TY - THES A1 - Bertero, Edoardo T1 - Mechano-energetic uncoupling in Barth syndrome cardiomyopathy T1 - Mechano-energetische Entkopplung bei der Barth Syndrom Kardiomyopathie N2 - In this Doctoral Thesis we investigated the consequences of perturbed mitochondrial calcium handling in the context of a rare human disease, Barth syndrome, in which the altered phospholipid composition of the inner mitochondrial membrane affects the structural organization of several protein complexes, including the mitochondrial calcium uniporter. We discovered that loss of the mitochondrial calcium uniporter in cardiac, but not skeletal muscle mitochondria hinders the calcium-induced adaptation of mitochondrial oxidative metabolism during workload transitions. This mechano-energetic uncoupling impairs the physiological increase in contractile force during physical exercise and might predispose Barth syndrome patients to the development of arrhythmias. N2 - Diese Doktorarbeit umfasst vier Studien, deren verbindendes Thema die Rolle von Calcium (Ca2+) als Verbindung zwischen elektromechanischer Kopplung und mitochondrialem oxidativen Metabolismus im Herzen unter physiologischen und pathologischen Bedingungen ist. Dieser Prozess wird als mechano-energetische Kopplung bezeichnet. Während eine übermäßige Ca2+ Aufnahme in Mitochondrien katastrophale Folgen für die oxidative Phosphorylierung hat und zum Zelltod führt, stimuliert die physiologische Ca2+-Aufnahme über den mitochondrialen Ca2+ uniporter (MCU) die Krebs-Zyklus abhängige Erzeugung von Reduktionsäquivalenten, die sowohl die Atmungskette als auch die mitochondrialen Antioxidationssysteme antreiben, und spielt somit eine wesentliche Rolle sowohl für die ATP Produktion als auch für die Eliminierung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS). ... KW - Barth syndrome KW - Cardiomyopathy KW - Mitochondria KW - Calcium KW - Cardiolipin Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-255176 ER - TY - THES A1 - Chowdhury, Suvagata Roy T1 - The Role of MicroRNAs in \(Chlamydia\) Infection T1 - Die Rolle von MicroRNAs in der Chlamydien-Infektion N2 - The obligate intracellular pathogen Chlamydia trachomatis is the causative agent of trachoma related blindness and the sexually transmitted pelvic inflammatory disease. Being an obligate intracellular pathogen, C. trachomatis has an intricate dependency on the survival of the host cell. This relationship is indispensible owing to the fact that the pathogen spends a considerable fraction of its biphasic lifecycle within a cytoplasmic vacuole inside the host cell, the so-called chlamydial inclusion. The cellular apoptotic-signalling network is governed by several finely tuned regulatory cascades composed of pro- and anti-apoptotic proteins that respond to changes in the cellular homeostasis. In order to facilitate its intracellular survival, Chlamydia has been known to inhibit the premature apoptosis of the host cell via the stabilization of several host anti-apoptotic proteins such as cIAP2 and Mcl-1. While the pro- and anti-apoptotic proteins are the major regulators of the host apoptotic signalling network, a class of the small non-coding RNAs called microRNAs (miRNAs) has increasingly gained focus as a new level of regulatory control over apoptosis. This work investigates the changes in the host miRNA expression profile post Chlamydia infection using a high throughput miRNA deep sequencing approach. Several miRNAs previously associated with the modulation for apoptotic signalling were differentially expressed upon Chlamydia infection in human endothelial cells. Of the differentially regulated miRNAs, miR-30c-5p was of particular interest since it had been previously shown to target the tumor suppressor protein p53. Our lab and others have previously demonstrated that Chlamydia can downregulate the levels of p53 by promoting its proteasomal degradation. This work demonstrates that Chlamydia infection promotes p53 downregulation by increasing the abundance of miR-30c-5p and a successful infection cycle is hindered by a loss of miR-30c-5p. Over the last decade, dedicated research aimed towards a better understanding of apoptotic stimuli has greatly improved our grasp on the subject. While extrinsic stress, deprivation of survival signals and DNA damage are regarded as