TY - THES A1 - Roos, Claudia T1 - Characterization of tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis (TWEAK)-induced signaling pathways T1 - Charakterisierung TWEAK induzierter Signalwege N2 - TWEAK ist ein typischer Vertreter der TNF Ligandenfamilie. TWEAK wird als Typ II Transmembranprotein exprimiert, kann jedoch durch proteolytische Prozessierung auch als lösliches Protein freigesetzt werden. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass oligomerisiertes TWEAK in Hinblick auf die Aktivierung des klassischen NFκB Signalweges deutlich aktiver ist als lösliches, trimeres TWEAK. Jedoch sind beide TWEAK-Varianten in der Lage, die Depletion von TRAF2 und die Prozessierung von p100, beides Kennzeichen für die Aktivierung des alternativen NFκB Signalweges, zu induzieren. Ebenso wie andere lösliche TNF-Liganden, die ihren entsprechenden Rezeptor nur schwach aktivieren, erlangt lösliches TWEAK durch Oligomerisierung vergleichbare Aktivität zum membrangebundenen Liganden. TRAF2 spielt eine Schlüsselrolle in der TWEAK-vermittelten NFκB Aktivierung. Durch Depletion oder Degradation von TRAF2 fällt die Entscheidung, ob lediglich der alternative oder beide, der klassische und der alternative NFκB Signalweg aktiviert werden. Die Blockade des TWEAK-Rezeptors Fn14 inhibiert die Aktivierung der NFκB Signalwege, ungeachtet welche Form von TWEAK zur Stimulation genutzt wird. Das weist darauf hin, dass die unterschiedlichen Aktivitäten der beiden TWEAK-Varianten in der Induktion des klassischen und alternativen NFκB Signalweges nicht durch die Nutzung verschiedener Rezeptoren verursacht sind. Damit wird in dieser Arbeit anhand von TWEAK zum ersten mal gezeigt, dass ein TNF Ligand in unterschiedlichen Varianten qualitativ unterschiedliche Aktivitäten des entsprechenden TNF Rezeptors auslöst. N2 - TWEAK is a typical member oft he TNF ligand family. Therefore it is initially expressed as a type II transmembrane protein, but a soluble variant can be released by proteolytic processing. In this work it is shown that oligomerized TWEAK is more competent than soluble, trimeric TWEAK regarding the activation of classical NFκB signaling pathway. However, both TWEAK variants are able to induce depletion of TRAF2 and processing of p100, which are hallmarks for the activation of the noncanonical NFκB pathway. Like other solube TNF ligands with no or poor activity on their corresponding receptor, TWEAK gains high activity upon oligomerization resembling the activity of the transmembrane ligand. TRAF2 has a key role in TWEAK-induced NFκB signaling. Depletion or degradation of TRAF2 is crucial for activation of the noncanonial or both, the classical and the noncanonical NFκB pathway. Blocking the TWEAK receptor Fn14 inhibits the activation of NFκB signaling, irrespective of the TWEAK form used for stimulation. This indicates that the different activities of the two TWEAK variants in activation of classical and noncanonical NFκB signaling are not caused by the use of different receptors. Therefore this study on TWEAK is the first reported case where one TNF ligand in different variants induces qualitatively different activities of the corresponding TNF receptor. KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Signaltransduktion KW - Fn14 KW - NFkappaB KW - p100 KW - TRAF2 KW - TWEAK KW - Fn14 KW - NFkappaB KW - p100 KW - TRAF2 KW - TWEAK Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-45295 ER - TY - THES A1 - Poppe, Heiko Anton T1 - Bestimmung der Substrat- und Inhibitorspezifität von Phosphodiesterasen mittels Mikrokaloriemetrie T1 - Phosphodiesterase activity and specificity measured using microcalorimetry N2 - Neben den cAMP- und cGMP-abhängigen Proteinkinasen (PKA bzw. PKG) sind als zyklonukleotid-regulierte Effektorproteine die Ionenkanäle CNG1-4, der "guanine nucleotide exhange factor“ Epac sowie die zyklonukleotid-spaltende Familie der Phosphodiesterasen (PDEs) von Bedeutung. Industriell synthetisierte cGMP- und cAMP-Analoga besitzen zwar meist eine hohe Affinität für ihr Zielprotein, über ihre Hydrolysestabilität gegenüber PDEs in der Zelle ist jedoch wenig bekannt. In dieser Arbeit wurden die kinetischen Konstanten von elf der am häufigsten genutzten cAMP-und cGMP-Analoga an verschiedenen Vertretern der PDE-Familien mittels Mikrokaloriemetrie bestimmt. Zudem konnte in den Messungen der inhibitorisch Effekt hydrolysestabiler Derivate auf die PDEs qualitativ und quantitativ ermittelt werden kann. Die Ergebnisse zeigen, dass Phosphodiesterasen in der Lage sind, auch chemisch modifizierte Analogsubstanzen der Cyclonukleotide cAMP und cGMP zu hydrolysieren. Hydrolysestabile Derivate dagegen entwickeln häufig inhibitorische Wirkung auf die PDEs und verursachen dadurch Veränderungen der intrazellulären cAMP und cGMP Konzentrationen. So vermag z. B. die Epac-spezifische Substanz Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS in den in vitro Experimenten die PDEs mit ki-Werten im einstelligen mikromolaren Bereich zu inhibieren. In mit Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS stimulierten Thrombozyten steigt als Folge dieser PDE-Hemmung die cGMP Konzentration in der Zelle an und man beobachtet eine als Folge eine PKG-vermittelte Phosphorylierung des Substratproteins VASP – eine unerwünschte Nebenreaktion. Die erhobenen Daten lassen außerdem Rückschlüsse auf den Inhibitionsmechanismus zu. Einige Analoga inhibieren die cGMP-bindenden GAF-Domänen in den PDEs 2A, 5A, 6cone und 10A sowie die PDE 4D3 nach dem linear-mixed-Typ und beeinflussen daher, neben der katalytischen Aktivität, vermutlich auch regulatorische Zentren dieser Enzyme. Zusammenfassend erleichtern die erhobenen Daten Wissenschaftlern die Auswahl des für ihre Fragestellung am besten geeigneten Derivates. N2 - cAMP and cGMP are critical second messengers that regulate multiple targets including different cAMP/cGMP-dependent protein kinases (PKA/PKGs), exchange proteins directly activated by cAMP (Epacs), phosphodiesterases (PDEs) and cyclic nucleotide-gated ion channels (CNGs). Second and third generation cyclic nucleotide analogs are widely used to elucidate specificity of cellular signaling, mediated by these target proteins. However, the selectivity and stability of these analogs need to be fully understood in order