TY  - THES
A1  - Hoffmann, Dana
T1  - Neue Biomarker zum Nachweis von Nierentoxizität
T1  - Novel Biomarker of Nephrotoxicity
N2  - Der Prozess von der Entdeckung und Entwicklung eines potentiellen Arzneistoffs bis zu dessen Zulassung ist extrem kosten‐ und zeitintensiv und eine Vielzahl dieser Stoffe kann aufgrund toxischer Nebenwirkungen in präklinischen Studien nicht weiterentwickelt werden. Dabei ist die Niere eines der Hauptziele von Xenobiotika‐induzierter Organtoxizität, jedoch ist eine frühe Detektion von Nierenschäden schwierig. Den derzeitig verwendeten klinischen Parameter, wie Blutharnstoff (BUN) und Serumkreatinin fehlt es an Sensitivität und Spezifität, da sie Fremdstoff‐induzierte Toxizität meist erst aufzeigen, wenn schon ein erheblicher Teil der Nierenfunktion beeinträchtigt ist. Daher ist es notwendig, empfindlichere und zuverlässigere Biomarker zu identifizieren und zu validieren, welche kleinste Nierenschädigungen früher als traditionelle Parameter erkennen. In den letzten Jahren wurden in der Literatur aber auch von verschiedenen Projekten eine Reihe neuer gen‐basierender und Urinbiomarker (Kim‐1, Clusterin, Lipocalin‐2, Timp‐1) identifiziert. Ziel dieser Dissertation war es die Aussagekraft dieser Marker im Vergleich zu traditionellen Endpunkten, einschließlich klinische Chemie und Histopathologie an Gewebe‐, Urin‐ und Serumproben von männlichen Ratten, welche mit Modellsubstanzen für Nephrotoxizität (Aristolochiasäure und Gentamicin) oder nephrotoxischen Arzneistoffkandidaten (PredTox Projekt) behandelt wurden, mittels qRT‐PCR, Immunhistochemie und ELISA zu untersuchen. Zusammenfassend kann man sagen, dass die Effekte auf Ebene der Gen‐ und Proteinexpression generell sehr gut mit den histopathologischen Veränderungen korrelieren. Sie konnten meist früher oder in niedrigeren Dosierungen als die traditionellen Nierenmarker BUN und Serumkreatinin detektiert werden. Eine erhöhte Expression und Exkretion von Kim‐1 zeigte sich in allen Studien als eine der frühesten Antworten auf Schädigung der proximalen Tubuli und stellt somit den empfindlichsten Biomarker dar. Die erhöhte Ausscheidung von Clusterin konnte teilweise vor einer veränderten Gen‐ und Proteinexpression im Gewebe detektiert werden und unterstützen die Verwendung von Clusterin als nicht‐invasiven Biomarker. Obwohl eine gesteigerte Exkretion von Lipocalin‐2 sehr früh nach Schädigung des proximalen Tubulus detektiert werden konnte, ist diese nicht spezifisch für einen Nierenschaden. Dennoch könnte die vermehrte Expression/Ausscheidung von Lipocalin‐2 als frühe Antwort auf eine Entzündung oder einen Gewebeschaden eine sinnvolle Ergänzung der routinemäßigen Testung auf Toxizität darstellen. Ebenfalls konnte ein dosis‐ und zeitabhängiger Konzentrationsanstieg von einem Großteil der potentiellen Biomarker des „WideScreen™ Rat Kidney Toxicity Panels 1 and 2“ im Urin beobachtet werden. Da jedoch die potentiellen Biomarker unterschiedliche Empfindlichkeiten besitzen und unter Umständen auch vom Mechanismus der Toxizität von Verbindungen abhängen, erscheint eine Kombination von verschiedenen Biomarkern zur frühzeitigen Erkennung von proximalen Nierenschäden sowie zur Verlaufskontrolle von Nierenerkrankungen sinnvoll. Durch die einfache Probenahme und leichte Bestimmung ist die Messung der neuen potentiellen Nierenbiomarker im Urin neben der Bestimmung der traditionellen Parameter der klinischen Chemie sowie der Histopathologie sinnvoll für die Identifizierung von Nierenschädigungen in präklinischen Studien.