major proponents of apoptotic induction, a significant responsibility lies with the mitochondrial network of the cell. Mitochondrial function and dynamics are crucial to cell fate determination and dysregulation of either is decisive for cell survival and pathogenesis of several diseases. The ability of the mitochondrial network to perform its essential tasks that include ATP synthesis, anti-oxidant defense, and calcium homeostasis amongst numerous other processes critical to cellular equilibrium is tied closely to the fission and fusion of individual mitochondrial fragments. It is, thus, 8 unsurprising that mitochondrial dynamics is closely linked to apoptosis. In fact, many of the proteins involved regulation of mitochondrial dynamics are also involved in apoptotic signalling. The mitochondrial fission regulator, Drp1 has previously been shown to be transcriptionally regulated by p53 and is negatively affected by a miR- 30c mediated inhibition of p53. Our investigation reveals a significant alteration in the mitochondrial dynamics of Chlamydia infected cells affected by the loss of Drp1. We show that loss of Drp1 upon chlamydial infection is mediated by the miR-30c-5p induced depletion of p53 and results in a hyper-fused architecture of the mitochondrial network. While it is widely accepted that Chlamydia depends on the host cell metabolism for its intracellular growth and development, the role of mitochondria in an infected cell, particularly with respect to its dynamic nature, has not been thoroughly investigated. This work attempts to illustrate the dependence of Chlamydia on miR-30c-5p induced changes in the mitochondrial architecture and highlight the importance of these modulations for chlamydial growth and development. N2 - Das Gram-negative Humanpathogen Chlamydia trachomatis versursacht das Trachom, eine ansteckende follikuläre Bindehautentzündung, die letztlich zur Erblindung Infizierter führt, sowie sexuell übertragbare Entzündungen im Urogenitaltrakt. C. trachomatis ist ein obligat intrazelluläres Bakterium mit einem biphasischen Lebenszyklus, der in einer spezialisierten Vakuole innerhalb des Wirtszellzytoplasmas durchlaufen wird, der sogenannten Chlamydien-Inklusion. C. trachomatis ist daher davon abhängig, dass die infizierte Wirtszelle überlebt, bis die Entwicklung des Erregers abgeschlossen ist und moduliert dazu das apoptotische Signalnetzwerk der Wirtszelle. Dieses besteht aus mehreren fein aufeinander abgestimmten regulatorischen Kaskaden aus pro- und anti- apoptotischen Proteinen, die normalerweise auf Veränderungen in der zellulären Homöostase reagieren und als Folge den programmierten Zelltod einleiten können. Es ist jedoch bekannt, dass Chlamydia die Apoptose der Wirtszelle durch Stabilisierung mehrerer anti-apoptotischer Wirtsproteine wie cIAP2 und Mcl-1 inhibiert. Während pro- und anti-apoptotische Proteine Hauptregulatoren des Apoptosesignalnetzwerks darstellen, wurde kürzlich eine neue Ebene der Apoptose- Regulation identifiziert, die durch kleine, nicht-kodierende microRNAs (miRNAs) gesteuert wird. In der vorliegenden Arbeit untersuchte ich die Veränderungen in dem miRNA Expressionsprofil von Wirtszellen nach einer Chlamydieninfektion. Mittels miRNA deep sequencing wurden dabei mehrere miRNAs identifiziert, die abhängig von der Infektion mit Chlamydia differentiell in menschlichen Endothelzellen exprimiert werden und deren Funktion mit der Modulation der Apoptose-Signalwege assoziiert sind. Dabei war miR-30c-5p von besonderem Interesse, da deren molekulares target das Tumorsuppressorprotein p53 ist. Unter anderem durch unser Labor wurde dabei bereits gezeigt, dass Chlamydia den Proteasom-vermittelten Abbau von p53 fördert und somit die Menge des Proteins in der Wirtszelle depletieren kann. In der hier vorliegenden Arbeit zeige ich darüberhinaus, dass eine Chlamydia-Infektion die p53 Mengen in den Wirtszellen senkt, indem miR-30c-5p verstärkt produziert wird, während das intrazelluläre Wachstum von C. trachomatis durch den Verlust von miR- 30c-5p inhibiert wird. Zusammen mit den apoptotischen Regulationskaskaden entscheiden auch die Integrität der Mitochondrien sowie die Dynamik des mitochondrialen Netzwerks über das Schicksal der Zelle. Eine Dysregulation dieser Funktionen führt zur Einleitung des Zelltods und bildet die