte. Die spontan aufgetretenen RIM101-Suppressormutationen fanden sich bei den 14 verschiedenen analysierten Revertanten in einem umschriebenen Bereich, der auf dem das C-terminale Drittel codierenden Teil des RIM101-ORF liegt. Um die Folgen von stärkeren, also weiter upstream lokalisierten, Rim101p-Trunkierungen zu untersuchen, wurden daraufhin C.-albicans-Stämme konstruiert, die nach Transformation eines linearisierten Plasmides jeweils ein RIM101-Allel mit einer gezielt eingeführten Nonsense-Mutation enthielten. Wir erhielten 19 solcher Stämme (phr2∆) mit in 5’-Richtung progessiven RIM101-Trunkierungen in einem weiten Bereich des RIM101-ORF. Interessanterweise konnten wir bei der darauf folgenden Untersuchung der gewonnenen Stämme drei Gruppen von RIM101-Trunkierungen unterscheiden, die verschiedene Konsequenzen für Wachstum und Filamentierung mit sich brachten: a) Der Austausch der Codons 281, 305 und 333, die näher am 5’-Ende im Bereich oder der Nähe der Zinkfingerregion lokalisiert sind, ermöglicht kein Wachstum bei pH 4. b) Die Einführung von Nonsense-Codons an die Stellen 385 und 411 führt dazu, dass die entsprechenden Stämme bei pH 4 wachsen und PHR1 induzieren, aber nicht in der Lage sind, bei diesem pH-Wert zu filamentieren. c) Dagegen erlaubt der Ersatz von einem der Codons 463 bis 475 durch ein Stop-Codon Wachstum, PHR1-Induktion und filamentöses Wachstum bei pH 4. Die Region zwischen den Aminosäuren 411 und 463 muss also für die Initiation der Keimschlauchbildung essentiell, für die Induktion pH-regulierter Gene wie PHR1 aber nicht notwendig sein. Dieses Ergebnis scheint darauf hinzuweisen, dass der Funktion des Transkriptionsfaktors Rim101p in den Bereichen Zellwandaufbau/Wachstum und pH-abhängiger Morphogenese zwei verschiedenartige Steuermechanismen zugrunde liegen. Denkbare Modelle für solche Mechanismen werden in der vorliegenden Arbeit auf dem Hintergrund früherer Studien diskutiert. Der letzte Teil dieser Arbeit befasst sich mit der potentiellen Bedeutung von Rim101p bei der Regulation der Expression von sog. sekretorischen Aspartylproteinasen (SAPs). Mit Hilfe eines Reportersystemes sollen die Auswirkungen von RIM101-Mutationen auf drei „hyphenspezifische“ Mitglieder der SAP-Genfamilie, nämlich SAP4, SAP5 und SAP6, untersucht werden. Daraus gewonnene Informationen könnten die bisher vorwiegend isolierte Betrachtung des Dimorphismus und der Proteinasen im Pathogenitätsprozess ausweiten auf ein sich ergänzendes Zusammenspiel dieser Faktoren.
