TY - THES A1 - Tomaschütz, Lena T1 - Probleme angepasster HIV-Diagnostik in ressourcenarmen Ländern am Beispiel Gikonkos, Ruanda – Situationsanalyse und potentielle Lösungsansätze T1 - Problems of rapid HIV diagnostics in resource limited countries using the example of Gikonko, Rwanda - situation analysis and possible answers N2 - Nachdem im Rahmen einer engen Zusammenarbeit zwischen dem Missionsärztlichen Institut in Würzburg und dem Centre de Santé in Gikonko, Ruanda bereits im Vorfeld dieser Arbeit erhebliche Probleme mit falsch positiven HIV-Schnelltestergebnissen aufgefallen waren, wurden 162 Patienten bezüglich ihres HIV-Status untersucht und bei einer kleineren Gruppe (46 Patienten) eine eingehende serologische Analyse durchgeführt. Dabei waren Ziele dieser Arbeit (1) den HIV-Status aller in Gikonko als HIV-positiv geführten Patienten zu überprüfen, um so das diagnostische Problem genauer einschätzen zu können; (2) die Reaktionsmuster der Tests zu analysieren, um mögliche Schwachpunkte der einzelnen Schnelltests zu finden; (3) nach Ursachen sowie potentiellen Kreuzreaktivitäten für uneindeutige oder falsch positive Testergebnisse zu suchen; (4) Risikogruppen zu definieren, in denen HIV-Schnelltests weniger aussagekräftig sind und (5) die angepasste HIV-Diagnostik in einigen ausgewählten Fällen mit genaueren Verfahren in Deutschland zu überprüfen und nach weiteren serologischen Auffälligkeiten zu suchen. Hierfür wurden Blutproben mithilfe der im ruandischen Testalgorithmus verwendeten Schnelltests (DetermineTM, UnigoldTM, CapillusTM, First ResponseTM) vor Ort auf HIV getestet. Von Patienten mit zu Voruntersuchungen abweichenden bzw. wider-sprüchlichen Ergebnissen wurden Serumproben nach Deutschland zu genaueren serologischen Analyse transportiert. Diese umfasste die virologische Untersuchung auf HIV mittels ELISA, Western Blot (im positiven Fall zur Bestätigung) sowie PCR, eine immunologische und autoimmunologische Untersuchung (Bestimmung von IgG, IgM, Rheumafaktor sowie ANCA), sowie eine parasitologische Untersuchung (Bestimmung von Malaria-Antikörper) und die Messung von Werten der klinischen Chemie (Kreatinin, GOT, GPT). Ergänzt wurde die serologische Analyse durch die Erhebung von Daten aus der Kartei des Krankenhauses sowie der Schwangerenambulanz in Gikonko. Es zeigte sich, dass unter Verwendung von HIV-Schnelltests bei nur 79% der Patienten (n = 112) der HIV-positive Status bestätigt werden konnte, 15% (n = 21) erhielten ein klar negatives Ergebnis und in 6% (n = 8) führten die HIV-Schnelltests zu keinem eindeutigen Ergebnis. Bei der virologischen Untersuchung in Deutschland wurden alle negativen Ergebnisse bestätigt; unter den acht uneindeutig getesteten Seren wurde in zwei Fällen eine HIV-Infektion nachgewiesen. Um Schwachpunkte oder Anfälligkeiten einzelner Tests auf Störfaktoren aufzeigen, wurden die Reaktionsmuster der HIV-Schnelltests entsprechend der genaueren serologischen Untersuchungen dargestellt und analysiert. Es zeigte sich, dass besonders DetermineTM und CapillusTM ursächlich für uneindeutige Testergebnisse waren. Bei der genaueren Analyse von Seren von Patienten mit zu Voruntersuchungen abweichenden bzw. widersprüchlichen Ergebnissen wurden bei 7% (n = 3) Rheumafaktoren und bei 16% (n = 5) ANCAs nachgewiesen. Außerdem zeigten 48% der Proben (n = 22) stark erhöhte IgM-Werte. Es waren wiederum vornehmlich die Tests DetermineTM und CapillusTM, welche Probleme bei der Testung der entsprechenden Seren aufwiesen. Der Einfluss zweier äußerer Faktoren hingegen war evident: Zum einen führte die Interpretationsvorschrift der Hersteller, jegliche Reaktion als positiv zu werten, zu vielen falsch positiven Ergebnissen und zum anderen genügten die zur Verfügung stehenden HIV-Schnelltests im ländlich gelegenen Gikonko, mit einer HIV-Prävalenz von 4%, den biomathematischen Anforderungen nicht. Die erhobenen Daten aus der Kartei des Centre de Santé erhärteten die Annahme, dass die Neutralität der interpretierenden Person durch eine verdächtige Familien- oder Eigenanamnese bzw. eine entsprechende Klinik gefährdet wird. Die Analyse der Kartei der Schwangerenambulanz zeigte eine signifikante Häufung falsch positiver Testergebnisse im letzten Trimenon. N2 - To evaluate the problem of false