TY - THES A1 - Gjorgjevikj, Maja T1 - IL-4 analogues with site-specific chemical modification as screening tools for foldamers T1 - IL-4-Muteine mit ortsspezifische chemische Modifikation als Screening-Tools für Foldamere N2 - The cytokine Interleukin-4 (IL-4) plays a crucial role in the pathophysiology and progression of asthma and other atopic diseases. Its activities are signaled into the cells upon binding to and signaling through a shared receptor complex composed of the subunits IL-4Rα and common γc. Another cytokine, Interleukin-13 shares many functions with IL-4. This can be explained by the fact that both, IL-4 and IL-13, can signal via a shared receptor complex comprising the IL-4R and the IL-13R1 subunit. Therefore, the IL-4Rα receptor subunit has become a highly promising drug target, since it mediates IL-4 and IL-13 responses and blocking IL-4Rα will abrogate IL-4 as well as IL-13 effector functions. Currently, an IL-4 based mutein (Pitrakinra), acting as a dual IL-4/IL-13 receptor antagonist is in clinical development. This work describes the generation and production of biologically active IL-4 muteins, which contain a single additional engineered cysteine. The introduction of a free thiol group allows site-specific chemical modification. The muteins were expressed in E. coli in insoluble form, refolded and purified. The thiol group of the mutein was protected as mixed disulfide with the tripeptide glutathione. A first attempt to chemically reduce the engineered cysteine residue failed, because the three native disulfide bonds of IL-4 exhibit a similar reactivity and chemical reduction of the native disulfide resulted in full deactivation and precipitation of the IL-4 protein. Therefore, an enzymatic approach was developed which specifically reduces the mixed disulfide bonds with an attached glutathion moiety and thus leaves the native structurally essential disulfide bonds unaltered. For optimization, four different IL-4 cysteine muteins with four cysteine residues introduced at positions close to the IL-4Rα binding site were tested and their reduction rates by glutaredoxin was determined. The enzymatic reduction occured at different rates for all four muteins indicating that accessibility is an important influence and must be determined individually for each mutant protein. After optimization of the pH value and particularly the reaction time, all muteins could be prepared with the engineered thiol group being released in reasonable yield. The proteins exhibiting the free thiol group were then modified by N-ethylmaleimide (NEM) or maleimido-PEG. The effects of these modifications at different positions on binding to IL-4R were measured employing SPR biosensor technology. In the second project of this study, foldamers, which represent a new class of stable, compactly folded biomolecules and can specifically interact with proteins and nucleic acids, were examined to identify their potential as new drugs to interfere with IL-4 activities. Fragment-based drug discovery offers great promise for providing new starting points for drug discovery and facilitates the lead optimization. As foldamers equipped with a thiol-group for tethering could not to be produced; only the effect of foldamers present in a synthesized foldamer library on the binding to IL-4R could be tested. Two libraries containing different foldamers based on aromatic amide were synthesized by Michael Grotz and Dr. Michael Deligny and tested in our lab for their capability to disrupt the ligand-receptor interaction of IL-4 and its receptor IL-4Rα [ECD] using surface plasmon resonance technology. None of the studied foldamers could specifically inhibit the IL-4/IL-4Rα interaction. Some foldamers showed non-specific binding. The study presented here shows the design and production of a potentially new type of IL-4 antagonists, which employ site-specific chemical modification to exert their antagonistic function. N2 - Das Zytokin Interleukin-4 (IL-4) spielt eine entscheidende Rolle in der Entstehung und Pathophysiologie von Asthma und anderen atopischen Krankheiten. Seine Aktivitäten können in die Zelle durch die Bindung an einen Rezeptorkomplex übertragen werden, welcher aus den Untereinheiten IL-4Rα und γc besteht. Interleukin-13 (IL-13), ein verwandtes Zytokin, und IL-4 besitzen viele gemeinsame Funktionen. Das kann dadurch erklärt werden, dass IL-4 wie auch IL-13 ihre Signale über einen gemeinsamen Rezeptorkomplex übertragen können, der aus der IL-4R und der IL-13R1 Untereinheit besteht. Die IL-4R Untereinheit ist ein vielversprechendes Zielmolekül für die Entwicklung von Pharmaka, da sie IL-4 und IL-13 Reaktionen vermittelt. Durch Blockieren von IL-4R werden die Aktivitäten von IL-4 sowie IL-13 unterdrückt. Ein IL-4 basiertes Doppelmutein (Pitrakinra), welches als Gegenspieler zu IL-4 und IL-13 Rezeptoren fungiert, befindet