TY  - JOUR
A1  - Piselli, Claudio
A1  - Benz, Roland
T1  - Fosmidomycin transport through the phosphate‐specific porins OprO and OprP of Pseudomonas aeruginosa
JF  - Molecular Microbiology
N2  - The Gram‐negative bacterium Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen, responsible for many hospital‐acquired infections. The bacterium is quite resistant toward many antibiotics, in particular because of the fine‐tuned permeability of its outer membrane (OM). General diffusion outer membrane pores are quite rare in this organism. Instead, its OM contains many substrate‐specific porins. Their expression is varying according to growth conditions and virulence. Phosphate limitations, as well as pathogenicity factors, result in the induction of the two mono‐ and polyphosphate‐specific porins, OprP and OprO, respectively, together with an inner membrane uptake mechanism and a periplasmic binding protein. These outer membrane channels could serve as outer membrane pathways for the uptake of phosphonates. Among them are not only herbicides, but also potent antibiotics, such as fosfomycin and fosmidomycin. In this study, we investigated the interaction between OprP and OprO and fosmidomycin in detail. We could demonstrate that fosmidomycin is able to bind to the phosphate‐specific binding site inside the two porins. The inhibition of chloride conductance of OprP and OprO by fosmidomycin is considerably less than that of phosphate or diphosphate, but it can be measured in titration experiments of chloride conductance and also in single‐channel experiments. The results suggest that fosmidomycin transport across the OM of P. aeruginosa occurs through OprP and OprO. Our data with the ones already known in the literature show that phosphonic acid‐containing antibiotics are in general good candidates to treat the infections of P. aeruginosa at the very beginning through a favorable OM transport system.
KW  - fosmidomycin
KW  - lipid bilayer membrane
KW  - OprO
KW  - OprP
KW  - porin
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-238905
VL  - 116
IS  - 1
SP  - 97
EP  - 108
ER  - 
TY  - JOUR
A1  - Abdali, Narges
A1  - Younas, Farhan
A1  - Mafakheri, Samaneh
A1  - Pothula, Karunakar R.
A1  - Kleinekathöfer, Ulrich
A1  - Tauch, Andreas
A1  - Benz, Roland
T1  - Identification and characterization of smallest pore-forming protein in the cell wall of pathogenic Corynebacterium urealyticum DSM 7109
JF  - BMC Biochemistry
N2  - Background: Corynebacterium urealyticum, a pathogenic, multidrug resistant member of the mycolata, is known as causative agent of urinary tract infections although it is a bacterium of the skin flora. This pathogenic bacterium shares with the mycolata the property of having an unusual cell envelope composition and architecture, typical for the genus Corynebacterium. The cell wall of members of the mycolata contains channel-forming proteins for the uptake of solutes. Results: In this study, we provide novel information on the identification and characterization of a pore-forming protein in the cell wall of C. urealyticum DSM 7109. Detergent extracts of whole C. urealyticum cultures formed in lipid bilayer membranes slightly cation-selective pores with a single-channel conductance of 1.75 nS in 1 M KCl. Experiments with different salts and non-electrolytes suggested that the cell wall pore of C. urealyticum is wide and water-filled and has a diameter of about 1.8 nm. Molecular modelling and dynamics has been performed to obtain a model of the pore. For the search of the gene coding for the cell wall pore of C. urealyticum we looked in the known genome of C. urealyticum for a similar chromosomal localization of the porin gene to known porH and porA genes of other Corynebacterium strains. Three genes are located between the genes coding for GroEL2 and polyphosphate kinase (PKK2). Two of the genes (cur_1714 and cur_1715) were expressed in different constructs in C. glutamicum Delta porA Delta porH and in porin-deficient BL21 DE3 Omp8 E. coli strains. The results suggested that the gene cur_1714 codes alone for the cell wall channel. The cell wall porin of C. urealyticum termed PorACur was purified to homogeneity using different biochemical methods and had an apparent molecular mass of about 4 kDa on tricine-containing sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Conclusions: Biophysical characterization of the purified protein (PorACur) suggested indeed that cur_1714 is the gene coding for the pore-forming protein in C. urealyticum because the protein formed in lipid bilayer experiments the same pores as the detergent extract of whole cells. The study is the first report of a cell wall channel in the pathogenic C. urealyticum.