N2  - Among the environmental cues that influence morphological development in Candida albicans, the ambient pH has a defining role. The morphogenetic programme that is induced by this signal is termed “pH-regulated dimorphism”. In C. albicans the pH-response pathway activates Rim101p, which shows functional homologies to the transcription factors PacC of Aspergillus nidulans and Rim101p of Saccharomyces cerevisiae. Fundamental cell functions, including morphological development as well as cell wall biosynthesis are under the control of C. albicans-Rim101p. Insight into the roles of PHR1, PHR2 and the pH-response in polymorphism was gained through reversion analysis of homozygous phr2D mutants. Analyses of fourteen revertants demonstrated that they had acquired dominant activation mutations in RIM101 leading to premature stop codons. A null mutation of Efg1p was epistatic to the RIM101 mutation and suppressed filamentation but not RIM101 mediated activation of PHR1 expression. Thus, Rim101p effects are mediated both in an Efg1p-dependent and independent manner. We differentiated between RIM101 regions involved in the regulation of polymorphism from those controlling pH-dependent gene expression. We constructed 6 strains containing a carboxy-terminal truncated RIM101 gene by replacing codons 281, 305, 333, 385, 411 and 464 with nonsense codons. The replacement of codons 281, 305 and 333, located within or in proximity to the zinc-finger domain, did not allow growth at pH 4. Replacement of codons 385 and 411 resulted in strains which: (i) grew at pH 4, (ii) expressed the PHR1 gene at pH 4, but in contrast to mutagenesis of codon 464 (iii) were not able to filament at pH 4. These results suggest that the region located between codons 411 and 464 is essential for the Rim101p mediated induction of filamentation in C. albicans. In addition to beeing a regulator of morphological development, which is linked to pathogenesis, Rim101p also plays an important role in cell wall biosynthesis. Understanding the function of Rim101p in C. albicans will provide key insights into how these two fundamental processes are integrated. Besides the switch between growth forms, the secretion of aspartic proteases (SAPs) seems to be one of the important virulence factors in C. albicans. In order to provide an optimum adaption to different host niches, it is likely that various virulence factors are regulated in coordinated fashion by specific host signals. In the final part of this work, we started to investigate a potential role of Rim101p in regulating the expression of a set of SAP-genes. By using the URA3 gene of C. albicans as a reporter of gene expression, we tended to observe consequences of RIM101 mutations on the induction of SAP4, SAP5 and SAP6, which are members of a hypha-specific gene family. Linking the respective regulatory pathways of the known virulence factors might be a crucial step towards a comprehensive view of the pathogenetic process preceding candidiasis in humans.
KW  - Candida albicans
KW  - pH
KW  - RIM101
KW  - Dimorphismus
KW  - Filamentierung
KW  - Candida albicans
KW  - pH
KW  - RIM101
KW  - dimorphism
KW  - filamentation
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11223
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TY  - THES
A1  - Kurzai, Oliver
T1  - Molekulare Charakterisierung pH-regulierter Gene bei der humanpathogenen Hefespezies Candida dubliniensis und ihr Nutzen für die epidemiologische Diagnostik
T1  - PH-regulated genes of the pathogenic yeast Candida dubliniensis and their impact in epidemiological diagnostics
