TY - THES A1 - Reidl, Sebastian T1 - Funktionale Charakterisierung an der Biofilmbildung beteiligter Faktoren pathogener und kommensaler Escherichia coli T1 - Functional characterization of biofilm-associated traits of pathogenic and commensal Escherichia coli N2 - Multizelluläre Gemeinschaften in Form bakterieller Biofilme stellen aus medizinischer Sicht ein großes klinisches Problem dar. Häufig lassen sich chronische oder rezidivierende Erkrankungen aber auch nosokomiale Infektionen auf die multizelluläre Lebensweise von humanpathogenen Erregern zurückführen. Sowohl fakultativ als auch obligat pathogene Escherichia coli-Stämme besitzen eine Vielzahl unterschiedlicher Faktoren, die die Biofilmbildung beeinflussen. Daran beteiligt sind unter anderem Flagellen, extrazelluläre polymere Substanzen, Adhäsine oder Oberflächen-assoziierte Proteine wie Autotransporter. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die funktionale Charakterisierung des Proteins Antigen 43 (Ag43). Aufgrund seiner Autoaggregation-vermittelnden Eigenschaft trägt Ag43 ebenfalls zur Mikrokoloniebildung und Biofilmreifung bei. Antigen 43 ist ein Autotransporterprotein, welches innerhalb der Bakterienspezies Escherichia coli weit verbreitet ist. Interessanterweise besitzen viele E. coli-Isolate gleich mehrere identische oder ähnliche Kopien von agn43, die in der Regel von variablen Genombereichen (genomische Inseln, Plasmide) kodiert werden. Am Beispiel der Antigen 43-Varianten des uropathogenen Escherichia coli (UPEC)-Stammes 536 (O6:K15:H31), des kommensalen E. coli Isolats Nissle 1917 (O6:K5:H1) sowie des E. coli K-12-Laborstammes MG1655 (OR:H48:K-) ist die Bedeutung des Autotransporterproteins im Rahmen dieser Arbeit näher untersucht worden. Hierfür wurden die verschiedenen agn43-Allele in ein geeignetes Vektorsystem kloniert und im Adhäsin-freien Escherichia coli K-12-Stamm MG1655 ΔfimΔflu exprimiert. Da Antigen 43 in Wildtypstämmen posttranslational glykosyliert vorliegt, sind die Experimente zusätzlich unter Einfluß der heterologen, AIDA I-spezifischen Heptosyltransferase Aah (‘Autotransporter Adhesin Heptosyltransferase’) durchgeführt worden. Anhand von Bindungsstudien (intermolekulare Autoaggregation, Zelladhäsionstests) wurde gezeigt, daß sich einzelne Ag43-Varianten teilweise in ihren Eigenschaften unterscheiden. Im direkten Vergleich mit AIDA-I (‘Adhesin Involved in Diffuse Adherence’) enteropathogener Escherichia coli (EPEC) konnte für Ag43 nur eine Funktion als schwaches Adhäsin nachgewiesen werden. Die heterologe O-Glykosylierung beeinflußte die Funktionalität des Antigen 43 in unterschiedlichem Ausmaß. Je nach Autotransporter-Variante führte die Heptosylierung entweder zu signifikant reduzierten Affinitäten, oder sie hatte keinen Effekt auf die Bindungskapazität des Ag43. Antigen 43 weist zudem strukturelle Homologien zu vergleichbaren Domänen anderer Autotransporter auf. Für viele dieser Proteine konnte bereits eine adhäsive oder invasive Funktion nachgewiesen werden. Eine mögliche Interaktion von Ag43 mit eukaryontischen Rezeptoren ist hingegen noch nicht bzw. nur unvollständig untersucht worden. In Overlay assays und ELISAs wurde für Antigen 43 hier erstmals die spezifische Bindung an die extrazellulären Matrixkomponenten Kollagen und Laminin gezeigt. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, daß das Escherichia coli spezifische Autotransporterprotein Antigen 43 nicht nur an der bakteriellen Biofilmbildung, sondern auch an der Besiedlung epithelialer Gewebe beteiligt sein kann. Seine Expression verschafft Bakterien einen Kolonisationsvorteil, der mit erhöhter Fitneß einhergeht. Die Aah-vermittelte O-Glykosylierung scheint für die Funktionalität von Ag43 nicht zwingend erforderlich zu sein. Des weiteren ist im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein Testsystem entwickelt worden, das auf der Basis von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungen (FISH) die Differenzierung von verschiedenen (uro-)pathogenen Mikroorganismen ermöglicht. Das etablierte Protokoll eignet sich nicht nur für die diagnostische Erregeridentifizierung, sondern auch in Abhängigkeit des Probenmaterials zur Untersuchung von (Multispezies-)Biofilmen. N2 - Bacteria living in multicellular communities, i.e. biofilms, have evolved into a major health problem. Most chronic or recurrent diseases including nosocomial infections can be traced back to the multicellular lifestyle of pathogenic agents. Both facultative and obligate pathogenic strains of Escherichia coli express a multitude of diverse factors contributing to biofilm formation like flagella, extracellular polymeric substances, adhesins, or surface-exposed proteins, e.g. autotransporters. This work presents the functional characterization of the surface-associated protein antigen 43 (Ag43). Due to its autoaggregating phenotype, Ag43 is also involved in the formation of microcolonies and biofilms. Antigen 43 represents an autotransporter protein frequently expressed by all Escherichia coli pathotypes. Interestingly, many E. coli isolates encode multiple identical or orthologous copies of agn43 which are usually associated with mobile genetic elements (genomic islands, plasmids). Here, the antigen 43 variants of uropathogenic Escherichia coli (UPEC) strain 536 (O6:K15:H31), commensal isolate E. coli Nissle 1917 (O6:K5:H1), and E. coli K-12 strain MG1655 (OR:H48:K-) have been analyzed. For this purpose, the different agn43-alleles were cloned into a capable vector system and subsequently expressed in Escherichia coli K-12 strain MG1655 ΔfimΔflu lacking the genes encoding type 1-fimbrial adhesins (fim) and antigen 43 (flu). Due to the occurrence of posttranslational glycosylation of Ag43 in wild type strains, experiments were additionally carried out upon co-expression of the heterologous AIDA-I-specific heptosyl transferase Aah (Autotransporter Adhesin Heptosyltransferase). On the basis of binding studies (intermolecular autoaggregation, adhesion to eukaryotic cells) individual properties could be detected for each Ag43-variant. However, compared to AIDA-I (Adhesin Involved in Diffuse Adherence) of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) strains, antigen 43 was shown to act as a weak adhesin. Additionally, O-glycosylation partly influenced protein functions. Depending on the variant tested, posttranslational modification by Aah either resulted in significantly reduced affinities or had no effect on the binding capacity of Ag43. Furthermore, antigen 43 exhibits structural homologies compared to certain domains of related autotransporters. For many of these proteins, an adhesion- or invasion-mediating function could be demonstrated. To date, the interaction of Ag43 with a putative eukaryotic receptor has not been determined, yet. Here, it is shown for the first time that antigen 43 specifically binds to components of the extracellular matrix. Overlay assays and ELISAs identified collagen and laminin as epithelial receptors for Ag43. Taken together, the results obtained in this study confirm the functional role of antigen 43 in biofilm formation as well as its effect during bacterial colonization of epithelial tissues. Expression of the Escherichia coli-specific autotransporter protein is directly correlated to the improved fitness of bacteria infecting the human host. Aah-mediated O-glycosylation seems not to be strictly required for the function of Ag43. The second aim of this work was the design and development of a test system which can be used for the differentiation of (uro-)pathogenic microorganisms in biofilms. For this purpose, the FISH (Fluorescence-in-situ-Hybridization)-technique has been optimized for diagnostic applications. Depending on the specimen, the protocol can also be adapted to the analysis of (multispecies) biofilms. KW - Escherichia coli KW - Biofilm KW - Adhäsine KW - Glykosylierung KW - Extrazelluläre Matrix KW - Kollagen KW - Laminin KW - Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung KW - Katheter KW - Autotransporterprotein KW - Fitneßfaktor KW - autotransporter protein KW - fitness factor Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35684 ER - TY - THES A1 - Homburg, Stefan T1 - Untersuchungen zur Molekularbiologie von Escherichia coli-Wildstämmen T1 - Investigations on the molecular biology of Escherichia coli wildtype strains N2 - Eine eindeutige Unterscheidung zwischen extraintestinal pathogenen (ExPEC) und kommensalen E. coli-Stämmen zu treffen, fällt häufig schwer, da Virulenz-assoziierte Faktoren von ExPEC auch in kommensalen Stämmen gefunden werden können. Als naher Verwandter des uropathogenen Isolates E. coli CFT073 weist der apathogene, kommensale Stamm E. coli Nissle 1917 (O6:K5:H1) die Expression einer Vielzahl solcher „ExPEC-Virulenzfaktoren“ auf. Dazu gehören verschiedene Fimbrien, Siderophore und Proteine, die an der Biofilmbildung beteiligt sind. Der Vergleich des Stammes mit ExPEC-Isolaten lässt daher Rückschlüsse auf die Funktion dieser Faktoren im jeweiligen ökologischen Kontext zu. E. coli Nissle 1917 bildet den sog. rdar-Morphotyp aus, eine multizelluläre Struktur, die auf der Koexpression von Zellulose und Curli-Fimbrien beruht. Dieser findet sich bei vielen E. coli und Salmonella-Spezies, tritt aber in der Regel nur bei Temperaturen unterhalb 30 °C auf. E. coli Nissle 1917 hingegen weist diesen Phänotyp auch bei 37 °C auf, was vermutlich die Kolonisierungsfähigkeit gegenüber anderen kommensalen E. coli erhöht. Hier konnte demonstriert werden, dass die Expression des rdar-Morphotyps bei E. coli Nissle 1917 unabhängig von den bisher beschriebenen Regulatoren CsgD und YaiC ist. Mittels Mutagenese mit dem Transposon miniTn5 wurde nach rdar-negativen Klonen gesucht mit dem Ziel, einen möglichen übergeordneten Regulator dieses Phänotyps zu identifizieren. Bei dieser Untersuchung wurden einige Gene ermittelt, die bislang nicht dafür bekannt waren, die Expression von Zellulose oder Curli-Fimbrien zu beeinflussen. Während die Funktion vieler der ermittelten ORFs unbekannt war, hatte vor allem die Inaktivierung von Genen, die an der Biosynthese von Oberflächenstrukturen (Fimbrien, Kapsel, Colansäure, LPS) einen veränderten Phänotyp zur Folge. Allerdings konnte in den wenigsten Fällen ein Zusammenhang zu Curli- oder Zellulosesynthese hergestellt werden. Es zeigte sich, dass die Regulation des rdar-Morphotyps offenbar komplexer und von mehr Faktoren zumindest indirekt abhängig ist, als bislang beschrieben. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine 55 kb große genomische Insel untersucht, die im asnW-tRNA-Lokus inseriert ist und die Proteine für die Synthese eines hybriden nichtribosomalen Peptid-Polyketids kodiert. Die Insel konnte mittels PCR in extraintestinal pathogenen sowie kommensalen Isolaten der phylogenetischen Gruppe B2 nachgewiesen werden, darunter die Stämme E. coli Nissle 1917, IHE3034, CFT073 und J96. Eine Kokultivierung von HeLa-Zellen mit diesen Bakterien hatte eine Blockierung des Zellzyklus und Megalozytose (zytopathischer Effekt) zur Folge. Die Deletion der asnW-Insel führte zur Aufhebung des zytopathischen Phänotyps, der durch Einbringen des Genclusters auf einem BAC-Vektor wieder hergestellt werden konnte. Der zytopathische Effekt konnte nur nach direktem Kontakt der Bakterien mit HeLa-Zellen beobachtet werden und war weder durch Bakterienlysate, abgetötete Bakterien oder Kulturüberstände zu erzielen. Das PKS/NRPS-Gencluster umfasst 18 ORFs (clbA bis clbR), von denen 17 an der Synthese der aktiven Komponente beteiligt sind. Die Anzahl der Genprodukte und die Abfolge der putativen Domänen unterscheidet sich dabei von allen bislang beschriebenen PKS/NRPSSystemen. Untersuchungen zur Transkription ergaben drei monocistronisch und vier teilweise sehr große (bis 23 kb) polycistronisch transkribierte Einheiten aus bis zu sechs ORFs. Zudem konnte eine konstitutive Transkription aller ORFs festgestellt werden, wenngleich in unterschiedlicher Stärke. Nach Kontakt mit HeLa-Zellen wurde keine erhöhte Transkription oder Promotoraktivität einzelner ORFs festgestellt. Daher scheint die Kontaktabhängigkeit des zytopathischen Effekts nicht auf einer durch HeLa-Zellen hervorgerufenen Induktion der PKS/NRPS-Expression zu beruhen. Die Kontaktabhängigkeit konnte durch die Induktion bzw. Überexpression einer PKS/NRPS (clbB), den putativen Schlüsselenzymen Thioesterase (clbQ) und Phosphopantetheinyl-Transferase (clbA) oder dem möglichen Regulator clbR nicht überwunden werden. Mittels Luziferase-Reportergenfusionen konnte ein Einfluss unterschiedlicher Medien und Kulturbedingungen auf die Promotoraktivität einzelner Gene festgestellt werden. Dies wurde auf den Einfluss des BarA/UvrY- Zweikomponentensystems zurückgeführt, welches über CsrA/CsrBC den Kohlenstoff-Metabolismus von E. coli post-transkriptional reguliert. Die natürliche uvrY-Deletionsmutante UPEC 536 wies trotz des Besitzes des kompletten PKS/NRPS-Genclusters keinen zytopathischen Effekt auf. Dieser konnte jedoch durch Komplementation mit uvrY wieder hergestellt werden. Dies ist der erste Hinweis für einen außerhalb der asnW-Insel liegenden Regulationsmechanismus der PK/NRP-Synthese. Die Funktion des Peptid-Polyketids in vivo bleibt weiterhin unklar und könnte sowohl Fitness als auch Virulenz von E. coli beeinflussen. N2 - In many cases, it is difficult to draw a clear distinction between extraintestinal pathogenic (ExPEC) and commensal E. coli strains as virulence-associated factors of ExPEC can also be found in commensal strains. Being closely related to the uropathogenic strain CFT073 E. coli Nissle 1917 (O6:K5:H1) exhibits expression of several of such “ExPEC virulence factors”. Belonging to those are various fimbriae, siderophores, and proteins involved in biofilm formation. Therefore, the comparison of ExPEC isolates and E. coli Nissle 1917 can reveal insights into the function of these factors within the respective ecological context. E. coli Nissle 1917 exhibits the so-called rdar morphotype, a multicellular structure based on the co-expression of cellulose and curli fimbriae. It can be found in many E. coli and Salmonella species, but is usually restricted to temperatures below 30 °C. However, E. coli Nissle 1917 features this phenotype also at 37 °C which might increase its colonization ability compared to other commensal E. coli. Here, it could be demonstrated that expression of the rdar morphoype in E. coli Nissle 1917 is independent of the two regulators described so far, CsgD and YaiC. Thus, by applying transposon mutagenesis using miniTn5 it was screened for rdar-negative mutants. The aim was to discover a superordinate regulator of this phenotype. During this investigation, several genes were identified which so far had not been reported to influence expression of cellulose or curli fimbriae. While the function of many of the determined ORFs was unknown, the inactivation primarily of genes involved in the biosynthesis of surface structures (fimbriae, capsule, colanic acid, LPS) resulted in an altered phenotype. However, only in a few cases a connection to the biosynthesis of curli fimbriae or cellulose could be established. In conclusion, the regulation of curli and cellulose biosysnthesis proved to be more complex and dependent – at least indirectly – on more factors than previously described. In the second part of this thesis, a genomic island, 55 kb in size and inserted into the asnW-tRNA locus, was investigated, which encodes proteins necessary for the synthesis of a hybrid nonribosomal peptide-polyketide. By PCR the island was proven to be present in extraintestinal pathogenic as well as in commensal isolates of the phylogenetic group B2, among those the strains E. coli Nissle 1917, IHE3034, CFT073, and J96. Cocultivation of HeLa cells with those bacteria induced cell cycle arrest and megalocytosis (cytopathic effect). Deletion of the asnW island resulted in abolition of the cytopathic effect, which could be restored by introduction of a BAC vector containing the gene cluster. The cytopathic effect was only observed after direct contact of the bacteria with HeLa cells and could not be achieved using bacterial lysates, killed bacteria or culture supernatants. The PKS/NRPS gene cluster comprises 18 ORFs (clbA to clbR) of which 17 are involved in the synthesis of the active compound. The number of gene products and the sequence of putative domains differ from those of all PKS/NRPS systems described so far. Investigations on the transcription of the island revealed three monocistronically transcribed units and four polycistrons of sizes up to 23 kb. In addition, a constitutive transcription of every ORF was observed, albeit at variable levels. Upon cell contact, neither elevated transcription nor different promoter activities of single ORFs were observed. Thus, the contact dependence of the cytopathic effect does not seem to result from an induction of expression caused by HeLa cells. The contact dependence could not be overcome by induction or overexpression of either a PKS/NRPS (clbB), the putative key enzymes thioesterase (clbQ) and phosphopantetheinyl transferase (clbA), or the potential regulator clbR. Using luciferase reporter gene fusions an influence of diverse media and culture conditions on the promoter activities of singele genes was detected. This was ascribed to the influence of the BarA/UvrY two-component system, which regulates the carbon metabolism of E. coli on the post-transcriptional level via CsrA/CsrBC. The natural uvrY deletion mutant UPEC 536, despite containing the complete PKS/NRPS gene cluster, did not exhibit an cytopathic effect. However, this feature could be restored by complementation with uvrY. This is the first evidence for an regulatory mechanism of the PK/NRP synthesis located beyond the asnW island. The in vivo function of the peptide-polyketide so far remains unclear, but it might affect fitness as well as virulence of E. coli. KW - Escherichia coli KW - Virulenzfaktor KW - Biofilm KW - Molekulargenetik KW - Fitness KW - Biofilm KW - Polyketid KW - Regulation KW - fitness KW - biofilm KW - polyketide KW - regulation Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22884 ER - TY - THES A1 - Batzilla, Christoph Friedemann T1 - Untersuchungen zur Biofilmbildung und zum Quroum-sensing in Staphylococcus epidermidis T1 - Investigations on biofilm formation and quorum sensing in Staphylococcus epidermidis N2 - Das Gram-positive, Koagulase-negative Bakterium Staphylococcus epidermidis war viele Jahrzehnte als harmloser Kommensale der menschlichen Haut und der Schleimhäute bekannt. Jedoch hat sich S. epidermidis in den letzten zwanzig Jahren zu einem Haupterreger von Nosokomialinfektionen entwickelt. Dabei unterscheidet sich S. epidermidis im Vergleich zu anderen Erregern durch ein sehr begrenztes Spektrum an Pathogenitätsfaktoren, aber auch durch seine Fähigkeit, Biofilme auf künstlichen Oberflächen wie Kathetern und Implantaten formen zu können. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit zwei Hauptaspekten, die in der Pathogenität von S. epidermidis eine wichtige Rolle spielen: (i) dem Quorum-sensing System Agr (accessory gene regulator) und (ii) dem zeitlichen Prozess des Aufbaus, sowie der Regulation der Biofilmbildung von S. epidermidis. Das Quorum-sensing System Agr ist Teil eines komplexen regulatorischen Netzwerks. In der vorliegenden Arbeit wird durch Proteom- und Transkriptomanalysen gezeigt, dass das Agr-System in S._epidermidis den Hauptregulator für die Sekretion von extrazellulären Proteinen darstellt und darüber hinaus einen großen Einfluss auf die Regulation des Zentralmetabolismus und der Biosynthese von Aminosäuren hat. Mittels Mikroarray-Analyse konnte eine wichtige Verknüpfung des Agr-Systems mit dem pleiotrophen Repressor CodY identifiziert werden, der viele stationäre-Phase Gene im S._epidermidis Wildtyp reprimiert, jedoch nicht in der getesteten agr Mutante. Dieses führt zu einem stark veränderten Phänotyp der S. epidermidis agr Mutante, in Hinblick auf Wachstumskapazität, der Biofilmbildung, der Invasivität und dem Langzeitüberleben. Interessanterweise ergaben wissenschaftliche Studien, dass ca. 17 % der klinischen Isolate natürlich vorkommende agr Mutanten sind. Dieses könnte ein Hinweis darauf sein, dass S. epidermidis agr Mutanten aufgrund ihres stark veränderten Phänotyps und ihrer veränderten biochemischen Bedürfnisse und Kapazität in der Lage sind, andere ökologische Nischen im menschlichen Wirt zu besiedeln. Der zweite Teil dieser Arbeit hat die Biofilmbildung von S. epidermidis zum Thema. Durch die Etablierung eines standardisierten Modells der Biofilmbildung, war es möglich, über die Einführung einer Biofilm-Adhäsion-Ratio die Biofilmbildung als zeitlichen dynamischen Prozess darzustellen und verschiedenste Bedingungen und Stämme miteinander zu vergleichen. Dabei zeigte sich, dass die Biofilmbildung in S._epidermidis ein klar zeitlich strukturierter Prozess ist, der von Umweltfaktoren und der Nährstoffsituation abhängig ist, und dass verschiedene Stämme sehr unterschiedlich auf Veränderungen in ihrer Umwelt reagieren. Die zeitliche Analyse der Biofilmbildung mittels konfokaler Lasermikroskopie ergab, dass viele der Bakterien im Biofilm sterben. Dieses macht den Biofilm wesentlich anfälliger für Strömungsscherkräfte, die dann ganze Bakterienverbände ablösen und zu neuen Infektionsherden schwemmen könnten. Somit ermöglicht der Tod einer einzelnen Zelle unter Umständen ein besseres klonales Überleben. Die Mikroarray-Analysen der Genexpression im Biofilm zeigten, dass dieser einen physiologisch klar definierten Prozess durchläuft, der zu einer sehr stark verminderten metabolischen Aktivität und einer erhöhten Antibiotika-Resistenz führt. Darüber hinaus zeigen Bakterien im Biofilm einen weniger aggressiven Charakter, wie die Expression von Proteasen oder anderer Pathogenitätsfaktoren, welches S. epidermidis dabei hilft, dem Immunsystem des Wirts zu entgehen. Diese neuen Ergebnisse zur Regulation der Genexpression im Biofilm und zur Rolle des Quorum-sensing Systems Agr in S. epidermidis tragen wesentlich zum Verständnis der Pathogenität und der Physiologie dieses wichtigen nosokomialen Erregers bei. Sie bilden eine wichtige theroretische Grundlage für weiterführende Studien, mit dem Ziel in Zukunft neue Therapie- und Präventionsansätze gegen S. epidermidis-Infektionen zu entwickeln. N2 - The gram-positve, coagulase-negative bacterium Staphylococcus epidermidis was regarded as a harmless commensal of the human skin and mucosa. However, in the last two decades S. epidermidis has emerged as one of the major causes of nosocomial infections. In contrast to other infectious bacteria, S. epidermidis possesses only a limited number of pathogenicity factors, but forms a thick biofilm on artificial devices such as catheters and implants. This thesis deals with two main aspects of the pathogenicity of S. epidermidis: (i) the Quorum-sensing system Agr (accessory gene regulator) and (ii) the aspects of time dependency of biofilm formation and its regulatory mechanism. The Quorum-sensing system Agr is part of a complex network in Staphylococci. This work demonstrates that the Agr-System is the main regulator for the extracellular proteome. Moreover, it affects directly and indirectly the central metabolism and the biosynthesis of amino acids in S. epidermidis. By employing microarray and proteome analyses the pleiotrophic repressor CodY was identified as an important player which interacts with the Agr-system and influences staphylococcal metabolism. CodY is responsible for the repression of late stationary phase genes. Proteome and transcriptome analyses along the growth curve revealed that this effect occurs only in the S. epidermidis agr wild type, while the S. epidermidis agr mutant expresses late stationary phase genes right from the beginning of the exponential growth stage. This leads to a strongly altered phenotype of the S. epidermidis agr mutant concerning growth capacities, biofilm formation, invasion into host cells and long term survival. Interestingly, another study has shown recently that about 17 % of all clinical isolates are naturally occurring S. epidermidis agr mutants. This supports the hypothesis that S. epidermidis agr mutants are capable of clonizing alternative ecological niches by their strong altered biochemical and physiological properties. The main focus in the second part of this thesis aims at biofilm formation of S. epidermidis. In order to compare different conditions and strains for their biofilm capacity, a standardized protocol was established and a simple mathematical model was introduced. These investigations underlined that biofilm formation in S. epidermidis is a chronologically synchronized, but dynamic process which depends on environmental conditions and nutrition supply. In addition, different strains display variations in responsing to altered environmental conditions. Interestingly, S. epidermidis is not able to detach from a biofilm in form of single cells. s shown by confocal laser microscopy over a time course of 48 hours, bacteria rather die off in the inner zones of the biofilm. By this means, the structure gets instable and more susceptible to shearing forces resulting in detachment and drifting of bacterial clusters which are then transported to novel colonization sites. Therefore, death of a single cell might be an advantage for the clonal survival. This is in accordance with the data of gene expression analyses by microarrays. Moreover, these analyses show that biofilm formation in S. epidermidis is a strongly regulated process under very special physiological conditions. Obviously, biofilm formation leads to a diminished metabolic activity, a higher antibiotic resistant and to a diminished secretion of extracellular proteins and other immunogenic substances which supports the evasion of S. epidermidis from the host immune response. The results on regulation of biofilm formation and the function of the Agr system give interesting new insights into the pathogenicity and physiology of this important pathogen and its survival in the human host. The data provide an excellent theoretical basis for future experimental work aiming at the development of new therapeutic strategies against S. epidermidis infections. KW - Staphylococcus epidermidis KW - Biofilm KW - Genregulation KW - S. epidermidis KW - Biofilm KW - agr KW - proteom KW - transcriptom KW - S. epidermidis KW - biofilm KW - agr KW - proteom KW - transcriptom Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22278 ER - TY - THES A1 - Eckart, Martin T1 - Analyse einer chromosomalen Deletion und Entdeckung einer neuartigen nicht-translatierten RNA in Staphylococcus epidermidis T1 - Analysis of a chromosomal deletion and discovery of a novel non-translated RNA in Staphylococcus epidermidis N2 - Staphylococcus epidermidis ist ein wichtiger Bestandteil der gesunden Hautflora des Menschen, gleichzeitig aber auch der häufigste Erreger nosokomialer Infektionen bei immunsupprimierten Patienten. Die Forschungsarbeiten haben sich in den vergangenen Jahren besonders auf Faktoren und Mechanismen konzentriert, welche zur Etablierung der Spezies als Pathogen beigetragen haben. Eine typische Eigenschaft klinischer Isolate ist die Fähigkeit, auf künstlichen Oberflächen Biofilme zu bilden. Gegenstand der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der IS-vermittelten Genomflexibilität und der Vergleich der Genomstruktur nosokomialer und kommensaler Isolate von S. epidermidis. Dazu wurde eine 260 kb große spontane Deletion im Chromosom des Biofilm-bildenden Stammes S. epidermidis 307 sequenziert und annotiert, von der bekannt war, dass sie durch eine homologe Rekombination zweier IS256-Kopien ausgelöst wurde. Auf dem deletierten Fragment fanden sich neben dem ica-Operon zahlreiche potentielle Virulenz-assoziierte Gene. Das überraschende Ergebnis dieser Analyse war jedoch die Identifizierung eines neuartigen SCC-Elementes, das den rechten Rand der Deletion begrenzt. Dies ist die erste Beschreibung eines SSC-Elementes mit einer CcrC-Rekombinase, dem das Methicillin-Resistenzgen mecA fehlt. In der Nähe des Rekombinasegens fand sich S.