TY  - JOUR
A1  - Fehrholz, Markus
A1  - Glaser, Kirsten
A1  - Speer, Christian P.
A1  - Seidenspinner, Silvia
A1  - Ottensmeier, Barbara
A1  - Kunzmann, Steffen
T1  - Caffeine modulates glucocorticoid-induced expression of CTGF in lung epithelial cells and fibroblasts
JF  - Respiratory Research
N2  - Background:
Although caffeine and glucocorticoids are frequently used to treat chronic lung disease in preterm neonates, potential interactions are largely unknown. While anti-inflammatory effects of glucocorticoids are well defined, their impact on airway remodeling is less characterized. Caffeine has been ascribed to positive effects on airway inflammation as well as remodeling. Connective tissue growth factor (CTGF, CCN2) plays a key role in airway remodeling and has been implicated in the pathogenesis of chronic lung diseases such as bronchopulmonary dysplasia (BPD) in preterm infants. The current study addressed the impact of glucocorticoids on the regulation of CTGF in the presence of caffeine using human lung epithelial and fibroblast cells.
Methods:
The human airway epithelial cell line H441 and the fetal lung fibroblast strain IMR-90 were exposed to different glucocorticoids (dexamethasone, budesonide, betamethasone, prednisolone, hydrocortisone) and caffeine. mRNA and protein expression of CTGF, TGF-β1-3, and TNF-α were determined by means of quantitative real-time PCR and immunoblotting. H441 cells were additionally treated with cAMP, the adenylyl cyclase activator forskolin, and the selective phosphodiesterase (PDE)-4 inhibitor cilomilast to mimic caffeine-mediated PDE inhibition.
Results:
Treatment with different glucocorticoids (1 μM) significantly increased CTGF mRNA levels in H441 (p < 0.0001) and IMR-90 cells (p < 0.01). Upon simultaneous exposure to caffeine (10 mM), both glucocorticoid-induced mRNA and protein expression were significantly reduced in IMR-90 cells (p < 0.0001). Of note, 24 h exposure to caffeine alone significantly suppressed basal expression of CTGF mRNA and protein in IMR-90 cells. Caffeine-induced reduction of CTGF mRNA expression seemed to be independent of cAMP levels, adenylyl cyclase activation, or PDE-4 inhibition. While dexamethasone or caffeine treatment did not affect TGF-β1 mRNA in H441 cells, increased expression of TGF-β2 and TGF-β3 mRNA was detected upon exposure to dexamethasone or dexamethasone and caffeine, respectively. Moreover, caffeine increased TNF-α mRNA in H441 cells (6.5 ± 2.2-fold, p < 0.05) which has been described as potent inhibitor of CTGF expression.
Conclusions:
In addition to well-known anti-inflammatory features, glucocorticoids may have adverse effects on long-term remodeling by TGF-β1-independent induction of CTGF in lung cells. Simultaneous treatment with caffeine may attenuate glucocorticoid-induced expression of CTGF, thereby promoting restoration of lung homeostasis.