KW  - cell wall channel
KW  - mycolic acid
KW  - porin
KW  - Corynebacterium urealyticum
KW  - lipid bilayer membrane
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-226959
VL  - 19
ER  - 
TY  - THES
A1  - Thein, Marcus
T1  - Porins of Lyme Disease and Relapsing Fever Spirochetes
T1  - Porine aus Lyme-Borreliose- und Rückfallfieber- Spirochäten
N2  - Die Gattung Borrelia gehört zur Abteilung der Spirochäten, einem alten Zweig der Bakteriendomäne, der nur entfernt mit Gram-negativen Bakterien verwandt ist. Sämtliche Arten dieser Gattung sind obligate Parasiten. Borrelien können in die Erreger zweier humaner Krankheiten eingeteilt werden: die Lyme-Borreliose und das Rückfallfieber. Borrelien besitzen mit 0.91 Mb ein sehr kleines Chromosom und sind daher in ihren metabolischen Fähigkeiten eingeschränkt. Folglich ist das Überleben sämtlicher Borrelienarten absolut abhängig von Nährstoffen, die von ihren Wirten bereitgestellt werden. Der Transport dieser Nährstoffe und anderer Moleküle über die äußere Membran wird durch porenformende Proteine, so genannte Porine ermöglicht. Porine sind wassergefüllte Kanäle, die in zwei Klassen unterteilt werden können: allgemeine Diffusionsporen und substratspezifische Porine. Aus dem Lyme-Borreliose Erreger Borrelia burgdorferi wurden bisher drei mutmaßliche Porine charakterisiert und beschrieben: P13, Oms28 und P66. Demgegenüber sind die Kenntnisse über Porine in Rückfallfieberarten rudimentär und es wurde bisher noch kein einziges Porin für Vertreter dieser Krankheit identifiziert. Unter Berücksichtigung dieses Hintergrunds war die allgemeine Zielsetzung dieser Arbeit, einen Einblick in die Porinzusammensetzung von sowohl Lyme Borreliose- als auch Rückfallfieber-Spirochäten zu erlangen. Dieses Ziel konnte erreicht werden, indem Porine aus den Außenmembranen von Borrelien isoliert und identifiziert wurden und anschließend biophysikalisch in künstlichen Lipidmembranen charakterisiert wurden. Ein Kapitel dieser Arbeit beschreibt die Identifizierung und Charakterisierung des ersten Porins aus Rückfallfiebererregern. Das porenformende Protein wurde aus den Außenmembranen von Borrelia duttonii, Borrelia hermsii und Borrelia recurrentis isoliert und Oms38 genannt, für „outer membrane-spanning protein of 38 kDa“. Die biophysikalische Charakterisierung mit der „black lipid bilayer“ Methode zeigte, dass Oms38 kleine, wassergefüllte Kanäle mit einer Einzelkanalleitfähigkeit von 80 pS in 1 M KCl bildet. Diese Kanäle sind nicht spannungsabhängig und leicht selektiv für Anionen mit einem Permeabilitätsverhältnis von Kationen zu Anionen von 0,41 in KCl. Ein homologes Protein zu Oms38 wurde in den Lyme Borreliose Erregern Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii und Borrelia afzelii identifiziert. Das porenformende Protein dieser Arten weist eine hohe Sequenzhomologie zu Oms38 auf und zeigt ähnliche biophysikalische Eigenschaften, das heißt es formt Poren von 50 pS in 1 M KCl. Durch Titrationsexperimente konnte gezeigt werden, dass die Pore teilweise durch Dicarboxylate blockiert werden kann. Eine Auswertung dieser Versuche legte nahe, dass dieses Protein keine allgemeine Diffusionspore darstellt, sondern einen Kanal mit einer spezifischen Bindestelle für diese Komponenten. Daher wurde dieses Porin DipA genannt, was für „dicarboxylate-specific porin A“ steht. In einer anderen Versuchsreihe wurde gezeigt, dass das Porin P66 sowohl in Lyme Borreliose Erregern als auch in Rückfallfieberarten vorhanden ist. Hierfür wurden die Außenmembranen der Lyme Borreliose Erreger Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii und Borrelia garinii und der Rückfallfieberarten Borrelia duttonii, Borrelia recurrentis und Borrelia hermsii genauer untersucht. Mit Ausnahme des P66 