N2  - Candida dubliniensis ist eine 1995 erstmals beschriebene pathogene Hefespezies mit enger phylogenetischer Verwandtschaft zu Candida albicans. Sie wird mittels routinemäßig angewendeter Verfahren nicht von C. albicans unterschieden, weil sie als einzige Spezies im Genus Candida neben C. albicans Chlamydosporen ausbilden kann. C. dubliniensis ist bisher vor allem aus dem Oropharynx HIV-positiver Patienten isoliert worden. PHR1 und PHR2 sind funktionell homologe, pH-abhängig exprimierte Gene von C. albicans, deren Produkte essentiell für die Verknüpfung von b-1,3- und b-1,6-Glukan in der Zellwand sind. Die Deletion jedes dieser Gene führt zu einem pH-abhängigen Phänotyp mit aberranter Morphogenese in vitro und reduzierter Virulenz im Tiermodell. In dieser Arbeit werden PHR homologe Gene im Genom von C. dubliniensis charakterisiert. CdPHR1 weist eine Homologie von 90,5 Prozent zu PHR1 und CdPHR2 eine Homologie von 91,7 Prozent zu PHR2 auf. Wie PHR1 wird auch CdPHR1 nur unter neutralen und alkalischen Bedingungen exprimiert, während sich CdPHR2 Transkript, wie das von PHR2, nur unter sauren Bedingungen nachweisen lässt. Die funktionelle Homologie von CdPHR1 zu PHR1 wird durch Komplementation des Phänotyps einer C. albicans phr1 Mutante mit CdPHR1 gezeigt. Dabei erweist sich der native Promoter von CdPHR1 als funktional in C. albicans. Im Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae wird CdPHR1 unter Kontrolle seines nativen Promotors dagegen pH-unabhängig exprimiert. Auch die zusätzliche Einführung eines mutierten, dominant aktiven Allels von RIM101, das in C. albicans für die pH-abhängige Genexpression verantwortlich ist, hat darauf keinen Einfluss. In C. glabrata und Aspergillus nidulans findet sich keine Expression von CdPHR1. Basierend auf Sequenzunterschieden zwischen PHR1 und CdPHR1 wird ein PCR-Schnelltest zur Speziesunterscheidung entwickelt. Dieser wird in einer epidemiologischen Studie mit 133 chlamydosporenpositiven klinischen Isolaten evaluiert. 21 oropharyngeale Isolate von 14 HIV-positiven Patienten können so retrospektiv als C. dubliniensis klassifiziert werden, dies entspricht einer Prävalenz von C. dubliniensis in diesem Kollektiv von 30 Prozent. Die Ergebnisse der PCR werden durch Sequenzierung ribosomaler Gene (V3, ITS1, ITS2) bestätigt. Parallel werden phänotypische Tests zur Identifizierung von C. dubliniensis auf ihre diagnostische Validität getestet. Während sich die Chlamydosporenmorphologie der Isolate und die Koloniefärbung auf dem Farbindikatormedium CHROMagar Candida als unzulänglich für die Unterscheidung erweisen und das für C. dubliniensis beschriebene Wachstumsdefizit bei 45°C zwar sensitiv, nicht aber spezifisch für die Identifizierung dieser Spezies ist, korreliert die Koloniemorphologie auf Staib-Agar zu 100 Prozent mit den molekularen Daten. Alle C. dubliniensis Isolate werden in einem biochemischen Assay (Micronaut RC) untersucht, dabei zeigt der Test auf b-Glukosidase Aktivität hohes diskriminatorisches Potenzial. In Resistenztestungen zeigen sich die C. dubliniensis Isolate sensibler als die oropharyngealen C. albicans Isolate gegen gebräuchliche Antimykotika. In dieser Studie kann gezeigt werden, dass C. dubliniensis und C. albicans auf teilweise austauschbare Mechanismen zur Reaktion auf Alterationen des pH-Milieus verfügen. Die pH-abhängige Regulation zellwandassoziierter Gene ist dabei eng mit morphogenetischen Prozessen verbunden. Trotz dieser Ähnlichkeit ist C. dubliniensis nicht nur weniger virulent als C. albicans, sondern zeigt auch ein unterschiedliches epidemiologisches Spektrum, das durch eine Spezialisierung auf oropharyngeale Kolonisation und Infektion bei HIV-positiven Patienten gekennzeichnet ist. Um die Gründe für diese Unterschiede aufzeigen zu können, ist eine verlässliche Identifizierung von C. dubliniensis notwendig. Dazu stellen die präsentierten Daten einerseits einen schnellen und verlässlichen PCR Test, andererseits eine sorgfältige Evaluierung derzeit gebräuchlicher phänotypischer Verfahren vor. Phänotypisch und genotypisch exzellent charakterisierte Isolate beider Spezies stehen für weitere Untersuchungen zur Verfügung.