to properly interpret results and rigorously assess the mechanisms by which these analogs work in the cell. To better understand the selectivity and cross-reactivity of these analogs I measured the activation or inhibitory activity of 13 commonly-used cyclic nucleotide analogs 8 different PDEs. To measure their stability to hydrolysis I utilized isothermal microcalorimetry, a method that allows to evaluate whether or not an analog can function as a substrate or inhibitor for PDEs. I demonstrate that indeed some of these analogs can be hydrolyzed by multiple PDEs and others are competitive inhibitors. Herein I provide Ki data for all of the non-hydrolyzable analogs and Km and Vmax values for all of the hydrolyzable analogs. Each of these values, as well as their mode of inhibition can be determined in a single experiment. The data strongly implied that several of these analogs might, in addition to their primary effects, also cause elevation of cAMP or cGMP indirectly by inhibiting PDEs in the cell. Such an effect could of course cloud interpretation of the use of these analogs. Similarly, those that are PDE substrates also might have their duration of action substantially reduced. To illustrate this point we show that Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS, a highly specific non-hydrolyzable Epac activator in vitro, can under certain conditions enhance cGMP/PKG and cAMP/PKA signaling pathways in intact platelets. Specifically we found enhanced VASP phosphorylation at both PKA and PKG phosphorylation sites after the addition of Sp-8-pCPT-2’-O-Me-cAMPS. These data indicate that this “selective Epac activator” is able to indirectly activate the cAMP/PKA and cGMP/PKG signalling pathways presumably through inhibition of platelet PDE5 and/or PDE3. The data together allow to provide recommendations for how best to probe the different cyclic nucleotide signalling pathways using cyclic nucleotide analogs. In summary, the data provide evidence that most cAMP and cGMP analogs have multiple targets. Therefore, interpretation of any effects these analogs have in cells should take into consideration their possible cross-target reactivities. KW - Cyclisches Nucleotid Phosphodiesterase <3 KW - 5-> KW - Proteinkinase A KW - Hydrolyse KW - Mikrokalorimetrie KW - Cyclo-GMP KW - Cyclo-GMP-Derivate KW - Dissoziationskonstante KW - Enzymkinetik KW - Inhibition KW - Cyclo-AMP KW - Signaltransduktion KW - Thrombozyt KW - Immunoblot KW - Stickst KW - Proteinkinase G KW - Adenylatcyclase KW - Epac KW - Linear Mixed Inhibition KW - GAF Domaine KW - Proteinkinase G KW - Adenylylcyclase KW - Epac KW - Linear mixed inhibition KW - Gaf domaine Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34477 ER - TY - THES A1 - Nekhoroshkova, Elena T1 - A-RAF kinase functions in ARF6 regulated endocytic membrane traffic T1 - Die Rolle der A-RAF-Kinase in ARF6 reguliertem endocytotischem Membrantransport N2 - Extracellular signals are translated and amplified via cascades of serially switched protein kinases, MAP kinases (MAPKs). One of the MAP pathways, the classical RAS/RAF/MEK/ERK pathway, transduces signals from receptor tyrosine kinases and plays a central role in regulation of cell proliferation. RAF kinases (A-, B- and C-RAF) function atop of this cascade and convert signals emanating from conformational change of RAS GTPases into their kinase activity, which in turn phosphorylates their immediate substrate, MEK. Disregulated kinase activity of RAF can result in tumor formation, as documented for many types of cancer, predominantly melanomas and thyroid carcinomas (B-RAF). A-RAF is the least characterized RAF, possibly due to its low intrinsic kinase activity and comparatively mild phenotype of A-RAF knockout mice. Nevertheless, the unique phenotype of araf -/- mice, showed predominantly neurological abnormalities such as cerebellum disorders, suggesting that A-RAF participates in a specific process not complemented by activities of B- and CRAF. Here we describe the role of A-RAF in membrane trafficking and identify its function in a specific step of endocytosis. This work led to the discovery of a C-terminally truncated version of A-RAF, AR149 that strongly interfered with cell growth and polarization in yeast and with endocytosis and actin polymerization in mammalian cells. As this work was in progress two splicing isoforms of ARAF, termed DA-RAF1 and DA-RAF2 were described that act as natural inhibitors of RAS-ERK signaling during myogenic differentiation (Yokoyama et al., 2007). DA-RAF2 contains the first 153 aa of A-RAF and thus is nearly identical with AR149. AR149 localized specifically to the recycling endosomal compartments as confirmed by colocalization and coimmunoprecipitation with ARF6. Expression of AR149 interferes with recycling of endocytosed transferrin (Tfn) and with actin polymerization. The endocytic compartment, where internalized Tfn is trapped, was identified as ARF6- and RAB11- positive endocytic vesicles. We conclude that the inhibition of Tfn trafficking in the absence of A-RAF or under overexpression of AR149 occurs between tubular- and TGNassociated recycling endosomal compartments. siRNA-mediated depletion of endogenous A-RAF or inhibition of MEK by U0126 mimic the AR149 overexpression phenotype, supporting a role of ARAF regulated ERK signalling at endosomes that is controlled by AR149 and targets ARF6. Our data additionally suggest EFA6 as a partner of A-RAF during activation of ARF6. The novel findings on the A-RAF localization and the interaction with ARF6 have led to a new model of ARAF function were A-RAF via activation of ARF6 controls the recycling of endocytic vesicles.Endocytosis and rapid recycling of synaptic vesicles is critically important for the physiological function of neurons. The finding, that A-RAF regulates endocytic recycling open a new perspective for investigation of the role of A-RAF in the nervous system. N2 - Extrazelluläre Signale werden über eine Serie von nacheinander geschalteten Proteinkinasen, den MAP-Kinasen (MAPK) weitergeleitet und multipliziert. Einer der MAPK-Signalwege, der RAS/RAF/MEK/ERK-Signaltransduktionsweg, leitet Signale von Tyrosinkinaserezeptoren weiter und spielt eine zentralle Role in der Regulation der Zellproliferation. RAF Kinasen (A-, B-, und CRAF) stehen am Anfang der Kaskade. Sie wandeln die signalbedingte strukturellen Änderungen der RAS-GTPase in ihre Kinaseaktivität um und phosphorylieren ihr direktes Substrat, MEK. Eine Störung in der Regulation der Kinaseaktivität des RAF-Proteins kann zur Tumorbildung führen, wie es bei vielen Krebsarten, vor allem Melanom und Schilddrüsenkarzinom (B-RAF), dokumentiert ist. A-RAF ist die bislang am wenigsten charakterisierte RAF-Kinase, möglicherweise aufgrund sihrer nidrigen intrinsischen Kinaseaktivität. Weiterhin weist die A-RAF defficiente Maus einen relativ milden hauptsächlich neuronalen Phänotyp auf, der sich unter anderem auch in einer Fehlfunktion des Cerebellums manifestiert. Dieser einzigartige Phänotyp weist darauf hin, dass eine Reihe zellulärer Prozesse spezifisch durch A-RAF und nicht durch aktiveren B- und C-RAF vermittellt wird. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde die Rolle des A-RAF-Proteins im intrazellulären Membrantransport analysiert und eine spezifische A-RAF Funktion by endozytotischen Prozessen identifiziert. Diese Arbeit führte zur Entdeckung einer C-terminal verkürtzten Form von A-RAF, AR149, welche das Wachstum und die Polarisation von Hefezellen beeinträchtigt. In Säugetierzellen wirkt AR149 störend auf die Endozytose und die Aktinpolymerisation. Während des Entstehungsprozesses dieser Studie, wurden parallel zwei Spleißisoformen des A-RAF-Proteins, DARAF1 und 2, publiziert, die als natürliche Inhibitoren des RAS-RAF-MEK-ERK-Signalwegs in der myogenen Differenzierung agieren (Yokoyama et al., 2007). DA-RAF2 beinhaltet die ersten 153 Aminosäuren des A-RAF Proteines und ist damit fast identisch mit AR149. Eigene Kolokalisierungund Koimmunopräzipitationsexperimente mit ARF6 weisen darauf hin, dass AR149 spezifisch in ARF6-positiven Recycling-Endosomen lokalisiert ist. Expression des AR149 Proteins bechindert das Recycling von endozytiertem Transferrin und die Aktin Polimerisation. Die endosomalen Kompartimente in denen internalisiertes Transferrin gefangen vor liegt, konntenals ARF6- und RAB11-positive endozytotische Vesikeln characterisiert werden. Diese Ergebnisse lassen auf eine durch A-RAF Überexpression bzw. durch die Abwesenheit an A-RAF vermittelte Blokade des intrazellulären Transferrintransportes zwischen den tubulären- und Trans-Golgi-Netzwerk-assoziirten endosomalen Recycling-Kompartimenten schließen. Inhibierung der endogenen A-RAF-Expression durch siRNA oder Hemmung der MEK-Aktivität durch U0126 haben den selben Effekt wie AR149. Auf der Basis dieser Ergebnisse wird ein neues Modell für die Rolle der A-RAF regulierten ERK Signallwirkung auf Endosomen vorgestellt, bei dem das Zielprotein die ARF6 GTPase durch 3 AR149/DA-RAF2 negativ reguliert wird. Daruber hinaus deuten unsere Daten darauf hin, dass EFA6, ein GEF-Faktor von ARF6, als Kooperationspartner von A-RAF bei der ARF6-Aktivierung fungiert. Endocytose und das schnelle Recycling von synaptischen Vesikeln ist von besonderer Bedeutung für die Funktion von Neuronen. Aus dem Befund, dass A-RAF ein Regulator des endocytotischen Recyclings ist ergibt sich dacher eine neue Perspektieve für die Untersuchung der A-RAF Funktion im Nervensystem. KW - Raf-Kinasen KW - Endocytose KW - Onkologie KW - Signaltransduktion KW - Carcinogenese KW - ARF6 GTPase KW - Recycling- Endosomen KW - ERK KW - A-RAF KW - Signal-Übertragung KW - A-RAF KW - signal transduction KW - mitogen cascade KW - membrane trafficking KW - endocytic recycling Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-44566 ER - TY - THES A1 - Klenk, Johann Christoph T1 - Effekte von Parathormon auf die Struktur und Komplexierung des Parathormonrezeptors 1 T1 - Effects of parathyroid hormone on the structure and complexation of parathyroid hormone receptor 1 N2 - Der Parathormonrezeptor Typ 1 (PTHR) ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor der Gruppe 2 und wichtigster Regulator des Kalziumstoffwechsels. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine neuartige posttranslationale Modifikation des PTHR in Form einer proteolytischen Spaltung der Ektodomäne identifiziert, charakterisiert und deren Regulation beschrieben. Nach langanhaltender Stimulation des Rezeptors mit Agonisten – aber nicht mit Antagonisten – wurde eine Massen- und Mengenzunahme des Rezeptorproteins beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass der Rezeptor unter basalen Bedingungen einer Spaltung unterliegt. Der Massenunterschied entsteht durch die proteolytische Spaltung der Ektodomäne des PTHR, was nachfolgend die Stabilität des Rezeptors beeinträchtigt. Die Spaltung erfolgte innerhalb einer unstrukturierten Schleife der Ektodomäne, welche die Bereiche für die Ligandenbindung miteinander verbindet. Hierbei handelt es sich um eine Region, die im Vergleich zu anderen Gruppe 2-Rezeptoren spezifisch für den PTHR ist. Das durch die Spaltung entstandene N-terminale Fragment bleibt durch eine Disulfidbrücke mit dem Transmembranteil des Rezeptors verbunden. Durch Versuche mit verschiedenen Proteaseinhibitoren konnte die verantwortliche Protease der Familie der zinkabhängigen extrazellulären Proteasen zugeordnet werden. Diese Ergebnisse beschreiben einen Mechanismus wie die Homoöstase des PTHR reguliert sein könnte. In einem zweiten Abschnitt wurde die Interaktion der Adapterproteine NHERF1 und beta-Arrestin2 mit dem PTHR untersucht. Beide Proteine interagierten unabhängig mit dem Rezeptor, wobei NHERF1 über eine PDZ-Domäne konstitutiv an den C-Terminus des Rezeptors bindet. beta-Arrestin2 hingegen bindet nach Aktivierung des Rezeptors und führt zur Desensitisierung des Rezeptors. Mittels biochemischer und mikroskopischer Methoden konnte gezeigt werden, dass beide Proteine gemeinsam einen ternären Komplex mit dem PTHR bilden, welcher durch die direkte Interaktion zwischen NHERF1 und beta-Arrestin2 vermittelt wird. Dies hat zur Folge, dass beta-Arrestin im basalen Zustand durch NHERF1 an den Rezeptor gekoppelt wird. Durch Analyse der Assoziationskinetik mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Messungen zeigte sich, dass diese Kopplung zu einer zweifach erhöhten Rekrutierungsgeschwindigkeit von beta-Arrestin2 an den PTHR führt. Somit stellt unterstützt NHERF1 die beta-Arrestin2-vermittelte Desensitisierung