Homologs von Borrelia hermsii rekonstituierten P66 Proteine aus allen Arten sehr aktiv in künstliche Membranen und formten Poren zwischen 9 und 11 nS in 1 M KCl. Die biophysikalischen Eigenschaften der Homologe wurden in Experimenten mit „black lipid bilayer“ Membranen ausführlich verglichen. Des Weiteren wurden Porendurchmesser und Konstitution des Borrelia burgdorferi Porins P66 genau untersucht. Hierfür wurde die P66 Einzelkanalleitfähigkeit in Anwesenheit von verschiedenen Nichtelektrolyten in künstlichen Lipidmembranen analysiert. Der effektive Durchmesser des P66 Wasserlumens wurde auf ~1.9 nm bestimmt. Darüber hinaus konnte P66 mit bestimmten Nichtelektrolyten wie PEG 400, PEG 600 und Maltohexaose blockiert werden. Weitere Blockierungsexperimente auf Einzelkanalebene deckten sieben Unterzustände von P66 auf, die auf ein P66 Heptamer schließen ließen. Dieser heptamere Charakter konnte durch Blue native PAGE Analysen bestätigt werden. Zusammenfassend beschreibt diese Dissertation detaillierte biochemische und biophysikalische Untersuchungen von Porinen aus sowohl Lyme Borreliose- als auch Rückfallfieber-Borrelien. Erkenntnisse aus dieser Arbeit bringen das Verstehen der Nährstoffaufnahme über Außenmembranen dieser streng wirtsabhängigen, pathogenen Spirochäten einen großen Schritt vorwärts. Ein fundiertes Wissen über oberflächenexponierte Proteine wie Porine ist Vorraussetzung für die Herstellung erfolgreicher Impfstoffe und Therapeutika gegen die von Borrelien verursachten Krankheiten.
N2  - The genus Borrelia belongs to the spirochete phylum, an ancient evolutionary branch of the domain bacteria that is only afar related to Gram-negative bacteria. Borreliae can be subdivided into the agents of the two borrelian-caused human diseases, Lyme disease and relapsing fever. Both disease patterns are closely related to the peculiar biology of Borrelia species and exhibit a wide spectrum of diverse clinical manifestations. Due to the small 0.91 Mb chromosome, borreliae have a lack of biosynthetic capacity. Thus, all Borrelia species are highly dependent on nutrients provided by their hosts. The transport of nutrients and other molecules across the outer membrane is enabled by pore-forming proteins, so-called porins. Porins are water-filled channels and can be subdivided into two different classes, general diffusion pores and substrate-specific porins. In terms of the Lyme disease agent Borrelia burgdorferi, three putative porins were characterized in previous studies: P13, Oms28 and P66. In contrast to Lyme disease species, the porin knowledge of relapsing fever Borrelia is low, which means that not any porin has actually been described for representatives of these agents. Thus, the general aim of this thesis was to provide insight into the porin content of both, Lyme disease and relapsing fever spirochetes. This aim could be achieved by isolating and identifying porins from Borrelia outer membranes and by biophysically characterizing them in artificial lipid membranes. In one chapter of this study, the first identification and characterization of a relapsing fever porin is presented. The pore-forming protein was isolated from outer membranes of Borrelia duttonii, Borrelia hermsii and Borrelia recurrentis and designated Oms38, for “outer membrane-spanning protein of 38 kDa”. Biophysical characterization of Oms38 was achieved by using the black lipid bilayer method and demonstrated that Oms38 forms small, water-filled channels with a single-channel conductance of 80 pS in 1 M KCl. The Oms38 channel did not exhibit voltage-dependent closure and is slightly selective for anions with a permeability ratio of cations over anions of 0.41 in KCl. Subsequently, a protein homologous to Oms38 was identified in the Lyme