TY - THES A1 - Kajahn, Inga T1 - Kopplungsmethoden in der Naturstoffanalytik : Untersuchungen an Arabidopsis thaliana und an Ancistrocladus-Pflanzen T1 - Hyphenation methods in the analysis of natural products : investigations on Arabidopsis thaliana and Ancistrocladus-plants N2 - Im Rahmen dieser Disseration wurden im Einzelnen folgende Ergebnisse erzielt: A. Isolierung und Strukturaufklärung von Naphthylisochinolin-Alkaloiden aus verschiedenen Ancistrocladus-Spezies: • Die bisher noch nicht phytochemisch untersuchten Rindenextrakte der vietnamesischen Unterart Ancistrocladus tectorius ssp. cochinchinensis wurden im Hinblick auf ihre Sekundärmetabolite analysiert. Dabei identifizierte man vier bereits bekannte und drei neuartige Naphthylisochinoline-Alkaloide. Die Strukturen dieser drei Metabolite wurden nach Isolierung unter Verwendung diverser 2D-NMR-Techniken aufgeklärt. Die entdeckten Substanzen – Ancistrocladinium A (30) und seine beiden O-Demethylderivate 31 und 32 – waren die drei ersten Vertreter des neuartigen N,8'-Naphthyldihydroisochinolin-Kupplungstyps. Diese Naturstoffe verfügen über vielversprechende pharmakologische Wirkungen – vor allem gegen den Erreger der Leishmaniose. • Die botanisch noch nicht vollständig charakterisierte Lianenart ''A. ikela'', die aus der Demokratischen Republik Kongo stammt, wurde im Laufe der Arbeit morphologisch und phytochemisch untersucht und beschrieben. Neben den beiden N,C-verknüpften Naphthylisochinolinen Ancistrocladinium A (30) und Ancistrocladinium B [(M/P)-39] wurde bei der phytochemischen Analyse ein neuartiges C,C-gekuppeltes Alkaloid – 8-O-Methylancistrogriffin C (40) – isoliert. Des weiteren wurde ein Gradient entwickelt, der die vollständige Trennung der beiden Atrop-Diastereomere von 39 und dadurch HPLC-NMR- und HPLC-CD-Analysen der einzelen Epimere ermöglichte, so dass die Rotationsbarriere der bei Raumtemperatur langsam drehenden Biarylachse bestimmt werden konnte. • Aus Blättern der bereits gut untersuchten indischen Ancistrocladus-Art A. heyneanus wurde mit 6-O-Methyl-8,4'-O-didemethylancistrocladin (42) ein weiteres neues Naphthylisochinolin-Alkaloid isoliert. • Eine phytochemische Untersuchung der Familie der Ancistrocladaceae auf das Vorkommen von N,C-verküpften Naphtylisochinolinen ergab, dass diese strukturell außergewöhnlichen Alkaloide in diesen Lianen weit verbreitet sind. B: Die Rolle des Phloems bei der Pathogen-vermittelten Ausbreitung von Signalen: • Im Rahmen des Teilprojektes B8 des SFBs 567 wurden Untersuchungen zur Rolle des Phloems bei der Weiterleitung von Langstreckensignalen nach Infektion von Arabidopsis-thaliana-Pflanzen mit virulenten oder avirulenten Stämmen von Pseudomonas syringae pv. tomato durchgeführt. Zunächst wurde dazu eine im nL-Maßstab anwendbare Analysenmethode für die Hauptmetabolite von A. thaliana – die Glucosinolate – entwickelt. Mit Hilfe dieser empfindlichen Methode wurden in Pflanzenextrakten von A. thaliana viele bekannte und einige neue Glucosinolate (8-Methylsulfonyl-n-octyl-, 2-Hydroxy-4-methylsulfinyl-n-butyl-, 2-Hydroxy-4-methylsulfonyl-n-butyl- und 4-Hydroxy- benzoyloxymethylglucosinolat) identifiziert. Des weiteren wurden MS/MS-Analysen der Glucosinolate durchgeführt, bei denen neben mehreren typischen Fragmenten für die Thiozucker-Einheit auch einige charakteristische Fragmente für die unterschiedlichen Seitenketten (z.B. Methylsulfinyl-n-alkyl- oder Methylthio-n-alkyl-Struktur) detektiert wurden. Leider ergaben vor allem die aromatischen und heteroaromatischen Seitenketten-Typen kein typisches Fragmentierungs-muster. • Bei der Analyse der Phloemexsudate konnte in Phloemsäften von unbehandelten Pflanzen neben Methoxyglucobrassicin (73) ein für Pflanzen neuartiges Phosphat 87 (1-Glycero-1-myo-inositolphosphat) identifiziert werden. In den Phloemsäften der unterschiedlich behandelten Pflanzen (infiltriert mit MgCl2, einem virulentem oder einem avirulentem Pseudomonas-Stamm) kamen sämtliche Hauptmetabolite der Blätter vor. Lediglich ein leichter, nicht signifikanter Konzentrationsanstieg von Methoxyglucobrassicin (73) wurde im Phloemsaft von mit avirulenten Pathogenen infizierten Pflanzen festgestellt. Dieser Anstieg muss aber kritisch betrachtet werden, da er auch ein Artefakt des starken mechanischen Reizes des Infiltrationsprozesses sein könnte. Andere kleine Konzentrationsänderungen könnten außerdem durch das starke ''Grundrauschen'' der Infiltration überlagert werden. C: Strukturaufklärung polyketidischer Sekundärmetabolite aus Mikroorganismen: • Zwei niedermolekulare Naturstoffe aus dem extremophilen Streptomyceten-Stamm KC 1030, die in der Arbeitsgruppe von Prof. H.