N2  - The discovery and development of new drugs is very costly and time‐consuming and the rate of drug failure due to late‐breaking findings in preclinical toxicity studies is high. The kidney is a major target of xenobiotic induced organ toxicity but early detection of renal damage or minor effects on renal function is challenging due to the functional reserve of the kidney. Current clinical pathology parameters of nephrotoxicity such as blood urea nitrogen (BUN) and serum creatinine are relatively insensitive and non specific, revealing kidney damage not until 70‐80 % of the renal epithelial mass has been lost. There is a clear need for the identification and validation of more sensitive and reliable biomarkers, which are indicators of minimal kidney damage rather than impaired kidney function. Recently a range of novel gene‐based and urinary kidney biomarker (Kim‐1, clusterin, lipocalin‐2 and Timp‐1) was identified from literature and various colloraborative projects. The aim of this work was to investigate the performance of these markers compared to traditional endpoints, such as clinical chemistry and histopathology in tissue, urine and serum samples collected from studies, in which male Wistar rats were treated either with model compounds of nephrotoxicity (aristolochic acid and gentamicin) or drug candidates (PredTox) using qRT‐PCR, immunohistochemistry and ELISA. In summary, effects on marker gene and protein expression generally correlated well with the renal histopathology alterations and were frequently detected at earlier time‐points or lower doses than the traditional clinical parameters BUN and serum creatinine. Overexpression and enhanced urinary excretion of Kim‐1 was one of the earliest responses to proximal tubule damage and might be seen as the most sensitive marker of nephrotoxicity. Furthermore, urinary Clusterin was increased before changes in gene and protein expression or even histopathological alterations were evident, confirming urinary clusterin as a sensitive, non‐invasive marker for renal injury. Although changes in urinary lipocalin‐2 occurred very early after proximal tubule damage, lipocalin‐2 may not specific for kidney injury. However, its rapid response to inflammation and tissue damage in general may reinforce its use in routine toxicity testing. A dose‐ and time‐dependent increase in most of the novel urinary biomarkers was evident using the “WideScreen™ Rat Kidney Toxicity Panels 1 and 2”. Due to the the variable sensitivity of a single biomarker, a combination of many different biomarkers to detect kidney injury appears to be useful. Concerning of the easy sampling and measurement, the additional determination of potential urinary biomarkers of nephrotoxcity next to the traditional clinical chemistry parameters and histopathological changes is helpful to identify kidney damage at early time‐points.
KW  - Biomarker
KW  - Nephrotoxizität
KW  - Niere
KW  - biomarker
KW  - nephrotoxicity
KW  - kidney
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48562
ER  - 
TY  - THES
A1  - Müller, Stephanie
T1  - Identification of early molecular changes associated with Fumonisin B1-induced carcinogenesis in vivo and in vitro
T1  - Frühe molekulare Ereignisse im Mechanismus der Kanzerogenität des Mykotoxins Fumonisin B1