des PTHR. N2 - The Parathyroid hormone receptor type 1 (PTHR) belongs to the class 2 of G-protein coupled receptors (GPCRs) and is the main regulator of calcium homeostasis of the body. The first part of the dissertation describes a novel mechanism of receptor regulation based on a proteolytic cleavage of the receptor’s extracellular domain. Prolonged stimulation with PTH led to an apparent increase in molecular mass and in stability of the PTHR. Biochemical analysis of the receptor protein revealed that the PTHR undergoes posttranslational cleavage. Agonistic but not antagonistic PTH-peptides prevented this cleavage, thereby stabilizing the molecular mass and also increasing the half life of the receptor. The cleavage was shown to occur within an unstructured stretch of the extracellular domain of the receptor, which connects two parts required for ligand binding and which is unique in the PTHR amongst all class 2 GPCRs. The cleaved N-terminal fragment was further connected by a disulfide bridge and could only be released by reducing agents. By testing a panel of different protease inhibitors, a protease belonging to the family of zinc-dependent metalloproteases could be identified to be responsible for the PTHR cleavage. Thus, these findings describe a new mechanism how PTHR homeostasis may be regulated. In the second part, the interaction between the adaptor proteins NHERF1 and beta-arrestin2 with the PTHR was assessed. Both proteins interacted independently with the receptor. While NHERF1 formed a constitutive interaction with the PTHR C-terminus, beta-arrestin2-binding required activation of the receptor. Using biochemical and microscopic methods it was shown that both proteins formed a ternary complex with the receptor. This complex was mediated by a direct interaction between NHERF1 and beta-arrestin2 which has been identified in this work. As a consequence, NHERF1 leads to a coupling of beta-arrestin2 close to the PTHR. Association kinetics of beta-arrestin2 with the PTHR measured by fluorescent resonance energy transfer were two-fold increased in the presence of NHERF, suggesting that the ternary complex facilitates the desensitization of the PTHR by beta-arrestin2. KW - Parathormon KW - Proteolyse KW - Endokrinologie KW - Calcium KW - Rezeptor KW - Retinales S-Antigen KW - GPCR KW - Matrix-Metalloprotease KW - NHERF KW - Signaltransduktion KW - G-Protein KW - GPCR KW - Matrix-Metalloproteinase KW - NHERF KW - signal transduction KW - G-protein Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47288 ER - TY - THES A1 - Hyun, Tae Kyung T1 - Function and regulation of plant Mitogen-Activated Protein Kinases in metabolic and stress signaling pathways T1 - Funktion und Regulation von pflanzlichen Mitogen-aktivierten Proteinkinasen in metabolischen und Stress Signalwegen N2 - In Pflanzenzellen ist die Aktivierung von Mitogen-aktivierten Protein (MAP) Kinasen eine allgemeine Reaktion zur abwehrvermittelten Signaltransduktion. Da die nachgeschalteten Prozesse der Aktivierung der MAP Kinasen in Pflanzen weitestgehend unbekannt sind,wurde die Rolle der MAP Kinasen in Abhängigkeit von stressvermittelnden Stimuli auf die Abwehrmechanismen und den primären Kohlenhydratmetabolismus in Tomate untersucht. Dabei wurde die Beziehung zwischen MAP Kinasen (LpMPK2 und LPMPK3) und der extrazellulären Invertase Lin6, welche ein Schlüsselenzym der apoplastischen Phloementladung darstellt, analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass die mRNAs von LpMPK3 und Lin6 sequenziell durch dieselben stressvermittelnden Stimuli (E-Fol, PGA,Verwundung, KCl) induziert werden. Die Induktion des Lin6 Promotors, erkennbar durch eine erhöhte β-Glucuronidase Aktivität 2 Stunden nach Behandlung der Reporterlinien mit Stimuli, war abhängig von der Expression und Aktivierung der LpMPK3. Die vorliegenden Daten zeigen, dass die Induktion von der extrazellulären Invertase Lin6 durch stressvermittelnde Stimuli LpMPK3 bedarf. Die Behandlung mit Glukose zeigte eine gleichzeitige Induktion der AtMPK4 und AtMPK6 Aktivität, welche durch Anionen-Austausch-Chromatographie separiert und mit Hilfe von spezifischen MAP Kinase Antikörpern nachgewiesen werden konnten. Zusammengefasst lassen diese Daten vermuten, dass die Aktivierung der MAP Kinasen eine zentrale Rolle in der Zucker vermittelten Signalübertragung spielt. Die Bewegung der Stomata wird durch umweltbedingte Einflüsse wie ichtintensität, Luftfeuchtigkeit und CO2-Konzentration kontrolliert. In Arabidopsis wird die Entwicklung und Strukturierung durch eine komplette MAP Kinasen Signalkaskade reguliert. Hingegen ist in höheren Pflanzen wenig über die CO2 induzierte Signalübertragung bei der Bewegung der Stomata bekannt. Experimente zeigten, dass hohe CO2 Konzentrationen eine schnelle und kurzzeitige Aktivierung von SIPK und NtMPK4 bewirken. Die Aktivierung der beiden MAP Kinasen könnte bei hoher CO2 Konzentration die Aktivierung eines Anionenkanals zur Stomata Bewegunng regulieren. Während in einer Vielzahl von Studien die antioxidativen Eigenschaften von Tocopherolen im Hinblick auf die Regulierung der Stresstoleranz beschrieben ist, sind die nicht-antioxidativen Eigenschaften von Tocopherolen in höheren Pflanzen bis heute nur wenig aufgeklärt. Daher wurde in Tabak die Funktion von α-Tocopherol auf die Stimuli-induzierte und MAP Kinasevermittelte Signalübertragung analysiert. Es wurde gezeigt, dass die Aktivierung der MAP Kinase durch die Behandlung mit einem pilzlichen Elizitor und dem Derivat α-Tocopherol- Phosphat induziert wird. Bei der Behandlung mit α-Tocopherol trat dieser Effekt nicht auf. Interessanterweise wurde bei α-Tocopherol im Gegensatz zu Ascorbinsäure ein kurzzeitiger inhibitorischer Effekt auf die Aktivierung der Stimuli-induzierten MAP Kinasen in BY2 Zellen und Tabakpflanzen beobachtet. Der Inhibitor-Aktivitäts-Test ließ vermuten, dass die Applikation indirekt die Aktivität von MAP Kinasen beeinflussen könnte. Diese Ergebnisse deuten auf eine negative Regulierung von α-Tocopherol auf die Stimuli-induzierte Signalübertragung durch Inaktivierung der MAP kinasen hin. Purin-Analoga sind aufgrund ihrer strukturellen Selektivität als spezifische Proteinkinase- Inhibitoren in Mammalia beschrieben. In dieser Arbeit wurden C2, N6, N9 –trisubstituierte Purine