N2  - Candida dubliniensis is a recently described pathogenic yeast species that is phylogenetically closely related to Candida albicans. In routine clinical diagnostic procedures both species are not differentiated due to the unique ability of C. dubliniensis to form germ-tubes and chlamydospores as C. albicans. Most C. dubliniensis isolates have been recovered from the oropharynx of HIV-infected patients. PHR1 and PHR2 are functionally homologous genes of C. albicans responsible for crosslinking b-1,3- and b-1,6-glucans of the yeast cell wall. These genes are characterized by a unique pattern of pH-dependent transcription. Deletion of each of these genes results in a pH-dependent phenotype with aberrant in vitro morphogenesis and reduced virulence in an animal model. Here, PHR homologous genes of C. dubliniensis are characterized. CdPHR1 is 90.5 per cent homologous to PHR1, CdPHR2 is 91.7 per cent homologous to PHR2. Like PHR1, CdPHR1 is only expressed in neutral to alkaline conditions, whereas CdPHR2 transcript - as with PHR2 - can only be found in acidic conditions. Functional homology of CdPHR1 with PHR1 is shown by complementation of a phr1 phenotype in C. albicans with CdPHR1. The native promoter of CdPHR1 is thereby shown to be functional in C. albicans. In contrast CdPHR1 is expressed in a pH-independent manner in bakers yeast Saccharomyces cerevisiae. This constitutive expression is not altered by additional integration of a dominant active allele of RIM101, encoding the transcription factor, that ensures pH-dependent gene expression in C. albicans. CdPHR1 is not expressed in C. glabrata and Aspergillus nidulans. A rapid PCR-test for discrimination between C. albicans and C. dubliniensis is constructed based on sequence differences between PHR1 and CdPHR1. This test is evaluated in an epidemiological study with 133 chlamydospore-positive clinical yeast isolates. 21 oropharyngeal isolates are retrospectively identified as C. dubliniensis, resulting in a prevalence of 30 per cent in this patient collective. PCR-results are confirmed by sequencing rDNA (V3, ITS1, ITS2). Phenotypic tests for identification of C. dubliniensis are evaluated with respect to their diagnostic potential. Whereas chlamydospore-morphology and colony colour on Chromagar Candida are not suited for reliable discrimination, and the growth deficit of C. dubliniensis at 45°C is sensitive but not specific, colony morphology on Staib agar corresponds 100 per cent to the molecular biology data. All C. dubliniensis isolates are biochemically characterized using the Micronaut RC system. The test for b-glucosidase activity within this system shows a high discriminatory potential. Susceptibility testing reveals, that the C. dubliniensis isolates are more sensitive to antifungals than the C. albicans isolates. C. dubliniensis and C. albicans rely on interchangeable mechanisms to react to the ambient pH. Furthermore, pH-regulated expression of cell wall associated genes is closely linked to morphogenesis. Despite this, C. dubliniensis is not only less virulent than C. albicans but also displays a distinct epidemiology characterized by a preference for oropharyngeal colonialization and infection of HIV-positive patients. To reveal the reasons for this, reliable identification of C. dubliniensis is necessary. For that purpose, a rapid PCR test is introduced together with an evaluation of currently available phenotypic methods. Thoroughly characterized isolates of both species are available for further studies.
KW  - Candida
KW  - albicans
KW  - dubliniensis
KW  - pH
KW  - PHR
KW  - CdPHR
KW  - RIM101
KW  - Zellwand
KW  - Candida
KW  - albicans
KW  - dubliniensis
KW  - pH
KW  - PHR
KW  - CdPHR
KW  - RIM10
KW  - cell wall
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1182281
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TY  - THES
A1  - El-Barkani, Abdelmalic
T1  - Molekulargenetische Charakterisierung des pH-regulierten Dimorphismus und der pH-abhängigen Genexpression von Candida albicans und Entwicklung eines Reportersystem für Candida glabrata
T1  - Molecular genetic Characterisation of the pH Regulated Dimorphism and the pH Dependent Gene Expression of Candida albicans and Development of a Reporter System for Candida glabrata