sich derzeit in der klinischen Entwicklung. In dieser Arbeit wird die Bildung und Produktion von biologisch aktiven IL-4 Muteinen mit einem einzelnen zusätzlich eingefügten Cysteinrest beschrieben. Die Einführung einer freien Thiol-Gruppe ermöglicht ortsspezifische chemische Modifizierungen. Ein „Tethering“ Ansatz sollte dann auch eine sehr schwach Bindung von thiol-reaktiven Verbindungen an IL-4 messbar machen. Die Muteine wurden in unlöslicher Form in E. coli exprimiert, zurückgefaltet und auf gereinigt. Dabei wurde die Thiolgruppe des Muteins als Disulfid mit dem Tripeptid Glutathion geschützt. Erste Versuche gezielt den eingeführten Cysteinrest selektiv chemisch zu reduzieren schlugen fehl, da die drei proteineigenen Disulfidbrücken von IL-4 eine ähnliche Reaktivität zeigten, und die Reduktion zur vollständigen Desaktivierung und Fällung des IL-4 Proteins führte. Daher wurde ein enzymatischer Ansatz entwickelt, der gezielt die Disulfidbrücke zum Glutathionrest reduziert und die proteineigenen strukturell essentiellen Disulfidbrücken unverändert lässt. Zur Optimierung wurden vier verschiedene IL-4 Cystein-Muteine mit Cysteinresten an verschiedenen Positionen nahe der IL-4Rα Bindungsstelle getestet und die Reduktionsgeschwindigkeit in Gegenwart von Glutaredoxin bestimmt. Die enzymatische Reduktion verlief für alle vier Muteine mit verschiedenen Geschwindigkeiten. Dies deutet darauf hin, dass die Zugänglichkeit der Disulfidgruppe einen wichtigen Einfluss besitzt. Die Reduktionsbedingungen mussten daher für jedes Mutein neu bestimmt werden. Nach Optimierung des pH Wertes und insbesondere der Reaktionszeit konnten alle Muteine mit einer freien Thiolgruppe in angemessener Ausbeute erhalten werden. Die Proteine mit jeweils einer freien Thiolgruppe wurden daraufhin mit N-Ethylmaleinimid (NEM) oder Maleimido-PEG modifiziert. Die Effekte der Modifizierung an verschiedenen Positionen des IL-4 auf die Bindung an IL-4R wurden mit Hilfe der SPR-Spektroskopie (Oberflächen Plasmon Resonanz Spektroskopie) gemessen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Interaktion von Foldameren mit der IL-4Ra Rezeptorkette untersucht. Foldamere stellen eine neue Klasse von stabilen, kompakt gefalteten Biomolekülen dar, die möglicherweise spezifisch mit Proteinen und Nukleinsäuren wechselwirken können. Es sollten Vorversuche durchgeführt werden um zu sondieren, ob aus Foldameren Hemmstoffe für IL-4 und IL-13 entwickelt werden können. Da Foldamere mit einer Thiolgruppe zur Anbindung (Tethering) an IL-4 nicht hergestellt werden konnten, wurden zunächst nur nichtreaktive Foldamare aus einer synthetisierten Foldamer-Bibliothek getestet. Zwei Bibliotheken mit verschiedenen auf aromatischen Amiden basierenden Foldameren wurden von Michael Grotz und Dr. Michael Deligny synthetisiert und von mir mit Hilfe der SPR Spektroskopie auf ihre Fähigkeit getestet, die Ligand-Rezeptor Wechselwirkung von IL-4 und derIL-4Rα Rezeptoruntereinheit zu unterbinden. Keines der untersuchten Foldamere konnte die IL-4/IL-4Rα Wechselwirkung spezifisch hemmen. Einige Foldamere zeigten eine unspezifische Bindung. Die hier dargestellten Studien zeigen das Design und die Herstellung eines potentiell neuen Typs von Gegenspieler zu IL-4, welcher ortsspezifische chemische Modifikationen ausnutzt um seine antagonistische Funktion zu erfüllen. KW - Il 4 KW - Foldamere KW - Modifizierung KW - Foldamers KW - PEG chemical modification KW - Zutokin KW - chemische Modifizierung KW - SPR-Spektroskopie Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-113531 ER - TY - THES A1 - Dehm, Volker Christoph T1 - Synthesis and Characterization of an Oligo(Phenylene Ethynylene)-Based Perylene Bisimide Foldamer T1 - Synthese und Charakterisierung eines Oligo(phenylenethinylen)-basierten Perylenbisimid Foldamers N2 - The present work is part of the currently only rudimentary understanding of the structure-property relationships in the self-assembly of pi-conjugated organic molecules. Such structures may reveal favorable photophysical and semiconducting properties due to the weak non-covalent pi-pi interactions between the monomer units. The specific mutual orientation of the dyes is known to evoke individual functional properties for the condensed matter, however, the related electronic processes are still not well-understood and further enhancements of functional properties are seldom triggered by rational design. The pi-pi self-assembly structures of perylene bisimide (PBI) dyes are promising, versatile materials for organic electronic devices and have been elected for this thesis as an archetype aggregate system to investigate the dye-dye interactions in more detail. In cooperation with experts in the field of spectroscopy and theory the development of reliable routines towards a better understanding of the origins of the functional properties may be feasible, and, on