TY - THES A1 - Saal, Lena T1 - Whole transcriptome profiling of compartmentalized motoneurons T1 - Globale Transkriptomanalyse von kompartimentierten Motoneuronen N2 - Spinal muscular atrophy and amyotrophic lateral sclerosis are the two most common devastating motoneuron diseases. The mechanisms leading to motoneuron degeneration are not resolved so far, although different hypotheses have been built on existing data. One possible mechanism is disturbed axonal transport of RNAs in the affected motoneurons. The underlying question of this study was therefore to characterize changes in transcript levels of distinct RNAs in cell culture models of spinal muscular atrophy and amyotrophic lateral sclerosis, especially in the axonal compartment of primary motoneurons. To investigate this in detail we first established compartmentalized cultures of Primary mouse motoneurons. Subsequently, total RNA of both compartments was extracted separately and either linearly amplified and subjected to microarray profiling or whole transcriptome amplification followed by RNA-Sequencing was performed. To make the whole transcriptome amplification method suitable for compartmentalized cultures, we adapted a double-random priming strategy. First, we applied this method for initial optimization onto serial dilutions of spinal cord RNA and later on to the compartmentalized motoneurons. Analysis of the data obtained from wildtype cultures already revealed interesting results. First, the RNA composition of axons turned out to be highly similar to the somatodendritic compartment. Second, axons seem to be particularly enriched for transcripts related to protein synthesis and energy production. In a next step we repeated the experiments by using knockdown cultures. The proteins depleted hereby are Smn, Tdp-43 and hnRNP R. Another experiment was performed by knocking down the non-coding RNA 7SK, the main interacting RNA of hnRNP R. Depletion of Smn led to a vast number of deregulated transcripts in the axonal and somatodendritic compartment. Transcripts downregulated in the axons upon Smn depletion were especially enriched for GOterms related to RNA processing and encode proteins located in neuron projections including axons and growth cones. Strinkingly, among the upregulated transcripts in the somatodendritic compartment we mainly found MHC class I transcripts suggesting a potential neuroprotective role. In contrast, although knockdown of Tdp-43 also revealed a large number of downregulated transcripts in the axonal compartment, these transcripts were mainly associated with functions in transcriptional regulation and RNA splicing. For the hnRNP R knockdown our results were again different. Here, we observed downregulated transcripts in the axonal compartment mainly associated with regulation of synaptic transmission and nerve impulses. Interestingly, a comparison between deregulated transcripts in the axonal compartment of both hnRNP R and 7SK knockdown presented a significant overlap of several transcripts suggesting some common mechanism for both knockdowns. Thus, our data indicate that a loss of disease-associated proteins involved in axonal RNA transport causes distinct transcriptome alterations in motor axons. N2 - Spinale Muskelatrophie und Amyotrophe Lateralsklerose zählen zu den beiden häufigsten und schwersten Motoneuronerkrankungen. Der zugrunde liegende Mechanismus beider Krankheiten ist bis heute nicht geklärt, dennoch werden verschiedene Theorien diskutiert. Ein möglicher Grund ist ein gestörter axonaler Transport von RNAs in den betroffenen Motoneuronen. Daraus folgernd ergab sich die zugrunde liegende Frage dieser Arbeit, ob Veränderungen in den Transkriptleveln bestimmter RNAs unter krankheitsähnlichen Bedingungen vor allem im axonalen Kompartiment von primären Maus-Motoneuronen beobachtet werden können. Um die Fragestellung genauer zu untersuchen, etablierten wir zuerst kompartimentierte Kulturen von primären Motoneuronen. Darauffolgend haben wir die totale RNA aus beiden Kompartimenten separat extrahiert und entweder diese linear amplifiziert und zur Microarrayanalyse gegeben oder wir führten eine Amplifikation des kompletten Transkriptoms mit anschließender RNA-Sequenzierung durch. Um die Amplifikation des kompletten Transkriptoms auch für die kompartimentierten Kulturen geeignet zu machen, verwendeten wir eine doublerandom priming Strategie und haben diese entsprechend angepasst. Zuerst wendeten wir die Methode an Serienverdünnungen von RNA aus dem Rückenmark an, um die Methode zu optimisieren. Später benutzten wir die Methode ebenfalls für kompartimentierte Motoneurone. Schon die Analyse der Wildtyp-Daten lieferte interessante Ergebnisse. Erstens, die Zusammensetzung der RNA in Axonen war höchst ähnlich zu der im somatodendritischen Kompartiment. Zweitens, in Axonen scheinen speziell Transkripte angereichert zu sein, welche mit Proteinsynthese und Energieproduktion in Verbindung stehen. In einem nächsten Schritt wurden dann die Experimente unter Verwendung von Knockdown-Kulturen wiederholt. Die Proteine, die dabei vermindert wurden waren Smn, Tdp-43 und hnRNP R. Ein weiteres Experiment wurde durchgeführt indem die nicht-codierende RNA 7SK verringert wurde. Die Depletion von Smn führte zu einer hohen Anzahl an deregulierten Transkripten sowohl im axonalen, als auch im somatodendritischen Kompartiment. Transkripte, die im axonalen Kompartiment nach Smn Depletion verringert waren, waren überwiegend für GOTerms angereichert, welche mit RNA Prozessierung in Verbindung stehen oder welche Proteine codieren, die in neuronalen