-haemolyticus-spezifische DNA. Weitere Untersuchungen zeigten, dass das SCC-Element durch die IS256/Tn4001 -vermittelte Deletion in der Mutante verkürzt wurde. Genomvergleiche ica-positiver und ica-negativer Stämme von S. epidermidis mittels Microarrays, sowie in-silico-Analysen zweier vollständiger S.-epidermidis-Genome ergaben, dass sich kommensale und pathogene Stämme in nur wenigen Faktoren unterscheiden. Diese befinden sich jedoch fast alle in einer Region um den oriC, in dessen Nähe auch die Insertionsstelle für die SCCmec-Inseln lokalisiert ist. Das deletierte DNA-Fragment von S. epidermidis 307 konnte ebenfalls dieser Region zugeordnet werden, die offenbar eine Zone hoher genomischer Flexibilität darstellt, in der fremde DNA integriert werden kann. Im Rahmen dieser Arbeit konnte außerdem gezeigt werden, dass das ica-Operon diesen variablen Genomabschnitt begrenzt. Die exakte Grenze zwischen ica-positiven und ica-negativen Stämmen bildet eine Thr-tRNA, die in einer 1,4 kb großen intergenischen Region stromabwärts des icaR-Regulatorgens lokalisiert ist. In unmittelbarer Nachbarschaft konnte ein Transkript nachgewiesen werden, welches nur in ica-positiven S. epidermidis vorkommt. Gestützt auf bioinformatische Analysen wurden zunächst die Polarität und Länge des Transkriptes, sowie der korrespondierende Promotor experimentell bestimmt. Demnach handelt es sich um eine 487 nt lange RNA, die entgegengesetzt zur Thr-tRNA orientiert ist und mit dieser teilweise überlappt. Da die Nukelotid-Sequenz weder eine Ribosomen- Bindungsstelle noch einen größeren Leserahmen aufweist, ist es sehr wahrscheinlich, dass es sich um eine nicht-translatierte RNA handelt. Qualitative RT-PCR-Experimente zeigten, dass die IGRica-RNA kostitutiv exprimiert wird. Spontane IS256 –Insertionsmutanten in der Promotorregion der IGRica-RNA wiesen phänotypisch eine deutlich verminderte Biofilmbildung auf. Daher ist zu vermuten, dass die IGRica-RNA in die Regulation dieses wichtigen Virulenzfaktors involviert ist. In der vorliegenden Arbeit konnte weiterhin gezeigt werden, dass S. epidermidis das in vielen Spezies konservierte Hfq-Protein exprimiert, welches ein Bindungspartner und Chaperon für zahlreiche regulatorische RNAs darstellt. gel-shift-Experimente mit rekombinantem Hfq-Protein aus S. epidermidis ergaben jedoch keine nachweisbare Wechselwirkung der IGRica-RNA mit diesem Faktor in vitro. Insgesamt hat die Studie gezeigt, dass S. epidermidis eine Spezies mit einer außerordentlich hohen Genomflexibilität ist, die sich hauptsächlich in einer bestimmten Genomregion abspielt und für die IS-Elemente von besonderer Bedeutung sind. Die Identifizierung von DNA aus anderen Staphylokokken-Arten in dieser Region zeigt, dass S. epidermidis zu horizontalem Gentransfer über Speziesgrenzen hinweg in der Lage ist. Dies, sowie die Daten zur neuen SCC-Kassette, unterstreichen die Bedeutung von S. epidermidis als Reservoir für die Entwicklung neuartiger Resistenz- und Virulenzdeterminanten, die gerade im Krankenhausmilieu auf Spezies mit höherem Virulenzpotential übertragen werden können und so einen wichtigen Faktor für die anhaltende Problematik nosokomialer Infektionen mit S. aureus darstellen. Die Entdeckung einer RNA mit möglicherweise regulatorischer Funktion ist der erste Faktor dieser Art, der – abgesehen von einigen phylogenetisch hoch konservierten RNAs – bisher in S. epidermidis nachgewiesen wurde. Die funktionale Analyse der IGRica-RNA und die Suche nach weiteren regulatorischen RNAs in Staphylokokken eröffnen ein Forschungsfeld, das zum besseren Verständnis der Lebensweise dieser bedeutenden Erreger beitragen kann. N2 - Staphylococcus epidermidis is an important part of the human skin flora, but also the most frequent cause of nosocomial infections in immune-suppressed patients. Research in the last years focused on the factors and mechanisms leading to the establishment of the species as a pathogen. A typical feature of clinical isolates of S. epidermidis is the ability to form biofilms on artificial surfaces. Topic of this work was the IS-mediated genome flexibility and the comparison of genome structure from nosocomial and commensal S. epidermidis isolates. A 260 kb large spontaneous deletion in the chromosome of the biofilm-forming strain S. epidermidis 307 was sequenced and annotated. The deletion was caused by homologous recombination of two IS256 copies. It contained many putative virulence-associated genes besides the ica operon. However, the surprising result of this analysis was the identification of a new SCC element that limits the right border of the deletion. This is the first report of a SCC element containing a CcrC recombinase but lacking the mecA gene. DNA of S. haemolyticus is located near the recombinase gene ccrC. Further studies showed that the SCC element is truncated due to IS256/Tn4001 mediated deletion in the mutant. Genome comparison of ica-positive and ica-negative S. epidermidis strains using microarrays revealed that commensal and pathogenic strains differ only in very few factors. This was confirmed by in silico comparison of two complete genomes of S. epidermidis. Most of the virulence factors are harbored within a region around the oriC. The insertion sites of the SCCmec islands and the deleted fragment of S. epidermidis are also located in this part of the genome, that obviously represents a region of high genomic flexibility and in which foreign DNA can be integrated. Furthermore, this work showed that the ica operon delimits this variable segment of the genome. The exact border between ica-positive and ica-negative strains represents a Thr-tRNA within the 1.4 kb intergenic region downstream of the icaR regulatory gene. In the direct vicinity a transcript could be detected that is only present in ica-positive S. epidermidis. Based on bioinformatical analysis the polarity, length, and the corresponding promoter were experimentally determined. The RNA ranges 487 nt in length and overlaps partly with the Thr-tRNA on the opposite strand. Neither a ribosomal binding site nor an appropriate open reading frame can be found; so, it is likely that the RNA is not translated. Qualitative RT-PCR experiments showed constitutive expression of the IGRica-RNA. Spontaneous IS256 insertion mutants within the promoter region of the IGRica-RNA exhibited a clearly diminished biofilm formation. Therefore, it is tempting to speculate that the IGRica-RNA is involved in the regulation of this important virulence factor. The experiments show that S. epidermidis also expresses the highly conserved Hfq protein that functions as a binding partner and a chaperon for many regulatory RNAs. However, gel shift experiments with recombinant Hfq from S. epidermidis revealed no detectable interaction of the IGRica-RNA with this factor in vitro. In summary, the study shows that S. epidermidis is a species with extraordinary high genome flexibility in a certain region of the genome where IS elements have a special influence. Identification of DNA from other staphylococcal species demonstrates that S. epidermidis is capable of horizontal gene transfer beyond the species barrier. This and the newly discovered SCC element emphasize the importance of S. epidermidis as a reservoir for the development of new resistance and virulence determinants. These factors can be transferred easily within the hospital environment to species with a higher virulence potential. This represents an important factor for the long-standing problem of nosocomial infections with S. aureus. The discovered RNA with a putative regulatory function is the first factor of this kind that has been identified in S. epidermidis so far, besides some phylogenetically conserved RNAs. Functional analysis of the IGRica-RNA and investigation for other regulatory RNAs in staphylococci open a wide field of research that can contribute considerably to the understanding of these important pathogens. KW - Staphylococcus epidermis KW - Hospitalismus KW - Biofilm KW - Deletionsmutante KW - Genexpression KW - Deletion KW - sRNA KW - IS256 KW - SCCmec KW - Biofilm KW - deletion KW - sRNA KW - IS256 KW - SCCmec KW - biofilm Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-21448 ER - TY - THES A1 - Hennig, Susanne T1 - Modulation der Biofilmbildung in Staphylococcus epidermidis und funktionale Charakterisierung der IS256 Transposase T1 - Modulation of biofilm formation in Staphylococcus epidermidis and functional characterization of IS256 transposase N2 - Staphylokokken, insbesondere Staphylococcus aureus sowie der Koagulase-negative Staphylococcus epidermidis, haben sich in den letzten Jahren als dominante Erreger nosokomialer Infektionen etabliert. Diese erstaunliche Anpassung an eine neue ökologische Nische beruht bei S. epidermidis vor allem auf drei Faktoren: (i) der Fähigkeit, Biofilme auf abiotischen Oberflächen auszubilden, (ii) dem Erwerb multipler Antibiotikaresistenzen und (iii) einer hohen genotypischen Variabilität. Ein markantes Beispiel für genotypische Variabilität ist die Phasenvariation der Biofilmbildung durch Insertion und präzise Exzision der Insertionssequenz IS256 aus dem ica-Operon. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der „OFF-ON“ Mechanismus der Phasenvariation, die präzise Exzision von IS256, untersucht. Dabei wurde demonstriert, dass IS256 inklusive der 8 bp target site Duplikation in einem Transposase-unabhängigen Prozess vollständig aus dem Chromosom entfernt wird, ohne chromosomale Umordnungen oder neue Insertionen. Präzise Exzision war hingegen abhängig von der Integrität der target site Duplikationen. Auch nach Insertion von IS256-Derivaten auf einem Plasmidsystem (spc::IS256) konnte präzise Exzision Transposase-unabhängig erfolgen. Die Wahrscheinlichkeit der Exzision für die vollständige IS256-Sequenz betrug in diesem System ca. 1x10-11 pro Generation und Zelle. Ab einer Verkürzung der Mikrohomologien zwischen den 8 bp target site Duplikationen auf 6 bp war präzise Exzision nicht mehr nachweisbar. Bei Verkürzung der IS256-Sequenz auf ca. 160 bp (target site Duplikation und inverted repeats blieben intakt) wurde die Wahrscheinlichkeit der präzisen Exzision ca. dreifach erhöht. Diese Beobachtungen unterstützen die Hypothese, dass diese Form der illegitimen Rekombination durch replicational slippage verursacht wird. Gleichzeitig weisen die Daten darauf hin, dass bei der Phasenvariation durch IS256 Insertions- und Exzisionshäufigkeit im Ungleichgewicht stehen. Während der Durchführung der Experimente zur präzisen Exzision aus icaC wurden nach mehrtägiger Passage häufig Varianten isoliert, die trotz noch vorhandener icaC::IS256 Insertion starke Biofilmbildner waren. Derartige biofilmpositive, PIA-negative Phasenvarianten wiesen im Atomic force Mikroskop einen anderen Phänotyp als der Wildtyp auf. Anstelle von fädiger extrazellulärer Substanz wie beim Wildtyp wurde verstärkt eine polymorphe, aus globulären Untereinheiten bestehende Matrix produziert. Im Gegensatz zum Wildtyp, der in einem vorrangig polysaccharidbasierten Biofilm wuchs, wurde dieser alternative Biofilm durch Proteinkomponenten vermittelt. Die Regulation des proteinogenen Biofilms unterschied sich vom PIA-Biofilm. Zugabe von 4 % NaCl inhibierte den proteinogenen Biofilm vollständig, während es im Wildtyp die Biofilmbildung induzierte. Zusatz von 3 % Ethanol im Medium bewirkte eine wesentlich stärkere Induktion der Biofilmbildung als beim Wildtyp. Die Transkriptmenge des accumulation associated protein, aap, war in der Phasenvariante im Vergleich zum Wildtyp erhöht. Dies spiegelte sich auch auf Proteinebene in einer erhöhten Expression von Aap wider. Die Daten zeigen, dass S. epidermidis über einen alternativen Mechanismus der Biofilmbildung verfügt, der zu einer Modulation der IS256-bedingten Phasenvariation der Biofilmbildung führen kann. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde die spezifische DNA-Bindung der IS256 Transposase in vitro näher charakterisiert. Dazu wurde die IS256 Transposase heterolog überexprimiert und mittels eines N-terminalen Calmodulin binding tag CBP)gereinigt. Im Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) band die CBP-Transposase spezifisch an IRL bzw. IRR DNA-Fragmente, zeigte jedoch eine leicht erhöhte Affinität zum IRR. Durch Atomic force Mikroskopie ließ sich die Bindung der CBP-Transposase an die inverted repeats innerhalb eines circle junction DNA-Fragments sowie unspezifische DNA-Endbindung nachweisen. Deletionen innerhalb der DNA-Sequenz des linken und rechten inverted repeats und anschließende EMSA-Experimente demonstrierten, dass die Transposase den inneren Bereich der inverted repeats erkennt und bindet. EMSA-Experimente mit verkürzten Transposasederivaten wiesen darauf hin, dass sich das DNA-Bindungsmotiv in der N-terminalen Domäne der Transposase befindet. Die identifizierte Proteinregion (Aa100-130) umfasste zwei a-Helices, getrennt durch einen kurzen turn, mit typischen Charakteristika eines Helix-turn-helix Motivs. Durch Punktmutationen wurden sechs konservierte Aminosäuren in diesem Bereich ausgetauscht und der Effekt im EMSA überprüft. Austausch von L103 und L127 gegen den Helixbrecher Prolin hatte keinen Effekt auf das Bindungsverhalten. Die Mutationen Y111A, G114W, T117A und R118A hingegen führten zu einer stark abgeschwächten Bindung bzw. zum Verlust des Bindungsvermögens. Damit wurde erstmals die DNA-Bindungsdomäne eines Elements der IS256-Familie näher beschrieben. N2 - During the past decades, Staphylococci, especially Staphylococcus aureus and the coagulase-negative Staphylococcus epidermidis, have been established as a predominant cause of nosocomial infections. This remarkable adaptation to a new ecological niche by S. epidermidis is due to three main factors: (i) the ability to colonize abiotic surfaces as biofilms, (ii) the acquisition of multiple resistances to antibiotics and (iii) a high genotypic and phenotypic variability. A prominent example of genotypic and phenotypic variability is phase variation in biofilm formation caused by insertion and excision of the insertion sequence IS256 within the ica operon. In the first part of this thesis, the mechanism of “OFF-ON” transition, caused by precise excision of IS256 from the ica operon, was studied. It was demonstrated that IS256 including the duplicated 8 bp target site is excised completely from the chromosome in a transposase-independent manner, neither accompanied by chromosomal rearrangements nor new insertions. However, precise excision depended on the integrity of the target site duplications. Even after insertion of IS256 onto a plasmid (spc::IS256) transposase-independent precise excision was detected. The probability of this event was calculated to be 1x10-11 per cell generation. After shortage of the microhomology between the 8 bp target site duplications to 6 bp or less, precise excision was not detectable any longer. Deletion of the transposase gene, leading to a 160 bp IS256 fragment still harbouring complete inverted repeats and flanked by intact target site duplications, enhanced the probability of precise excision about threefold. These observations support the hypothesis that precise excision is caused by the illegitimate recombination process of replicational slippage. Furthermore, the data indicate an imbalance between insertion and excision of IS256 within the phase variation process. When studying precise excision from icaC, strong biofilm producing variants still carrying the icaC::IS256 insertion were isolated frequently after several days of passaging. Such biofilm-positive, PIA-negative variants showed a phenotype different from the wild type as displayed by Atomic force microscopy. Instead of a fibrous extracellular substance as in the wild type, the variants produced a polymorphous matrix formed by more or less globular substructures. In contrast to the wild type growing in a polysaccharide-mediated biofilm, the alternative biofilm´s extracellular matrix consisted of proteins. Regulation of proteinaceous biofilm formation differed compared to PIA-dependent biofilm. Addition of 4 % sodium chloride abolished proteinaceous biofilm formation completely, while it induced biofilm formation in the wild type. Addition of 3 % ethanol caused a considerably stronger induction of biofilm formation compared to the wild type. The transcript level of accumulation associated protein, aap, was enhanced in comparison to the wild type; an observation that was also confirmed at the protein level. Taken together, these data indicate that S. epidermidis is capable of switching to an alternative mode of biofilm formation, thus possibly modulating the previously described phase variation by IS256 insertion and excision. In the third part of this thesis, specific binding of IS256 transposase was characterized in vitro. To this end, IS256 transposase was overexpressed heterologously and purified using an N-terminal calmodulin binding tag (CBP). In electrophoretic mobility shift assays (EMSA) CBP-transposase bound to IRL and IRR containing DNA fragments specifically, albeit with slightly higher affinity to IRR. Binding of CBP-transposase to the inverted repeats within circle junction DNA as well as unspecific end binding could be confirmed by Atomic force microscopy. Deletions within the sequence of the right or left inverted repeat revealed that CBP-transposase binds to the inner part of the inverted repeats. EMSA experiments with truncated transposase derivatives suggested a DNA binding motif within the N-terminal domain of the transposase. The identified protein region (amino acid 100 – 130) consists of two a-helices separated by a short turn, displaying typical features of a helix-turn-helix motif. Six conserved amino acid residues within this putative motif were exchanged by point mutations and the effect of the mutation was tested in EMSA. Exchange of L103 and L127 against the helix-breaking amino acid proline had no detectable effect on DNA binding. However, exchange Y111A, G114W, T117A and R118A strongly reduced or completely abolished DNA binding. This is the first description of a DNA binding domain of a member of the IS256 family. KW - Staphylococcus epidermis KW - Biofilm KW - Insertionselement KW - Staphylococcus KW - Biofilm KW - IS256 KW - Transposase KW - Phasenvariation KW - Staphylococcus KW - biofilm KW - IS256 KW - transposase KW - phase variation Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-20984 ER - TY - THES A1 - Kränzler, Hans-Marcus T1 - Untersuchungen zur Regulation der Biofilmbildung bei Staphylokokken T1 - Investigation of the regultion of the Staphylococcal Biofilmformation N2 - Staphylokokken sind in erster Linie Saprophyten, welche die Haut und Schleimhäute des Menschen besiedeln und dort eine wichtige Rolle für das Gleichgewicht der gesunden Mikroflora spielen. Gleichzeitig haben sie sich aber auch zu den häufigsten Verursachern nosokomialer Infektionen entwickelt. Vor allem S. aureus und S. epidermidis verursachen Erkrankungen, die von