KW  - airway remodeling
KW  - fibrosis
KW  - bronchopulmonary dysplasia
KW  - caffeine
KW  - CCN2
KW  - CTGF
KW  - glucocorticoids
KW  - H441
KW  - IMR-90
Y1  - 2017
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-157672
VL  - 18
IS  - 51
ER  - 
TY  - THES
A1  - Gebhardt, Susanne
T1  - Expression, biochemische Charakterisierung und biologische Analyse des CONNECTIVE TISSUE GROWTH FACTOR
T1  - Expression, biochemical charakterisation und biological analysis of CONNECTIVE TISSUE GROWTH FACTOR
N2  - Der Connective tissue growth factor, CTGF, ist ein mit der EZM assoziiertes Protein, das diverse zelluläre Aktivitäten, einschließlich Adhäsion, Proliferation, Differenzierung und Migration, besitzt. Die umfassenden biologischen Eigenschaften des CTGF in verschiedenen Zelltypen spiegelt seine Fähigkeit, eine Vielfalt an Zelloberflächenmolekülen (HSPGs, Integrine, …) als auch andere bioaktive Moleküle (BMP-4, TGF-&beta;1, ...) zu binden, wieder. Eine veränderte CTGF-Expression ist mit mehreren fibrotischen Erkrankungen assoziiert und CTGF selbst stimuliert die Entstehung und Progression fibrotischer Defekte. Genauere Informationen über den Einfluss des CTGF auf die Genexpression von Zellen waren bisher unbekannt. In dieser Arbeit wurde zunächst humanes CTGF in HEK-Zellen exprimiert und anschließend in mehreren chromatographischen Schritten aufgereinigt. Die biologische Charakterisierung zeigte, dass das rekombinante Protein mit BMP-2 in Oberflächenplasmonresonanzstudien und auf Zellbasis interagiert. Desweiteren konnte auch eine Interaktion mit Balb3T3-Zellen festgestellt werden. Die biologische Aktivität des Proteins wurde durch Proliferationsassays mit einer Endothelzelllinie und primären Fibroblasten des menschlichen Tenon bestätigt. Das reine rekombinante Protein wurde für Genexpressionsanalysen an humanen primären Fibroblasten des Tenon eingesetzt. Ergebnisse dieser Studie der Genexpression von HTF von drei unabhängigen Spendern zeigten, dass CTGF verschiedene biologische und physiologische Prozesse beeinflusst. Bekannte proliferatorische Eigenschaften und der Einfluss auf die EZM konnten bestätigt werden. Neben den bisher bekannten Funktionen der durch CTGF verursachten Effekte bei der Wundheilung, die überwiegend in der zweiten und dritten Phase der Wundheilung im Bereich der Umstrukturierung der EZM zu finden sind, konnten mehrere regulierte Gene nachgewiesen werden, die eine Rolle in der ersten Phase der Wundheilung, der Inflammation, spielen. Die interessantesten bisher im Zusammenhang mit CTGF noch nicht beschriebenen proinflammatorischen Proteine sind die CXC-Chemokine 1, 2, 6 und 8 sowie IL-6, die in den CTGF behandelten Fibroblasten stärker exprimiert waren. CTGF scheint somit eine mannigfaltige koordinierte Rolle in der Wundheilung am Auge, einschließlich Inflammation und EZM-Remodeling sowie möglicherweise auch in der Angiogenese und Hämostase, zu spielen und damit seine Rolle als mulitmodularer Faktor zu bestätigen.
N2  - Connective tissue growth factor, CTGF, is an ECM associated protein that has diverse cellular activities including adhesion, proliferation, differentiaton and migration. The widespread biological properties of CTGF reflects its ability to bind many cell surface molecules (HSPGs, Integrins, LDL, …) and other bioactive molecules (BMP-4, TGF-&beta; ...). Expression of CTGF is associated with many fibrotic diseases and CTGF itself stimulates development and progression of fibrotic defects. Detailed information about the effect of CTGF on cellular gene expression is relatively unknown so far. In this study human CTGF was expressed in HEK-cells and subsequently purified in several chromatographic steps. Biological characterization shows an interaction of the protein with BMP-2 in surface plasmon resonance studies and also in cell based assays. Furthermore there was detected an interaction with Balb3T3 cells. Biological activity of the protein was confirmed by proliferation assays with an endothelial cell line and primary fibroblasts of the human tenon. Pure recombinant protein was used for gene expression analysis of human primary fibroblast of the tenon. Results of this gene expression study from three independent donors showed influence of CTGF on different biological and physiological processes. Known proliferative properties and influence on the ECM could be confirmed. Beside up to now known function of CTGF induced effects in wound healing, predominantly found in second and third phase of wound healing in range of ECM remodeling and myofibroblast differentiation, several regulated genes, important in first phase of wound healing, the inflammation, could be detected. As yet unknown CTGF regulated interesting genes are the upregulated chemokines 1, 2, 6 and 8 as well as Interleukin 6, all with proinflammatoric properties. Significant influence of CTGF on the genexpression of tenon fibroblasts indicates the meaningful part of this protein in ocular woundhealing, including inflammation and ECM remodeling, potentially also angiogenesis and haemostasis, and confirms its multimodular function.