Fortsätzen, einschließlich Axon und Wachstumskegel lokalisiert sind. Bemerkenswert ist, dass wir unter den hochregulierten Transkripten im somatodendritischen Kompartiment überwiegend MHC Klasse I Transkripte gefunden haben. Dies könnte eine mögliche neuroprotektive Rolle dieser Transkripte annehmen lassen. Im Gegensatz zu den Ergebnissen beim Smn Knockdown fanden wir beim Tdp-43 Knockdown ebenfalls eine große Anzahl an herunterregulierten Transkripten im axonalen Kompartiment, diese sind allerdings überwiegend mit Funktionen in der Transkriptionsregulierung und beim RNA Splicing assoziiert. Die Ergebnisse des hnRNP R Knockdowns waren ebenfalls unterschiedlich. Bei diesem fanden wir die herunteregulierten Transkripte im axonalen Kompartiment überwiegend mit einer Regulierung der synaptischen Übertragung sowie mit Nervenimpulsen assoziiert. Interessanterweise zeigte ein Vergleich der deregulierten Transkripte sowohl im axonalen Kompartiment vom hnRNP R Knockdown, als auch vom 7SK Knockdown eine signifikante Übereinstimmung mehrerer Transkripte. Dies lässt einen teilweise gemeinsamen Mechanismus für beide Genprodukte vermuten. Somit deuten unsere Daten darauf hin, dass ein Verlust von krankheitsassoziierten Proteinen, die eine Rolle beim axonalen RNA-Transport spielen, zu verschiedenen Transkriptomveränderungen in Axonen von Motoneuronen führt. KW - Axon KW - Motoneuron KW - Spinale Muskelatrophie KW - amyotrophic lateral sclerosis Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-140006 ER - TY - THES A1 - Wetzel, Andrea T1 - The role of TrkB and NaV1.9 in activity-dependent axon growth in motoneurons T1 - Die Rolle von TrkB und NaV1.9 in aktivitätsabhängigem Axonwachstum von Motoneuronen N2 - Während der Entwicklung des Nervensystems lassen sich bei Motoneuronen aktivitätsabhängige Kalziumströme eobachten, die das Axonwachstum regulieren. Diese Form der neuronalen Spontanaktivität sowie das Auswachsen von Axonen sind bei Motoneuronen, die aus Tiermodellen der Spinalen Muskelatrophie isoliert werden, gestört. Experimente aus unserer Arbeitsgruppe haben gezeigt, dass spontane Erregbarkeit und aktivitätsabhängiges Axonwachstum von kultivierten Motoneuronen auch unter Verwendung von Toxinen beeinträchtigt sind, welche die Aktivität von spannungsabhängigen Natriumkanälen blockieren. In diesen Versuchen war die Wirkung von Saxitoxin effizienter als die Wirkung von Tetrodotoxin. Wir identifizierten den Saxitoxin-sensitiven/Tetrodotoxin-insensitiven spannungsabhängigen Natriumkanal NaV1.9 als Trigger für das Öffnen spannungsabhängiger Kalziumkanäle. Die Expression von NaV1.9 in Motoneuronen konnte über quantitative RT-PCR nachgewiesen werden und antikörperfärbungen offenbarten eine Anreicherung des Kanals im axonalen Wachstumskegel sowie an Ranvier'schen Schnürringen von isolierten Nervenfasern wildtypischer Mäuse. Motoneurone von NaV1.9 knock-out Mäusen zeigen reduzierte Spontanaktivität und eine Reduktion des Axonwachstums, welche durch NaV1.9 Überexpression normalisiert werden kann. In Motoneuronen von Smn-defizienten Mäusen konnte keine Abweichung der NaV1.9 Proteinverteilung nachgewiesen werden. Kürzlich wurden Patienten identifiziert, die eine missense-Mutation im NaV1.9 kodierenden SCN11A Gen tragen. Diese Patienten können keinerlei Schmerz empfinden und leiden zudem an Muskelschwäche in Kombination mit einer verzögerten motorischen Entwicklung. Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnten molekularbiologische Untersuchungen an Mäusen, welche die Mutation im orthologen Scn11a Gen tragen, zur Aufklärung des Krankheitsmechanismus beitragen. Die Kooperationsstudie zeigte, dass eine gesteigerte Funktion von NaV1.9 diese spezifische Kanalerkrankung auslöst, was die Wichtigkeit von NaV1.9 in menschlichen Motoneuronen unterstreicht. Eine frühere Studie beschrieb an hippocampalen Neuronen, dass die Rezeptortyrosinkinase tropomyosin receptor kinase B (TrkB) den NaV1.9 Kanal öffnen kann. Im Wachstumskegel von Motoneuronen ist TrkB nachweisbar und folglich in räumlicher Nähe zu NaV1.9 zu finden. Um zu prüfen, ob TrkB in die spontane Erregbarkeit von Motoneuronen involviert ist, wurden TrkB knock-out Mäuse untersucht. Isolierte Motoneurone von TrkB knock-out Mäusen weisen eine Reduktion der Spontanaktivität und eine Verringerung des Axonwachstums auf. Ob TrkB und NaV1.9 hierbei funktionell gekoppelt sind, ist Gegenstand künftiger Forschung. N2 - During development of the nervous system, spontaneous Ca2+ transients are observed that regulate the axon growth of motoneurons. This form of spontaneous neuronal activity is reduced in motoneurons from a mouse model of spinal muscular atrophy and this defect correlates with reduced axon elongation. Experiments from our group demonstrated that voltage-gated sodium channel pore blockers decrease spontaneous neuronal activity and axon growth in cultured motoneurons, too. In these experiments, saxitoxin was more potent than tetrodotoxin. We identified the saxitoxin-sensitive/tetrodotoxin-insensitive voltage-gated sodium channel NaV1.9 as trigger for the opening of voltage-gated calcium channels. In motoneurons, expression of NaV1.9 was verified via quantitative RT-PCR. Immuno labelling experiments revealed enrichment of the channel in axonal growth cones and at the nodes of Ranvier of isolated nerve fibres from wild type mice. Motoneurons from NaV1.9 knock-out mice show decreased spontaneous activity and reduced axonal elongation. This growth defect can be rescued by NaV1.9 overexpression. In motoneurons from Smn-deficient mice, NaV1.9 distribution appeared to be normal. Recently, patients