leichten Haut- und Wundinfektionen bis hin zu lebensbedrohlichen Infektionen wie Pneumonien, Sepsis oder Endokarditis reichen. Infektionen durch S. epidermidis treten dabei meist in Verbindung mit Fremdkörpern wie Kathetersystemen, künstlichen Gelenken und Herzklappen auf. In diesem Zusammenhang scheint vor allem die Fähigkeit, einen Biofilm auf diesen Fremdkörpern bilden zu können eine große Rolle für die Pathogenese zu spielen. Die Therapie von Staphylokokken-Infektionen wird zunehmend durch die ausgeprägte Antibiotikaresistenz dieser Erreger erschwert, die sich mittlerweile auch auf Reserveantibiotika wie Daptomycin, Synercid® (Quinupristin/Dalfopristin) oder Linezolid erstreckt. In der Vergangenheit wurde gezeigt, dass subinhibitorische Konzentrationen des Streptogramin-Antibiotikums Synercid® die Biofilmbildung in S. epidermidis induzieren. Darüber hinaus mehren sich die Hinweise auch bei anderen Bakterien, dass geringe Antibiotika-Konzentrationen, wie sie in natürlichen Habitaten wie zum Beispiel im Boden vorkommen, wichtige Signale bei der Kommunikation von Bakterien untereinander darstellen und möglicherweise eine Funktion bei der Modulation des Metabolismus im Kampf um Nährstoffe ausüben. In dieser Promotionsarbeit sollte daher exemplarisch, mit Hilfe der erst seit kurzem zur Verfügung stehenden DNA-Mikroarray-Technik, der Effekt von subinhibitorischen Synercid®-Konzentrationen auf die globale Genexpression von S. epidermidis und S. aureus analysiert werden. Dabei stand vor allem die Wirkung auf die Biofilmbildung und die Identifikation neuer, an der Biofilmbildung beteiligter Komponenten im Mittelpunkt. Die Ergebnisse zeigen, dass subinhibitorische Synercid®-Konzentrationen bei S. aureus, im Gegensatz zu S. epidermidis, zu einer reduzierten Biofilmbildung führen. Bei beiden Arten ist jedoch die unterschiedliche Biofilmbildung durch eine ausgeprägte Veränderung der allgemeinen Genexpression begleitet. Vor allem war eine starke Induktion von Genen zu beobachten, die für Proteine des Translationsapparates kodieren. Außerdem waren Gene des Nukleotid-Stoffwechsels, der Aminosäure-Synthese und des Kohlenstoff-Metabolismus unterschiedlich reguliert. Des Weiteren konnte mit Hilfe von HPLC-Analysen sowohl bei S. epidermidis als auch bei S. aureus eine reduzierte Konzentration des Signalmoleküls Guanosin-3-5-bisphosphat (ppGpp) festgestellt werden. ppGpp spielt vor allem bei der Kontrolle und Anpassung des Stoffwechsels an Wachstumsbedingungen, wie zum Beispiel das Nährstoffangebot, eine wichtige Rolle. Die Ergebnisse legen nahe, dass die Inaktivierung der ribosomalen Proteine durch Synercid® die reduzierte ppGpp-Konzentration bedingt, was zum einen zur verstärkten Bildung ribosomaler Proteine führt und zum anderen den Zellstoffwechsel in einer Weise beeinflusst, der eine vermehrte extrazelluläre Polysaccharid-Synthese und damit Biofilmbildung ermöglicht. Zusammenfassend zeigen die hier vorgestellten Daten, dass die unterschiedliche Beeinflussung der Biofilmbildung bei S. epidermidis und S. aureus sehr wahrscheinlich durch verschiedene Regulationswege des ica-Operons und/oder unterschiedliche katabolische Fähigkeiten bedingt werden. Die Ergebnisse belegen weiterhin, dass die Wirkung von Antibiotika weit über deren bekannte inhibitorische Effekte hinausgeht und vor allem den Stoffwechsel der Bakterien dramatisch beeinflußt. Die Konsequenzen dieser Befunde sowohl für das Verständinis von mikrobiologischen Konsortien in Ökosystemen als auch für die Anwendung von Antibiotika in der Medizin sind noch nicht abzusehen, bieten jedoch eine interessante Grundlage für weitere experimentelle Arbeiten. N2 - Staphylococci are common inhabitants of the human skin and mucosal membranes, as well as the most prevalent causes of nosocomial infections. The infections mainly caused by S. aureus and S. epidermidis range from mild skin infections to life-threatening infections, like pneumonia, bacteremia or endocarditis. Especially S. epidermidis is the primary pathogen involved in medical device associated infections. In this context, the ability to form a biofilm seems to be crucial. The prevalent antibiotic resistances of Staphylococci poses an increasing challenge to medicine in recent years. The remaining effective antibiotics to treat staphylococci infections are last resort antibiotics, such as daptomycine, Synercid® and linezolid. However, staphylococci isolates with intermediate and high resistances towards these antibiotics have already been reported. There are several lines of evidence that, beside their killing activity, antibiotics have a modulating effect on the metabolism of bacteria when applied in low concentrations. Hence, the impact of this natural compounds on bacteria have to be analysed in more detail in order to provide insights into their mode of action and how bacteria respond to these compounds. Former studies showed, that biofilm formation of staphylococci is influenced by environmental factors, such as temperature, osmolytic stress and the availability of glucose or oxygen, as well as by subinhibitory concentrations of antibiotics. In this context it was shown, that low concentrations of tetracycline, erythromycine and Synercid® induce biofilm formation of S. epidermidis. The aim of this study was to investigate the effect of subinhibitory concentrations of Synercid® on biofilm formation and global gene expression of S. epidermidis and S. aureus. For this purpose DNA microarrays were used to identify and characterise the mechanisms by which Synercid® alters biofilm formation. Furthermore, this studies should lead to the identification of new factors involved in biofilm formation of staphylococci. The data presented here, demonstrate that subinhibitory concentrations of Synercid® reduce biofilm formation in S. aureus, while inducing it in S. epidermidis. The altered biofilm formation is accompanied by a strong impact on the overall gene expression of both species. Especially the expression of genes encoding proteins of the translational apparatus were increased. In addition, genes encoding proteins of the nucleotide metabolism, amino acid biosynthesis and carbohydrate utilisation were affected. Furthermore, HPLC analyses revealed a decreased concentration of the small nucleotide signal molecule guanosine-3-5-bisphosphate (ppGpp) in S. aureus and S. epidermidis under the influence of Synercid®. ppGpp is involved in the control and adaptation of cellular metabolism to changing growth conditions. We hypothesise that the reduced concentrations of ppGpp is due to the inactivation of ribosomal proteins, as a result of Synercid® binding, and mediates on the one hand the increased production of proteins of the translation apparatus and on the other hand effects the cellular metabolism in a way that enable the cells to produce more extracellular polysaccharides resulting finally in an enhanced biofilm formation. In summary, the data presented here show that the differential effect of Synercid® on biofilm formation of S. epidermidis and S. aureus is most likely due to a differential regulation of the ica operon and/or different catabolic abilities. Moreover the data suggest that the effect of antibiotics is more than the sole interaction with a target structure, but influence gene expression and metabolism of bacteria more globally. The consequences of these findings for the comprehension of the interplay in microbial communities as well as for the clinical use of antibiotics is far from being understood. However, the results of this work might provide an interesting basis for future experimental work elucidating these interferences. KW - Staphylococcus KW - Biofilm KW - Genexpression KW - Staphylokokken KW - Biofilmbildung KW - Quinupristin/Dalfopristin KW - subinhibitorische Antibiotikakonzentrationen KW - Staphylococcus KW - biofilmformation KW - Quinupristin/Dalfopristin KW - subinhibitory antibiotikkonzentrations Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18784 ER - TY - THES A1 - Lößner, Isabel T1 - Die Rolle des bakteriellen Insertionselements IS256 bei der Modulation der Biofilmbildung in Staphylococcus epidermdis T1 - The role of the bacterial insertion sequence IS256 in the modulation of biofilmproduction in Staphylococcus epidermidis N2 - Staphylococcus epidermidis zählt zu den häufigsten Erregern nosokomialer Infektionen im Zusammenhang mit implantierten Fremdkörpern. Diese Bakterien zeigen eine außergewöhnliche phänotypische und genotypische Variabilität, von der auch die Expression wichtiger virulenz- und resistenzassoziierter Gene betroffen ist. Möglicherweise verfügen Staphylokokken damit über Anpassungsstrategien, die sie für das Überleben unter wechselnden Umweltbedingungen benötigen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von bakteriellen Insertionssequenzen (IS) bei der Genomplastizität von Staphylococcus epidermidis untersucht. Im Mittelpunkt des Interesses stand dabei das Insertionselement IS256 und sein Einfluß auf die Biofilmbildung von Staphylococcus epidermidis. Die Fähigkeit von S. epidermidis, an Oberflächen zu haften und Biofilme zu bilden ist von der Präsenz und Expression des ica-Operons abhängig, das Enzyme für die Synthese eines Exopolysaccharids (PIA) kodiert. Die PIA-Produktion ist äußerst variabel und hat damit Einfluß auf das Virulenz- und Kolonisierungsverhalten dieser Bakterien. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, daß die veränderliche PIA-Produktion bei S. epidermidis im wesentlichen auf drei Mechanismen zurückzuführen ist, an denen das IS-Element IS256 ursächlich beteiligt ist. Zunächst konnte durch den Vergleich der IS256-spezifischen Hybridisierungsmuster eines biofilmbildenden S. epidermidis-Wildtypstammes und dessen PIA-negativer Spontanvarianten gezeigt werden, daß die multiplen IS256-Kopien im Genom dieses Stammes außerordentlich aktiv sind. Die nähere Analyse der Varianten ergab bei einem Teil der PIA-negativen Abkömmlinge umfangreiche IS256-vermittelte genomische Umordnungen als Ursache für den Verlust der Biofilmbildung. Eine weitere Gruppe von Biofilm-negativen Varianten wies IS256-Insertionen im ica-Gencluster auf. Die Verteilung der Insertionsstellen im ica-Operon ließ darauf schließen, daß es sich bei dem icaC-Gen um einen Hot-spot für die Integration von IS256 handelt. Solche ica::IS256-Insertionen konnten bereits in zahlreichen S. epidermidis Stämmen nachgewiesen werden. Da diese Insertionen reversibel sind, bilden sie eine wesentliche Ursache für die Phasenvariation der Biofilmbildung von S. epidermidis. Bei einer dritten Gruppe von Varianten konnten Deletionen verschieden großer DNA-Abschnitte im S. epidermidis-Chromosom beobachtet werden, die zu einem Verlust der ica-Gene und damit der Fähigkeit, Biofilme auszubilden, führte. Um die Frage zu klären, welche Gene in der Umgebung des ica-Operons liegen und durch die Deletion von bis zu 250 kb-großen DNA-Fragmenten verloren gehen, wurde eine Cosmid-Genbank des S. epidermidis –Wildtypstammes erstellt. Die durch Nukleotidsequenzierung erhaltenen Informationen wurden mit der in der Genom-Datenbank zur Verfügung stehenden Sequenz des 1. A ZUSAMMENFASSUNG 2 Referenzstammes S. epidermidis RP62A verglichen und in einer Genkarte zusammengefaßt. Neben einzelnen Unterschieden zwischen den beiden S. epidermidis-Stämmen fiel vor allem auf, daß mehrere der von der Deletion betroffenen Leseraster für Proteine mit Ähnlichkeiten zu oberflächenassoziierten Proteinen kodieren, die an der Adhärenz der Bakterien beteiligt sein könnten. Daneben finden sich aber auch Leserahmen mit Ähnlichkeiten zu Transportsystemen und zahlreiche mobile genetische Elemente. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß das ica-Operon von S. epidermidis möglicherweise Teil einer Pathogenitätsinsel ist. Die Analyse der Deletionsrandbereiche einer Mutante ergab, daß der Verlust von mehr als 200 kb DNA durch homologe Rekombination zwischen zwei IS256-Elementen vermittelt wurde, die im Wildtypstamm in gleicher Orientierung zueinander vorlagen. Da IS256 offensichtlich eine wichtige Rolle bei der Genomplastizität von S. epidermidis spielt, konzentrierte sich der zweite Teil der Arbeit auf die Aufklärung des Transpositionsmechanismus dieses IS-Elements. Dabei konnte gezeigt werden, daß IS256 eine alternative Transpositionsreaktion nutzt, die durch die Bildung zirkulärer, extrachromosomaler DNA-Moleküle gekennzeichnet ist. Diese DNA-Zirkel bestehen aus einer vollständigen IS256-Kopie, bei der die beiden Enden des Elementes durch eine variable Anzahl von Nukleotiden fremder DNA als Brücke miteinander verbunden sind. Es konnte gezeigt werden, daß diese kurzen DNA-Abschnitte aus der Nachbarschaft der früheren IS256-Insertionsstelle stammen, wobei sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts liegende Nukleotidsequenzen nachgewiesen wurden. Neben diesen vollständigen IS256-Zirkeln wurden aber auch Moleküle gefunden, bei denen entweder das rechte oder das linke Ende von IS256 fehlten. Die Daten legen nahe, daß beide IS256-Enden an der Zirkelbildung teilnehmen können und im Unterschied zu anderen zirkelbildenden Insertionssequenzen, die Strangtransferreaktion während der Zirkularisierung mit geringer Spezifität verläuft. Ringförmige IS256-Moleküle konnten sowohl in S. epidermidis als auch in rekombinanten S. aureus und E. coli-Stämmen nachgewiesen werden, was auf eine untergeordnete Rolle speziesspezifischer Faktoren bei diesem Prozeß schließen läßt. Dagegen konnte durch die Einführung einer Mutation in das putative Transposasegen des Elementes gezeigt werden, daß dieses Genprodukt für die IS256-Zirkularisierung essentiell ist. Es ist zu vermuten, daß die Bildung zirkulärer IS256-Moleküle die Voraussetzung für die präzise Exzision des Elementes während der Phasenvariation der Biofilmproduktion bildet. Außerdem ist die Generierung stabiler Mutationen durch das Zurücklassen von Teilen der duplizierten Zielsequenz oder durch die Vermittlung kleinerer Deletionen während der Zirkelbildung vorstellbar. Darüber hinaus bilden die multiplen Kopien des Elementes im Genom Kreuzungspunkte für homologe Rekombinationsereignisse. IS256 stellt damit sehr wahrscheinlich einen wesentlichen Faktor für die Flexibilität des Genoms von S. epidermidis dar. Die detaillierte Aufklärung der molekularen Mechanismen, die die Transposition von IS256 beeinflussen, könnten daher wertvolle Einblicke in die genetischen Anpassungsstrategien dieses bedeutenden nosokomialen Pathogens geben. N2 - Staphylococcus epidermidis is the predominant cause of implanted medical device related infections and of nosokomial sepsis. These bacteria show an unusual phenotypic and genotypic variability that comprises the expression of virulence- and resistance-associated genes. This adaptability is thought to be involved in the survival of staphylococci under changing environmental conditions. In this study the role of bacterial insertion sequences (IS) in the genome plasticity of S. epidermidis was investigated. Of particular interest was the insertion sequence element IS256 and its influence on S. epidermidis-biofilm formation. The capability of S. epidermidis to attach to surfaces and to form biofilms is due to the presence and expression of the ica Operon. This gene locus was shown to mediate cell-cell adhesion and production of the polysaccharid intercellular adhesin (PIA). The PIA-production is variable and has an influence on the virulence and staphylococcal colonization. In the first part of this work it was shown that variable PIA-production depends on three different mechanisms which involve the insertion sequence IS256. By comparison of different IS256-specific hybridization patterns of a biofilm forming wildtype S. epidermidis and its PIA-negative spontaneous variants, it could be shown that IS256 which is present in multiple copies in the genome of this strain is highly active. A more detailed analysis of this variants has shown that IS256 mediates genome rearrangements and causes the loss of biofilm formation in a number of PIA-negative variants. Another group of biofilm-negative variants carries an IS256 inserted in the ica-Operon. The distribution of the icaC::IS256 insertion sites led us assume that icaC is a hot spot for the integration of IS256. ica::IS256 insertions have been detected in numerous S. epidermidis strains. Because this insertions are reversible they are a substantial cause for phase variation of biofilm formation in S. epidermidis. A third group of variants shows the deletion of chromosomal DNA fragments of variable length which are accompanied with the loss of the ica genes and the ability to form biofilms. To answer the question which are the ica-neighbouring genes that get lost with the deletion of DNA-Fragments up to 250 kbp, we constructed an S. epidermidis wild type cosmid library. Nucleotide sequence information has been compared with the sequence of the reference strain S. epidermidis RP62A that is available in the genome database and was summarized in a gene map. Apart from some differences between this two S. epidermidis strains, it was remarkable that various open reading frames get lost, which show similarities to surface-associated proteins and which might be involved in adherence of bacteria. In addition, there are open reading frames showing similarities to transport proteins and numerous mobile DNA elements. These results indicate that the ica operon could be possibly a part of a pathogenicity island. Analysis of the deletion borders of a mutant has shown that homologous 1. B SUMMARY 4 recombination between two IS256 elements, oriented in the same direction, were responsible for the loss of more than 200 kbp DNA. Because IS256 plays an essential role in the genome plasticity in S. epidermidis it was of special interest to elucidate the transposition mechanism of IS256 which was the second part of this work. The data obtained in this analyses have shown that IS256 transposes via an alternative transposition mechanism that is characterized by the formation of extrachromosomal circular DNA molecules. These DNA circles consist of complete IS256 copies in which the left and the right end of the IS element are connected via foreign DNA (circle junctions). It could be shown that these circle junctions were derived from upstream and downstream flanking DNA-sequences of the parental genetic locus. In addition to complete circles, incomplete circles were detected in which either the left or the right end of IS256 was truncated. These results suggest that either end of IS256 can attack the opposite terminus and, in contrast to other circle-forming IS elements, the strand-transfer reaction occurs with low specifity. Circular IS256 molecules could be shown both in recombinant S. aureus and E. coli strains, which indicates that in the circularization process host factors play a minor role. Mutagenesis of the gene for the putative