positive rapid HIV test results in resource limited countires, 162 patients of the Centre de Santé in Gikonko, Rwanda were tested using rapid tests and of 46 serum samples further serological analysis were performed. Objectives of this thesis were to quantify the number of patients with a false positive HIV status, to search for possible reasons for the failure of rapid HIV tests (e.g. cross reactivities), and to identify specific risk groups with a reduced reliability of rapid HIV tests. KW - HIV KW - HIV-Infektion KW - Schnelltest KW - Serodiagnostik KW - Diagnostik KW - Antikörper KW - Kreuzreaktion KW - Rwanda KW - Rheumafaktor KW - Autoantikörper KW - Schwangerschaf KW - falsch positiv KW - ANCA KW - ressourcenarm KW - HIV-Schnelltest KW - IgM KW - HIV KW - rapid test KW - false positive KW - pregnancy KW - crossreactivity KW - ANCA Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-39981 ER - TY - THES A1 - Kuhl, Angelika T1 - Epitop-abhängige Pathogenität von PR3-Autoantikörpern und Charakterisierung einer myofibrillären Myopathie mit familiärer arrhythmogener rechtsventrikulärer Dysplasie T1 - Epitope-dependend pathogenicity of PR3-autoantibodies and characterization of a myofibrillar myopathy with arrythmogenic right ventricular cardiomyopathy 7 N2 - Im ersten Teil dieser Arbeit wurden Antikörper-bindende Epitope von humaner Proteinase 3 (hPR3), dem Autoantigen der Wegenerschen Granulomatose (WG), charakterisiert. WG ist eine Autoimmunerkrankung, die durch chronische Entzündung des oberen und unteren respiratorischen Trakts, Vaskulitis und Glomerulonephritis gekennzeichnet ist. WG ist mit Anti-Neutrophilen zytoplasmatischen- Antikörpern (ANCA) assoziiert, die spezifisch gegen konformationelle Epitope auf der Oberfläche der Serinprotease hPR3 aus azurophilen Granula neutrophiler Granulozyten gerichtet sind. Die Charakterisierung von ANCA-bindenden Epitopen ist für ein besseres Krankheitsverständis Unverzichtbar. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde nach einem geeigneten PR3-Homolog gesucht, welches sich durch den gezielten Austausch von Oberflächen- Loops für die Kartierung von ANCA-Epitopen eignet. Zunächst wurde die PR3 Aminosäuresequenz der Primaten Pan troglodytes versus (Schimpanse), Macacca mulatta (Makakke) und Hylobates pileatus (Gibbon) analysiert und die Reaktivität gegenüber ANCA mit dem humanen Homolog verglichen. Sowohl Aminosäuresequenz als auch ANCA-Kreuzreaktivität korrelierten mit der phylogenetischen Distanz zu hPR3. Aufgrund der Bindungseigenschaften von Gibbon-PR3 (gibPR3) wurde dieses Homolog für Epitopstudien herangezogen, da die Aminosäuresequenz nur geringfügig von hPR3 abweicht und die Bindung von monoklonalen Anti-hPR3-Antikörpern und WG-Patientenseren im Immunoblot ein deutlich abgeschwächtes Signal lieferte oder keine Reaktivität mehr aufwies. Für die Epitop-Charakterisierung wurden drei hPR3/gibPR3-Mutanten generiert. Die rekombinante Expression von proPR3 erfolgte in Flp-in HEK 293 Zellen und wurde von dort aus dem Zellkultur-Überstand gereinigt und mittels Enterokinase konvertiert. Um das Epitopspektrum genau zu analysieren, wurde ein ELISA entwickelt, bei dem PR3 über den C-terminal gelegenen His6-Tag an Nickel-beschichtete Mikrotiterplatten gebunden wurde. Für den monoklonalen Anti-hPR3-Antikörper MCPR3-2 konnte die Region auf die Aminosäuren Arg60, Gln63A und Leu90 (Chymotrypsinogen-Nummerierung), das für 12.8 auf Met35, Asn38A, Pro38B und Arg74 der N-terminalen PR3-Domäne eingegrenzt werden. Letztere wurde von der Mehrheit der getesteten ANCA der WG-Patienten erkannt und zeigt somit, dass es sich hierbei um ein krankheitsrelevantes Epitop handelt. Diese Region schließt dabei auch den Bindungsbereich von α1-PI ein. Im weiteren konnte gezeigt werden, dass eine Bindung des Antikörpers bei gleichzeitiger Anwesenheit von α1-PI stark von dessen Konzentration abhängig ist. Bereits bei einer α1-PI-Konzentration von 1 mg/ml, konnte eine partielle Antikörperbindung beobachtet werden. Sinkt die Konzentration deutlich, so besitzen Anti-hPR3-Antikörper die Möglichkeit an diese zu binden. Somit konkurrieren Antikörper und Inhibitor um die PR3-Bindungsstellen. Ein ausgewogenes Protease-Inhibitor-Gleichgewicht ist allerdings für eine kontrollierte Protease-Aktivität notwendig. Ist dieses gestört, so kann es zur Bindung von ANCA an hPR3 auf der Membran von Neutrophilen und deren Aktivierung kommen. Dies hat zur Folge, dass vermehrt proteolytische Enzyme freigesetzt werden, welche durch unkontrollierte enzymatische Aktivität Entzündungsreaktionen und Gewebeschädigung hervorrufen. Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Charakterisierung einer autosomal-dominant vererbten myofibrillären Myopathie (MFM) in Kombination mit familiärer arrhythmogener rechtsventrikulärer Kardiomyopathie 7 (ARVD7) einer schwedischen Familie. Durch genomweite Kartierung mittels SNP (single nucleotide polymorphism)-Typisierung (Affymetrix Human Mapping 10K Array) wurde der Locus auf 10q22.3 bestätigt. Die Region wurde anschließend bis auf 4.1 Mbp zwischen den Markern D10S1645 und D10S1786 eingegrenzt. In diesem Intervall befinden sich 18 Kandidatengene. Nachdem die Protein-kodierenden Exons aller Gene im Krankheitsintervall sequenziert und dennoch keine signifikanten Abweichungen zwischen Patient und der Normalpopulation aufgefallen waren, wurde gezielt nach einer intragenische Deletion gesucht. Hierzu wurde von einem der Patienten zwei Maus-Hybridlinien generiert, die jeweils nur eines der beiden 10-er Homologe des Patienten enthalten. Doch auch hier waren die kodierenden Exons der 18 Gene aus beiden Hybridlinien durch PCR mit gleicher Effizienz und Größe amplifizierbar, so dass eine intragenische Deletionen mit großer Sicherheit bei allen Genen ausgeschlossen werden konnte. Des weiteren wurde nach SNPs in der transkribierten Sequenz der Kandidatengene gesucht, und die Expression beider Allele für 10 von 18 Kandidatengenen in Muskel-cDNA nachgewiesen. Kleine Veränderungen in nicht-kodierenden Bereichen, Introns, Promotor-Regionen, genomische Veränderungen oder de novo Insertionen sind mögliche pathogene Mechanismen, die im weiteren untersucht werden müssen. N2 - In the first part of this work we characterised antibody-binding epitopes of human proteinase 3 (hPR3), the autoantigen in Wegeners granulomatosis (WG). WG is an autoimmune disorder characterized by chronic inflammation of the upper and lower respiratory tract, perivascular inflammation and glomerulonephritis. WG is associated with anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA), which recognize conformational epitopes on the surface of hPR3 from azurophilic granules of neutrophil granulocytes. To determine, which epitopes are disease specific and pathogenetically relevant, we first identified a humanoid PR3 homolog which was used to map and distinguish the various ANCA-binding epitopes. We analysed the PR3 amino acid sequence of primates Pan troglodytes versus (chimpansee), Macacca mulatta (macaque) and Hylobates pileatus (gibbon) and compared the ANCA-binding pattern of these species to the human homolog. Amino acid differences and ANCA cross-reactivity correlated with the phylogenetic distance to the human homolog. We recognized the most useful PR3 variant was the gibbon equivalent (gibPR3) because it harboured a limited number of amino acid differences and showed an intermediate ANCA binding pattern with binding of some but not all monoclonal anti-hPR3 antibodies and WG patient sera. To determine the epitopes, we generated three PR3-chimera by reverting non-conserved PR3-loops to the respective human amino acids. ProPR3 was expressed in Flp-in 293 cells, purified from cell culture supernatant and activated by enterokinase. For epitope analysis an ELISA was developed, where PR3 was coupled via its C-terminal His6-tag to nickel-coated microtiter plates. The epitope of monoclonal anti-hPR3 antibody MCPR3-2 was mapped to a region defined by amino acids Arg60, Gln63A and Leu90 (chymotrypsinogen numbering), whereas Met35, Asn38A, Pro39B and Arg74 of the N-terminal PR3 domain contributed to the 12.8 epitope. The latter epitope was recognized by the majority of ANCA from Wegener patients tested and seems to be an ANCA-targeted region. The 12.8 epitope overlaps with the α1-PI binding site, too. Therefore antibody and inhibitor directly compete for binding to hPR3. Moreover we showed that antibody binding strongly depends on the concentration of this inhibitor. α1-PI-concentrations of 1 mg/ml