N2  - Fumonisin B1 (FB1) is a mycotoxin produced by various Fusarium species and constitutes a major contaminant of maize worldwide. A 2-year carcinogenicity study of the National Toxicology Program (NTP) in Fischer N344 rats showed that male rats were most susceptible to FB1-induced tumor formation in the kidney. Histopathologically, a rare and highly malignant tumor type originating from the proximal tubules of rat kidney with increased potential for invasion and metastasis was identified. However, mechanisms underlying the FB1-induced carcinogenesis in kidneys of male rats are still not clear. Previous studies have shown that FB1-mediated disruption of sphingolipid metabolism via inhibition of ceramide synthase is a primary key event in FB1 toxicity. The disruption of sphingolipid metabolism may cause time- and dose-related changes in the relative balance of various bioactive intermediates. Furthermore, the ability of FB1 to induce renal cell death and subsequent compensatory cell proliferation is well known, but it does not completely explain the invasive growth characteristics and exceptionally high metastatic potential of FB1-induced tumors. Considering the complexity of sphingolipid metabolism and the fact that various sphingolipids (e.g. ceramide, sphingoid bases and their respective 1-phosphates) act on opposing signaling pathways, it is hypothesized that the balance between individual sphingolipids and thus the overall cellular response to FB1 may shift with time and by continuing FB1 exposure, resulting in the disruption of specific cell signaling pathways, which may promote tumor formation in kidney. To identify early FB1-induced gene expression patterns in the kidney, which may be associated with sphingolipid-mediated signaling pathways in cancer, a short-term i.p. study on FB1 in male Sprague Dawley rats was performed and changes in gene expression were analyzed using a qRT-PCR array that comprises 84 relevant genes of 6 pathways pivotally involved in the formation of cancer. Furthermore, apoptosis and cell proliferation as well as changes in specific sphingolipids were investigated in FB1-treated kidneys. As shown by classical histopathology (H&E) and (immuno)-histochemical staining (TUNEL and BrdU), FB1 caused a time- and dose-dependent increase in tubular apoptosis in the cortex and OSOM of the kidney, which was compensated by the induction of proliferation in the affected areas. HPLC-MS/MS analysis of bioactive sphingolipids demonstrated that FB1 induced a marked elevation of the pro-apoptotic sphingoid bases sphinganine and sphingosine, which paralleled the time- and dose-dependent increase in renal tubular apoptosis. With prolonged exposure to FB1, increased metabolic conversion of the accumulated sphinganine to the sphinganine-1-phosphate, a second messenger with anti-apoptotic and proliferative properties, was observed in kidney. This finding was compliant with the increased regenerative cell proliferation in the cortex and OSOM. In addition to effects on sphingoid bases and their 1-phosphate metabolites, this study, for the first time, demonstrated reduced levels of specific ceramides in rat kidney after FB1 exposure. In particular, C16-ceramide, which is a widespread constituent of membrane-bound complex sphingolipids involved in cell adhesion, was time- and dose-dependently decreased after treatment with FB1. Besides its role as component of the cell membrane, C16-ceramide functions as a signaling molecule for the initiation of apoptosis in response to various stress stimuli. Under conditions of chronic FB1 exposure, a significant reduction in pro-apoptotic C16-ceramide together with markedly increased levels of anti-apoptotic and proliferation-promoting sphingoid base 1-phosphates may thus favor resistance to stress-induced apoptosis and facilitate the survival of abnormal cells with potential to initiate tumor formation. Our study also revealed that early exposure to FB1 resulted in increased expression of a plethora of genes involved in tumor initiation as well as tumor progression. While single FB1 exposure was demonstrated to predominately induce gene expression of proto-oncogenic transcription factors (e.g. Fos, Jun, Myc) and apoptotis-related genes (e.g. members of the tumor-necrosis