N2  - Candida albicans ist in der Lage seine Zellmorphologie in Abhängigkeit von Umweltfaktoren zu verändern (Odds, 1988). Dieser morphologische Formenwechsel ist ein wesentlicher Pathogenitätsfaktor von C. albicans. Der pH-Wert gehört zu den wichtigen Umweltfaktoren, welche die Zellmorphologie von C. albicans beeinflussen. Bei sauren pH-Werten wächst C. albicans als unizellulärer Sprosspilz, während bei neutralen pH-Werten und einer Umgebungstemperatur von 37°C die filamentöse Form dominiert (Buffo et al., 1984). C. albicans reagiert auf unterschiedliche pH-Werte mit der differentiellen Expression bestimmter Gene. Zu diesen gehören die funktional homologen Gene PHR1 und PHR2, deren Genprodukte an der Synthese der Pilzzellwand beteiligt sind. PHR1 wird im neutralen Milieu induziert, während PHR2 im sauren Milieu exprimiert wird. Die Deletion von PHR1 oder PHR2 führt zu pH-abhängigen Defekten des Wachstums, der Zellmorphologie und der Virulenz (Saporito-Irwin et al., 1995; Mühlschlegel und Fonzi, 1997; De Bernardis et al., 1998). Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde anhand der Isolierung von phr2D-Revertanten der Zusammenhang der molekularen Regulation des morphologischen Formenwechsels und der pH-regulierten Expression von Genen, die eine wichtige Funktion bei der Zellwandsynthese besitzen, untersucht. Die phr2D-Revertanten waren in der Lage bei einem pH-Wert von 4 zu wachsen und zu filamentieren. Das irreguläre Wachstum der Revertanten war auf eine konstitutive Expression des PHR1-Gens zurückzuführen. Dagegen spielte das bei sauren pH-Werten exprimierte PHR1 keine Rolle für das atypische Filamentierungsverhalten der Revertanten. Die molekulargenetische Untersuchung unabhängiger phr2D-Revertanten zeigte, dass eine heterozygote dominant-aktive Mutation im RIM101-Lokus für den Phänotyp der Revertanten verantwortlich war. RIM101 ist demnach das Schlüsselelement des pH-regulierten Dimorphismus. Diese Ergebnisse zeigten zudem, dass der in Aspergillus nidulans und anderen Pilzen beschriebene molekulare Mechanismus der pH-abhängigen Genexpression auch in C. albicans konserviert ist. Die Expression multipler wildtypischer oder mutierter RIM101-Kopien führte zur Suppression des Temperatursignals, welches für das pH-abhängige filamentöse Wachstum notwendig ist. Demnach konvergieren die Umweltsignale pH-Wert und Temperatur auf gemeinsame Zielgene. RIM101 von C. albicans scheint seine eigene Expression zu induzieren. Konstitutiv aktive RIM101-Allele verursachen eine starke Expression von RIM101 bei pH 4. Im Wildtyp dagegen wird RIM101 bei sauren pH-Werten nur schwach exprimiert. Die Inaktivierung der MAP Kinase Kaskade und der cAMP-abhängigen Kaskade durch Deletion der beiden Gene CPH1 und EFG1 führt zur Blockade der morphologischen Flexibilität von C. albicans (Lo et al., 1997). Mit Hilfe eines dominant–aktiven RIM101-Allels wurde eine mögliche Wechselwirkung von RIM101 mit diesen Filamentierungskaskaden untersucht. Diese Untersuchungen ergaben, dass der pH-regulierte Dimorphismus von EFG1 abhängig war. Dagegen war die pH-regulierte Genexpression unabhängig von EFG1. C. albicans und Candida glabrata sind als opportunistische Krankheitserreger in der Lage diverse Gewebe und Organe zu besiedeln und zu infizieren. Das Überleben in den unterschiedlichen Wirtsnischen erfordert daher eine hohe Anpassungsfähigkeit. Auf unterschiedliche Umweltbedingungen reagiert C. albicans, wie oben beschrieben, mit der Expression bestimmter Gene, wie z. B. PHR1, PHR2 und RIM101. Während die Genregulation in C. albicans in den letzten Jahren intensiv erforscht wurde, ist über die differentielle Genexpression in der klinisch zunehmend wichtigen Spezies C. glabrata kaum etwas bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Etablierung eines geeigneten Reportersystems für C. glabrata angestrebt, welches zur Untersuchung der Genregulation und der Identifizierung differentiell exprimierter Gene eingesetzt werden kann. Das lacZ-Gen wurde als Reporter für die Genexpression in C. glabrata getestet. Die Resultate zeigten die Funktionalität des bakteriellen lacZ-Gens als Reporter für die Genexpression in C. glabrata. Zu dem wurden C. glabrata / E. coli Shuttle-Vektoren entwickelt, die für translationelle Genfusionen zum lacZ verwendet werden können.