getestet, um grundlegende Beziehungen zwischen chemischer Struktur und inhibitorischen Effekten auf pflanzliche MAP Kinasen zu untersuchen. Die Modifikation der Substitution in der Position C2 und N9 bedingte eine erhöhte inhibitorische Aktivität von 6- (Benzylamino)-Purin Analoga. Daneben lassen die 6-(iso-Pentenylamino)-Purin Analoga vermuten, dass die Addition einer Methylgruppe an der N9 Position verglichen mit der Addition einer Isopropyl-Gruppe eine um das zweifache erhöhte inhibitorische Aktivität bewirkt. Zusammengefasst zeigen die Studien, dass die Selektivität und Wirksamkeit der Inhibitioren durch die Modifikation der chemischen Struktur verbessert wird. Desweiteren wurde die physiologische Funktion von AtPDP1 (Arabidopsis thaliana PLAT domain protein 1) auf die Regulation der Abwehrsignalübertragung, hervorgerufen durch biotsche und abiotische Faktoren, charakterisiert. Interessanterweise bewirkte die Überexpression von AtPDP1 eine erhöhte Empfindlichkeit gegen virulente Pathogene und nekrotrophe Pilze. Zudem begünstigte es die Bildung von Nekrosen aufgrund von unbekannten biotischen Faktoren. Dagegen zeigten diese überexprimierenden Linien während erhöhtem Salzstress eine signifikante Verzögerung der Seneszenz und eine höhere Quantenausbeute des PS II im Vergleich zu den Kontrollpflanzen. Die Ergebnisse weisen sehr deutlich auf eine positive Regulation von AtPDP1 auf die Salztoleranz und erhöhte Empfindlichkeit gegenüber biotischem Stress hin. Daher wird angenommen, dass AtPDP1 durch komplexe Signalwege und Wechselwirkungen während der Stressadaptation reguliert wird. N2 - Activation of mitogen-activated protein (MAP) kinases is a common reaction of plant cells in defense-related signal transduction pathways. Since the downstream events after the activation of MAP kinases are largely unknown in plants, the role of MAP kinases in the co-ordinate regulation of defense reactions and primary carbon metabolism by stress related stimuli has been analyzed in tomato. Thus, the relationship between mitogen activated protein kinases (LpMPK2 and LpMPK3) and extracellular invertases Lin6, as the key enzyme of an apoplasmic phloem unloading pathway, has been analyzed. The results showed that the mRNAs of LpMPK3 and Lin6 are sequentially induced by the same set of stress related stimuli (E-Fol, PGA,wounding, and KCl). The induction of the Lin6 promotor, as revealed by an increase in β-glucuronidase activity after 2 hours, was dependent both on the expression and activation of LpMPK3. These data suggest that the induction of extracellular invertase Lin6 by stress related stimuli requires LpMPK3. Glucose, metabolic molecule, was shown to result in the simultaneous induction of AtMPK4 and AtMPK6 activities that could be separated by anion-exchange chromatography, and characterized by differential cross-reaction with MAP kinase antibodies. Taken together, these data suggest that the activation of MAP inases play central roles in the regulation of sugar signaling. Stomatal movement is controlled by environmental signals including light intensity,humidity and atmospheric CO2 level. In Arabidopsis, a complete MAP kinase signaling cascade regulates stomatal development and patterning. However, the movement of stomata mediated by CO2 induced signaling pathways is not fully studied in higher plants. Here, we show that elevated levels of CO2 induce rapid and transient activation of SIPK and NtMPK4. The activation of both MAP kinases may regulate the anion channel activation for stomatal movement by the elevated level CO2. Up to now, the non-antioxidant function of tocopherol is not clear in higher plant,whereas the ability of tocopherol to modulate the stress tolerance mediated by function of antioxidant has been described in numerous studies. Thus, the function of α-tocopherol in stimuli-induced signal transduction pathways mediated by MAP kinase has been analyzed in tobacco. It has been shown that the activation of MAP kinase was induced by treatment of fungal elicitor and α-tocopherol phosphate but not α-tocopherol. Interestingly, α-tocopherol showed the transient inhibitory effect on the activation of stimuli-induced MAP Kinases in BY2 cells and tobacco plants, whereas ascorbate did not inhibit the activation of MAP kinases. The inhibitory activity test indicated that current application may indirectly affect the activity of MAP kinases. These results suggest that α-tocopherol can negatively regulate stimuliinduced signal transduction pathways via inactivation of MAP kinases. The purine-analogues have been tested and reported to be specific inhibitors of protein kinases mediated by structural-based selectivity in mammalian. Here, we tested C2, N6, N9-trisubstituted purines to determine basic relationship between their chemical structure and inhibitory activity using a particular plant MAP kinase. The modification of substitution in position C2 and N9 caused the increased inhibitory activity of 6-(benzylamino) purine analogue. In addition, 6-(isopentenylamino) purine analogues suggested that addition of a methyl group to position N9 caused at least 2-fold increased inhibitory activity compared with the addition of isopropyl group.Taken together, our study suggests that the selectivity and potency of inhibitors can be improved by structure modification. In addition, we have characterized the physiological function of Arabidopsis thaliana PLAT domain protein 1 (AtPDP1) in modulating the interaction of defense pathways mediated by biotic and abiotic factors. Interestingly, overexpression of AtPDP1 resulted in increasing susceptibility of virulent pathogens and necrotrophic fungus, and developing necrosis induced by unknown biotic factors. However, these overexperssion lines showed the significantly delayed senescence and higher level of phosystem II quantum yield compared with control plants against high salt stress. Our results strongly indicate that AtPDP1 positively regulate with salt tolerance, and enhances the sensitivity to biotic stresses. We propose that the AtPDP1 might be regulated with the complex pathways of interplay among various signaling during stress adaptation. KW - Signaltransduktion KW - (Signal transduction pathways) Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34978 ER - TY - THES A1 - Hintzen, Christoph T1 - Molekulare Mechanismen der Oncostatin M-vermittelten Signaltransduktion und deren Bedeutung in der Entzündung sowie der antiviralen Immunabwehr N2 - Die Dissertation beschäftigt sich mit der Oncostatin M-vermittelten Signaltransduktion und dessen Bedeutung für den entzündlichen Verlauf einer Rheumatoiden Arthritis, die immunmodulatorischen Fähigkeiten von Tumoren sowie die antivirale Immunantwort. KW - Entzündung KW - Signaltransduktion KW - Cytokine KW - Rheumatoide Arthritis Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36018 ER - TY - THES A1 - Donat, Stefanie T1 - Molekulare und funktionelle Charakterisierung der Serin/Threonin-Proteinkinase PknB und -Phosphatase Stp in Staphylococcus aureus T1 - Molecular and functional charaterization of the ser/thr kinase PknB and phosphatase Stp of Staphylococcus aureus N2 - Um Änderungen in seiner Umwelt wahrnehmen zu können, benötigt S. aureus unterschiedliche Signaltransduktionssysteme. In dieser Arbeit wurde erstmals die Eukaryoten-ähnliche Serin/Threonin-Proteinkinase (STPK) PknB umfassend charakterisiert. Die posttranslationale Proteinmodifikation mittels Phosphorylierung spielt sowohl in Eukaryoten als auch in Prokaryoten eine wichtige Rolle. Man glaubte lange, dass die Phosphorylierung von Serin-, Threonin- und Tyrosinresten ein nur auf Eukaryoten beschränkter Regulationsmechanismus ist. Dagegen wurde die Phosphorylierung an Histidin- und Aspartatresten durch die Zweikomponenten-Systeme allein den Prokaryoten zugeordnet. Die Genomanalysen der letzten Jahre identifizierten jedoch STPKs und Serin/Threonin-Proteinphosphatasen (STPP) in nahezu allen prokaryotischen Genomen. Auch S. aureus codiert für eine STPK, die eine hohe Homologie zu den beschriebenen STPKs aufweist. In dieser Arbeit wurden mittels Microarray-Analyse einer ΔpknB-Mutante im Stamm 8325 erste Hinweise zur Funktion von PknB als Regulator der Zellwandsynthese sowie zentraler Stoffwechselwege gewonnen. Es wurden mittels Phosphopreoteom-Analysen in vivo-Substrate identifiziert und weiterhin die Kinase biochemisch charakterisiert. N2 - S. aureus needs effective signal transduction systems to be able to sense a changing environment. In this work we characterize for the first time the regulatory ser/thr protein kinase PknB. The posttranslational protein modification via phosphorylation plays an important role in eukaryotes as well as in prokaryotes. The phosphorylation of proteins on serine, threonine, and tyrosine residues was originally thought to be a mechanism of signal sensing and translation only restricted to eukaryotes. In contrast, prokaryotes were thought to achieve signal transduction exclusively via the phosphorylation of histidine and aspartate residues by using two-component systems. However, recent bacterial genome sequencing identified STPKs and STPPs in almost all bacterial genomes. S. aureus also encodes a STPK, which shows high similarity to the described STPKs. In this study the putative function of PknB as a regulator of cell wall-synthesis as well as central metabolic pathways was analysed by a competitive microarray approach. Furthermore, a phosphoproteome analysis was used to identify in vivo substrates and a biochemical characterization was performed. KW - Staphylococcus aureus KW - Kinase KW - Signaltransduktion KW - staphylococcus aureus KW - ser/thr kinase KW - signaltransduction Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-41893 ER - TY - THES A1 - Böhme, Linda T1 - Cellular response to double-stranded RNA in Chlamydia trachomatis-infected human host cells T1 - Zelluläre Antwort auf doppelsträngige RNA in Chlamydia trachomatis-infizierten humanen Wirtszellen N2 - Chlamydien sind Gram-negative, obligat-intrazelluläre Bakterien, die für ein weites Spektrum an relevanten Krankheiten verantwortlich sind. Auf Grund ihres zweiphasigen Entwicklungszyklusses sind Chlamydien von einer intakten Wirtszelle abhängig, um sich erfolgreich vermehren und im Organismus ausbreiten zu können. Daher haben Chlamydien anspruchsvolle Strategien entwickelt, um das Immunsystem des Wirtes auszuschalten oder den programmierten Zelltod ihrer Wirtszelle zu verhindern. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob eine Infektion mit C. trachomatis einen Einfluss auf die zelluläre Antwort auf dsRNA nehmen kann. Die Synthese von dsRNA ist ein charakteristisches Merkmal der Replikation von Viren, welche sowohl die Apoptose induzieren als auch das Immunsystem aktivieren kann. Um eine chlamydiale und virale Co-Infektion zu simulieren, wurden Chlamydien-infizierte Epithelzellen mit der synthetischen dsRNA Polyinosin-Polycytidinsäure (polyI:C) transfiziert. Im ersten Teil der Arbeit wurde untersucht, ob Chlamydien die durch dsRNA eingeleitete Apoptose verhindern können. Eine signifikante Reduktion der dsRNA-induzierten Apoptose konnte in infizierten Zellen beobachtet werden. Es zeigte sich, dass die Prozessierung der Initiator-Caspase-8 in infizierten Zellen unterblieb. Dies war von der frühen bakteriellen Proteinsynthese abhängig und für die dsRNA-vermittelte Apoptose spezifisch, da der durch TNFalpha bewirkte Zelltod nicht auf der Ebene der Caspase-8 verhindert werden konnte. Die Aktivierung von zellulären Faktoren, die bei der Apoptoseinduzierung eine wichtige Rolle spielen, beispielsweise PKR und RNase L, war in infizierten Zellen jedoch unverändert. Stattdessen konnte durch RNA Interferenz-vermittelte Depletion gezeigt werden, dass der zelluläre Caspase-8-Inhibitor cFlip eine entscheidende Rolle bei der chlamydialen Blockierung der dsRNA-vermittelten Apoptose spielt. Mittels Co-Immunopräzipitation konnte ein erster Hinweis darauf gefunden werden, dass C. trachomatis eine Anreicherung von cFlip im dsRNA-induzierten Komplex von Caspase-8 und FADD bewirkt. Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht, ob Chlamydien die Immunantwort auf virale Infektionen beeinflussen, welche vor allem die Expression von Interferonen und Interleukinen beinhaltet. Es stellte sich heraus, dass die Aktivierung des Interferon regulatory factor 3 (IRF-3) und des zur Familie von NF-kappaB Trankriptionsfaktoren gehörenden p65, zwei zentralen Regulatoren der Immunantwort auf dsRNA, in infizierten Epithelzellen verändert war. Die Degradation von IkappaB-alpha, des Inhibitors von NF-kappaB, war in infizierten Zellen beschleunigt, begleitet von einer Veränderung der Translokation des Transkriptionsfaktors in den Zellkern. Im Gegensatz dazu wurde die nukleäre Translokation von IRF-3 durch die Infektion signifikant verhindert. Die hier vorgestellten Daten zeigen erstmals, dass eine Infektion mit C. trachomatis die zelluläre Antwort auf dsRNA signifikant verändern kann und implizieren einen Einfluss von chlamydialen Infektionen auf den Ausgang von viralen Superinfektionen. N2 - Chlamydia are Gram-negative obligate intracellular bacteria responsible for a wide spectrum of relevant diseases. Due to their biphasic developmental cycle Chlamydia depend on an intact host cell for replication and establishment of an acute infection. Chlamydia have therefore evolved sophisticated strategies to inhibit programmed cell death (PCD) induced by a variety of stimuli and to subvert the host immune system. This work aimed at elucidating whether an infection with C. trachomatis can influence the cellular response to double-stranded RNA (dsRNA). The synthesis of dsRNA is a prominent feature of viral replication inside infected cells that can induce both PCD and the activation of a cellular innate immune response. In order to mimic chlamydial and viral co-infections, Chlamydia-infected cells were transfected with polyinosinic:polycytidylic acid (polyI:C), a synthetic dsRNA. In the first part of this work it was investigated whether C. trachomatis-infected host cells could resist apoptosis induced by polyI:C. A significant reduction in apoptosis, determined by PARP cleavage and DNA fragmentation, could be observed in infected cells. It could be shown that processing of the initiator caspase-8 was inhibited in infected host cells. This process was dependent on early bacterial protein synthesis and was specific for dsRNA because apoptosis induced by TNFalpha was not blocked at the level of caspase-8. Interestingly, the activation of cellular factors involved in apoptosis induction by dsRNA, most importantly PKR and RNase L, was not abrogated in infected cells. Instead, RNA interference experiments revealed the crucial role of cFlip, a cellular caspase-8 inhibitor, for chlamydial inhibition of dsRNA-induced apoptosis. First data acquired by co-immunoprecipitation experiments pointed to an infection-induced concentration of cFlip in the dsRNA-induced death complex of caspase-8 and FADD. In the second part of this work, the chlamydial influence on the first line of defense against viral infections, involving expression of interferons and interleukins, was examined. Activation of the interferon regulatory factor 3 (IRF-3) and the NF-kappaB transcription factor family member p65, both central regulators of the innate immune response to dsRNA, was altered in Chlamydia-infected epithelial cells. polyI:C-induced degradation of IkappaB-alpha, the inhibitor of NF-kappaB, was accelerated in infected cells which was accompanied by a change in nuclear translocation of the transcription factor. Translocation of IRF-3, in contrast, was significantly blocked upon infection. Together the data presented here demonstrate that infection with C. trachomatis can drastically alter the cellular response to dsRNA and imply an impact of chlamydial infections on the outcome of viral super-infections. KW - Chlamydia trachomatis KW - Signaltransduktion KW - Immunreaktion KW - Doppelhelix KW - RNS KW - Apoptosis KW - Apoptose KW - doppelsträngige RNA KW - Immunantwort KW - Apoptosis KW - Chlamydia trachomatis KW - double-stranded RNA KW - innate immunity KW - signal transduction Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46474 ER - TY - THES A1 - Baljuls, Angela T1 - Differences and Similarities in the Regulation of RAF Isoforms: Identification of Novel A-RAF Phosphorylation Sites T1 - Unterschiede und Ähnlichkeiten in der Regulierung der RAF Isoformen : Identifizierung der neuen A-RAF Phosphorylierungsstellen N2 - In mammals, the RAF family of serine/threonine kinases consists of three members, A-, B- and C-RAF. Activation of RAF kinases involves a complex series of phosphorylations. Although the most prominent phosphorylation sites of B- and C-RAF are well characterized, little is known about regulatory phosphorylation of A-RAF. Using mass spectrometry, we identified here a number of novel in vivo phosphorylation sites in A-RAF. The physiological role and the function of these sites were investigated subsequently by amino acid exchange at the relevant positions. In particular, we found that S432 participates in MEK binding and is indispensable for A-RAF signaling. On the other hand, phosphorylation within the activation segment does not contribute to epidermal growth factor-mediated activation. Regarding regulation of A-RAF activity by 14-3-3 proteins, we show that A-RAF activity is regulated differentially by its C-terminal and internal 14-3-3 binding domain. Furthermore, by use of SPR technique, we found that 14-3-3 proteins associate with RAF in an isoform-specific manner. Of importance, we identified a novel regulatory domain in A-RAF (referred to as IH-segment) positioned between amino acids 248 and 267, which contains seven putative phosphorylation sites. Three of these sites, serines 257, 262 and 264, regulate A-RAF activation in a stimulatory manner. The spatial model of the A-RAF fragment including residues between S246 and E277 revealed a “switch of charge” at the molecular surface of the IH-region upon phosphorylation, suggesting a mechanism in which the high accumulation of negative charges may lead to an electrostatic destabilization of protein/membrane interaction resulting in depletion of A-RAF from the plasma membrane. Activation of B- and C-RAF is regulated by phosphorylation at conserved residues within the negative-charge regulatory region (N-region). Identification of phosphopeptides covering the sequence of the N-region led to the conclusion that, similar to B- and C-RAF, kinase activity of A-RAF is regulated by phosphorylation of the N-region. Abrogation of A-RAF activity by S299A substitution and elevated activity of the A-RAF-Y301D-Y302D mutant confirmed this conclusion. In addition, we studied the role of the non-conserved residues within the N-region in the