carrying a missense mutation in the NaV1.9-encoding gene SCN11A were identified. These patients are not able to feel pain and suffer from muscular weakness and a delayed motor development. Molecular biological work during this dissertation supported the analysis of this mutation in a mouse model carrying the orthologous alteration in the Scn11a locus. The cooperation study confirmed that a gain-of-function mechanism underlies the NaV1.9-mediated channelopathy, thus suggesting a functional role of NaV1.9 in human motoneurons. An earlier study showed in hippocampal neurons that the receptor tyrosine kinase tropomyosin receptor kinase B (TrkB) can open the NaV1.9 channel. TrkB is localized in growth cones of motoneurons and subsequently found in close proximity to NaV1.9. In order to proof whether TrkB is involved in spontaneous excitability in motoneurons, TrkB knock-out mice were analysed. Isolated motoneurons from TrkB knock-out mice show a reduced spontaneous activity and axon elongation. It remains to be studied whether TrkB and NaV1.9 are functionally connected. KW - Motoneuron KW - Neurotrophic factors KW - NaV1.9 KW - motoneuron KW - spontaneous neuronal activity KW - Axon KW - Wachstum KW - Natriumkanal KW - TrkB Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-92877 ER - TY - THES A1 - Sivadasan, Rajeeve T1 - The role of RNA binding proteins in motoneuron diseases T1 - Die Rolle von RNA-bindenden Proteinen in Motoneuronerkrankungen N2 - Motoneuron diseases form a heterogeneous group of pathologies characterized by the progressive degeneration of motoneurons. More and more genetic factors associated with motoneuron diseases encode proteins that have a function in RNA metabolism, suggesting that disturbed RNA metabolism could be a common underlying problem in several, perhaps all, forms of motoneuron diseases. Recent results suggest that SMN interacts with hnRNP R and TDP-43 in neuronal processes, which are not part of the classical SMN complex. This point to an additional function of SMN, which could contribute to the high vulnerability of spinal motoneurons in spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). The current study elucidates functional links between SMN, the causative factor of SMA (spinal muscular atrophy), hnRNP R, and TDP-43, a genetic factor in ALS (amyotrophic lateral sclerosis). In order to characterize the functional interaction of SMN with hnRNP R and TDP-43, we produced recombinant proteins and investigated their interaction by co-immunoprecipitation. These proteins bind directly to each other, indicating that no other co-factors are needed for this interaction. SMN potentiates the ability of hnRNP R and TDP-43 to bind to ß-actin mRNA. Depletion of SMN alters the subcellular distribution of hnRNP R in motoneurons both in SMN-knockdown motoneurons and SMA mutant mouse (delta7 SMA). These data point to functions of SMN beyond snRNP assembly which could be crucial for recruitment and transport of RNA particles into axons and axon terminals, a mechanism which may contribute to SMA pathogenesis and ALS. ALS and FTLD (frontotemporal lobar degeneration) are linked by several lines of evidence with respect to clinical and pathological characteristics. Both sporadic and familial forms are a feature of the ALS-FTLD spectrum, with numerous genes having been associated with these pathological conditions. Both diseases are characterized by the pathological cellular aggregation of proteins. Interestingly, some of these proteins such as TDP-43 and FUS have also common relations not only with ALS-FTLD but also with SMA. Intronic hexanucleotide expansions in C9ORF72 are common in ALS and FTLD but it is unknown whether loss of function, toxicity by the expanded RNA or dipeptides from non ATG-initiated translation is responsible for the pathophysiology. This study tries to characterize the cellular function of C9ORF72 protein. To address this, lentiviral based knockdown and overexpression of C9ORF72 was used in isolated mouse motoneurons. The results clearly show that survival of these motoneurons was not affected by altered C9ORF72 levels, whereas adverse effects on axon growth and growth cone size became apparent after C9ORF72 suppression. Determining the protein interactome revealed several proteins in complexes with C9ORF72. Interestingly, C9ORF72 is present in a complex with cofilin and other actin binding proteins that modulate actin dynamics. These interactions were confirmed both by co-precipitation analyses and in particular by functional studies showing altered actin dynamics in motoneurons with reduced levels of C9ORF72. Importantly, the phosphorylation of cofilin is enhanced in C9ORF72 depleted motoneurons and patient derived lymphoblastoid cells with reduced C9ORF72 levels. These findings indicate that C9ORF72 regulates axonal actin dynamics and the loss of this function could contribute to disease pathomechanisms in ALS and FTLD. N2 - Motoneuronerkrankungen bilden eine heterogene Gruppe von Pathologien, die durch die progressive Degeneration von Motoneuronen charakterisiert sind. Zunehmend werden genetische Faktoren in Assoziation mit Motoneuronerkrankungen identifiziert, die eine Funktion im RNA Metabolismus besitzen, was dafür spricht, dass ein gestörter RNA Metabolismus ein gemeinsames zugrunde liegendes Problem in mehreren, vielleicht allen, Formen von Motoneuronerkrankungen sein könnte. Neuere Ergebnisse legen nahe, dass SMN mit hnRNP R und TDP-43 in neuronalen Prozessen interagiert, die nicht Teil der klassischen Rolle des SMN Komplexes sind. Dies deutet auf eine zusätzliche