N2  - Morphological development of the fungal pathogen C. albicans is profoundly affected by environmental signals. This morphological flexibility is considered an essential factor for pathogenicity of C. albicans. One of the important signals that regulates morphology of C. albicans is the ambient pH. Acidic pH restricts growth to the yeast form, whereas neutral pH permits development of the filamentous form. Superimposed on the pH restriction is a temperature requirement of approximately 37°C for filamentation. C. albicans responds to changes in environmental pH by differential expression of several genes including PHR1 and PHR2. PHR2 is an acid expressed gene that is not expressed at detectable levels above pH 6.5. Mutants lacking PHR2 are unable to grow at acidic pH and exhibit morphological defects. PHR1 is an alkaline expressed gene with the inverse pattern of expression. PHR1 and PHR2 encode functionally homologous proteins involved in cell wall biosynthesis, which is pivotal in determining cell shape changes during morphogenesis. The role of pH in development was investigated in this work by selecting revertants of phr2D mutants that had gained the ability to grow at acid pH. The extragenic suppressors in two independent revertants were identified as nonsense mutations in the pH response regulator RIM101 that resulted in a carboxy-terminal truncation of the open reading frame. These dominant active alleles conferred the ability to filament at acidic pH, to express PHR1, an alkaline expressed gene, at acidic pH and to repress the acid expressed gene PHR2. This indicates that RIM101 is a key regulator of the pH-dependent dimorphism in C. albicans. Furthermore these results suggest that the molecular mechanisms which control pH-dependent gene expression in Aspergillus nidulans and other fungi are also conserved in C. albicans. It was also observed that both the wild type and mutant alleles could act as multicopy suppressors of the temperature restriction on filamentation, allowing extensive filamentation at 29°C. This observation suggests that two environmental signals, pH and temperature, converge on common molecular targets. The ability of the activated alleles to promote filamentation was dependent upon the developmental regulator EFG1. The results suggest that RIM101 is responsible for the pH-dependence of hyphal development. C. albicans and C. glabrata are opportunistic pathogens which are able to colonize and infect many tissues and organs. This indicates that these organisms are well adapted for survival within the diverse environmental niches of the human host. C. albicans responds to different environmental signals, as described above, with the expression of certain genes, e.g. PHR1, PHR2 and RIM101. In contrast to C. albicans the gene regulation in the emerging pathogen C. glabrata is poorly understood. In order to develop a reporter system allowing studies on regulated gene expression in C. glabrata the functionality of the E. coli lacZ gene as a reporter of gene expression in C. glabrata was investigated. C. glabrata shuttle vectors suitable for the construction of translational fusions of a gene of interest to the E. coli lacZ reporter were generated. By fusing different promoters to the lacZ gene it could be shown that the E. coli lacZ gene provides a sensitive and inducible reporter displaying b-galactosidase activity in C. glabrata.
KW  - Candida albicans
KW  - Wasserstoffionenkonzentration
KW  - Genexpression
KW  - Torulopsis glabrata
KW  - Markierungsgen
KW  - Candida albicans
KW  - pH
KW  - Dimorphismus
KW  - Genexpression
KW  - RIM101
KW  - Candida glabrata
KW  - Reportergen
KW  - Candida albicans
KW  - pH
KW  - dimorphism
KW  - gene expression
KW  - RIM101
KW  - Candida glabrata
KW  - reporter gene
Y1  - 2000
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1125
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TY  - THES
A1  - Klement, Jochen
T1  - Zur Abhängigkeit der Parameter der Blutgasanalyse aus dem Nabelschnurblut des Neugeborenen von der Lagerung der Probe
T1  - Time dependent change of the parameters of the blood gas analysis in umbilical cord blood of the newborn
