TY - THES A1 - Tränkenschuh, Wolfgang T1 - Die Rolle von NF-kappaB und MEK in der Apoptosesuppression durch Raf T1 - The role of NF-kappaB and MEK in suppression of apoptosis by activated Raf N2 - Aus genetischen und zellbiologischen Untersuchungen ist bekannt, dass die Proteinkinase Raf Apoptose unterdrücken kann, die Effektoren sind jedoch im Detail nicht klar. Am Modell der IL-3 abhängigen Zellinie 32D wurde die Rolle des Transkriptionsfaktors NF-kappaB in der Apoptosesuppression durch aktiviertes Raf untersucht. Unter Verwendung zweier aktiver Raf-Mutanten ergaben sich Hinweise auf eine proapoptotische Funktion, passend zu den NF-kappaB zugeschriebenen proaptotischen Zielgenen. Für den Raf-Effektor MEK ist eine antiapoptotische Funktion bekannt. Hier gelang es mit einer hyperaktiven Mutante (deltaStu-MEK-LIDEMANE) aus IL-3 abhängigen 32D Zellen einen Faktor-unabhängigen Zellpool (FID) zu generieren. Das von den bekannten Vorstellungen über Zytokin-abhängige Zellinien abweichende Verhalten, nach dem erst die Mutation von mehr als einem Onkogen zu einer Faktorunabhängigkeit führt, wurde genauer charakterisiert. Die FID-Zellen sind weiter von den Signalmolekülen MEK und PI3-Kinase abhängig und ein autokriner Mechanismus konnte ebenso wie die Expression von Signalmolekülen auf der Zelloberfläche ausgeschlossen werden. N2 - The protein kinase Raf is able to suppress apoptosis, although its effectors are not known in detail. The IL-3-dependent cell line 32D served as a model for the suppression of apoptosis by activated Raf in order to elucidate the role of the transcription factor NF-kappaB. We used two different active Raf mutants in our experimental approach and found evidence of a proapoptotic role for NF-kappaB. This stresses the significance of the proapoptotic target genes of NF-kappaB. The Raf effector MEK has an established antiapoptotic role. Our hyperactive MEK-mutant (deltaStu-MEK-LIDEMANE) turned IL-3-dependent 32D cells into cytokine-independent cells contrary to the traditional model of cytokine dependence. The cytokine-independent cells still employed the MEK and PI3-Kinase pathways. An autocrine mechanism could be excluded as well as the presence of surface signalling molecules. KW - Apoptosis KW - Raf-Kinasen KW - Interleukin 3 KW - Apoptosis KW - NF-kappaB KW - MEK KW - Interleukin-3 Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-37011 ER - TY - THES A1 - Giner, Martin T1 - Signalmechanismen der epithelialen Proliferation und DIfferenzierung T1 - Signal mechanisms of Proliferation and Differentiation in Epithelia N2 - Gestörte Proliferations- und Differenzierungsprozesse in Keratinozyten spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese vieler Hauterkrankungen. Intrazelluläre Signalmechanismen, die die korrekte Balance zwischen epidermaler Proliferation und Differenzierung aufrecht halten, sind bis jetzt größtenteils unbekannt. Einer dieser ausschlaggebenden Transkriptionsfaktoren ist der Nukleäre Faktor-kappaB (NF-kB). Uns interessierte der Einfluss des IKK/IkBa/NF-kB-Signalweges auf das intrinsische Differenzierungsprogramm von Keratinozyten. Mittels retroviraler Infektion wurden sowohl in primären Keratinozyten als auch in HaCaT verschieden mutante Formen von Faktoren des NF-kB-Signalweges eingebracht: dominant negative (dn) Formen der IKK1 und IKK2, eine konstitutiv aktive Form der IKK2 (IKK2 EE) und eine nicht-degradierbare Form des Inhibitors IkBa. Zusätzlich wurden auch pharmakologische Inhibitoren von NF-kB (BAY 11-7082 und SC-514) untersucht. Die Funktionalität der Mutanten wurde im Westernblot durch Analyse der IkBa Degradation überprüft. Anschließend wurde die Differenzierung der Keratinozyten durch Erhöhung des extrazellulären Calciums induziert. Der Grad der Differenzierung wurde durch morphologische Studien und Untersuchung der Expression der Differenzierungs-marker p21 und Involucrin untersucht. Im Gegensatz zu Ergebnissen aus Tiermodellen, konnten wir keine Effekte der mutierten IkB Kinasen 1 und 2 auf die Calcium-induzierte in vitro Differenzierung beobachten. Jedoch wurde die Aktivierung inflammatorischer Gene, gemessen an der Induktion von ICAM-1 und IL-8 nach TNF-a Stimulation, vollständig in den IKK2 KD und mut IkBa exprimierenden Zellen inhibiert. In der Zelllinie, welche die entsprechende IKK1 Mutante trug, wurde deren Expression nur teilweise geblockt. Zusammenfassend lässt sich aus unseren Ergebnissen schließen, dass zumindest in vitro IKK1 und IKK2 nicht an der Regulation des Calcium-induzierten intrinsischen Differen-zierungsprozesses von Keratinozyten beteiligt sind, jedoch eine zentrale Rolle in der inflammatorischen Aktivierung dieser Zellen spielen. N2 - Disturbed proliferation and differentiation processes of keratinocytes play a major role in the pathogenesis of many skin diseases. Intracellular signalling mechanisms which regulate the balance between epidermal proliferation and differentiation, however, are thus far largely unknown. Earlier reports suggest a role for the transcription factor nuclear factor–kappaB (NF-kB) in such processes. Here we attempted to analyze the impact of the IKK/IkBa/NF-kB signalling pathway on the intrinsic differentiation process of keratinocytes. Primary human keratinocytes as well as HaCaT cells were retrovirally infected to express different mutant forms of components of the IKK/NF-kB pathway: dominant negative (dn) mutants of NF-kB upstream kinases IKK1 and IKK2, a constitutive active form of IKK2 (IKK2 EE), and a non degradable mutant form of IkBa. In addition, pharmacological inhibitors of the pathway such as BAY 11-7082 and SC-514 were analysed. Proper functionality of the generated mutants was subsequently confirmed by Western blot analysis monitoring induced IkBa degradation. Thereafter, differentiation of keratinocytes was induced by elevation of extracellular calcium levels. The differentiation state of keratinocytes was then assessed by studying morphology and expression of differentiation markers such as p21 as well as involucrin. In contrast to data reported from animal models, we could not detect any effects of mutated IKK1 or IKK2 on the calcium-induced intrinsic differentiation program in keratinocytes. However, inflammatory activation of keratinocytes as measured by TNF-a-mediated up-regulation of ICAM-1 and IL-8 was almost completely inhibited in cells expressing dn IKK2 and the IkBa mutant form whereas it was only partly blocked in IKK1dn cells. In conclusion, our data suggest that, in least in vitro, IKK1 and IKK2 are not involved in the regulation of calcium-induced keratinocyte differentiation while they are pivotal for inflammatory activation of these cells. KW - NF-kappaB KW - Keratinozyten KW - Involucrin KW - Differenzierung KW - Proliferation KW - inflammatorische Antwort KW - NF-kappaB KW - Keratinocytes KW - Involucrin KW - differentiation KW - proliferation KW - inflammatory response Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27069 ER -