factor family), repeated exposure resulted in marked upregulation of genes mediating cell survival and cell proliferation (e.g. Bcl-XL, Bcl-2, Nfκb1 and Egfr). Moreover, continued exposure to FB1 initiated increased expression of genes critically involved in tumor migration, adhesion, invasion and metastasis. A close correlation was established between gene expression changes in response to FB1 and known signaling pathways mediated by extracellular or intracellular action of sphingoid base 1-phosphates - bioactive lipids that were markedly increased after FB1 treatment. In particular, genes encoding components of the plasminogen activator system were abundantly upregulated. These mediate invasion and metastasis in response to So1P, and may hence particularly promote the formation of highly aggressive and invasive tumors in kidney as observed after chronic exposure to FB1. Thus, it is conceivable that upregulation of a majority of genes in response to FB1 may be a direct or indirect consequence of increased So1P signaling. Another aim of this study was to identify differences in the organ-specific susceptibility for tumor formation by comparing FB1-mediated effects on apoptosis, cell proliferation, sphingolipids, and selected cancer-related genes in kidney and liver. Collectively, the present results revealed that kidney and liver showed marked differences in several endpoints of FB1 toxicity, which seemed to be primarily associated with their different susceptibility to FB1-mediated alterations in sphingolipid metabolism. The strong correlation between histopathological lesions and alterations in sphingolipid metabolism as well as sphingoid base 1-phosphate accumulation and concomitant S1P receptor expression suggested that tumor formation and progression to highly malignant carcinomas seems to be rather favored in kidney compared to liver. However, genes mostly deregulated by FB1 treatment in kidney (PAI-1, Thbs1 and Itga2) were also found to be induced in liver. To verify FB1-induced gene expression in kidney, normal rat tubular epithelial (NRK-52E) cells were analyzed for FB1-induced expression changes of the same cancer-related genes as in vivo. The results of qRT-PCR analysis revealed that gene expression changes in NRK-52E cells after FB1 treatment strongly correlated with those found in rat kidney and paralleled the marked alterations in sphingolipid metabolism. Furthermore, a good correlation between FB1-induced expression changes of cancer-related genes obtained in vivo and in vitro and those known to be mediated by bioactive sphingoid base 1-phosphates in cancer was established. Moreover, experiments modeling the invasive behavior of NRK-52E cells showed that FB1 may enhance cell invasion, which also correlated with both the increase in invasion- and metastasis-associated genes and bioactive sphingoid base 1-phophates. Importantly, NRK-52E cells basally expressed the S1P receptors S1P2 and S1P3, which are known to be involved in tumor migration and invasion. Since these receptors were also identified as most abundant S1PRs in kidneys of male Sprague Dawley rats, they may present important mediators of gene expression and invasion in response to FB1 in vivo. In summary, FB1-mediated disruption of sphingolipid metabolism and subsequent time- and dose-related increase in intermediates, such as bioactive sphingoid base 1-phosphates, correlate with early changes in genes and signaling pathways that may mediate loss of growth control, replication, evasion of apoptosis, cell motility and invasion, and thus favor renal tumor formation in response to FB1. However, to clarify whether the obtained gene expression changes in cancer-related genes in kidney are specific to the biological action of sphingoid base 1-phosphates and their respective receptors, further mechanistic studies are necessary.