Funktion von SMN hin, die zur hohen Störanfälligkeit von spinalen Motoneuronen in spinaler Muskelatrophie (SMA) und amyotropher Lateralsklerose (ALS) beitragen könnte. Die vorliegende Arbeit beleuchtet funktionelle Beziehungen zwischen SMN, dem auslösenden Faktor der SMA, und hnRNP R, sowie TDP-43, einem weiteren genetischen Faktor bei ALS. Um die funktionelle Interaktion von SMN mit hnRNP R und TDP-43 zu charakterisieren, wurden rekombinante Proteine hergestellt und ihre Interaktion durch co-Immunpräzipitation untersucht. Diese Proteine binden direkt an einander, was darauf hindeutet, dass für diese Interaktion keine weiteren co-Faktoren erforderlich sind. SMN potenziert die Fähigkeit von hnRNP R und TDP-43, β-Aktin mRNA zu binden. Depletion von SMN verändert die subzelluläre Verteilung von hnRNP R in Motoneuronen sowohl in SMN-knock-down Motoneuronen, als auch in der SMA Mausmutante (delta7 SMA). Diese Daten deuten auf Funktionen von SMN jenseits der snRNP Assemblierung hin, die entscheidend für die Rekrutierung und den Transport von RNA Partikel in Axonen und Axon Terminalen sein könnten, einem Mechanismus, der zur Pathogenese von SMA und ALS beitragen könnte. ALS und FTLD (fronto-temporale Lobus Degeneration) sind aufgrund mehrerer Nachweislinien bezüglich klinischer und pathologischer Charakteristika vernetzt. Sowohl sporadische als auch familiäre Formen sind Merkmal des ALS-FTLD Spektrums, wobei zahlreiche Gene mit diesen pathologischen Erscheinungen assoziiert wurden. Beide Krankheiten sind durch pathologische zelluläre Proteinaggregation charakterisiert. Interessanterweise haben einige dieser Proteine, wie TDP-43 und FUS, einen gemeinsamen Bezug nicht nur mit ALS-FTLD, sondern auch mit SMA. Intronische Hexanukleotid-Expansionen in C9ORF72 sind häufig in ALS und FTLD, es ist jedoch unbekannt, ob Funktionsverlust, Toxizität aufgrund der verlängerten RNA, oder Dipeptide von non-ATG initiierter Translation für die Pathophysiologie verantwortlich sind. Die vorliegende Arbeit versucht die zelluläre Funktion von C9ORF72 Protein zu charakterisieren. Hierfür wurde lentiviraler knock-down und Überexpression von C9ORF72 in isolierten Motoneuronen eingesetzt. Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass das Überleben dieser Motoneurone durch veränderte C9ORF72 Konzentrationen nicht beeinflusst wurde, wohingegen negative Auswirkungen auf Axonwachstum und Wachstumskegelgröße nach C9ORF72 Suppression deutlich wurden. Die Bestimmung des Protein Interaktoms identifizierte mehrere Proteinkomplexe mit C9ORF72. Interessanterweise liegt C9ORF72 in einem Komplex mit Cofilin und anderen Aktin-bindenden Protein vor, welche die Aktin Dynamik modulieren. Diese Interaktionen wurden sowohl durch Analyse von co-Präzipitationen als auch besonders durch funktionelle Studien bestätigt, die eine veränderte Aktin Dynamik in Motoneuronen mit reduzierter C9ORF72 Konzentration zeigten. Wichtig ist die Beobachtung, dass die Phosphorylierung von Cofilin in C9ORF72 depletierten Motoneuronen und in Lymphoblastoid-Zellen mit reduzierter C9ORF72 Konzentration verstärkt ist. Diese Ergebnisse zeigen, dass C9ORF72 die axonale Aktin Dynamik reguliert und dass der Verlust dieser Funktion zu Krankheits-Pathomechanismen in ALS und FTLD beitragen könnte. KW - Motoneuron KW - RNA binding proteins KW - Krankheit KW - RNS-Bindungsproteine KW - Motoneuron diseases Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-141907 ER - TY - THES A1 - Pei, Geng T1 - The Role of Raf-mediated Signalling Pathways for Motoneuron T1 - Die Rolle von Raf-vermittelten Signalwegen bei Entwicklung und Überleben von Motoneuronen N2 - The transmission of proliferative and developmental signals from activated cell-surface receptors to initiation of cellular responses in the nucleus is synergically controlled by the coordinated action of a diverse set of intracellular signalling proteins. The Ras/Raf/MEK/MAPK signalling pathway has been shown to control the expression of genes which are crucial for the physiological regulation of cell proliferation, differentiation and apoptosis. Within this signalling cascade, the Raf protein family of serine/threonine kinases serves as a central intermediate which connects to many of other signal transduction pathways. To elucidate the signalling functions of the different Raf kinases in motoneurons during development, the expression, distribution and subcellular localization of Rafs in the spinal cord and the facial nucleus in brainstem of mice at various embryonic and postnatal stages were investigated. Moreover, we have investigated the intracellular redistribution of Raf molecules in isolated motoneurons from 13 or 14 day old mouse embryos, after addition or withdrawal of neurotrophic factors to induce Raf kinases activation in vitro. Furthermore, in order to investigate the potential anti-apoptotic function of Raf kinases on motoneurons, we isolated motoneurons from B-raf-/- and c-raf-1-/- mouse embryos and analysed the survival and differentiation effects of neurotrophic factors in motoneurons lacking B-Raf and c-Raf-1. We provide evidence here that all three Raf kinases are expressed in mouse spinal motoneurons. Their expression increases during the period of naturally occurring cell death of motoneurons. In sections of embryonic and postnatal spinal cord, motoneurons express exclusively B-Raf and c-Raf-1, but not A-Raf, and subcellularly Raf kinases are obviously colocalized with mitochondria. In isolated motoneurons, most of the B-Raf or c-Raf-1 immunoreactivity is located in the perinuclear space but also in the nucleus, especially after