Grundlage der Pathogenese mehrerer Krankheiten. Zu den wesentlichen Aufgaben des mitochondrialen Netzwerkes gehören, neben zahlreichen anderen, die Synthese von ATP, die Detoxifizierung von reaktiven Sauerstoff-Spezies sowie die Kalziumhomöostase. Die funktionelle Integrität des mitochondrialen Netzwerks ist dabei stark von Teilungs- und Fusionsraten mitochondrialer Fragmente abhängig und diese mitochondriale Dynamik ist wiederum eng mit der Apoptose verknüpft; so sind etwa viele Proteine, welche die mitochondriale Dynamik regulieren, auch an der apoptotischen Signalgebung beteiligt. Zum Beispiel wird die Transkription des an der Mitochondrienteilung beteiligten Proteins Drp1 durch p53 reguliert und eine miR-30c-vermittelte Inhibition von p53 senkt daher die Menge an Drp1 in der Zelle. In der hier vorliegenden Arbeit demonstriere ich die signifikante Veränderung der mitochondrialen Dynamik in menschlichen Zellen nach einer Chlamydieninfektion. Die entstehende hyperkondensierte Architektur des mitochondrialen Netzwerks ist dabei auf den Verlust von Drp1 zurückzuführen, welcher durch die miR-30c-5p- induzierte Depletion von p53 vermittelt wird. Während die Abhängigkeit des intrazellulären Wachstums von Chlamydia vom Stoffwechsel der Wirtszelle weitgegen akzeptiert ist, wurde die Rolle der Mitochondrien und die Dynamik des mitochondrialen Netzwerks in infizierten Zellen bisher vernachlässigt. Innerhalb der vorliegenden Arbeit wurde zum ersten Mal die Abhängigkeit von Chlamydia auf miR- 30c-5p induzierte Veränderungen in der mitochondrialen Architektur illustriert. KW - Chlamydia KW - MicroRNAs KW - Mitochondria KW - Microscopy KW - Chlamydienkrankheit KW - miRNS KW - Mitochondrium KW - Mikroskopie Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-155866 ER - TY - JOUR A1 - De Lira, Maria Nathalia A1 - Raman, Sudha Janaki A1 - Schulze, Almut A1 - Schneider-Schaulies, Sibylle A1 - Avota, Elita T1 - Neutral Sphingomyelinase-2 (NSM 2) Controls T Cell Metabolic Homeostasis and Reprogramming During Activation JF - Frontiers in Molecular Biosciences N2 - Neutral sphingomyelinase-2 (NSM2) is a member of a superfamily of enzymes responsible for conversion of sphingomyelin into phosphocholine and ceramide at the cytosolic leaflet of the plasma membrane. Upon specific ablation of NSM2, T cells proved to be hyper-responsive to CD3/CD28 co-stimulation, indicating that the enzyme acts to dampen early overshooting activation of these cells. It remained unclear whether hyper-reactivity of NSM2-deficient T cells is supported by a deregulated metabolic activity in these cells. Here, we demonstrate that ablation of NSM2 activity affects metabolism of the quiescent CD4\(^+\) T cells which accumulate ATP in mitochondria and increase basal glycolytic activity. This supports enhanced production of total ATP and metabolic switch early after TCR/CD28 stimulation. Most interestingly, increased metabolic activity in resting NSM2-deficient T cells does not support sustained response upon stimulation. While elevated under steady-state conditions in NSM2-deficient CD4\(^+\) T cells, the mTORC1 pathway regulating mitochondria size, oxidative phosphorylation, and ATP production is impaired after 24 h of stimulation. Taken together, the absence of NSM2 promotes a hyperactive metabolic state in unstimulated CD4\(^+\) T cells yet fails to support sustained T cell responses upon antigenic stimulation. KW - neutral sphingomyelinase-2 KW - T cell receptor KW - Seahorse XF KW - oxidative phosphorylation KW - ATP-adenosine triphosphate KW - Mitochondria Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-211311 SN - 2296-889X VL - 7 ER - TY - THES A1 - Gupta, Kapuganti Jagadis T1 - Nitric oxide in plants: Investigation of synthesispathways and role in defense against avirulent Pseudomonas N2 - Die Zahl der physiologischen Prozesse in Pflanzen, die scheinbar durch NO reguliert werden, hat in den letzten Jahren stark zugenommen. NO übernimmt wichtige Rollen für die Steuerung von Wachstum und Entwicklung, für die Pathogenresistenz und bei abiotischem Stress, sowohl in unterirdischen als auch in oberirdischen Organen. In Pflanzen wurden bisher eine Reihe verschiedener enzymatischer und einige wenige nichtenzymatische Synthesewege für NO vorgeschlagen. Das Hauptziel dieser Arbeit bestand nun darin, die