a longer time-line, such knowledge may enable optimization of functional organic materials. Having designed such structures entailed the challenge of developing feasible synthesis strategies, and to actually generate the targeted molecules by synthesis. Several synthesis approaches were conducted until finally a perylene bisimide foldamer was obtained based on a Sonogashira co-polymerization reaction. After purification and enrichment of the larger-sized species by means of semi-preparative gel permeation chromatography (GPC) the average size of an octamer (8500 Da) species was determined by analytical GPC. The low polydispersity index (PD) of 1.1 is indicative of a sharp size distribution of the oligomers. This average size was confirmed by performing diffusion ordered NMR spectroscopy (DOSY). Furthermore, MALDI-TOF mass analysis substantiated the structural integrity of the co-polymerization product. Solvent-dependent UV/vis spectroscopic investigations demonstrated that intramolecular PBI  aggregates are reversibly formed, indicating that this oligomer is able to fold and unfold in the intended manner upon changing external conditions. In the unfolded states, the PBI moieties are closely arranged due to the short OPE bridges (< 2.4 nm), which is expressed by an exciton coupling interaction of the dyes and therefore the characteristic monomer absorption pattern of the PBI chromophore cannot be obtained in the unfolded states. More interestingly, the folded state revealed a pronounced aggregate spectrum of the PBIs, however, striking differences in the shape of the absorption spectrum compared to our previously investigated PBI self-assembly were obtained. N2 - Die vorliegende Arbeit ist Bestandteil von derzeit erst ansatzweise verstandenen Struktur-Eigenschaftsbeziehungen in Selbstassoziaten pi-konjugierter organischer Moleküle. Solche Strukturen können nützliche photophysikalische und Halbleitereigenschaften aufweisen, die begründet sind in den schwachen, nicht-kovalenten pi-pi-Wechselwirkungen zwischen den Monomereinheiten. Die spezifische gegenseitige Orientierung zwischen den Farbstoffen ruft dabei unterschiedliche funktionelle Eigenschaften im Festkörper hervor, die zugrundeliegenden elektronischen Prozesse sind jedoch noch nicht genügend verstanden, so dass eine gezielte Steuerung oder Verbesserung der funktionellen Eigenschaften schwierig ist. Die pi-pi- Selbstassoziate von Perylenebisimiden (PBI) sind vielversprechende, vielseitige Materialien für die organische Elektronik, und wurden daher für diese Arbeit als Forschungsobjekt ausgewählt um die Wechselwirkung zwischen den Farbstoffen genauer zu untersuchen. In Kooperation mit Experten aus den Forschungsgebieten der Spektroskopie und Theorie sollen verlässliche Routinen entwickelt werden, die ein besseres Verständnis der elektronischen Vorgänge in organischen Funktionsmaterialen ermöglichen und auf längere Sicht eine gezielte Optimierung derselben erlauben. Nachdem entsprechende Modelsysteme konzipiert und berechnet wurden, wurden geeignete Synthesestrategien entwickelt und umgesetzt, was schließlich zu der erfolgreichen Synthese eines Perylenbisimid Foldamers führte, die auf einer abschließenden Sonogashira Co-Polymerisation basierte. Nachdem dieses mittels semip-präparativer Gelpermeationschromatographie (GPC) sowohl gereinigt, als auch dessen größeren Oligomerspezies angereichert wurden, wurde mittels analytischer GPC im Mittel eine molekulare Masse von 8400 Da erhalten, was einem Oktamer entspricht. Dabei wurde ein kleiner Polydispersionsindex (PD) von 1.1 erhalten, was für eine relativ enge Größenverteilung der Oligomerspezies spricht. Diese Größendimension wurde mittels Messung der Selbstdiffusion durch Feldgradienten-NMR-Spektroskopie (diffusion ordered spectroscopy, DOSY) bestätigt. Weiterhin konnte mittels MALDI-TOF- Massenanalyse die strukturelle Integrität des Co-Polymerisationsproduktes nachgewiesen werden. UV/Vis-spektroskopische Untersuchungen zeigten die reversible Ausbildung intramolekularer PBI pi-pi-Aggregate bei Veränderung der Lösungsmittel, was die gewünschten Faltungseigenschaften des Foldamers bei veränderten äußeren Bedingungen demonstriert. In nicht gefalteten Zuständen sind die PBI Farbstoffe durch die kurzen OPE-Brücken zu räumlicher Nähe (< 2.4 nm) gezwungen, was sich in einer exzitonischen Kopplung der Farbstoffe äußert, weshalb für nicht-gefaltete Zustände kein reines, charakteristisches PBI Monomerabsorptionsspektrum beobachtet werden konnte. Im interessanteren gefalteten Zustand weisen die PBIs ein ausgeprägtes Aggregatabsorptionsspektrum auf, allerdings mit klaren Unterschieden in der Bandenform verglichen mit den von uns früher untersuchten intermolekularen PBI-Selbstassoziaten. KW - Perylenbisdicarboximide KW - Foldamers KW - Aggregate KW - dye Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53211 ER -