activation by addition of CNTF and BDNF in vitro. We found that c-Raf-1 translocation from the cytosol into the nucleus of motoneurons after its activation by neurotrophic factors is a distinct event. As a central finding of our study, we observed that the viability of isolated motoneurons from B-raf but not c-raf-1 knockout mice is lost even in the presence of CNTF and other neurotrophic factors. This indicates that B-Raf but not c-Raf-1, which is still present in B-raf deficient motoneurons, plays a crucial role in mediating the survival effect of neurotrophic factors during development. In order to prove that B-Raf is an essential player in this scenario, we have re-expressed B-Raf in mutant sensory and motor neurons by transfection. The motoneurons and the sensory neurons from B-raf knockout mouse which were transfected with exogenous B-raf gene revealed the same viability in the presence of neurotrophic factors as primary neurons from wild-type mice. Our results suggest that Raf kinases have important signalling functions in motoneurons in mouse CNS. In vitro, activation causes redistribution of Raf protein kinases, particularly for c-Raf-1, from motoneuronal cytoplasm into the nucleus. This redistribution of c-Raf-1, however, is not necessary for the survival effect of neurotrophic factors, given that B-raf-/- motor and sensory neurons can not survive despite the presence of c-Raf-1. We hypothesize that c-Raf-1 nuclear translocation may play a direct role in transcriptional regulation as a consequence of neurotrophic factor induced phosphorylation and activation of c-Raf-1 in motoneurons. Moreover, the identification of target genes for nuclear translocated c-Raf-1 and of specific cellular functions initiated by this mechanism awaits its characterization. N2 - Die Vermittlung von wachstumsfördernden und entwicklungsspezifischen Signalen von aktivierten Zelloberflächenrezeptoren führt zur Initiation von Transkriptionsprogrammen im Zellkern, die durch das koodinierte Zusammenwirken von intrazellulären Signalproteinen synergistisch gesteuert werden. Der Ras/Raf/MEK/MAPK-Weg steuert die Expression von Genen für die physiologische Regulation der Zellproliferation, Differenzierung und Apoptose. Innerhalb dieser Signalkaskade stellen die Serin/Threonin Kinasen der Raf Familie eine zentrale Zwischenstufe dar, die Verbindungen zu vielen anderen Signaltransduktionswegen herstellt. Um die Funktionen der verschiedenen Raf-Kinasen in Motoneuronen während der Entwicklung aufzuklären, wurden die Expression, Verteilung und subzelluläre Lokalisation der Raf-Isoformen in spinalen Motoneuronen und im Nucleus Fazialis der Maus während der Embryonalentwicklung und postnatal untersucht. Desweiteren haben wir die intrazelluläre Umverteilung der Raf-Moleküle in isolierten Motoneuronen von 13 oder 14 Tage alten Mäusembryonen untersucht. Um die Rolle der Raf-Kinasen nach Zugabe oder Entzug von neurotrophen Faktoren bei Motoneuronen zu untersuchen, analysierten wir die Überlebens-und Differenzierungseffekte von neurotrophen Faktoren bei Motoneuronen von B-raf oder c-raf-1 defizienten Mäusen. Wir zeigen in dieser Arbeit, daß alle drei Raf-Kinasen in spinalen Motoneuronen der Mäuse exprimiert sind. Ihre Expression steigt während der Zeit des natürlich auftretenden Zelltods. An Schnitten von embryonalem und postnatalem Rückenmark exprimieren Motoneurone ausschließlich B-Raf and c-Raf-1, aber nicht A-Raf. Raf-Kinasen sind offensichtlich an Mitochondrien lokalisiert. In isolierten Motoneuronen findet man B-Raf und c-Raf-1, Immunreaktivität vor allem im perinukleären Bereich, aber auch im Zellkern, vor allem nach Aktivierung durch Zugabe von CNTF und BDNF in vitro. Wir haben gefunden, daß die Translokation von c-Raf-1 vom Zytosol in den Nukleus von Motoneuronen nach Aktivierung durch neurotrophe Faktoren ein spezifischer Vorgang ist. Als zentralen Befund dieser Arbeit beobachteten wir, daß Motoneurone von B-raf-/-, aber nicht von c-raf-1-/-, Embryonen nicht lebensfähig sind, auch nicht in Gegenwart von CNTF oder anderer neurotropher Faktoren. Dies bedeutet, daß B-Raf und nicht c-Raf-1, welches noch immer in B-raf defizienten Motoneuronen präsent ist, eine entscheidende Rolle als Vermitter des Überlebenseffektes von neurotrophen Faktoren spielt. Um zu beweisen, daß B-Raf hierbei eine essentielle Komponente darstellt, haben wir in B-raf defizienten sensorischen und Motoneuronen B-Raf durch Transfektion exprimiert. Erfolgreich mit B-raf Plasmid transfizierte B-raf-/- sensorische und Motoneurone zeigten dieselbe Überlebensfähigkeit in Gegenwart von neurotrophen Faktoren wie primäre Neurone von Wildtyp-Mäusen. Diese Arbeit zeigt daher, daß Raf-Kinasen wichtige Funktionen in Motoneuronen der Maus haben. Die Aktivierung von Raf-Kinasen in vitro führt zur Änderung ihrer subzellulären Verteilung, vor allem von c-Raf-1 vom Zytoplasma in den Kern. Diese Umverteilung von c-Raf-1 ist jedoch nicht notwendig für den Überlebenseffekt von neurotrophen Faktoren, vor allem, wenn man in Betracht zieht, daß B-raf defiziente sensorische und Motoneuronen trotz der Gegenwart von c-Raf-1 nicht überleben. Wir nehmen an, daß die nukleäre Translokation von c-Raf-1 eine direkte Rolle bei der transkriptionellen Regulation durch neurotrophe Faktoren spielt. Die Indentifizierung von c-Raf-1 regulierten Zielgenen und von durch diese beeinflussten zellulären Funktionen ist eine Aufgabe für die Zukunft. KW - Maus KW - Motoneuron KW - Zelldifferenzierung KW - Raf KW - Signaltransduktion KW - Raf-Kinasen KW - Motoneuron KW - Raf-Kinase KW - Zentrales Nervensystem KW - motoneuron