NO Produktion von Pflanzen und speziell von Wurzeln möglichst quantitativ zu erfassen und die beteiligten Enzyme zu identifizieren. Dieses Ziel sollte vor allem durch Chemilumineszenz-Messung von NO in der Gasphase (= direkte Chemilumineszenz) erreicht werden, aber auch durch die indirekte Chemilumineszenz, bei welcher Spuren von NO-Oxidationsprodukten wie Nitrat und Nitrit erfasst werden. Als Versuchspflanzen wurden verwendet: Wildtypen von Nicotiana tabacum cv. Xanthi oder cv. Gatersleben; Nitratreduktase-freie, auf Ammonium-N angezogene Mutanten, die keine Nitratreduktase (NR) induzieren; WT Pflanzen, die auf Wolframat angezogen wurden um die Synthese funktionaler MoCo-Enzyme zu unterbinden; eine NO-überproduzierende, Nitritreduktase (NiR)-freie Transformante, sowie gelegentlich Gerste, Reis und Erbsen. Eine hypersensitive Reaktion (HR) von Tabak wurde erzeugt durch Druckinfiltration von avirulenten Bakterien des Stammes Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. Bei Sauerstoffkonzentrationen ≤1% wurde exogenes Nitrit auch von völlig NR-freien Wurzeln zu NO reduziert. Folglich war NR nicht die einzige NO-Quelle von Wurzeln. Im Gegensatz dazu waren NR-freie Blattstreifen nicht in der Lage, Nitrit zu NO umzusetzen. Die NO-Bildung von Wurzeln wurde außerdem durch Hemmstoffe des mitochondrialen Elektronentransportes, Myxothiazol und Salicylhydroxamsäure (SHAM) gehemmt, während die NO-Produktion von NR-exprimierenden Blattstreifen gegen diese Inhibitoren unempfindlich war. Damit stimmte auch überein, dass gereinigte Mitochondrien aus Wurzeln, aber nicht die aus Blättern Nitrit mit Hilfe von NADH zu NO reduzieren konnten. Die Inhibitor-Wirkung lässt darauf schließen, dass in Wurzelmitochondrien beide terminalen Oxidasen and der NO-Bildung beteiligt sind, und dass selbst in NR-haltigen Wurzeln ein großer Teil der Reduktion von Nitrit zu NO durch die Mitochondrien bewerkstelligt wird, und weniger durch NR selbst. Die Unterschiedliche Fähigkeit von Blatt-und Wurzelmitochondrien zur anaeroben Nitrit:NO-Reduktion wurde nicht nur bei Tabak, sondern auch bei Arabidopsis, Gerste und Erbse gefunden. Sie scheint also eine generelle Eigenschaft höherer Pflanzen zu sein. Die Nitrit:NO Reduktion wurden auch direkt als Nitrit- bzw. NADH-Verbrauch gemessen. Die Reaktion war außerdem exklusiv mit der Membranfraktion der Mitochondrien assoziert, ohne jede Beteiligung von Matrixkomponenten. Es wurde auch geprüft, ob Wurzelmitochondrien und- gereinigte Membranen NO ausschließlich aus Nitrit produzierten, oder eventuell auch über eine NO-Synthase (NOS). Außerdem wurde untersucht, ob und in welchem Umfang die NO-Messungen durch eine NO-Oxidation verfälscht werden konnten. Zusätzlich zur Chemilumineszenz wurden Fluoreszenzmessungen mit Diaminofluoreszeinen (DAF) zum Vergleich herangezogen. In Luft produzierten Mitochondrien ja kein Nitrit-abhängiges NO, und eine NOS-Aktivität konnte weder durch direkte noch durch indirekte Chemilumineszenz nachgewiesen werden. Mit DAF-2 oder DAR-4M wurde jedoch eine L-Arginin-abhängige Fluoreszenzerhöhung beobachtet. Diese scheinbare NOS-Aktivität wurde mit kommerzieller iNOS verglichen und zeigte dabei sehr untypische Antworten auf NOS-Inhibitoren, Substrate und Kofaktoren. Sie wird deshalb als Artefakt beurteilt. Bei Verwendung von iNOS wurden ca. 2/3 des insgesamt produzierten NO zu (Nitrit+Nitrat) oxidiert. Mitochondrien scheinen NO zu verbrauchen, ohne jedoch die Oxidation von NO zu (Nitrit+Nitrat) zu erhöhen. Vermutlich wird dabei ein flüchtiges Intermediat gebildet (eventuell N2O3). In unserer Gruppe wurde kürzlich gezeigt, dass der pilzliche Elicitor Cryptogein eine hypersensitive Reaktion (HR) bei Tabak hervorrief, die völlig unabhängig von der Gegenwart oder Abwesenheit von NR war. Eine Schlussfolgerung daraus war, dass die NR-abhängige NO-Bildung für die HR keine Rolle spielte. Hier präsentieren wir Hinweise darauf, dass dieses Szenario Cryptogein-spezifisch sein könnte. Pseudomonas syringae pv phaseolicola wurde in Tabakblätter des Wildtyps und derNiR-defizienten, NO-überproduzierenden Mutante (clone 271) infiltriert, die entweder auf Ammonium oder auf Nitrat angezogen waren. Es wurde die Entwicklung der Läsionen, das Bakterienwachstum und die Zuckerkonzentrationen in den Blättern und im Blattapoplasten verfolgt. Die Läsionen-Entwicklung war positiv, und das Bakterienwachstum negativ korreliert mit der Nitrat-Ernährung und einer eventuellen NO-Produktion. Das Bakterienwachstum war positiv korreliert mit einer Ammonium-Ernährung und mit apoplastischen Zuckerkonzentrationen. Der Gesamtgehalt an freier + konjugierter Salicylsäure (SA) war durch bakterielle Infektion immer drastisch gesteigert, aber ohne klare Korrelation mit einer NO-Produktion. In Gegenwart von Cryptogein war das Wachstum von Pseudomonas fast völlig gehemmt. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass die vermutete gegenseitige Abhängigkeit von Bakterienwachstum, NO-Produktion und der HR sehr komplex ist und nicht auf einfache unifaktorielle Beziehungen reduziert werden kann. N2 - During the last few years an increasing number of physiological processes in plants have been shown to be regulated by NO. NO plays important roles in growth and development, plant disease resistance, abiotic stress, and in above and underground plant organs. In recent years several enzymatic pathways and few non-enzymatic pathways were proposed for nitric oxide production in plants. The major goal of this work was to quantify NO production by plants and especially by roots, and to identify the enzymes responsible for NO production. As a major method, NO production by roots was followed through on-line measurement of NO emission into the gas phase by chemiluminescence (= direct chemiluminescence), and also by indirect chemiluminescence where trace amounts of oxidized products like NO2- and NO3- can be easily measured. Plants used were tobacco wild-type (N. tabacum cv Xanthi or cv Gatersleben), NR-free mutants grown on ammonium in order to prevent NR induction, plants grown on tungstate to inhibit synthesis of functional MoCo-enzymes, and a NO-overproducing nitrite reductase (NiR)-deficient transformant as well as barley, rice and pea. Induction of a hypersensitive response (HR) in tobacco leaves was achieved by using avirulent Pseudomonas syringae pv phaseolicola. At oxygen concentrations of <1%, even completely nitrate reductase (NR)-free root tissues reduced added nitrite to NO, indicating that in roots, NR was not the only source for nitrite-dependent NO formation. By contrast, NR-free leaf slices were not able to reduce nitrite to NO. Root NO formation was blocked by inhibitors of mitochondrial electron transport (Myxothiazol and SHAM), whereas NO formation by NR containing leaf slices was insensitive to the inhibitors. Consistent with that, mitochondria purified from roots, but not those from leaves, reduced nitrite to NO at the expense of NADH. The inhibitor studies suggest that, in root mitochondria, both terminal oxidases participate in NO formation, and they also suggest that even in NR-containing roots, a large part of the reduction of nitrite to NO was catalysed by mitochondria, and less by NR. The differential capacity of root and leaf mitochondria to reduce nitrite to NO appears to be common among higher plants, since it was observed with Arabidopsis, barley, pea, and tobacco. Nitrite and NADH consumption by mitochondria were also measured. Anaerobic, nitrite-dependent NO emission was exclusively associated with the membrane fraction, without participation of matrix components. It was also examined whether root mitochondria and mitochondrial membranes produce nitric oxide (NO) exclusively by reduction of nitrite or also via a nitric oxide synthase (NOS),- and to what extent direct NO measurements could be falsified by NO oxidation. In addition to chemiluminescence, Diaminofluoresceins (DAF) were used as an NO indicators for comparison. In air, mitochondria apparently produced no nitrite-dependent NO, and no NOS activity was detected by direct or indirect chemiluminescence. In contrast, with DAF-2 and DAR-4M an L-arginine-dependent fluorescence increase took place. However, the response of this apparent NOS activity to inhibitors, substrates and cofactors was untypical when compared with commercial iNOS and is considered an artefact. With iNOS, about 2/3 of the NO were oxidized to (nitrite + nitrate). Mitochondria also appear to consume NO without increasing oxidation to (nitrite+ nitrate). We therefore assume formation of NO to a volatile intermediate (eventually N2O3). It was recently shown that the