disease agents Borrelia burgdorferi, Borrelia garinii and Borrelia afzelii. The pore-forming protein of these species exhibits high sequence homology to Oms38 and similar biophysical properties, i.e. it forms pores of 50 pS in 1 M KCl. Interestingly, titration experiments revealed that this pore could be partly blocked by dicarboxylic anions, which means that this protein does not form a general diffusion pore but a channel with a binding-site specific for those compounds. Consequently, this porin was termed DipA, for “dicarboxylate-specific porin A”. In another set of experiments, it was shown that the porin P66 is present in both Lyme disease and relapsing fever species. Therefor, the outer membranes of the Lyme disease species Borrelia burgdorferi, Borrelia afzelii, Borrelia garinii and the relapsing fever species Borrelia duttonii, Borrelia recurrentis and Borrelia hermsii were closer investigated. Except of the P66 homologue of Borrelia hermsii P66 of all species was highly active in artificial lipid membranes, forming pores with huge single-channel conductances between 9 and 11 nS in 1 M KCl. Moreover, the channel diameter and the constitution of Borrelia burgdorferi P66 were investigated in detail. Therefor, the P66 single-channel conductance in the presence of different nonelectrolytes with known hydrodynamic radii was analyzed in black lipid bilayers. The effective diameter of the P66 channel lumen was determined to be ~1.9 nm. Furthermore, as derived from multi-channel experiments the P66-induced membrane conductance could be blocked by certain nonelectrolytes, such as PEG 400, PEG 600 and maltohexaose. Additional blocking experiments on the single-channel level revealed seven subconducting states and indicated a heptameric constitution of the P66 channel. This indication could be confirmed by Blue native PAGE analysis which demonstrated that P66 units form a complex with a corresponding mass of approximately 440 kDa. Taking together, this thesis describes detailed biochemical and biophysical investigations of both Lyme disease and relapsing fever Borrelia porins and represents an important step forward in understanding the outer membrane pathways for nutrient uptake of these strictly host-dependent, pathogenic spirochetes. Furthermore, it provides some knowledge of the outer-membrane protein composition of Borrelia spirochetes. A profound knowledge of surface-exposed proteins, such as porins, is one precondition for the production of a successful vaccine and the drug design against the two borrelian-caused diseases.
KW  - Porin
KW  - Membranproteine
KW  - Borrelia
KW  - Lyme-Borreliose
KW  - Rückfallfieber
KW  - Spirochäten
KW  - porin
KW  - membrane protein
KW  - Borrelia
KW  - Lyme disease
KW  - relapsing fever
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35158
ER  - 
TY  - THES
A1  - Barth, Enrico
T1  - Study of the properties of channel-forming proteins of the cell walls of different Corynebacteriae
T1  - Untersuchung der Eigenschaften kanalbildender Proteine aus den Zellwänden verschiedener Corynebacteriae
N2  - Die Gattung Corynebacterium gehört, neben Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus und weiteren nahverwandten Gattungen, dem unverwechselbaren, gattungsübergreifenden Taxon Mycolata an. Viele Spezies aus dieser heterogenen Gruppe Mycolsäure-haltiger Actinomyceten sind entweder aufgrund ihrer medizinischen oder ihrer biotechnologischen Bedeutung bekannt. Beispielsweise zählen Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Corynebacterium diphtheriae und Nocardia farcinica, welche weltweit Verursacher besonders gefährlicher bakterieller Infektionskrankheiten sind, zu dieser ungewöhnlichen Gruppe Gram-positiver Bakterien. Ebenso bedeutsam sind einige apathogene