N2  - Fumonisin B1 ist ein Mykotoxin, das von verschiedenen Spezies der Gattung Fusarium produziert wird, und weltweit wesentlich zur Kontamination von Mais beiträgt. Eine zweijährige Kanzerogenitätsstudie des National Toxicology Programs (NTP) zeigte, dass männliche Ratten nach Verabreichung von FB1 am anfälligsten für die Bildung von Nierentumoren waren. Aus histopathologischer Sicht handelte es sich dabei um sehr seltene und hoch maligne Formen von Tumoren des proximalen Tubulus der Niere, die eine verstärkte Neigung zur Invasion und Metastasierung aufwiesen. Jedoch sind bis heute die genauen Mechanismen nicht hinreichend geklärt, die zu einer FB1-induzierten Kanzerogenese in der Rattenniere führen können. Frühere Studien berichteten, dass die durch FB1 vermittelte Störung des Sphingolipidmetabolismus mittels Inhibierung der Ceramidesynthase ein initiales Ereignis in der Toxizität darstellt und zu zeit- und dosisabhängigen Veränderungen im relativen Gleichgewicht verschiedener bioaktiver Zwischenprodukte des Sphingolipidmetabolismus führen kann. Des Weiteren ist bekannt, dass FB1 dazu in der Lage ist, in der Niere Zelltod gefolgt von regenerativer Zellproliferation zu induzieren. Dies erklärt jedoch nicht vollständig, wie die durch FB1 verursachten Tumore ein invasives Wachstum und außergewöhnlich hohes Metastasierungspotential erlangen. Die Komplexität des Sphingolipidmetabolismus und die Tatsache, dass verschiedene Sphingolipide (z.B. Ceramide, Sphingoidbasen und ihre entsprechenden 1-Phosphate) einen Einfluss auf gegensätzliche Signalwege in der Zelle ausüben können, deuten darauf hin, dass das Gleichgewicht zwischen den einzelnen Sphingolipiden und somit die gesamten zellulären Effekte von FB1 über die Zeit und mit zunehmender Exposition gegenüber FB1 zu Störungen spezifischer Signalwegen führen können, die eine Tumorentstehung in der Niere begünstigen. Um frühere Effekte von FB1 auf das Expressionsmuster von Genen in der Niere zu ermitteln, die möglicherweise mit den durch Sphingolipide vermittelten Signalwegen und Krebs verbunden sind, wurde eine Kurzzeitstudie mit FB1 in männlichen Sprague Dawley-Ratten durchgeführt und die Veränderungen der Genexpression von 84 Genen der 6 wichtigsten, krebsrelevanten Signalwege mittels qRT-PCR untersucht. In diesem Zusammenhang wurden in Nieren der FB1-behandelten Tiere auch Untersuchungen zu Apoptose, Zellproliferation sowie zu Veränderungen der spezifischen Sphingolipide durchgeführt. Anhand klassischer histopatholgischer sowie (immun)-histologischer Färbungen konnte gezeigt werden, dass FB1 zu einem zeit- und dosisabhängigen Anstieg von Apoptose in Cortex und OSOM der Niere führte, dem gleichzeitig eine gesteigerte Proliferation in den entsprechenden Bereichen folgte. Die HPLC-MS/MS-Analyse bioaktiver Sphingolipide in der Niere zeigte, dass die Behandlung mit FB1 zeitgleich zu einem Anstieg der pro-apoptotischen Sphingoidbasen Sphinganin und Sphingosin und verstärkter tubulärer Apoptose führte. Mit anhaltender Exposition gegenüber FB1 konnte in der Niere eine Zunahme der metabolischen Umwandlung von Sphinganin in Sphinganine-1-Phosphat, einem sekundären Botenstoff mit anti-apoptotischen und wachstumsfördernden Eigenschaften, beobachtet werden. Diese Beobachtung stimmte auch mit der verstärkten regenerativen Zellproliferation in Cortex und OSOM der Niere überein. Weiterhin konnte mittels Sphingolipidanalyse erstmals gezeigt werden, dass die Exposition gegenüber FB1 zu einer Verminderung spezifischer Zellceramide führte. Insbesondere der Gehalt an C16-Ceramid wurden durch die Behandlung mit FB1 zeit- und dosishängig in der Niere reduziert. Neben seiner Funktion als Bestandteil der Zellmembran spielt C16-Ceramide eine