-P. Fiedler (Universität Tübingen) isoliert worden waren, wurden strukturell aufgeklärt. Bei dem einen handelt es sich um das bereits bekannte Frigocyclinon (89), bei dem anderen um ein neues Angucyclinon 88 mit Fridamycin-E-Grundkörper. Darüber hinaus wurden aus einem weiteren Streptomyces-Stamm (AK 671) zwei neue (97, 98) und drei (96, 99, 100) bekannte biosynthetisch interessante Sekundärmetabolite isoliert. N2 - In detail, the following results were achieved during this doctoral thesis: A: Isolation and structural elucidation of naphthylisoquinoline alkaloids from Ancistrocladus species: • The not yet phytochemically investigated bark extracts of the Vietnamese subspecies Ancistrocladus tectorius ssp. cochinchinensis were analyzed. Four already known and three unknown naphthylisoquinoline alkaloids were identified. The three new metabolites were isolated and structurally elucidated by the use of different 2D NMR techniques. The defined structures – ancistrocladinium A (30) and its two O-demethyl derivatives 31 and 32 – are the first representatives of the new N,8'-naphthyl dihydroisoquinoline coupling type. These natural products exhibit promising biological activities – above all against the pathogen of leishmaniasis. • The botanically not yet fully characterized liana species ''A. ikela'', which was collected in the Congo Basin (Democratic Republic Congo), was morphologically and phytochemically investigated and described botanically. Besides the two N,C-coupled naphthylisoquinolines, ancistrocladinium A (30) and ancistrocladinium B [(M/P)-39], a new C,C-coupled alkaloid – 8-O-methylancistrogriffine C (40) – was isolated. Furthermore, by establishing a gradient system for the baseline separation of both atropodiastereomers of 39 HPLC-NMR and HPLC-CD analyses of the individual two purified epimers were performed to define the rotational barrier of the biaryl axis, which slowly rotates at room temperature. • From the leaves of the already well-investigated Indian Ancistrocladus species A. heyneanus, 6-O-methyl-8,4'-O-didemethylancistrocladine (42), a hitherto unknown naphthylisoquinoline alkaloid, was isolated. • A phytochemical investigation of the plant family of the Ancistrocladaceae with respect to the occurrence of N,C-coupled naphtylisoquinolines proved that these structurally exceptional alkaloids are quite common in this liana family. B: The role of the phloem during the propagation of pathogen-mediated signals: • Within the scope of the project B8 of the SFB 567, investigations on the role of the phloem during the propagation of long-distance signals after infection of plants of Arabidopsis thaliana with virulental or avirulental strains of Pseudomonas syringae pv. tomato were carried out. For this purpose initially an analytical method for the main metabolites – the glucosinolates – of A. thaliana applicable at a nL-scale was developed. Using this sensitive method, many known but also some new glucosinolates (8-methylsulfonyl-n-octyl-, 2-hydroxy-4-methylsulfinyl-n-butyl-, 2-hydroxy-4-methylsulfonyl-n-butyl-, and 4-hydroxy-benzoyloxymethyl-glucosinolate) were identified in plant extracts of A. thaliana. Furthermore, MS/MS analyses of the glucosinolates were carried out to verify their structures. Next to some typical fragments of the thiosugar moiety a few characteristic fragments of the different side chain structures (e.g. methylsulfinyl-n-alkyl- or methylthio-n-alkyl structure) were detected. Unfortunately, not all of the different types of side chaines led to typical fragmentation pattern. • In the phloem sap of entirely