Mycolata-Arten, die industrielle Anwendung finden. Corynebacterium glutamicum und Corynebacterium efficiens sind leistungsfähige Bakterien, die zum Beispiel in der Produktion des Geschmacksverstärkers Glutamat und des Tierfuttermittelzusatzes Lysin eingesetzt werden, während verschiedene Rhodococcus Spezies Anwendung bei der Herstellung von Acrylsäuren finden. Die Zellwand der Mycolata zeigt, verglichen mit der klassischer Gram-positiver Bakterien, eine außergewöhnliche Zusammensetzung und Struktur auf. Abgesehen von einem Arabinogalactan-Peptidoglycan-Komplex enthält die Zellwand der meisten Actinomyceten einen hohen Anteil an Mycolsäuren. Diese langkettigen, verzweigten Fettsäuren formen eine, mit der äußeren Membran Gram-negativer Bakterien vergleichbare, stark undurchlässige, hydrophobe äußere Hülle, welche die Grundlage der außergewöhnlichen Medikamentenresistenz bei den Mycolata bildet. Wie die äußere Membran Gram-negativer Bakterien enthält die Zellwand der Mycolata porenformende Proteine, die den Durchlass hydrophiler Substanzen gestatten. Indem sie eine Verbindung zwischen dem Zellinneren und der Umwelt, in der das Bakterium lebt, schaffen und einen kontrollierten Austausch zwischen beiden ermöglichen, tragen die Kanalproteine entscheidend zur Funktion der bakteriellen Zellhülle bei. Das Ziel dieser Arbeit war das Wissen über Zellwandkanäle in Corynebakterien zu erweitern. Deshalb untersuchten wir PorA und PorH Proteine, die basierend auf früheren Studien Zellwandkanälen in C. glutamicum, C. efficiens und Corynebacterium callunae zugeordnet werden, um ungeklärten Fragen nachzugehen und um Wissen über deren Struktur zu erlangen. Ferner inspizierten wir Zellwände pathogener Corynebakterien, genauer gesagt von Corynebacterium diphtheriae und Corynebacterium jeikeium, um herauszufinden, ob diese Spezies wie ihre harmlosen Verwandten Kanalproteine besitzen. In dieser Arbeit wiesen wir mit C. diphtheriae und C. jeikeium in zwei weiteren Corynebacterium-Arten offene, mit Wasser gefüllte Zellwandkanäle nach. Des Weiteren stellten wir fest, dass sich die Zellwandkanäle von C. glutamicum, C. efficiens und C. diphtheriae aus zwei Proteinen zusammensetzen, einem zugehörig zu der Gruppe der PorH Proteine und einem weiteren aus der Gruppe der PorA Proteine. Diese heteromere Struktur von Zellwandkanälen bei Corynebakterien stellt ein Novum für Zellwandkanäle bei den Mycolata dar. Indessen besteht der Zellwandkanal von C. jeikeium aus nur einem Protein, CjPorA, angeordnet zu einem Oligomer. Obgleich das Molekulargewicht dieses Proteins (4 kDa) mit dem von PorH und PorA Proteinen vergleichbar ist (5-7 kDa), weißt seine Primärsequenz keine eindeutige Homologie zu diesen auf. Dennoch deutet vieles auf eine Verwandtschaft zwischen CjPorA und PorH/PorA Proteinen hin, da das Gen jk0268, welches für CjPorA kodiert, sich in einer Region des C. jeikeium Chromosoms befindet, die der Genomregion entspricht in welcher die porH/porA Gene der anderen Corynebakterien lokalisiert sind. Dies lässt vermuten, dass jk0268 (welches für den homomeren Zellwandkanal in C. jeikeium kodiert) und die porH/porA Gene von C. glutamicum, C. efficiens und C. diphtheriae (die einen heteromeren Zellwandkanal kodieren) wahrscheinlich Nachkommen eines gemeinsamen Vorläufergens sind. Phylogenetische Analysen der Gattung Corynebacterium unterstützen diese Annahme. Desweitern legen sie nahe, dass die hier untersuchten Zellwandkanäle innerhalb dieser Gattung wahrscheinlich weit verbreitet sind. Ein umfassendes Wissen über Zellwandkanäle, denen beim Transport gelöster Stoffe über die äußere Membran in Corynebakterien und anderen Mitgliedern der Mycolata eine entscheidende Rolle zukommt, könnte von großem wirtschaftlichem und medizinischem Nutzen sein.