activation process of RAF kinases. The non-conserved amino acids in positions –3 and +1 relative to the highly conserved S299 in A-RAF and S338 in C-RAF have so far not been considered as regulatory residues. Here, we demonstrate that Y296R substitution in A-RAF led to a constitutively active kinase. In contrast, G300S substitution (mimicking B- and C-RAF) acts in an inhibitory manner. These data were confirmed by analogous mutations in C-RAF. Based on the three-dimensional structure of the catalytic domain of B-RAF, a tight interaction between the N-region residue S339 and the catalytic domain residue R398 was identified in C-RAF and proposed to inhibit the kinase activity of RAF proteins. Furthermore, Y296 in A-RAF favors a spatial orientation of the N-region segment, which enables a tighter contact to the catalytic domain, whereas a glutamine residue at this position in C-RAF abrogates this interaction. Considering this observation, we suggest that Y296, which is unique for A-RAF, is a major determinant of the low activating potency of this RAF isoform. Finally, the residues R359 in A-RAF and R398 in C-RAF, which interact with the N-region, are also involved in binding of phosphatidic acid. Substitution of this conserved arginine by alanine resulted in accumulation of hyper-phosphorylated form of RAF, suggesting that this residue play a crucial role in phosphorylation-mediated feedback regulation of A- and C-RAF. Collectively, we provide here for the first time a detailed analysis of in vivo A-RAF phosphorylation status and demonstrate that regulation of A-RAF by phosphorylation exhibits unique features compared with B- and C-RAF. N2 - Die Protein-Familie der Serin/Threonin-spezifischen RAF-Kinasen umfasst in Säugetieren drei Mitglieder, A-, B- und C-RAF. Bei der Aktivierung dieser Kinasen spielen Phosphorylierungs-ereignisse eine entscheidende Rolle. Im Gegensatz zu B- und C-RAF, deren Phosphorylierungsstellen ausgiebig charakterisiert sind, blieb die Phosphorylierung von A-RAF weitgehend unerforscht. In der vorliegenden Arbeit wurden unter Verwendung der massenspektrometrischen Analyse zahlreiche neue in vivo A-RAF-Phosphorylierungsstellen identifiziert. Die physiologische Relevanz und die Funktion dieser Stellen wurden anschließend durch Aminosäurenaustausch an den relevanten Positionen untersucht. Dabei wurde festgestellt, dass S432 in der A-RAF-Bindung zu MEK involviert und für die Signalweiterleitung unverzichtbar ist. Hingegen ist die EGF-bedingte A-RAF-Aktivierung nicht von der Phosphorylierung innerhalb des Aktivierungssegments abhängig. Hinsichtlich der Regulation von A-RAF-Aktivierung durch 14-3-3-Proteine, wurde hier gezeigt, dass die katalytische Aktivität von A-RAF durch die C-terminale und die interne 14-3-3-Bindungsdomänen unterschiedlich reguliert wird. Weiterhin wurde mittels SPR-Verfahren festgestellt, dass die Interaktion von 14-3-3-Proteinen mit RAF-Kinasen einen isoformspezifischen Charakter trägt. Von entscheidender Bedeutung war die Entdeckung einer neuen regulatorischen Domäne (hier als IH-Segment bezeichnet), die in der A-RAF-Sequenz die Aminosäuren 248 bis 267 umfasst und sieben A-RAF-spezifische Phosphorylierungsstellen enthält. Drei dieser Stellen, S257, S262 und S264, erwiesen sich als positive Regulatoren der A-RAF-Aktivierung. Das räumliche Modell dieses A-RAF-Fragments deckte eine „Ladungsumkehr“ an der molekularen Oberfläche der IH-Region infolge der Phosphorylierung auf. Dieser Befund begründete den Vorschlag eines Regulations-mechanismus, in dem die starke Akkumulierung der negativen Ladungen zu einer elektrostatischen Destabilisierung der Protein-Membran-Interaktion führt, was die Verdrängung der A-RAF-Kinase von der Plasma-Membran zur Folge haben könnte. Die Aktivierung von B- und C-RAF wird durch Phosphorylierung der sogenannten „negativ geladenen“ Region (N-Region) reguliert. Die Identifizierung mehrerer Phosphopeptide aus der N-Region von A-RAF veranlasste die Schlussfolgerung, dass die A-RAF-Aktivität ebenfalls durch die Phosphorylierung innerhalb dieser Region gesteuert werden könnte. In der Tat, die Aufhebung der A-RAF-Aktivität durch die S299A-Substitution und die erhöhte Aktivität der A-RAF-Y301D-Y302D-Mutante bestätigen diese Aussage. Darüberhinaus wurde die Rolle der nichtkonservierten Aminosäuren an den Positionen –3 und +1 relativ zum S299 in A-RAF und S338 in C-RAF im Aktivierungsprozess der RAF-Kinasen untersucht, nachdem diese ursprünglich nicht als regulatorische Stellen erkannt wurden. Es wird hier demonstriert, dass Y296R-Substitution der A-RAF-Kinase eine konstitutive Aktivität verleiht. Hingegen wirkte die G300S-Substitution, die von B- und C-RAF abgeleitet wurde, inhibitorisch. Diese Befunde wurden durch die analogen Mutationen in C-RAF bestätigt. Basierend auf der dreidimensionalen Struktur der katalytischen Domäne von B-RAF wurde eine Interaktion zwischen der N-Region und der katalytischen Domäne in A- und C-RAF festgestellt, die zu einer Inhibierung der Aktivität führen soll. Darüberhinaus wurde gezeigt, dass die räumliche Ausrichtung von Y296 in der N-Region von A-RAF einen engen Kontakt mit der katalytischen Domäne ermöglicht; dagegen hebt Glutamin in dieser Position die Interaktion auf. In Anbetracht dieser Befunde wurde vorschlagen, dass das A-RAF-spezifische Y296 das niedrige Aktivierungs-potential dieser RAF-Isoform determiniert. In diesem Zusammenhang wurde auch gefunden, dass die Aminosäuren R359 in A-RAF und R398 in C-RAF eine duale Funktion besitzen, indem sie sowohl mit der N-Region als auch mit Lipiden in Wechselwirkung treten können. Substitution dieser konservierten Arginine durch Alanin führte zur Akkumulierung der hyperphosphorylierten Formen der RAF-Kinasen, was die Schlussfolgerung erlaubt, dass diese Reste eine wichtige Rolle in der ERK-vermittelten Feedback-Regulation von A- und C-RAF spielen. Insgesamt wird hier zum ersten Mal eine detaillierte Analyse der in vivo A-RAF-Phosphorylierung geliefert und gezeigt, dass die phosphorylierungsvermittelte Regulation von A-RAF einzigartige Merkmale innerhalb der Familie von RAF-Kinasen aufweist. KW - Raf KW - Phosphorylierung KW - Signaltransduktion KW - RAF kinases KW - phosphorylation KW - signal trunsduction Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36135 ER -