N2  - In der vorliegenden Studie sollte geprüft werden, ob eine Blutgasanalyse aus Nabelschnurblut, deren Substrat unmittelbar nach der Geburt gewonnen wurde, die aber mit größerer Latenz durchgeführt wurde, Werte erbringt, die einen Rückschluß auf den Blutgasstatus zum Zeitpunkt der Geburt erlauben. Praktische Relevanz kann eine solche Aussagemöglichkeit im Rahmen von Sectiones bei verspäteter Messung oder bei Latenz zwischen Blutentnahme und Analyse der Probe im Rahmen von Hausgeburten erlangen. Bei einer Lagerungstemperatur von 24-25°C wurden anhand einer 77 Proben starken Studie die Abweichungen vom Ausgangswert bis 30 Stunden post partum bestimmt. Mit diesen Werten wurde durch einfache Subtraktion der Versuch unternommen, arterielle und venöse Stichproben auf den Ausgangswert zum Zeitpunkt der Geburt zurückzurechnen. Folgende Parameter wurden berücksichtigt: pH, pCO2, pO2, SBC, ABE, SBE. Die Rückrechnung der Parameter nach der oben genannten Formel durch einfache Subtraktion erbrachte folgende Ergebnisse: signifikante Unterschiede zwischen errechnetem und gemessenem Wert ergaben sich: · nach vier, acht, zwölf und 16 Stunden für die Rückrechnung des venösen pHs, · nach zwölf und 16 Stunden für die Rückrechnung des venösen pCO2, · nach acht und zwölf Stunden für die Rückrechnung des venösen pO2, · nach acht und zwölf Stunden für die Rückrechnung des venösen SBC, · nach acht und zwölf Stunden für die Rückrechnung des venösen ABE, · nach zwölf Stunden für die Rückrechnung des venösen SBE, · nach acht Stunden für die Rückrechnung des arteriellen ABE, · nach acht Stunden für die Rückrechnung des arteriellen SBE. Die Folgerungen, die aus den Ergebnissen gezogen werden können, lauten wie folgt: · Ein nachträglich zu bestimmender Blutgasstatus sollte aus arteriellem Nabelschnurblut gewonnen werden. · Es empfiehlt sich die Analyse innerhalb einer Lagerungsdauer von vier Stunden. · Bei einer Sectio caesarea könnte die Analyse auch erst am Ende des operativen Eingriffs erfolgen, ohne daß es zu signifikanten Änderungen eines der Parameter kommt. · Steht ein Kühlschrank zur Verfügung, kann die Änderung der Parameter durch Lagerung im Kühlschrank geringer gehalten werden. · Mit den Parametern pH, pCO2, SBC, ABE und SBE läßt sich bis zu vier Stunden nach der Geburt der arterielle Säure-Basen-Haushalt und damit die Sauerstoffversorgung des Kindes sub partu beurteilen. Explizit lassen sich schwerwiegende Entgleisungen im Einzelfall ausschließen. Insofern ließe sich bei rechtzeitiger Analyse einer bei einer Hausgeburt vor Ort entnommenen Probe eine krasse Fehlleistung des Geburtshelfers als wahrscheinlich oder unwahrscheinlich einstufen. Eine weitere Ausdehnung der Lagerungsdauer führt zu größeren Ungenauigkeiten in der Rückrechnung und folglich zu größeren Fehlern.
N2  - The question to be answered by this study was, if an acid-base state from umbilical cord blood which is taken immediately after birth but which has already been stored for several hours gives an exact information about the acid-base state after birth. This could be of interest when analysing blood too late after a caesarean sectio or after a birth at home. We took 77 samples and analysed the differences between the acid-base state immediately after birth and after each hour. Using these differences, we tried to count back by simple subtraction the acid-base state at birth. The calculated values were compared with the really measured values by Student’s T-Test. The following parameters were included: pH, pCO2, pO2, standard bicarbonate SBC, actual base excess ABE, base excess in the extra cellular fluid SBE. The following conclusions resulted: there are significant differences in comparison of calculated and measured values for: · Venous pH after four, eight, twelve and 16 hours · Venous pCO2 after twelve and 16 hours · Venous pO2 after eight and twelve hours · Venous SBC after eight and twelve hours · Venous ABE after eight and twelve hours · Venous SBE after twelve hours · Arterial ABE after eight hours and · Arterial SBE after eight hours By these results, there are some conclusions to be made for practical obstetrics: · When analysing too late, you should analyse arterial cord blood. · It is best to analyse within the first four hours after birth. · You can analyse the cord blood at the end of a caesarean sectio without getting significant wrong values. · The differences to the values when analysed immediately after birth are smaller when storing the blood at lower temperature, for example in the fridge. · You can control the child’s conditions at birth with the parameters pH, pCO2, SBC, ABE and SBE. by an analysis after four hours of storage. Explicitly, you can deny an important lack of oxygen under birth in singular cases. Regarding births at home, you can declare bigger mistakes of the obstetrician as rather likely or not when analysing a sample within four hours when it was taken at birth. By storing the blood for a longer time, the differences between measured and calculated values get bigger.
KW  - Säure-Basen-Haushalt
KW  - Blutgasstatus
KW  - pH
KW  - Basendefizit
KW  - Kohlendioxidpartialdruck
KW  - Azidose
KW  - Nabelschnurblut
KW  - Acid-base-state
KW  - blood gases
KW  - pH
KW  - base excess
KW  - pCO2 acidosis
KW  - umbilical cord blood
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3016
ER  -