hypersensitive response (HR) of tobacco triggered by the fungal elicitor cryptogein occurred independent of the presence or absence of nitrate reductase (NR). One conclusion was that NR-dependent NO formation played no role in the HR. Here we present evidence that the described scenario may be specific for cryptogein. Pseudomonas syringae pv. phaseolicola was infiltrated into tobacco leaves from WT plant and from the NiR-deficient NO-overproducing clone 271, grown either on nitrate or ammonium. Lesion development as well as bacterial growth and sugar concentrations in leaves and in the leaf apoplast was monitored. Lesion development was positively and bacterial growth was negatively correlated with nitrate nutrition and eventually with NO formation. Bacterial growth was positively correlated with ammonium nutrition and apoplastic sugar concentrations. Total (free and conjugated) SA content were always drastically increased by bacterial infection, but there was no clear correlation with NO production. In the presence of cryptogein, Pseudomonas growth was drastically reduced. This shows that the assumed interdependence of bacterial growth, NO production and the HR is complex and not unifactorial. KW - Pflanzen KW - Nitric Oxide KW - Mitochondria KW - Nitrate Reductase KW - Nitric Oxide Synthase KW - Nitrite KW - Stickstoffoxide KW - Stickstoffoxidsynthase KW - Mitochondrium KW - Nitratreduktase Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25545 ER - TY - THES A1 - Kunz, Tobias C. T1 - Expansion Microscopy (ExM) as a tool to study organelles and intracellular pathogens T1 - Expansionsmikroskopie (ExM) als Tool zur Untersuchung von Organellen und intrazellulären Pathogenen N2 - The resolution of fluorescence light microscopy was long believed to be limited by the diffraction limit of light of around 200-250 nm described in 1873 by Ernst Abbe. Within the last decade, several approaches, such as structured illumination microscopy (SIM), stimulated emission depletion STED and (direct) stochastic optical reconstruction microscopy (d)STORM have been established to bypass the diffraction limit. However, such super-resolution techniques enabling a resolution <100 nm require specialized and expensive setups as well as expert knowledge in order to avoid artifacts. They are therefore limited to specialized laboratories. Recently, Boyden and colleagues introduced an alternate approach, termed expansion microscopy (ExM). The latter offers the possibility to perform superresolution microscopy on conventional confocal microscopes by embedding the sample into a swellable hydrogel that is isotropically expanded. Since its introduction in 2015, expansion microscopy has developed rapidly offering protocols for 4x, 10x and 20x expansion of proteins and RNA in cells, tissues and human clinical specimens. Mitochondria are double membrane-bound organelles and crucial to the cell by performing numerous tasks, from ATP production through oxidative phosphorylation, production of many important metabolites, cell signaling to the regulation of apoptosis. The inner mitochondrial membrane is strongly folded forming so-called cristae. Besides being the location of the oxidative phosphorylation and therefore energy conversion and ATP production, cristae have been of great interest because changes in morphology have been linked to a plethora of diseases from cancer, diabetes, neurodegenerative diseases, to aging and infection. However, cristae imaging remains challenging as the distance between two individual cristae is often below 100 nm. Within this work, we demonstrate that the mitochondrial creatine kinase MtCK linked to fluorescent protein GFP (MtCK-GFP) can be used as a cristae marker. Upon fourfold expansion, we illustrate that our novel marker enables visualization of cristae morphology and localization of mitochondrial proteins relative to cristae without the need for specialized setups. Furthermore, we show the applicability of expansion microscopy for several bacterial pathogens, such as Chlamydia trachomatis, Simkania negevensis, Neisseria gonorrhoeae and Staphylococcus aureus. Due to differences in bacterial cell walls, we reveal important aspects for the digestion of pathogens for isotropic expansion. We further show that expansion of the intracellular pathogens C. trachomatis