untreated plants, only methoxyglucobrassicin (73) and a phosphate 87 (1-glycero-1-myo-inositolphosphate), which was not kown so far to be located in plants, were identified in the course of the analysis of the phloem exudates. In the phloem saps of all the differently treated plants (infiltrated with MgCl2, virulental or avirulental Pseudomonas strain) all of the main leaf metabolites occurred. Solely a slight but not significant increase of the concentration of methoxyglucobrassicin (73) was measured in the phloem exudates of plants infected with avirulental pathogens. One has to be extremely careful with respect to the observed increase since it is possible that the enhanced glucosinolate concentration was the result of the strong mechanical stimulus of the infiltration procedure. Furthermore, slight changes in the concentration of other metabolites could be superimposed by signals caused by the infiltration procedure. C: Structural elucidation of polyketidic secondary metabolites from microorganisms • The structures of two low-molecular natural products isolated in the working group of Prof. H.-P. Fiedler (University of Tübingen) from the extremophilic Streptomyces strain KC 1030 were elucidated. One of them was the already known frigocyclinone (89) and the other one was the new angucyclinone 88 with a fridamycine E core structure. Moreover, from the Streptomyces strain AK 671, two new (97, 98) and three known (96, 99, 100) biosynthetically interesting secondary metabolites were isolated. KW - CE-oTOF-MS KW - Arabidopsis thaliana KW - Glucosinolate KW - Ancistrocladaceae KW - Ancistrocladus cochinchinenesis KW - Ancistrocladinium A KW - Naphthylisochinolinalkaloide KW - CE-oTOF-MS KW - Arabidopsis thaliana KW - glucosinolates KW - Ancistrocladus cochinchinensis KW - ancistrocladinium A KW - naphthylisoquinoline alkaloids Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27288 ER - TY - THES A1 - Bonfig, Katharina Barbara T1 - Untersuchungen zur Rolle des Kohlenhydratmetabolismus während Pflanze-Pathogen-Interaktionen und der Keimlingsentwicklung T1 - Studies on the role of carbohydrate metabolism during plant-pathogen-interactions and seedling development N2 - Invertasen sind Schlüsselenzyme in der Kohlenhydratverteilung und haben möglicherweise auch während einer Pathogeninfektion eine zentrale Bedeutung. In vorliegender Arbeit wurde zunächst die Regulation verschiedener Stoffwechselwege in Arabidopsis thaliana nach Infektionen mit einem virulenten oder avirulenten Stamm von Pseudomonas syringae untersucht. Mit Hilfe der Chlorophyllfluoreszenz-Bildgebung konnten räumliche und zeitliche Veränderungen der Photosynthese verfolgt werden. Verschiedene Parameter waren unterschiedlich reguliert. In beiden Interaktionen waren Effekte nur lokal um die Infektionsstellen erkennbar und qualitativ ähnlich. Unterschiede waren im zeitlichen Eintreten und Verlauf sichtbar. Die Methode schien geeignet für die sensitive, nicht-invasive Pathogenfrüherkennung vor dem Auftreten sichtbarer Symptome. Die Regulation verschiedener Gene innerhalb von Source-Sink-Übergängen und die Aktivität von Invertasen war in den beiden Interaktionen qualitativ unterschiedlich. Die Infektion mit virulenten Bakterien resultierte in einer Repression photosynthetischer Gene. Die Aktivität vakuolärer Invertasen stieg vorübergehend nach Infektion mit virulenten Bakterien an, während sie nach Infektion mit avirulenten Bakterien sank. Die Aktivität extrazellulärer Invertasen war in beiden Interaktionen reprimiert. Die erfolgreiche Generierung verschiedener Bakterienstämme von P. syringae, die das grün fluoreszierende Protein exprimieren, kann bei der weiteren Charakterisierung von Pflanze-Pathogen-Interaktionen helfen. Die Regulation von Invertasen erfolgt auf transkriptioneller und posttranslationaler Ebene. Um die Funktion von Invertasen in Pflanze-Pathogen-Interaktionen zu verstehen, wurde zunächst die Regulation von Invertasen durch endogene proteinogene Invertaseinhibitoren untersucht. In Übereinstimmung mit in silico Expressionsdaten konnte durch Untersuchung von Reportergenlinien und in