TY - THES A1 - Rosel, Eva Annemarie T1 - Die Rolle der endothelialen Stickstoff-Monoxid-Synthase (eNOS) in der Endothelaktivierung T1 - The role of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in endothelial activation N2 - Im Mittelpunkt der Arbeit stand die Rolle der endothelialen Stickstoff-Monoxid-Synthase (eNOS) für die Endothelaktivierung. Für diese Untersuchungen wurde die MLEC-Zellkulturtechnik (murine lung endothelial cells) und die Gegenüberstellung des Wiltyp- und eNOS-Knockout-Genotyps verwendet. Die MLEC-Kulturen wurden aus dem mikrovaskulären Stromgebiet der Lungen von C57Bl6-Wildtyp-Mäusen (WT) und von eNOS-Knockout-Mäusen (KO) angelegt und immunomagnetisch (Anti-CD102) zweifach selektioniert. Die Reinheit der Kulturen für Endothelzellen nach zwei Selektionen lag bei über 95%. WT-Endothelzellen produzieren eine basale Menge an Stickstoff-Monoxid (NO). Sie steigern ihre NO-Produktion nach Stimulation mit VEGF (vascular endothelium growth factor), mit dem Kalzium-Ionophor Ionomycin sowie unter Scherkraftexposition. Die eNOS-Proteinexpression erhöht sich dementsprechend nach 12 Stunden Scherkraftexposition. WT- und eNOS-KO-Endothelzellen unterscheiden sich unter basalen Bedingungen nicht in ihrer Oberflächenexpression der Adhäsionsmoleküle ICAM-1, E-Selektin, P-Selektin und VCAM-1. Nach Zytokin-Stimulation erhöhen beide Genotypen ihr Adhäsionsmolekülprofil in gleicher Weise. Sowohl WT- als auch eNOS-KO-Endothelzellen verfügen zudem über einen schnellen Mechanismus, der die Hochregulation der P-Selektin-Oberflächenexpression nach Stimulation mit Thrombin oder Menadion in gleicher Weise ermöglicht. Auf Stimulation mit Thrombin oder Menadion reagieren WT-Zellen mit einem signifikanten Anstieg der Produktion von freien Sauerstoff-Radikalen (ROS, rapid oxygen species). eNOS-KO-Zellen zeigen eine im Vergleich zum WT erhöhte basale ROS-Produktion. Diese lässt sich auch nach Stimulation nicht weiter steigern. Die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass die MLEC-Zellkulturtechnik ein verlässliches Modell für Untersuchungen an Gefäßendothelzellen darstellt. eNOS-KO-Zellen exprimieren nicht automatisch mehr Adhäsionsmoleküle an der Zelloberfläche als WT-Zellen. Allerdings ist die basale Produktion von ROS in eNOS-KO-Zellen vermehrt. Folglich ist in diesem Modell eNOS nicht für die konstitutive Suppression der endothelialen Aktivierung verantwortlich. Der NO-Effekt kann nicht in einer direkten und kontinuierlichen Unterdrückung der endothelialen Oberflächenaktivierung liegen. Das Fehlen von NO führt vielmehr zu einer Verschiebung des Gleichgewichts zwischen dem Radikalfänger NO und O2- (Superoxid) zugunsten von O2-. Aufgrund dieses Ungleichgewichts ist die basale ROS-Produktion von eNOS-KO-Zellen vermutlich erhöht. Damit wird die Endothelzelle empfindlicher gegenüber zusätzlichem oxidativen Stress. Die eNOS-KO-Zellen können die höhere ROS-Belastung in den durchgeführten Untersuchungen kompensieren. Es ist aber denkbar, dass bei zusätzlichem oxidativen Stress ein erhöhtes Maß an O2- das Startsignal für die Abläufe der endothelialen Aktivierung darstellt. N2 - The objective of this study was the role of the endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in endothelial activation. To do this we used MLEC cell cultures (murine lung endothelial cells) and the comparison between wildtype- and eNOS-knockout-genotype. MLECs were generated from microvascular lung tissue from C57Bl6-wildtype-mice (WT) and from eNOS-knockout-mice (KO) by immunomagnetic bead selection (anti-CD102). The endothelial cell cultures purity after twofold selection was > 95%. WT-endothelial cells produced a baseline amount of nitric oxide (NO). After stimulation with VEGF (vascular endothelium growth factor), with the calcium-ionophore ionomycin or after exposure to shear stress, WT-endothelial cells produced significantly higher amounts of NO. Simultaneously eNOS-protein expression was upregulated after 12 hours of shear stress exposure. Resting WT- and eNOS-KO-endothelial cells showed no difference in their surface expression of the adhesion molecules ICAM-1, E-Selektin, P-Selektin- and VCAM-1. Stimulation with cytokines led to an equally strong increase of the adhesion molecule expression in both genotypes. WT- as well as eNOS-KO-endothelial cells show a rapid mechanism to upregulate the surface expression of P-Selektin in a similar way after stimulation with thrombin or menadione. WT-endothelial cells showed a significant increase in the generation of rapid oxygen species (ROS) following stimulation with thrombin or menadione. The baseline level of ROS generation in eNOS-KO-endothelial cells is higher than in WT-cells and cannot even be increased upon stimulation. The results show that the MLEC-cell culture technique is