wichtige Rolle als Grundbaustein von komplexen, Zelladhäsion fördernden Sphingolipiden und ist in Gegenwart verschiedener Stressfaktoren auch ein wichtiges Signalmolekül in der Initiierung von Apoptose. Im Fall einer chronischen Exposition gegenüber FB1 könnten demnach stark verminderte Gehalte an pro-apoptotischen C16-Ceramid, verbunden mit drastisch erhöhten Gehalten an anti-apoptotischen und wachstumsfördernden Sphingoidbasen-1-Phosphaten, zu einer Resistenz gegenüber stressbedingter Apoptose führen, die das Überleben initiierter Zellen und damit die Tumorentstehung begünstigen. Weiterhin zeigte unsere Studie, dass bereits eine frühe Exposition gegenüber FB1 die Expression einer Reihe von Genen in der Niere erhöht, die in der Tumorentstehung- sowie Progression eine Rolle spielen. Während die einmalige Verabreichung von FB1 hauptsächlich zu einem Anstieg der Expression von Transkriptionsfaktoren (z.B. Protoonkogene wie Fos, Jun und Myc) und apoptotischen Gene (z.B. Mitglieder der Familie der Tumornekrosefaktorrezeptoren) führte, wurde nach mehrmaliger Exposition eine deutliche Heraufregulierung von Genen beobachtet, die das Wachstum und Überleben von Zellen (z.B. Bcl-XL, Bcl-2, Nfκb1 und Egfr) vermitteln. Des Weiteren führte die längere Exposition zu einem Anstieg der Expression von Genen, die entscheidend an Migration, Adhäsion, Invasion und Metastasierung von Tumoren beteiligt sind. Dabei konnte ein enger Zusammenhang zwischen den FB1-induzierten Genexpressionsveränderungen und bereits bekannten extrazellulären und intrazellulären Signalwegen von bioaktiven Sphingoidbasen-1-Phosphaten hergestellt werden. Dazu zählte vor allem die Erhöhung von Genen, die wichtige Komponenten des ‚Plasminogen-Aktivator‘-Systems kodieren, und in Gegenwart von Sphingosine-1-Phosphat zu einer Erhöhung der Invasivität und Metastasierung, und somit möglicherweise auch zu einer begünstigten Bildung hochaggressiver und invasiver Tumoren in der Niere nach chronischer Exposition gegenüber FB1 beitragen können. Ein weiteres Ziel der Studie war es, mögliche Unterschiede in der organspezifischen Disposition für die Entstehung von Tumoren zu ermitteln, indem die FB1-vermittelten Effekte auf Apoptose, Zellproliferation, Sphingolipide, und ausgewählte krebsrelevante Gene zwischen Niere und Leber verglichen wurden. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse darauf hin, dass zwischen Niere und Leber deutliche Unterschiede in den verschiedenen Endpunkten der FB1-vermittelten Toxizität existieren, welche hauptsächlich mit der unterschiedlichen Anfälligkeit gegenüber den FB1-induzierten Veränderungen des Sphingolipidmetabolismus in Zusammenhang gebracht werden. Anhand der starken Korrelation zwischen den beobachteten histopathologischen Läsionen und gleichzeitig starken Veränderungen im Sphingolipidmetabolismus, sowie der Akkumulation von Sphingoidbasen-1-Phosphaten und entsprechender Expression der Sphingosine-1-Phosphatrezeptoren in der Niere, lässt sich vermuten, dass die Tumorentstehung- und Progression zu hoch malignen Karzinomen eher in der Niere als in der Leber begünstigt ist. Die durch die FB1-Behandlung am stärksten deregulierten Gene (PAI-1, Thbs1 und Itga2) in der Niere, wurden jedoch auch in der Leber durch FB1 induziert. Um die Genexpressionsveränderungen in der Niere zu verifizieren, wurden Ratten-tubulusepithelzellen (NRK-52E-Zellen) mit FB1 behandelt und Veränderungen in der Expression der gleichen krebsrelevanter Gene, die zuvor in vivo untersucht wurden, analysiert. Die Ergebnisse der qRT-PCR-Analyse zeigten, dass die Genexpressionsveränderungen in NRK-52E-Zellen nach Behandlung mit FB1 sowie die damit verbundenen Veränderungen im Sphingolipidmetabolismus stark mit denen in der Rattenniere korrelierten. Es konnte zudem sowohl in vivo