N2  - The genus Corynebacterium belongs, together with Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus and further closely related genera, to the distinctive suprageneric taxon mycolata. Many species within this diverse group of mycolic acid containing actinomycetes are known either because of their medical or biotechnological relevance. For instance, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Corynebacterium diphtheriae and Nocardia farcinica, causer of most dangerous bacterial infectious diseases world-wide, are among this exceptional group of Gram-positive bacteria. Likewise of importance are some harmless mycolata species which find use in industrial settings. Corynebacterium glutamicum and Corynebacterium efficiens are, e.g., potent producers of the flavour enhancer glutamate and the animal feed additive lysine, while several Rhodococcus species are applied in the production of acrylic acids. The cell wall of mycolata species, compared with that of Gram-positive bacteria, exhibits an unusual composition and organization. Besides an arabinogalactan-peptidoglycan complex, the cell walls of most actinomycetes contain large amounts of mycolic acids. Comparable to the outer membrane of Gram-negative bacteria, these long-chained branched fatty acids form a highly impermeable hydrophobic outer layer which provides the basis of the exceptional drug resistance of mycolata species. Like the outer membrane of Gram-negative bacteria, the cell wall of mycolata contains channel-forming proteins that allow the passage of hydrophilic solutes. By permitting and controlling the exchange and communication between the interior of the cell and the environment in which the bacterium lives, the channels play an important role for the function of the bacterial cell envelope. This thesis aimed to extend our knowledge about cell wall channels in corynebacteria. For this purpose, we examined PorA and PorH proteins that have been associated by previous studies with cell wall pores in C. glutamicum, C. efficiens and Corynebacterium callunae in order to resolve unanswered questions and to gain structural knowledge. We also investigated cell walls of pathogenic corynebacteria, in particular of Corynebacterium diphtheriae and Corynebacterium jeikeium, to investigate if these species possessed channels as is the case with their harmless relatives. In this work we provided evidence for the existence of large and water-filled cell wall channels in C. diphtheriae and C. jeikeium. Moreover, we demonstrated that the major cell wall channels of C. glutamicum, C. efficiens and C. diphtheriae consist of two distinctive polypeptides; one of whom belongs to the class of PorH proteins and the other to the class of PorA proteins. This heteromeric structure of channels of corynebacteria represents a novelty for channels of the mycolata. In contrast, the C. jeikeium channel is solely constituted by a single protein, CjPorA, arranged as an oligomer. Although the molecular mass of this protein (4kDa) is comparable to those of PorH and PorA proteins (5-7 kDa), it shares no distinctive homology in its primary sequence with them. However, there is evidence for relationship between CjPorA and PorH/PorA proteins because the gene jk0268, coding for CjPorA, is localized in a chromosomal region of C. jeikeium that corresponds to the genomic region containing the porH/porA genes in the other corynebacteria. This suggests that jk0268 (coding for the homomeric cell wall channel in C. jeikeium) and the porH/porA genes of C. glutamicum, C. efficiens and C. diphtheriae (coding for heteromeric cell wall channels) are presumably descendants of a common ancestor gene. This assumption gets support from data on phylogenetic analysis of the genus Corynebacterium. Moreover, these data suggest that the here investigated cell wall channels are presumably widespread within this genus. A profound knowledge of cell wall channels, building the main passage of solutes through the outer mycolate membrane in corynebacteria and other members of the mycolata, can be of great economical and medical value.
KW  - Zellwand
KW  - Corynebacterium
KW  - Corynebacterium callunae
KW  - Corynebacterium diphtheriae
KW  - Corynebacterium efficiens
KW  - Corynebacterium glutamicum
KW  - Porin
KW  - Corynebacterium jeikeium
KW  - C. jeikeium
KW  - C. glutamicum
KW  - C. efficiens
KW  - C. callunae
KW  - C. diphtheriae
KW  - Mykolsäuren
KW  - Lipid Bilayer Membran
KW  - Corynebacterium jeikeium
KW  - C. jeikeium
KW  - C. glutamicum
KW  - C. efficiens
KW  - C. callunae
KW  - C. diphtheriae
KW  - Mycolic acid
KW  - Lipid Bilayer Membrane
KW  - porin
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36325
ER  -