KW - Raf KW - CNS Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1846 ER - TY - THES A1 - Rathod, Reenaben Jagdishbhai T1 - Study of local protein synthesis in growth cones of embryonic mouse motor neurons T1 - Analyse der lokalen Proteinsynthese in Wachstumskegeln von embryonalen Maus Motoneuronen N2 - In cultured motoneurons of a mouse model for the motoneuron disease spinal muscular atrophy (SMA), reduced levels of the protein SMN (survival of motoneurons) cause defects in axonal growth. This correlates with reduced β-actin mRNA and protein in growth cones, indicating that anterograde transport and local translation of β-actin mRNA are crucial for motoneuron function. However, direct evidence that indeed local translation is a physiological phenomenon in growth cones of motoneurons was missing. Here, a lentiviral GFP-based reporter construct was established to monitor local protein synthesis of β-actin mRNA. Time-lapse imaging of fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) in living motoneurons revealed that β-actin is locally translated in the growth cones of embryonic motoneurons. Interestingly, local translation of the β-actin reporter construct was differentially regulated by different laminin isoforms, indicating that laminins provide extracellular cues for the regulation of local translation in growth cones. Notably, local translation of β-actin mRNA was deregulated when motoneurons of a mouse model for type I SMA (Smn-/-; SMN2) were analyzed. In situ hybridization revealed reduced levels of β-actin mRNA in the axons of Smn-/-; SMN2 motoneurons. The distribution of the β-actin mRNA was not modified by different laminin isoforms as revealed by in situ hybridization against the mRNA of the eGFP encoding element of the β-actin reporter. In case of the mRNA of α-actin and γ-actin isoforms, the endogenous mRNA did not localize to the axons and the localization pattern was not affected by the SMN levels expressed in the cell. Taken together our findings suggest that regulation of local translation of β-actin in growth cones of motoneurons critically depends on laminin signaling and the amount of SMN protein. Embryonic stem cell (ESC)-derived motoneurons are an excellent in vitro system to sort out biochemical and cellular pathways which are defective in neurodegenerative diseases like SMA. Here, a protocol for the differentiation and antibody-mediated enrichment of ESC-derived motoneurons is presented, which was optimized during the course of this study. Notably, this study contributes the production and purification of highly active recombinant sonic hedgehog (Shh), which was needed for the efficient differentiation of mouse ESCs to motoneurons. ESC-derived motoneurons will now offer high amounts of cellular material to allow the biochemical identification of disease-relevant molecular components involved in regulated local protein synthesis in axons and growth cones of motoneurons. N2 - In kultivierten Motoneuronen eines Maus-Models für die Motoneuronen-Erkrankung Spinale Muskelatrophie (SMA) verursachen verminderte Mengen des Proteins SMN (survival of motoneurons) Schäden im axonalen Wachstum. Dies korreliert mit einer verminderten Menge an β-Aktin kodierender mRNA und β-Aktin Protein. Dies impliziert, dass anterograder Transport und lokale Translation von β-Aktin mRNA für die Motoneuronfunktion notwendig ist. Bislang gab es jedoch keinen direkten Nachweiß funktioneller lokaler Translation in Wachstumskegeln von Motoneuronen. In dieser Arbeit wurde ein lentivirales GFP-basierendes Reporterkonstrukt etabliert, welches lokale Proteinsynthese von β-Aktin mRNA nachweißt. Zeitraffermikroskopie von GFP-vermittelter Fluoerszenzregeneration nach Fotobleichung (fluorescence recovery after photobleaching; FRAP) in lebenden Motoneuronen zeigte, dass β-Aktin in Wachstumskegeln embryonaler Motoneuronen lokal translatiert wird. Interessanterweise wurde die lokale Translation des β-Aktin Reporterkonstrukts differentiell durch verschiedene Laminin-Isoformen reguliert. Dies gibt einen Hinweis, dass Laminin als extrazelluläres Signalmolekül die Regulation der lokalen Translation in Wachstumskegeln reguliert. Die lokale Translation von β-Aktin mRNA war dereguliert wenn Motoneurone eines Mausmodels für die Typ I SMA (Smn-/-;SMN2) analysiert wurden. In situ Hybridisierung bestätigte eine Reduktion von β-Aktin mRNA in den Axonen von Smn-/-;SMN2 Motoneuronen. Die Verteilung der β-Aktin mRNA wurde von verschiedenen Laminin-Isoformen nicht beeinflusst, wie durch in situ Hybridisierung gegen eGFP kodierende Elemente des β-Aktin Reporters bestätigt werden konnte. Im Fall der mRNA für α-Aktin und γ-Aktin Isoformen wurde keine axonale Lokalisierung der endogenen mRNAs festgestellt und das Lokalisierungsmuster dieser mRNAs war durch reduzierte zelluläre SMN Mengen nicht beeinflusst. Zusammenfassend deuten diese Befunde darauf hin, dass die lokale Translation von β-Aktin in Wachstumskegeln von Motoneuronen von Laminin-Signalgebung und von der Menge an SMN Protein abhängt. Motoneurone aus embryonalen Stammzellen sind ein etabliertes in vitro System um biochemische und zelluläre Signalwege zu identifizieren, die in neurodegenerativen Erkrankungen wie SMA betroffen sind. Hier wird ein Protokoll zur Differenzierung und Antikörper-gestützten Anreicherung von Motoneuron aus embryonalen Stammzellen präsentiert, welches im Rahmen dieser Arbeit optimiert wurde. Im Besonderen wird die Herstellung und Reinigung von hochaktivem Sonic Hedgehog (Shh) vorgestellt, welches für die effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus notwendig