Northern Blot Analysen eine starke Expression von Invertaseinhibitoren in Blättern von A. thaliana festgestellt werden. Nach Applikation biotischer und abiotischer Stressfaktoren wurde diese Expression nahezu vollständig reprimiert. Die indirekte Bestimmung der Invertaseinhibitoraktivität durch Messung der Invertaseaktivität in Mischextrakten zeigte, dass diese nach einer Pathogeninfektion vollständig reprimiert war. In funktionellen Ansätzen wurden transgene Pflanzen generiert, die Invertaseinhibitoren unter Kontrolle induzierbarer Promotoren exprimieren. Die Induktion der Invertaseinhibitorexpression änderte die Sensitivität gegenüber verschiedenen Pathogenen nicht signifikant. In einem pharmakologischen Ansatz wurde der chemische Inhibitor Acarbose zur Hemmung der Invertaseaktivität in A. thaliana verwendet. Eine Behandlung von Blättern bei gleichzeitiger Infektion mit Bakterien verursachte eine erhöhte Sensitivität der Pflanzen gegenüber der Infektion, eine stärkere Repression verschiedener Chlorophyllfluoreszenzparameter sowie ein erhöhtes Bakterienwachstum im Vergleich zu einer Infektion mit den Bakterien allein. Keine Effekte wurden auf transkriptioneller Ebene bei der Untersuchung von Genen verschiedener Stoffwechselwege gefunden. Die Invertaseaktivität nach zusätzlicher Behandlung mit Acarbose war tendenziell niedriger als die Aktivität nach einer Pathogeninfektion alleine. Acarbose erhöhte die Spiegel an Salicylsäure unabhängig von einer Pathogeninfektion. Da das Bakterienwachstum in Mutanten des Salicylsäure-vermittelten Abwehrweges bei zusätzlicher Behandlung mit Acarbose ebenfalls erhöht war, kann eine Beteiligung dieses Abwehrweges am Acarboseeffekt bisher ausgeschlossen werden. Invertasen sind neben ihrer Beteiligung an der Abwehr für die Regulation von Entwicklungsprozessen wichtig. In einem funktionellen Ansatz mit Pflanzen, die Invertaseinhibitoren induzierbar produzieren, wurde die Funktion von Invertasen getestet. Zur Generierung spezifischer Effekte wurden die Inhibitoren unter Kontrolle synthetischer Promotoren in A. thaliana exprimiert. Unerwarteterweise war das Wachstum putativ transgener Keimlinge jedoch im 4-Blatt-Stadium arretiert. Eine Analyse der Aktivität der ß-Glucuronidase in den entsprechenden Reporterlinien zeigte eine Korrelation zwischen der Wachstumsarretierung und einer hohen Aktivität dieser Promotoren unter verschiedenen in vitro Bedingungen. Dieser negative Effekt der Invertaseinhibition auf das Keimlingswachstum wurde in transgenen Tabakpflanzen bekräftigt, die Invertaseinhibitoren unter Kontrolle eines Tetracyclin-induzierbaren Promotors exprimierten. Eine erfolgreiche Induktion des Promotors resultierte in einer Reduktion des Frischgewichtes der Keimlinge. Mittels in silico Expressionsdaten und Northern Blot Analysen konnte für A. thaliana eine spezifische und starke Expression verschiedener Invertaseisoformen in Keimlingen nachgewiesen werden. Diese komplementären Ergebnisse zeigen die Notwendigkeit der Invertaseaktivität für eine normale Keimlingsentwicklung. N2 - Invertases are key metabolic enzymes in carbohydrate partitioning which may also play an important role during pathogen infection. In this study, the regulation of different metabolic pathways in Arabidopsis thaliana plants after infection by a virulent and an avirulent strain of Pseudomonas syringae was investigated. With help of chlorophyll fluorescence imaging spatio-temporal changes in photosynthesis were monitored. The monitored chlorophyll fluorescence parameters were showing differential regulation. The effects were restricted to the vicinity of the infection site and did not spread to uninfected areas of the leaf. Qualitatively similar changes in photosynthetic parameters were observed in both interactions. Major differences between the responses to both strains were evident in the onset and time course of changes. Changes could be detected by chlorophyll fluorescence imaging before symptoms were visible by eye. In contrast to photosynthesis, the regulation of marker genes for source/sink relations and the activities of invertase isoenzymes showed