allowed partial binding to PR3 and concentrations below shifted the binding towards the antibody. This finding indicates that a protease-inhibitor balance is critical because ANCA-binding to membrane bound PR3 on the surface of neutrophils would lead to activation and release of proteolytic enzymes to the environment and to an uncontrolled proteolytic activity. The second part of this studies were dedictated to the search for the genetic defect in a Swedish family suffering from autosomal dominant myofibrillar myopathy (MFM) in combination with arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy (ARVC7). In a comprehensive follow up study we reexamined the previous linkage data for MFM/ARVC7 by genome wide SNP analyses and confirmed the locus assignment using a high density single nucleotide polymorphism (SNP) marker panel from Affymetrix to 10q22.3. The critical interval was narrowed down to 4.1 Mbp between the two markers D10S1645 and D10S1786. Because no mutation was found in the coding exons of the 18 candidate genes for MFM/ARVC7 we tried to identify small genomic deletions and generated hybrid cell lines carrying only the affected or the normal chromosome 10 homolog. All sequence tagged sites and exons were present on both homologs excluding the possibility of intragenic and submicroscopic deletions. Furthermore, we identified SNPs within the transcribed sequences of 10 candidate genes and showed expression of both alleles in patient muscle cDNA. Subtle alterations in noncoding transcripts, introns, promoter regions or splicing enhancers, genomic inversions or de novo insertions are probably responsible for both disparate syndromes and have to be investigated. KW - Wegenersche Granulomatose KW - Proteinase 3 KW - ANCA KW - konformationelle Epitope KW - Wegeners granulomatosis KW - Proteinase 3 KW - ANCA KW - conformational epitopes Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27028 ER - TY - THES A1 - Huyke, Constance Angela T1 - Expression von rekombinanten Antigenen zur Untersuchung der Autoantikörperspezifität bei Goodpasture-Syndrom T1 - Expression of recombinant antigenes for investigating the specifity of anti-GBM-antibodies N2 - Das Goodpasture-Syndrom zählt zum Formenkreis von Autoimmunerkrankungen, die klinisch unter dem Bild eines pulmorenalen Syndroms verlaufen. Als Goodpasture-Syndrom wird hierbei die Trias aus rapid progredienter Glomerulonephritis, begleitenden Lungenblutungen und dem Auftreten von Anti-GBM-Autoantikörpern bezeichnet. Neben dieser klassischen Form existieren auch Verläufe, die nur die Nieren (35 %) oder nur die Lunge (5 %) betreffen. Die B-Zell-vermittelte Immunität trägt den Hauptanteil am Krankheitsgeschehen. Die Autoantikörper sind gegen die NC1-Domäne der α3-Ketten des glomerulären Basalmembran Kollagen (Typ IV) gerichtet. In der indirekten Immunfluoreszenz sind als Korrelat dafür charakteristische lineare Ablagerungen von Immunkomplexen zu sehen. Das Goodpasture-Autoantigen ist Bestandteil eines speziellen Kollagennetzwerkes, das nur in der glomerulären und alveolaren Basalmembran vorkommt. Das Goodpasture-Autoantigen ist von diskontinuierlicher Struktur. Für die Antikörperbindung sind vor allem die Aminosäureabschnitte 17-31 (GPA) und 127-141 (GPB) von α3(IV)NC1 verantwortlich. Sie werden durch Faltung des Moleküls in räumliche Nähe zueinander gestellt. Mit der vorliegenden Arbeit sollte die Frage beantwortet werden, ob unterschiedliche klinische Verläufe mit verschiedenen Autoantikörperpopulationen korrelieren. Versuche mit rekombinanten Antigenen zeigten die Existenz mehrerer möglicher Autoantikörpersubklassen. 12 der 14 Seren reagierten stärker mit der Chimäre C6 ( entspricht dem Epitop GPB) als mit C2 (entspricht dem Epitop GPA), die beiden anderen Seren hatten ein umgekehrtes Reaktionsverhalten. Sie hatten eine höhere Affinität zu C2 (GPA) als zu C6 (GPB). Von den 12 Seren mit der Reaktion C2 < C6 reagierten 5 Seren etwa gleich stark mit C6 und C2.6 (entspricht GPAB). Bei dieser Gruppe richtete sich die Affinität der Autoantikörper hauptsächlich gegen das Epitop GPB, das in beiden Chimären enthalten ist. Sieben Seren hatten das Charakteristikum C2 < C6 << C2.6. Hier hatten die Autoantikörper die höchtste Affinität zu dem Epitop GPAB als „Gesamtepitop“. Die einzelnen Epitopanteile GPA und GPB konnten allein keine so starke Bindung erzeugen. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war, den Zusammenhang zwischen der klnischen Ausprägung des Goodpasture Syndroms und den Autoantikörpersubklassen zu untersuchen. In den beiden größeren Gruppen (n=5 und n=7) waren Patienten mit und ohne Lungenbefall eingeschlossen. Die beiden Seren mit C2 > C6 wiesen ebenfalls eine Beteiligung von Lunge und Niere auf. Mit den vorliegenden Fallzahlen war keine Korrelation zu den Autoantikörpersubklassen zu ermitteln. Das Outcome hinsichtlich der Nierenfunktion wurde ebenfalls auf einen Zusammenhang mit den Autoantikörpersubklassen hin untersucht. Auch hier ergab sich bei den untersuchten Fallzahlen keine Korrelation mit verschiedenen Autoantikörpersubklassen. Das initiale Serumkreatinin bei Diagnosestellung und in gewissem Umfang auch die Höhe des Antikörpertiters waren die entscheidenden Faktoren. Der zweite Aspekt der vorliegenden Arbeit beschäftigte sich mit sogenannten „doppelt“ positiven Patienten mit pulmorenalem Syndrom. Diese gehören zu einer Untergruppe von Vaskulitis-Fällen, die neben ANCA auch Anti-GBM-Autoantikörper vorweisen. Klinisch verlaufen diese Fälle oftmals sehr ähnlich wie ein Goodpasture-Syndrom. Die neun untersuchten Patienten mit C-ANCA (n=7) bzw. P-ANCA (n=2) und Anti-GBM-Autoantikörpern reagierten alle mit der α3(IV)NC1-Domäne, jedoch reagierte nur ein Serum Goodpasture-typisch. Die anderen 8 Seren zeigten entweder keinen Synergismus (n=2) oder reagierten nur sehr schwach (< 16 %) mit den Chimären (n=6). Das legt die Schlussfolgerung nahe, dass die Anti-GBM-Antikörper bei Vaskulitis-Patienten in der Regel nicht mit denen von einfach positiven Goodpasture-Patienten übereinstimmen, sondern gegen verschiedene Substrukturen der Epitope gerichtet sind. Weiterführende Untersuchungen könnten in dieser Frage Klarheit verschaffen. Die Ergebnisse könnten auch zur Entwicklung eines diagnostischen Tests führen, der die Differenzierung der Autoantikörper erlaubt und die Diagnosestellung erleichtert. N2 - Goodpasture Syndrome is characterized by the trias of rapidly progessive glomerulonephritis, pulmonary haemorrhages and anti-glomerular basement antibodies, but the disease can also occur as glomerulonephritis without lung involvement (35 %) or as isolated pulmonary haemorrhage (< 5 %). The pathogenetic autoantibodies are mainly directed against the NC1 domain of the chain of collagen type IV, a major constitutent of human glomerular basement membrane. Two conformational epitopes (GPA and GPB) has been localized within the α3(IV) NC1 domain at residues 17-31 and 127-141. The present study investigated a possible correlation between the clinical outcome and several populations of autoantibodies. The existence of several populations of autoantibodies could have been shown by using α1/α3(IV) NC1 chimeras. 12 of 14 GP sera reacted stronger with C6 (GPB) than C2 (GPA), the remaining two sera reacted stronger with C2 than C6. Five sera reacted in the same intensity with C6 and C26. The main epitope was GPB, respectively. 7 sera showed the highest affinity to GPAB. There was no difference in clinical outcome or symptoms and between those antibody populations. The two major groups included patients with glomerulonephritis with and without lung involvement. The second point of this study was analysing sera with both anti-glomerular basement antibodies and ANCA. All investigated sera reacted with α3(IV) NC1 domain, but reacted very weakly with the chimeras or showed no synergism. The hypothesis is, that those antibodies bind another structure of the α3(IV) NC1 domain. There was no correlation between antibody reaction and clinical outcome too. KW - Goodpasture Syndrom KW - Anti-GBM-Antikörper KW - Vaskulitis KW - ANCA KW - Goodpasture Syndrome KW - anti-GBM-antibodies KW - vasculitis KW - ANCA Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11708 ER - TY - THES A1 - Pfister, Heiko T1 - Wegener'sche Granulomatose T1 - Wegener's granulomatosis N2 - Die Wegener'sche Granulomatose (WG) ist eine Autoimmunerkrankung, die sich typischerweise als chronische Entzündung des oberen Respirationstraktes, Vaskulitis und Glomerulonephritis manifestiert. WG