KW  - CTGF
KW  - rekombinante Expression
KW  - Expressionsanalyse
KW  - Fibrose
KW  - Glaukom
KW  - CTGF
KW  - rekombinant expression
KW  - expression analysis
KW  - fibrosis
KW  - glaukoma
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29565
ER  - 
TY  - THES
A1  - Laug, Roderich
T1  - Funktionsaufklärung von CYR61 und CTGF in mesenchymalen Stammzellen und Lungenendothelzellen
T1  - Functional examination of CYR61 and CTGF in mesenchymal stem cells and endothelial lung cells
N2  - Cystein rich protein 61 (CYR61/CCN1) und Connective tissue growth factor (CTGF/CCN2) stellen aufgrund ihrer Multifunktionalität zwei sehr interessante Vertreter aus der derzeit sechs Mitglieder umfassenden Familie der CCN-Proteine (CCN- CYR61/CCN1, CTGF/CCN2, NOV/CCN3, WISP1-3/CCN4-6) dar. Seit der Entdeckung von CYR61 und CTGF konnten die überlappenden, aber meist nicht redundanten zellspezifischen Effekte in verschiedenen Zellsystemen nachgewiesen werden. Die Einflüsse auf zahlreiche Prozesse wie Proliferation und Migration, aber auch Angiogenese und das Überleben von Zellen lassen eine weitreichende Bedeutung im Zusammenhang mit vielen Entwicklungsprozessen vermuten, so auch der des muskuloskelettalen Systems und der Entwicklung der Lunge.
In der vorliegenden Arbeit wurden für die nähere Charakterisierung von CYR61 und CTGF humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) und die humane primäre Lungenendothelzelllinie HPMEC-ST1.6R (human pulmonary microvascular endothelial cells) gewählt. Beide Zellsysteme sind für die Untersuchung der Funktionsfähigkeit in den verschiedenen Kompartimenten bestens geeignet. So ist die Zelllinie HPMEC-ST1.6R den primären Endothelzellen, im Vergleich mit anderen in der Forschung eingesetzten Zelllinien,  in Bezug auf spezifische Oberflächenmarker am nächsten. Mesenchymale Stammzellen bilden als multipotente Zellen das Rückrat des muskuloskelettalen Systems und sind an der Homöostase des menschlichen Stütz- und Bewegungsapparates maßgeblich beteiligt.
Um experimentell nutzbare Konzentrationen an rekombinanten Proteinen zu erhalten, wurde ein Baculovirus-Expressionsystems gewählt. Nach der erfolgreichen Klonierung der CTGF/Fc-Tag Sequenz in einen Expressionsvektor konnte dies auch durch Produktion in SF21-Insektenzellen erreicht und erstmalig rekombinantes CTGF/Fc von hoher Reinheit gewonnen werden. Allerdings konnte eine beständige Funktionsfähigkeit der aufgereinigten Proteine mittels eines Proliferationstestes nachfolgend nur bedingt bestätigt werden.
Für die weitere Versuchsplanung, einer Untersuchung der Auswirkung von rekombinantem CTGF (rCTGF) bzw. CYR61 (rCYR61) auf die Zielzellen, musste zunächst die zelleigene ctgf bzw. cyr61 Expression herunterreguliert werden, um einen endogenen Störeffekt auszuschließen. Durch den Einsatz spezifischer shRNAs konnte ctgf/CTGF sowohl in den hMSC-, wie auch den HPMEC-ST1.6R-Zielzellen deutlich herunterreguliert und nachfolgend eine markant reduzierte Proliferation beobachtet werden. Ein Effekt für die Regulation von cyr61 blieb aus.