and S. negevensis, enables the differentiation between the two distinct developmental forms, catabolic active reticulate bodies (RB) and infectious elementary bodies (EB), on a conventional confocal microscope. We demonstrate the possibility to precisely locate chlamydial effector proteins, such as CPAF or Cdu1, within and outside the chlamydial inclusion. Moreover, we show that expansion microscopy enables the investigation of bacteria, herein S. aureus, within LAMP1 and LC3-II vesicles. With the introduction of the unnatural α-NH2-ω-N3-C6-ceramide, we further present the first approach for the expansion of lipids that may also be suitable for far inaccessible molecule classes like carbohydrates. The efficient accumulation and high labeling density of our functionalized α-NH2-ω-N3-C6-ceramide in both cells and bacteria enables in combination with tenfold expansion nanoscale resolution (10-20 nm) of the interaction of proteins with the plasma membrane, membrane of organelles and bacteria. Ceramide is the central molecule of the sphingolipid metabolism, an important constituent of cellular membranes and regulates many important cellular processes such as differentiation, proliferation and apoptosis. Many studies report about the importance of sphingolipids during infection of various pathogens. While the transport of ceramide to Chlamydia has been reported earlier, one of the unanswered questions remaining was if ceramide forms parts of the outer or inner bacterial membrane. Expansion of α-NH2-ω-N3-C6-ceramide enabled the visualization of ceramide in the inner and outer membrane of C. trachomatis and their distance was determined to be 27.6 ± 7.7 nm. N2 - Aufgrund der Beugungseigenschaften des Lichtes wurde bereits 1873 durch Ernst Abbe für die Lichtmikroskopie eine theoretische Auflösungsgrenze von 200-250 nm definiert. Durch die Einführung verschiedener hochauflösender Mikroskopiemethoden, wie beispielsweise SIM-Mikroskopie (structured illumination microscopy), STED-Mikroskopie (stimulated emission depletion) und (d)STORM-Mikroskopie ((direct) stochastic optical reconstruction microscopy), konnte im letzten Jahrzehnt jedoch die Auflösung auf unter 100 nm verbessert werden. Allerdings benötigen solche Hochauflösungstechniken sowohl spezialisierte und kostenintensive Geräte als auch Expertenwissen zur Vermeidung von Artefakten, sodass diese nur in wenigen Laboren angewendet werden können. Ein alternativer Ansatz, die sogenannte Expansionsmikroskopie, wurde kürzlich von der Arbeitsgruppe um Ed Boyden etabliert. Hierbei wird eine Probe mit einem quellfähigen Gel vernetzt, welches daraufhin isotrop expandiert wird, sodass auch an konventionellen konfokalen Mikroskopen Hochauflösung ermöglicht wird. Seit ihrer Einführung im Jahre 2015 hat sich die Expansionsmikroskopie schnell entwickelt und bietet Protokolle für 4-fache, 10-fache oder sogar 20-fache Expansion von Proteinen als auch RNA in Zellen oder sogar komplexen Geweben. Mitochondrien besitzen zwei Membranen und sind für die Zelle von großer Bedeutung, da sie eine Vielzahl wichtiger Aufgaben übernehmen - von der ATP-Produktion durch die oxidative Phosphorylierung über die Produktion vieler wichtiger Metabolite bis hin zur Regulation zellulärer Signalwege. Die innere Mitochondrienmembran ist stark gefaltet und bildet Einstülpungen, die sogenannten Cristae, in welchen die oxidative Phosphorylierung und somit die Energieumwandlung und ATP-Synthese stattfindet. Morphologische Veränderungen der Cristae können sowohl beim Altern von Zellen, als auch bei verschiedenen Infektionen beobachtet werden und können darüber hinaus auch im Rahmen diverser Erkrankungen, wie beispielsweise Krebs, Diabetes oder neurodegenerativen Erkrankungen auftreten. Die Visualisierung der Cristae durch Fluoreszenzmikroskopie ist herausfordernd, da der Abstand zwischen einzelnen Cristae oftmals unter 100 nm beträgt. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass die Expression der mitochondrialen Kreatinkinase gekoppelt an das Fluoreszenzprotein GFP (MtCK-GFP) als Cristaemarker genutzt werden kann. In Kombination mit vierfacher Expansion ermöglicht unser Marker die Untersuchung morphologischer Veränderungen von Cristae, sowie die Lokalisierung mitochondrialer Proteine relativ zu den Cristae. Darüber hinaus wird im Rahmen dieser Arbeit die Anwendbarkeit der Expansionsmikroskopie für mehrere bakterielle Pathogene, und zwar Chlamydia trachomatis, Simkania negevensis, Neisseria gonorrhoeae und Staphylococcus aureus, gezeigt. Hierbei verdeutlichen wir wichtige Aspekte für den vollständigen Verdau unterschiedlicher bakterieller Zellwände und somit isotropen Expansion. Die Expansion der intrazellulären Pathogene C. trachomatis und S. negevensis ermöglichte es uns an konventionellen konfokalen Mikroskopen zwischen den zwei verschiedenen Entwicklungsstadien, der katabolisch aktiven Retikulärkörperchen (RBs) und der infektiösen Elementarkörperchen (EBs), zu unterscheiden. Außerdem konnte die Möglichkeit der präzisen Lokalisierung chlamydialer Proteine wie CPAF und Cdu1 innerhalb und außerhalb der chlamydialen Inklusion gezeigt werden und Bakterien, in diesem Fall S. aureus, in LAMP1 und LC3-II Vesikeln visualisiert werden. Mit der Einführung des unnatürlichen α-NH2-ω-N3-C6-Ceramides, präsentieren wir zudem ein erstes Konzept für die Expansion von Lipiden, welches möglicherweise auch für deutlich unzugänglichere Molekülklassen wie beispielsweise Kohlehydrate geeignet ist. Die effiziente Akkumulierung unseres funktionalisierten α-NH2-ω-N3-C6-Ceramides in Zellen sowie Bakterien ermöglicht in Kombination mit zehnfacher Expansion die Untersuchung der Interaktion von Proteinen mit der Zellmembran, Membranen von Organellen und Bakterien mit einer räumlichen Auflösung von 10-20 nm. Ceramid ist das zentrale Molekül des Sphingolipidstoffwechsels, ein wichtiger Baustein zellulärer Membrane und reguliert viele essentielle Prozesse wie die Zelldifferenzierung, die Proliferation als auch die Apoptose. Viele Studien berichten von der Bedeutung der Sphingolipide während der Infektion verschiedener Pathogene. So wurde beispielsweise zuvor berichtet, dass Ceramide aktiv zu Chlamydien transportiert und in deren Membranen eingebaut werden. Hierbei verblieb allerdings die Frage, ob Ceramide in der äußeren oder inneren bakteriellen Membran lokalisiert sind. Die Expansion unseres α-NH2-ω-N3-C6-Ceramides ermöglichte es uns Ceramide in der inneren und äußeren Membran von C. trachomatis zu visualisieren und den Abstand zwischen beiden Membranen auf 27.6 ± 7.7 nm zu bestimmen. KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Mitochondrium KW - Chlamydia trachomatis KW - Ceramide KW - Superresolution microscopy KW - Expansion microscopy KW - Mitochondria KW - Intracellular bacteria KW - Hochauflösungsmikroskopie KW - Expansionsmikroskopie KW - Mitochondrien KW - Intrazelluläre Bakterien Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-223330 ER - TY - JOUR A1 - Wagner, Fabienne A1 - Kunz, Tobias C. A1 - Chowdhury, Suvagata R. A1 - Thiede, Bernd A1 - Fraunholz, Martin A1 - Eger, Debora A1 - Kozjak-Pavlovic, Vera T1 - Armadillo repeat-containing protein 1 is a dual localization protein associated with mitochondrial intermembrane space bridging complex JF - PLoS ONE N2 - Cristae architecture is important for the function of mitochondria, the organelles that play the central role in many cellular processes. The mitochondrial contact site and cristae organizing system (MICOS) together with the sorting and assembly machinery (SAM) forms the mitochondrial intermembrane space bridging complex (MIB), a large protein complex present in mammalian mitochondria that partakes in the formation and maintenance of cristae. We report here a new subunit of the mammalian MICOS/MIB complex, an armadillo repeat-containing protein 1 (ArmC1). ArmC1 localizes both to cytosol and mitochondria, where it associates with the outer mitochondrial membrane through its carboxy-terminus. ArmC1 interacts with other constituents of the MICOS/MIB complex and its amounts are reduced upon MICOS/MIB complex depletion. Mitochondria lacking ArmC1 do not show defects in cristae structure, respiration or protein content, but appear fragmented and with reduced motility. ArmC1 represents therefore a peripheral MICOS/MIB component that appears to play a role in mitochondrial distribution in the cell. KW - Mitochondria KW - Outer membrane proteins KW - HeLa cells KW - Immunoprecipitation KW - Cytosol KW - Small interfering RNAs KW - Confocal microscopy KW - Cell stainin Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-202670 VL - 14 IS - 10 ER -