gehört zur Gruppe der sog. “pauci-immunen” Vaskulitiden, die mit Anti-Neutrophilen-Antikörpern (ANCA, anti neutrophil cytoplasmic antibody) assoziiert sind. Mit Hilfe der indirekten Immunfluoreszenz lassen sich ANCA im Serum der meisten WG-Patienten nachweisen. Die mit WG assoziierten sog. “klassischen” ANCA (c-ANCA) erkennen spezifisch Konformationsepitope der Serinprotease Proteinase 3 (PR3), die in den azurophilen Granula neutrophiler Granulozyten gespeichert wird. Die enge Korrelation PR3-spezifischer Antikörperspiegel mit dem Krankheitsverlauf läßt vermuten, daß sie bei der Pathogenese eine zentrale Rolle spielen könnten. Diese Hypothese wird von Daten aus in vitro Experimenten gestützt: werden Zytokin-stimulierte neutrophile Granulozyten mit Patientenserum oder isolierten c-ANCA inkubiert, erfolgt eine Aktivierung der Neutrophilen, die sich durch Degranulation und Freisetzung von Sauerstoffradikalen äußert. c-ANCA können so indirekt - aber vermutlich auch direkt - zur Endothelschädigung beitragen. Jedoch konnte bisher kein direkter Beweis des pathogenen Potentials von c-ANCA am Tiermodell erbracht werden. Um die Wirkung von c-ANCA an einem Mausmodell zu testen, war zunächst ein murines Maus-PR3- (mPR3) spezifisches Antiserum notwendig. Da humane c-ANCA nicht mit mPR3 kreuzreagieren, wurde für die Immunisierung von PR3/Neutrophilen-Elastase (NE)-defizienten Mäusen ein mPR3-Zymogen rekombinant in E. coli als Einschlußkörpermaterial (IB, inclusion bodies) hergestellt. Nach Renaturierung des IB-Materials in vitro wurde mit der Dipeptidylaminopeptidase Cathepsin C das N-terminale Propeptid abgespalten. Das gewonnene Enzym besaß die für PR3 und NE spezifische katalytische Aktivität, die durch den physiologischen Inhibitor humaner PR3, a1-Antitrypsin, inhibiert werden konnte. Es ist daher anzunehmen, daß das gewonnene rekombinante Material die korrekte Konformation durch Renaturierung in vitro erhalten hatte. Um nun die pathologische Wirkung von Anti-rmPR3-Antikörpern zu testen, wurden PR3/NE-defiziente Mäuse mit dem rekombinanten Zymogen (pro-rmPR3) oder der N-terminal prozessierten Form (rmPR3) immunisiert. Die Spezifität der gewonnenen Antiseren wurde durch Festphasenimmunoassay, Western Blotting und indirekte Immunfluoreszenzfärbung überprüft. Weiterhin konnte fluoreszenzzytometrisch die Bindung von Anti-mPR3-IgG an die Plasmamembran Zytokin-stimulierter Granulozyten nachgewiesen werden. Die hergestellten Antiseren erfüllten somit die für c-ANCA-positive Seren von WG-Patienten typischen Eigenschaften hinsichtlich der Antigenspezifität. Wenn c-ANCA alleine hinreichend für die Induktion der für WG charakteristischen Symptome sind, sollte der Antiserumtransfer auf Wildtyp-Mäuse WG-ähnliche Symptome in den Rezipienten hervorrufen. Nach wiederholter intravenöser Injektion von Serum pro-rmPR3-immunisierter Mäuse ließ sich ein signifikanter Antikörperspiegel bei Verdünnungen von 1:2000 über den gesamten Behandlungszeitraum von 10 Wochen in den Rezipienten nachweisen. Der anschließende histologische Befund von Niere und Lunge ergab jedoch keine pathologischen Veränderungen. Dieses Ergebnis legt nahe, daß c-ANCA alleine keine Krankheitssymptome hervorrufen. In dem gegenwärtigen Modell für c-ANCA-vermittelte Vaskulitis entfaltet sich die pathogene Wirkung von c-ANCA vor allem dann, wenn neutrophile Granulozyten zusätzlich durch proinflammatorische Zytokine wie Tumornekrosefaktor alpha (TNF alpha) stimuliert werden. Erst die Stimulation der Granulozyten ermöglicht die Bindung von c-ANCA an die Plasmamembran und deren anschließende Aktivierung. Deshalb wurde dieses Modell, das vorwiegend aus Ergebnissen von Experimenten in vitro abgeleitet ist, auf ein lokales Entzündungsmodell der Maus übertragen: Durch wiederholte Injektion von TNF alpha in die Haut wurde eine leichte Entzündungsreaktion ausgelöst. Diese Entzündungsreaktion ließ sich schließlich durch intravenöse Verabreichung von pro-rmPR3- oder rmPR3-Antiserum verstärken. Dieser Befund ist ein wichtiger Beweis für die verbreitete Ansicht, daß c-ANCA nicht nur ein Epihänomen der WG darstellen, sondern selbst ein pathogenes Potential besitzen. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Beteiligung der beiden Serinproteasen NE und PR3 an der Entstehung inflammatorischer Prozesse untersucht. Im Hinblick auf die bei der Pathogenese der WG beteiligten Mechanismen könnten PR3 und NE eine wichtige Rolle spielen. PR3 und NE können Proteine der extrazellulären Matrix abbauen, Apoptose in Endothelzellen induzieren und sind an der Regulation entzündlicher Prozesse über verschiedene Wirkmechanismen beteiligt. Um quantitative Unterschiede bei Entzündungsreaktionen zwischen NE/PR3-defizienten Mäusen und kongenen Wildtyp-Tieren zu untersuchen, wurde als Modell einer Typ III Hypersensitivitätsreaktion eine lokale passive Arthus-Reaktion induziert. Wildtyp-Mäuse entwickelten dabei eine deutlich stärkere lokale Entzündung als NE/PR3-defiziente Mäuse. Weitere Studien sind nötig um die Frage zu klären, ob eine der beiden Serinproteasen alleine oder in Kooperation mit der anderen diesen Phänotyp hervorruft. Für einen direkten synergistischen Effekt sprechen indes die Ergebnisse eines in vitro Experiments mit pro-rmPR3 und humaner NE: Bei Inkubation von pro-rmPR3 mit hNE wurde eine Spaltung des Proenzyms beobachtet, die mit einer Verstärkung der enzymatischen Bruttoaktivität einherging. Die physiologische Relevanz dieser Beobachtung muß allerdings noch geklärt werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit stehen im Einklang mit den neuesten Erkenntnissen über die Rolle der PR3 bei der Wegener’schen Granulomatose: PR3 dürfte sowohl aufgrund pleiotroper Effekte auf entzündliche Reaktionen als auch wegen seiner lytischen Eigenschaften zur Gewebeschädigung beitragen. Darüberhinaus konnte eine pathogene Wirkung von mPR3-spezifischen Antikörpern in der Maus nachgewiesen werden. N2 - Wegener's granulomatosis (WG) is an autoimmune disorder typically characterized by chronic inflammmation of the upper respiratory tract, vasculitis and glomerulonephritis. WG belongs to the group of anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody (ANCA) associated vasculitides with no or very few immune complex deposits (“pauci-immune”) in affected organs. “Classic” ANCA (c-ANCA) that produce a cytoplasmic staining pattern on neutrophils are a specific seromarker for this disease entity. They recognize conformational epitopes of proteinase 3 (PR3) from azurophil granules of neutrophil granulocytes. The correlation of PR3-specific antibody titers and disease course suggests that they are an important pathogenic factor for this autoimmune disease. The hypothesis is supported by in vitro experiments demonstrating an interaction of c-ANCA with cytokine primed neutrophils resulting in full activation manifested by degranulation and respiratory burst. It has been shown that c-ANCA can also directly induce the loss of endothelial barrier functions. However, direct evidence for the pathogenic potential of c-ANCA in vivo has not been published yet. The central aim of this study is to clarify the role of c-ANCA in WG. Since antibodies directed against human PR3 do not crossreact with the murine homolog, mPR3-specific antibodies were necessary to provide direct proof for c-ANCA mediated tisssue damage in a murine disease model. Hence, sufficient amounts of recombinant murine PR3 (mPR3) were necessary to generate mPR3 specific murine antibodies. Several attempts have been made to produce recombinant PR3 in prokaryotic and eukaryotic host systems. But conformational epitopes recognized by c-ANCA are not well preserved on recombinant PR3 derived from E. coli, P. pastoris, or baculovirus-infected insect cells described in the literature so far. While recombinant human PR3 expressed in eukaryotes is well recognized by c-ANCA, the yield of both active human and murine PR3 generated in eukaryotic expression systems is very low. To obtain sufficient amounts of correctly folded recombinant murine proteinase 3 (rmPR3) for multiple immunizations of PR3/NE-deficient mice, rmPR3 was produced as inclusion body material in E. coli as a catalytically inactive precursor molecule. After in vitro refolding the N-terminal propeptide was removed by limited proteolysis with the dipeptidylaminopeptidase cathepsin C yielding catalytically active enzyme. Due to its catalytic activity that could be inhibited by the physiologic inhibitor of human PR3, α1-antitrypsin, but not by secretory leukocyte