transposase revealed that this gene product is essential for formation of IS256 circles. There are grounds for the assumption that the formation of IS256-circles is the prerequisite for precise excision of the element during biofilm phase variation. Besides the generation of stable mutations through imprecise excision of the element is conceivable. In addition multiple copies of the element in the genome represent sites for homologous recombination. The combined data suggest that IS256 represents a driving force in the flexibility of the S. epidermidis genome. A detailed analysis of the molecular mechanisms which influence the transposition of IS256 could give an insight into the genetic adaptation of this important nosocomial pathogen. KW - Staphylococcus epidermis KW - Biofilm KW - Insertionselement KW - Staphylococcus epidermidis KW - Biofilm KW - IS256 KW - ica KW - Genomvariabilität KW - Staphylococcus epidermidis KW - biofilm KW - IS256 KW - ica KW - genomvariability Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3258 ER - TY - THES A1 - Cho, Seung-Hak T1 - Epidemiologische und molekulare Untersuchungen zur Biofilmbildung in Staphylococcus epidermidis und Staphylococcus aureus T1 - Epidemiological and molecular investigations of the biofilm formation in Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus N2 - Staphylococcus aureus und Staphylococcus epidermidis gehören zu den häufigsten Erregern nosokomialer Infektionen bei immunsupprimierten Patienten. Gleichzeitig bilden diese Bakterien einen wesentlichen Teil der gesunden Hautflora des Menschen. Bisher ist wenig darüber bekannt, ob es Unterschiede in der genetischen Ausstattung zwischen klinischen und kommensalen Isolaten gibt und welche Faktoren zur Etablierung von Staphylokokken im Hospitalmilieu beitragen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, daß die Fähigkeit zur Biofilmbildung offensichtlich ein wesentliches Merkmal pathogener Staphylokokken ist. Die Expression dieses Virulenzfaktors ist dabei hochvariabel und hängt von der genetischen Ausstattung der Stämme mit dem für die Biofilmbildung verantwortlichen ica-Operon, bestimmten Umweltfaktoren und dem Einfluß von Insertionssequenzen ab. In einer epidemiologische Untersuchung wurde gezeigt, daß in S. epidermidis das ica-Operon häufiger in klinischen als in kommensalen Stämmen vorkommt. Der überwiegende Teil dieser ica-positiven Stämme bildete phänotypisch einen Biofilm aus. Im Unterschied dazu enthielten alle untersuchten S. aureus-Stämme, unabhängig von ihrer Herkunft, das vollständige ica-Gencluster, wobei jedoch keiner dieser Stämme unter Laborbedingungen einen Biofilm bildete. Durch subinhibitorischen Konzentrationen bestimmter Antibiotika bzw. durch Osmostress ließ sich die Biofilmbildung in 30 Prozent der S. aureus-Stämme induzieren. Ebenso konnte in ica-positiven S. epidermidis-Stämmen die Biofilmbildung dirch diese Umweltfaktoren stimuliert werden. Die Studie ergab auch, daß es einen Zusammenhang zwischen der Biofilmbildung, der Antibiotikaresistenz und dem Vorkommen der Insertionssequenz IS256 gibt. So war IS256 signifikant häufig in klinischen S. epidermidis und S. aureus-Stämmen nachweisbar, während es keinen Unterschied im Auftreten von IS257 zwischen klinischen und saprophytären Isolaten gab. Die IS256-positiven S. epidermidis-Stämme wiesen überdurchschnittlich oft das ica-Operon auf und waren gegen mindestens zwei Antibiotika gleichzeitig resistent. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß IS256 an der Phasenvariation der Biofilmbildung in vivo beteiligt ist. Bei einem klinischen S. epidermidis-Stamm, der von einem Patienten mit einer Katheter-assoziierten Harnwegsinfektion isoliert wurde, wurde die Insertion des Elementes im icaC-Gen nachgewiesen, was in einem Biofilm-negativen Phänotyp resultierte. Subkultivierung der Insertionsmutante führte nach wenigen Passagen zur Ausbildung eines Biofilms. Die Nukleotidsequenzierung ergab die vollständige Exzision von IS256 aus dem icaC-Gen einschließlich der duplizierten Zielsequenz von sieben Basenpaaren. Diese Daten stimmen vollständig mit den zuvor in einer in-vitro-Studie erhaltenenen Ergebnissen überein und sie zeigen, daß IS256 die Expression des ica-Operons offensichtlich auch in vivo während einer Infektion beeinflußt. Bei S. aureus konnte in dieser Arbeit ebenfalls eine Phasenvariation der Biofilmexpression nachgewiesen werden. Durch Mehrfachpassagen wurden aus ehemals Biofilm-negativen Einzelkolonien mehrere Biofilmproduzenten gewonnen, die auch wieder zum Biofilm-negativen Phänotyp revertieren konnten. Die DNA-Analyse mittels Pulsfeldgelelektrophorese zeigte, daß es in den varianten Stämmen zu größeren DNA-Rearrangements gekommen war, die neben der variablen Biofilmbildung auch mit Unterschieden in der Expression des alternativen Transkriptionsfaktors SigmaB einhergingen. Die Nukleotidsequenzierung des sigB-Systems ergab in den Varianten mehrere Punktmutationen in den SigB-Regulatorgenen rsbU und rsbW. Dies legt nahe, daß der SigB-Genlokus einer starken genetischen Variabilität unterliegt, die wiederum pleiotrope Effekte auf die Genexpression in S. aureus ausübt. Durch Northern-Blot-Analysen konnte allerdings gezeigt werden, daß die Biofilmbildung in den S. aureus-Varianten nicht mit der veränderten SigB-Expression in Zusammenhang steht. N2 - Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis belong to the most frequent causes of nosocomial infections in immunocompromised patients. These bacteria form an essential part of the healthy skin flora of human beings. Little is known, whether there are differences in the genetic equipment between clinical and commensal isolates and which factors contribute to the setup of staphylococci in the hospital environment. The results of the presented work show that the ability to form biofilms is an essential feature of pathogenic staphylococci. The expression of this virulence factor is highly variable and depends on the presence of the ica operon which is responsible for biofilm formation, specific environmental factors and the influence of insertion sequences. In an epidemiological investigation, it was shown that the ica operon in S. epidermidis is more often present in clinical strains than in commensal ones. The predominant part of these ica-positive strains formed phenotypically a biofilm. In contrast, all examined S. aureus contained, independent of their origin, the complete ica gene clusters, while, however, none of these strains formed a biofilm under laboratory conditions. Biofilm formation could be induced by subinhibitory concentrations of specific antibiotics or osmotic stress in 30 percent of the S. aureus strains. Also, biofilm formation could be stimulated in ica-positive S. epidermidis strains through these environmental factors. The study also revealed that there is an association between biofilm formation, antibiotic resistance and the occurrence of the insertion sequence IS256. Thus, IS256 was significantly more often detected in clinical S. epidermidis and S. aureus strains, while there was no difference in the occurrence of IS257 between clinical and saprophytic isolates. Most of the IS256-positive S. epidermidis strains carried the ica operon and were simultaneously resistant against at least two antibiotics. Furthermore, it was shown that IS256 is involved in phase variation of biofilm formation in vivo. In case of a clinical S. epidermidis strain that was isolated from a patient with a catheter-associated urinary tract infection, the insertion of the element in the icaC gene was detected resulting in a biofilm-negative phenotype. Subcultivation of the insertion mutant resulted in biofilm-forming variants after a few passages. Nucleotide sequencing indicated the complete excision of IS256 from the icaC gene including the duplicated target site sequence of seven base pairs. These data are in agreement with the results received in a recent in vitro study and show that IS256 has an influence on the ica-expression during an infection. In this study, phase variation of biofilm formation was also shown in S. aureus. After serial passages, several biofilm producers were derived from formerly biofilm-negative single colonies which could also revert to the biofilm-negative phenotype again. DNA analysis by pulsed-field gel electrophoresis showed that in the variants large DNA-rearrangements took place. In addition to the variable biofilm production, differences in the expression of the alternative transcription factor SigmaB were observed in the variants. Nucleotide sequencing of the sigB system indicated several point mutations in the SigB regulatory genes rsbU and rsbW of the variants. This implies that the SigB gene locus is subject to a strong genetic variability that results, in turn, in pleiotropic effects on gene expression in S. aureus. However, Northern blot analysis revealed that the biofilm formation in the S. aureus variants are not associated with the varying SigB expression. KW - Staphylococcus aureus KW - Staphylococcus epidermis KW - Biofilm KW - Molekulargenetik KW - Staphylokokken KW - nosokomiale Infektionen KW - Biofilmbildung KW - ica-Operon KW - Insertionssequenzen KW - Phasenvariation KW - Regulatorgene KW - staphylococci KW - nosocomial infections KW - biofilm formation KW - ica Operon KW - insertion sequences KW - phase variation KW - regulator genes Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181296 ER -