a valid model for experimental research in vascular endothelial cells. eNOS-KO-cells do not automatically express a higher amount of adhesion molecules on their surface. However the baseline generation of ROS in eNOS-KO-cells is increased. Therefore eNOS is not responsible for the constitutive suppression of endothelial activation in this model. eNOS-derived NO is not required for the direct and continuous suppression of endothelial surface activation. The absence of NO leads to an imbalance between the scavenger NO and O2- (superoxide) in favour of O2-. It is probably because of this imbalance that the baseline ROS-generation in eNOS-KO-cells is increased. This causes endothelial cells to be more sensitive to oxidative stress. In our experiments the eNOS-KO-cells can compensate for the higher baseline ROS-level. It is however conceivable that an increased level of O2- as an additive oxidative stress may lead to starting signals for endothelial activation. KW - Stickstoffmonoxid KW - Stickstoffmonoxid-Synthase KW - Endothel KW - Zellkultur KW - Arteriosklerose KW - eNOS KW - eNOS-knockout KW - Endothelaktivierung KW - Mausmodell KW - endothelial nitric oxide synthase KW - eNOS-knockout KW - endothelial activation KW - nitric oxide KW - mouse model Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27824 ER - TY - THES A1 - Wycislo, Matthias T1 - Endotheliale Stickstoffmonoxidsynthase (NOS-III) reguliert die Proliferation neuraler Stammzellen im adulten Gyrus dentatus T1 - Endothelial nitric oxide synthase (NOS-III) regulates the proliferation of neural stem cells in the adult dentate gyrus N2 - Die Proliferation von in der Subgranulärzone des Gyrus dentatus ansässigen neuralen Stammzellen ist der erste Schritt der Neuentstehung von Nervenzellen im adulten Organismus, der so genannten adulten Neurogenese, die in bestimmten neurogenen Nischen des ZNS von Säugetieren und des Menschen vorkommt. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass das Enzym endotheliale Stickstoffmonoxidsynthase (NOS-III bzw. eNOS) bzw. durch NOS-III gebildetes Stickstoffmonoxid (NO) die Proliferation neuraler Stamm- bzw. Vorläuferzellen im Gyrus dentatus des Hippokampus positiv reguliert, da Mäuse, bei denen das Gen für dieses Enzym deletiert ist, über eine signifikant erniedrigte Stammzellproliferation verfügen. NOS-III-Knockout-Mäuse zeigen außerdem erhöhte Volumina von Substrukturen des Gyrus dentatus. Biometrische Faktoren, wie z. B. Alter, Geschlecht, Körpergewicht, Umgebungsbedingungen, hatten dagegen keinen signifikanten Einfluss auf die adulte Neurogenese. Die Abnahme der adulten Neurogenese bei NOS-III-Knockout-Tieren ist fast vollständig auf die Reduktion der Stammzellproliferation in der Subgranulärzone des Gyrus dentatus zurückzuführen. Ein Netto-Zuwachs an neu gebildeten Neuronen 4 Wochen nach Proliferation kann jedoch durch NOS-III nicht bewirkt werden, was auf eine komplexe Regulation der adulten Neurogenese hinweist. Die Stammzellproliferation im adulten murinen Gyrus dentatus wird jedoch vermutlich unter anderem über im Endothel gebildetes NO (als gasförmiges, parakrines Signalmolekül) vermittelt. N2 - The proliferation of neural stem cells residing in the subgranular layer of the dentate gyrus represents the first step in the formation of new neurons in the adult organism, the so-called adult neurogenesis that occurs in certain neurogenic niches of the mammalian as well as human CNS. The present work shows that endothelial nitric oxide synthase (NOS-III or eNOS) and nitric oxide (NO) formed by NOS-III, respectively, positively regulate the proliferation of neural stem- or precursor cells in the dentate gyrus of the hippocampus since NOS-III knockout mice (NOS III -/-) show significantly reduced stem cell proliferation. Moreover, NOS-III knockout mice exhibit increased volumina of dentate gyrus substructures. In contrast, biometric factors like age, gender, body mass and environmental conditions did not influence adult neurogenesis significantly. Mainly, the decrease of adult neurogenesis in NOS-III knockout animals is attributable to the reduction of stem cell proliferation in the subgranular zone of the dentate gyrus. However, a net increase of new neurons 4 weeks after proliferation cannot be produced by NOS-III pointing to a complex regulation of adult neurogenesis. Yet, stem cell proliferation in the murine dentate gyrus is presumambly mediated inter alia by NO as a gaseous, paracrine molecule produced in the endothelium. KW - Neurogenese KW - Stickstoffmonoxid KW - Stickstoffmonoxid-Synthase KW - Gyrus dentatus KW - Hippocampus KW - Adulte Neurogenese KW - adult neurogenesis KW - nitric oxide KW - nitric oxide synthase KW - dentate gyrus KW - hippocampus Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-30355 ER -