als auch in vitro eine gute Übereinstimmung der FB1-induzierten Veränderungen in der Expression krebsrelevanter Gene gefunden werden, die auch in Signalwegen von Sphingoidbasen-1-Phosphaten und der damit verbundenen Krebsentstehung eine Rolle spielen. Darüber hinaus zeigten Experimente zur Untersuchung der Invasivität von NRK-52E-Zellen, dass diese nach Behandlung mit FB1 ein höheres Invasionspotential aufweisen. Dies korrelierte sowohl mit der Beobachtung von Expressionserhöhungen von invasions- und metastasierungsfördernden Genen als auch dem Anstieg bioaktiver Sphingoidbasen-1-Phosphate. Interessanterweise konnte in der vorliegenden Studie festgestellt werden, dass NRK-52E-Zellen die Sphingosine-1-Phosphatrezeptoren S1P2 und S1P3 expremieren und über diese Rezeptoren möglicherweise Signalwege zur Migration und Invasion anregen können. Da S1P2 und S1P3 auch als Hauptsphingosine-1-Phosphatrezeptoren in der Rattenniere identifiziert wurden, lässt sich vermuten, dass diese nach FB1-Behandlung in vivo wesentlich zur Expression von Genen, die die Invasivität von Zellen erhöhen, beitragen können. Zusammenfassend deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die FB1-vermittelte Störung im Sphingolipidmetabolismus und der damit verbundene zeit- und dosisabhängige Anstieg bioaktiver Intermediate wie den Sphingoidbasen-1-Phosphaten, zu frühen Veränderungen in Genen und Signalwegen führen kann. Diese können Zellwachstum, Inhibierung von Apoptose, Migration und Invasion und somit die Bildung von Nierentumoren nach Exposition gegenüber FB1 fördern. Um jedoch zu klären, ob die ermittelten Genexpressionsveränderungen der untersuchten krebsrelevanten Genen in der Niere spezifisch mit der Wirkung von Sphingoidbasen-1-Phosphaten und deren Rezeptoren zusammenhängen, sind weiterführende mechanistische Studien notwendig.
KW  - Nephrotoxizität
KW  - Carcinogenität
KW  - Fumonisine
KW  - Fumonisin B1
KW  - Mykotoxin
KW  - mycotoxin
KW  - fumonisin B1
KW  - nephrotoxicity
KW  - carcinogenicity
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71336
ER  - 
TY  - THES
A1  - Reiser, Pia
T1  - Das Adverse Outcome Pathway (AOP) – Konzept als Grundlage für die Entwicklung mechanistischer tierversuchsfreier Ansätze: Eine Fallstudie über Nephrotoxizität initiiert durch rezeptorvermittelte Endozytose und lysosomalen Overload
T1  - The Adverse Outcome Pathway (AOP) concept as a framework for the development of mechanistic non-animal approaches: a case study of nephrotoxicity initiated by receptor-mediated endocytosis and lysosomal overload
N2  - Zur Verbesserung der Prüfung und Risikobewertung der zunehmenden Menge von
Chemikalien und Arzneimitteln, gilt es neue Alternativen in Form von in vitro
Prüfmethoden mit mechanistisch relevanten Endpunkten zu finden. Einen solchen
Rahmen bietet das konzeptionelle Konstrukt des Adverse Outcome Pathway (AOP)-
Konzepts. Es erzeugt auf der Basis bestehenden Wissens einen mechanistischen und
kausalen Zusammenhang mit Hilfe von mehreren Schlüsselereignissen (Key Event [KE])
zwischen einem initierenden molekularen Ereignis (Molecular Initiating Event [MIE]) und
einem adversen Effekt (Adverse Outcome [AO]) auf biologischer Ebene. Im Rahmen
dieser Arbeit wurde der AOP „Rezeptorvermittelte Endozytose und lysosomaler
Overload führen zu Nephrotoxizität“ am Zellkulturmodell proximaler Nierentubuluszellen
weiterentwickelt. Es wurden in vitro Assays für die Zelllinien RPTEC/TERT1 (Mensch)
und NRK-52 E (Ratte) für jedes KE etabliert. In dem AOP wird die Initiierung der
Schädigung des Nierengewebes durch rezeptorvermittelte Endozytose der Substanzen
(MIE) mit folgendem lysosomalem Overload (KE 1) und der lysosomalen Membranruptur
(KE 2) beschrieben. Es kommt zur Zellschädigung (KE 3) und endet mit einem Schaden