In dieser Arbeit wurden anschließend erstmals mittels Microarray-Analysen Veränderungen im Genexpressionsmuster der ctgf herunterregulierten hMSC- bzw. Lungenendothelzellen gegenüber Kontrollzellen untersucht. Des Weiteren war die Auswirkung einer Behandlung von ctgf herunterregulierten Zielzellen mit rCTGF gegenüber unbehandelten Kontrollzellen von Interesse. Für beide Zellsysteme konnten signifikante Genregulationen nach der Behandlung mit CTGF spezifischen shRNAs gegenüber den Kontrollzellen detektiert werden, mit interessanten Genclustern im Bereich der TGF-beta (transforming growth factor ß) Signalgebung, sowie der fokalen Adhäsion (z.B. VEGF). Eine Behandlung mit rCTGF hingegen zeigte gegenüber den unbehandelten Kontrollzellen in der Auswertung der Microarray-Analyse keine signifikante Veränderung im Genexpressionsmuster.
In dieser Arbeit wurden, neben einer effektiven Gewinnung von rekombinantem CTGF und der Herunterregulation der endogenen ctgf Expression, wichtige Erkenntnisse zur Biologie von CTGF (und CYR61) in mesenchymalen Stammzellen hMSC und der Lungenendothelzelllinie HPMEC-ST1.6R erlangt. Die erhaltenen Microarray-Daten bieten eine fundierte Grundlage für zahlreiche fortführende Untersuchungen.
N2  - Cystein rich protein 61 (CYR61/CCN1) and connective tissue growth factor (CTGF/CCN2) are two very interesting members of the CNN family (CCN- CYR61/CCN1, CTGF/CCN2, NOV/CCN3, WISP1-3/CCN4-6) consisting of six members so far. Since its discovery the overlapping, but mostly non-redundant effects of CYR61 and CTGF were shown in different cell systems. Both proteins are linked to many different processes like proliferation and migration, but also angiogenesis and survival. They seem to be involved in very fundamental biological processes, amongst other the development of the musculoskeletal system and the lung and were analyzed in this study.
To distinguish the two proteins CYR61 and CTGF, primary human mesenchymal stem cells (hMSC) and a human pulmonary endothelial cell line (HPMEC-ST1.6R) were chosen. Both cell systems are suited very well for getting more information about the function in these different compartments. So the cell line HPMEC-ST1.6R is more related to primary endothelial cells in reference to the cell surface markers, compared to other cell lines used for experimental research. Mesenchymal stem cells form the backbone of the musculoskeletal system and are involved in the homeostasis of this complex system.
Getting adequate concentrations of recombinant proteins for the upcoming experiments a baculovirus expression system was chosen. After successful cloning of the CTGF/Fc-Tag sequence into an expression vector, recombinant CTGF/Fc of high purity was obtained for the first time, produced in SF21 insect cells. However the stable functioning of the proteins was partly confirmed by proliferation tests.
To study the effect of recombinant CTGF or CYR61 in further experiments, the endogenous ctgf or cyr61expression had to be downregulated to avoid negative effects. By using specific shRNAs ctgf/CTGF has been downregulated in hMSC as well as HPMEC-ST1.6R cells and subsequently a reduced proliferation was observed. No effect was detected for the regulation of cyr61.
In this study for the first time changes in regulation of gene expression after downregulation of ctgf in hMSC and HPMEC-ST1.6R cells were studied by microarray analyses. Furthermore to discover the effect of treating ctgf downregulated cells with recombinant CTGF compared to control cells was another aim of this experimental series. For both cell systems, significant gene regulations were detected after treatment with CTGF specific shRNAs with interesting gene cluster for TGFß-signaling as well as focal adhesion (e.g. VEGF). In contrast, no significant change in gene regulation was detected by microarray analysis after treating the target cells with rCTGF compared to non-treated cells.
In summary, besides the effective preparation of rCTGF and the marked downregulation of ctgf gene expression, this study provides fundamental information about CTGF and its biology in hMSC and HPMEC-ST1.6R cells, as well. Based on the numerous detected gene regulations in the microarray analyses the study provides a basis for further experiments.
 
KW  - Connective Tissue Growth Factor
KW  - CYR61
KW  - CTGF
KW  - Mesenchymzelle
KW  - Endothelzelle
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-98711
ER  -