protease inhibitor (SLPI), the recombinant material was assumed to harbour the correct conformation after refolding. To test, if anti-rmPR3 antibodies were sufficient to induce symptoms characteristic for WG, anti-PR3 antiserum was generated by immunization of PR3/neutrophil elastase (NE)-deficient mice with recombinant, refolded mPR3 or its zymogen. Specificity of the obtained sera was confirmed by ELISA, Western Blotting and indirect immunofluorescence. Moreover, antisera bound to the membranes of primed murine neutrophils as determined by flow cytometry. The generated antisera thus fulfilled the criteria defining c-ANCA positive sera of WG patients with respect to antigen specificity. If anti-PR3 antibodies are sufficient to induce symptoms characteristic for WG, transfer of antiserum to wildtype mice should induce vasculitis and/or glomerulonephritis. By repetitive intravenous injection of antiserum from immunized mice a persisting antibody titer was generated in naïve wild type mice over a treatment period of 10 weeks. Lung and kidney of these mice were analyzed histologically but neither granuloma or vasculitis were found in the lungs nor glomerulonephritis or vasculitis was observed in the kidneys. This result suggests that c-ANCA alone are not sufficient to induce WG symptoms in the mouse. Our initial observations were not surprising since the current hypothetical concept of c-ANCA-induced vasculitis implies that a primary inflammatory stimulus provided by cytokines like TNF alpha is required for the target antigen to be expressed on the plasma membrane of neutrophils. Exposure of the target antigen enables the binding of c-ANCA and subsequently triggers neutrophil activation. Consequently, this model, that was primarily deduced from in vitro experiments, was adapted to a model of local inflammation in the mouse: A mild inflammation was induced by repetitive local injection of TNF alpha into the skin. This inflammatory reaction increased significantly in the presence of rmPR3-antibodies. Our experimental data thus confirm the current concept that ascribes a pathogenic potential to c-ANCA. A second aspect adressed in this work is the contribution of the two neutrophil serine proteases NE and PR3 to the generation of inflammatory processes. With respect to the mechanisms involved in the pathogenesis of WG, NE and PR3 may be of particular importance due to their ability to degrade extracellular matrix proteins, induction of apoptosis in endothelial cells, and the regulation of inflammatory processes by a variety of mechanisms. A local reverse passive Arthus reaction (RPA) was chosen as a model of a type III hypersensitivity reaction to reveal quantitative differences of inflammation in PR3/NE-deficient mice and congenic wild type mice. Wild type mice reacted significantly stronger than PR3/NE-deficient mice as determined by examination of local edema and hemorrhage intensity. It remains to be determined if the observed phenotype in vivo reveals a concerted effect of both serine proteases or if deficiency of one of the proteases alone accounts already for this phenotype. Experimental data presented in this work are consistent with the hypothesis that PR3 and NE may directly interact: When recombinant mPR3 was incubated with hNE, a cleavage of rmPR3 was observed that is apparently associated with changes in enzymatic activity. The physiologic relevance of this finding has to be defined in further studies. In summary, this work adds to the current understanding of the role of PR3 in WG: PR3 is not only the relevant autoantigen whose interaction with c-ANCA contributes to the fatal outcome of the disease but also contributes together with neutrophil elastase to tissue damage by its lytic activity and pleiotropic effects on inflammatory reactions. KW - Granuloma gangraenescens KW - Leukozytenelastase KW - Autoantikörper KW - Neutrophiler Granulozyt KW - Wegener'sche Granulomatose KW - Proteinase 3 KW - Serinprotease KW - vasculitis KW - ANCA KW - rekombinante Proteinexpression KW - Autoimmunität KW - Wegener's granulomatosis KW - Proteinase 3 KW - serine protease KW - vasculitis KW - ANCA KW - recombinant protein expression KW - autoimmunity Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3133 ER -