auf Organebene (AO). Für KE 1 erfolgte die Visualisierung des lysosomal-assoziierten
Membranproteins (lysosomal-associated Membranprotein [LAMP]) und in KE 2 die
Darstellung der Protease Cathepsin D (CTSD) mittels Immunfluoreszenz. Für KE 3
wurden spezifische Toxizitätsdaten der Testsubstanzen mit dem CellTiter-Glo®
Lumineszenz-Zellviabilitätstest generiert. Gewählte Stressoren für den AOP war die
Gruppe der Polymyxin-Antibiotika (Polymyxin B, Colistin, Polymyxin B Nonapeptid), das
Aminoglykosid Gentamicin, das Glykopeptid Vancomycin sowie Cadmiumchlorid. In
Zusammenschau der Ergebnisse der drei KEs war die Rangfolge der Auswirkungen der
drei Polymyxin-Derivate über alle KEs konsistent. Polymyxin B erwies sich als aktivste
Substanz, während Polymyxin B Nonapeptid die geringsten Auswirkungen zeigte. Als
Ausblick in weiterführenden Analysen der Arbeitsgruppe konnten bei Cadmiumchlorid
trotz einer signifikanten Zytotoxizität (KE 3) nur geringe Auswirkungen in der LAMPExpression
(KE 1) aufgezeigt werden. Des Weiteren erfolgte die Erstellung von
Response-Response-Analysen, um mittels vorgeschalteter Schlüsselereignisse
nachfolgende Effekte vorhersagen zu können. Projektpartner der Universität Utrecht
entwickelten darüber hinaus eine quantitative in vitro in vivo Extrapolation (QIVIVE)
mittels eines physiologisch basierten pharmakokinetischen (PBPK) Modells.
N2  - To improve testing and risk assessment of the increasing amount of chemicals and drugs, new alternatives of in vitro testing methods with mechanistically relevant endpoints need to be found. The conceptual construct of the Adverse Outcome Pathway (AOP) concept provides such a framework. It generates a mechanistic and causal relationship based on existing knowledge using multiple key events (KE) between an initiating molecular event (MIE) and an adverse outcome (AO) at a biological level. In this work, the AOP "Receptor-mediated endocytosis and lysosomal overload lead to nephrotoxicity" was further developed using a cell culture model of proximal renal tubular cells. In vitro assays were established for the RPTEC/TERT1 (human) and NRK-52E (rat) cell lines for each KE. In the AOP, initiation of renal tissue damage by receptor-mediated endocytosis of substances (MIE) with subsequent lysosomal overload (KE 1) and lysosomal membrane rupture (KE 2) is described. Cell damage occurs (KE 3) and ends with organ damage (AO). For KE 1, visualization of lysosomal-associated membrane protein (LAMP), and for KE 2, visualization of protease cathepsin D (CTSD) was used by immunofluorescence. For KE 3, specific test substance toxicity data were generated using the CellTiter-Glo® luminescence cell viability assay. Selected stressors for the AOP were polymyxin antibiotics (polymyxin B, colistin, polymyxin B nonapeptide), the aminoglycoside gentamicin, the glycopeptide vancomycin, and cadmium chloride. All results of the three KEs combined, the ranking of the effects of the three polymyxin derivatives was consistent across all KEs. Polymyxin B proved to be the most active compound, while polymyxin B nonapeptide showed the lowest effects. In further analyses of the working group, only minor effects in LAMP expression (KE 1) could be shown with cadmium chloride despite a significant cytotoxicity (KE 3). Furthermore, response-response analyses were performed to predict upstream effects by downstream key events. Project partners from Utrecht University also developed a quantitative in vitro to in vivo extrapolation (QIVIVE) using a physiologically based pharmacokinetic (PBPK) model.
KW  - Nephrotoxizität
KW  - Lysosom
KW  - Endozytose
KW  - Adverse Outcome Pathway
KW  - rezeptorvermittelte Endozytose
KW  - lysosomaler Overload
KW  - tierversuchsfrei
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-318046
ER  -