qualitative differences between both interactions. Inoculation of the virulent but not the avirulent strain resulted in downregulation of photosynthetic genes and upregulation of vacuolar invertases. The activity of vacuolar invertases transiently increased upon infection with the virulent strain but decreased with the avirulent strain while extracellular invertase activity was downregulated in both interactions. As an advanced tool for the characterization of the interaction between A. thaliana and P. syringae bacteria expressing the green fluorescing protein were generated. Invertases are regulated on transcriptional and posttranscriptional level. To understand the function of invertases in plant-pathogen-interactions, the regulation of endogenous proteinaceous invertase inhibitors was investigated. According to expression profiling the analysis of reporter gene lines and Northern Blot analyses revealed a strong expression of invertase inhibitors in source leaves of A. thaliana. After application of biotic and abiotic stress factors this expression was completely repressed. Indirect determination of invertase inhibitor activity by measurement of invertase activity in mixed extracts revealed a complete repression of inhibitor activity after pathogen infection. In functional approaches transgenic plants were generated, expressing invertase inhibitor proteins under control of inducible promoters. However, no effect of the induction of inhibitor expression on the sensitivity to different pathogens could be observed so far. In a pharmacological approach acarbose war used as an invertase inhibitor. Simultaneous treatment of plants with acarbose and bacteria revealed an increased sensitivity of the plant towards the bacterial infection and a stronger repression of chlorophyll fluorescence parameters compared to plants treated with bacteria alone. No effects on photosynthesis, carbohydrate metabolism and defence could be observed on transcriptional level. A tendency of lowered invertase activity could be observed after treatment with acarbose and bacteria compared to bacterial treatment alone. Acarbose treatment enhanced the levels of salicylic acid independent of bacterial infection. The acarbose-mediated increase in sensitivity was also detectable in sid2 and cpr6 mutants indicating that the effect of acarbose is independent of the salicylic acid mediated defence pathway. Invertases are important enzymes in higher plants, which are involved in regulating developmental processes and responses to external factors. In a functional approach the role of invertases was investigated using transgenic plants ectopically expressing inhibitor proteins to decrease invertase activity. For generating specific effects, these inhibitor proteins were expressed in A. thaliana under the control of synthetic promoters consisting of tetramers of pathogeninducible elements, which were reported to yield low constitutive expression. Unexpectedly, seedling growth of putative transgenic plants was arrested at the four-leaf stage. Analysis of ß-glucuronidase activity of corresponding reporter gene lines showed a correlation of the growth arrest with high activity of these promoters in seedlings grown under tissue culture conditions. The negative effect of invertase inhibition on seedling growth was substantiated by transgenic tobacco plants expressing an invertase inhibitor under control of a tetracycline inducible promoter. Ectopic induction of the invertase inhibitor during early seedling development resulted in a reduced fresh weight of seedlings. Expression profiling and Northern Blot analyses further supported the importance of invertase in Arabidopsis thaliana seedling development. Different invertases were specifically and strongly expressed. These complementing results show that invertase activity is required for normal seedling development. KW - Invertase KW - Invertaseinhibitor KW - Arabidopsis thaliana KW - Pseudomonas syringae KW - invertase KW - invertase inhibitor KW - Arabidopsis thaliana KW - Pseudomonas syringae Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-32488 ER -