war. Motoneurone aus embryonalen Stammzellen werden in zukünftigen Studien nun große Mengen an zellulärem Material liefern, und somit auf biochemischer Ebene die Identifizierung von krankheitsrelevanten molekularen Komponenten ermöglichen, die in der Regulation der lokalen Proteinsynthese in Axonen und Wachstumskegeln von Motoneuronen involviert sind. KW - Motoneuron KW - Maus KW - Embryo KW - Proteinsynthese KW - lokale Proteinsynthese KW - embryonale Maus KW - SMN KW - local translation KW - SMN KW - motor neuron KW - beta actin Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72045 ER - TY - THES A1 - Subramanian, Narayan T1 - Role of NaV1.9 in activity dependent axon growth in embryonic cultured motoneurons T1 - Die Rolle der NaV1.9 in Aktivität abhängig Axonwachstum in embryonalen kultivierten Motoneuronen N2 - Spontaneous neural activity has been shown to regulate crucial events in neurite growth including axonal branching and path finding. In animal models of spinal muscular atrophy (SMA) cultured embryonic mouse motoneurons show distinct defect in axon elongation and neural activity. This defect is governed by abnormal clustering of Ca2+ channels in the axonal regions and the protruding growth cone area. The mechanisms that regulate the opening of calcium channels in developing motoneurons are not yet clear. The question was addressed by blocking neural activity in embryonic cultured motoneurons by pharmacological inhibition of voltage-gated sodium channels (VGSC) by saxitoxin (STX) and tetrodotoxin (TTX). Low dosages of STX resulted in significant reduction of axon growth and neural activity in cultured motoneurons. This pharmacological treatment did not affect survival of motoneurons in comparison to control motoneurons that was grown in the presence of survival neurotrophic factors BDNF and CNTF. It was also found that STX was 10 times more potent than TTX a common inhibitor of VGSC with a reduced activity on the TTX-insensitive sodium channels NaV1.5, NaV1.8 and NaV1.9. Reverse Transcriptase-PCR experiments revealed the presence of NaV1.9 as the likely candidate that begins to express from embryonic stage sixteen in the mouse spinal cord. Immunolabelling experiments showed that the channel is expressed in the axonal compartments and axonal growth cones in cultured motoneurons. Suppression of NaV1.9 in cultured motoneurons by lentivirus mediated short hairpin-RNA (shRNA) resulted in shorter axon length in comparison with uninfected and scrambled constructs. Further, embryonic motoneurons cultured from NaV1.9 knockout mice also showed a significant reduction in neural activity and axon growth. The findings of this work highlight the role of NaV1.9 as an important contender in regulating activity dependent axon growth in embryonic cultured motoneurons. NaV1.9 could therefore be considered as a prospective molecule that could play an important role in regulating axon growth in motoneuron disease models like spinal muscular atrophy (SMA). N2 - Spontane neuronale Aktivität reguliert essentielle Ereignisse im Neuritenwachstum, wie beispielsweise die axonale Verzweigung und die Erkennung des Wachstumspfades. Motoneurone, die aus Tiermodellen der Spinalen Muskelatrophie (SMA) gewonnen werden, zeigen einen auffälligen Defekt im Streckenwachstum von Axonen und in der neuronalen Aktivität. Dieser Defekt wird von anormaler Clusterbildung von Ca2+ Kanälen in axonalen Regionen und in Wachstumskegeln begleitet. Die Mechanismen, die das Öffnen von Kalziumkanälen in embryonalen Motoneuronen in der Entwicklung regulieren, und die für das aktivitätsabhängige Axonwachstum benötigt werden, sind nicht bekannt. Diese Frage wurde in dieser Studie bearbeitet, indem neuronale Aktivität in embryonalen Motoneuronen durch pharmakologische Inhibition von spannungsabhängigen Natriumkanälen durch Saxitoxin (STX) und Tetrodotoxin blockiert wurde. Geringe Dosen von Saxitoxin bewirkten eine deutliche Reduktion des Axonwachstums und der neuronalen Aktivität in kultivierten Motoneuronen. Diese pharmakologische Behandlung beeinflusste nicht das Überleben von Motoneuronen im Vergleich zu Kontroll-Motoneuronen, die in der Anwesenheit der neurotrophen Faktoren BDNF und CNTF kultiviert wurden. Saxitoxin war etwa 5-10-mal potenter als TTX, ein üblicher Blocker spannungsabhängiger Natriumkanäle mit einer verminderte Aktivität auf die TTX-insensitiven Natriumkanäle NaV1.5, NaV1.8, und NaV1.9. Reverse-Transkriptase-PCR Experimente bestätigten die Anwesenheit von NaV1.9 am Tag E16 (embryonaler Tag 16) im Rückenmark der Maus. NaV1.9 ist ein einzigartiger Typus von einem Natriumkanal welcher in der Lage ist neuronale Erregbarkeit in der Nähe des Ruhemembranpotentials zu steuern. Deshalb war NaV1.9 ein guter Kandidat für einen Kanal, der spontane Erregung in Motoneuronen vermittelt. Immunofärbungen zeigten, dass NaV1.9 in axonalen Kompartimenten und axonalen Wachstumskegeln von kultivierten Motoneuronen exprimiert ist. Die Unterdrückung von NaV1.9 in kultivierten Motoneuronen durch lentiviralexprimierte short hairpin-RNA (shRNA) resultierte in kürzerer Axonlänge, im Vergleich zu nicht-infizierten Motoneuronen oder Motoneuronen, die eine sinnlose Kontroll-shRNA Sequenz exprimierten. Embryonale, kultivierte Motoneurone von NaV1.9 knockout Mäusen zeigten eine signifikante Verringerung der neuronalen Aktivität und verkürzte Axone. Diese Ergebnisse weisen auf eine Bedeutung von NaV1.9 im aktivitätsabhängigen Axonwachstum hin KW - Axon KW - Embryonalentwicklung KW - Motoneuron KW - Natriumkanal KW - Motoneuronen KW - NaV1.9 KW - motoneuron KW - Nav1.9 KW - axon growth Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57536 ER - TY - THES A1 - Thangaraj Selvaraj, Bhuvaneish T1 - Role of CNTF-STAT3 signaling for microtubule dynamics inaxon growth and maintenance: Implications in motoneuron diseases T1 - Die Funktion des CNTF-STAT3 Signalweges für die Microtubuli Dynamik in Axonalem Wachstum und Axon Erhalt: Implikationen für Motoneuronenerkrankungen N2 - Neurotrophic factor signaling modulates differentiation, axon growth and maintenance, synaptic plasticity and regeneration of neurons after injury. Ciliary neurotrophic factor (CNTF), a Schwann cell derived neurotrophic factor, has an exclusive role in axon maintenance, sprouting and synaptic preservation. CNTF, but not GDNF, has been shown to alleviate motoneuron degeneration in pmn mutant mice carrying a missense mutation in Tbce gene, a model for Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS). This current study elucidates the distinct signaling mechanism by which CNTF rescues the axonal degeneration in pmn mutant mice. ... N2 - Neurotrophe Faktoren beeinflussendie die neuronale Differenzierung, das Wachstum und die Stabilisierung von Axonen sowie Synaptische Plastizität und die Regeneration von Neuronen nach Verletzung. Der von Schwannzellen synthetisierte neurotrophe Faktor Ciliary neurotrophic factor (CNTF) spielt eine wichtige Rolle bei der axonalen Erhaltung sowie bei der Induktion und Reduktion von axonalen Verzweigungen. Die Behandlung der pmn Mausmutante mit CNTF, aber nicht mit GDNF führt zu einem späteren Krankheitsbeginn und verminderten Fortschreiten der Motoneuronendegeneration. Diese Mausmutante, die eine Punktmutation im Tbce Gen trägt, dient als Modell für die Amyotrophe Lateralsklerose. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die zugrunde liegenden Signalkaskaden aufzudecken, die den CNTF-vermittelten Effekt auf den Krnakheitsverlauf bei der pmn Maus verursachen. ... KW - Ciliary neurotrophic factor KW - STAT KW - CNTF KW - STAT3 KW - Stathmin KW - Microtubules KW - Signaltransduktion KW - Motoneuron KW - Krankheit Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76889 ER - TY - THES A1 - Schmitt, Dominique T1 - Initial characterization of mouse Syap1 in the nervous system: Search for interaction partners, effects of gene knockdown and knockout, and tissue distribution with focus on the adult brain T1 - Erste Charakterisierung des Maus-Syap1 im Nervensystem: Suche nach Interaktionspartnern, Auswirkungen von Gen-Knockdown und-Knockout sowie Untersuchungen über die Verteilung im Gewebe mit Fokus auf das adulte Gehirn N2 - The synapse-associated protein of 47 kDa (Sap47) in Drosophila melanogaster is the founding member of a phylogenetically conserved protein family of hitherto unknown molecular function. Sap47 is localized throughout the entire neuropil of adult and larval brains and closely associated with glutamatergic presynaptic vesicles of larval motoneurons. Flies lacking the protein are viable and fertile and do not exhibit gross structural or marked behavioral deficiencies indicating that Sap47 is dispensable for basic synaptic function, or that its function is compensated by other related proteins. Syap1 - the mammalian homologue of Sap47 - was reported to play an essential role in Akt1 phosphorylation in various non-neuronal cells by promoting the association of mTORC2 with Akt1 which is critical for the downstream signaling cascade for adipogenesis. The function of Syap1 in the vertebrate nervous system, however, is unknown so far. The present study provides a first description of the subcellular localization of mouse Syap1 in cultured motoneurons as well as in selected structures of the adult mouse nervous system and reports initial functional experiments. Preceding all descriptive experiments, commercially available Syap1 antibodies were tested for their specificity and suitability for this study. One antibody raised against the human protein was found to recognize specifically both the human and murine Syap1 protein, providing an indispensable tool for biochemical, immunocytochemical and immunohistochemical studies. In the course of this work, a Syap1 knockout mouse was established and investigated. These mice are viable and fertile and do not show obvious changes in morphology or phenotype. As observed for Sap47 in flies, Syap1 is widely distributed in the synaptic neuropil, particularly in regions rich in glutamatergic synapses but it was also detected at perinuclear Golgi-associated sites in certain groups of neuronal somata. In motoneurons the protein is especially observed in similar perinuclear structures, partially overlapping with Golgi markers and in axons, dendrites and axonal growth cones. Biochemical and immunohistochemical analyses showed widespread Syap1 expression in the central nervous system with regionally distinct distribution patterns in cerebellum, hippocampus or olfactory bulb. Besides its expression in neurons, Syap1 is also detected in non-neuronal tissue e.g. liver, kidney and muscle tissue. In contrast, non-neuronal cells in the brain lack the typical perinuclear accumulation. First functional studies with cultured primary motoneurons on developmental, structural and functional aspects reveal no influence of Syap1 depletion on survival and morphological features such as axon length or dendritic length. Contrary to expectations, in neuronal tissues or cultured motoneurons a reduction of Akt phosphorylation at Ser473 or Thr308 was not detected after Syap1 knockdown or knockout. N2 - Das Synapsen-assoziierte Protein von 47 kDa (Sap47) in Drosophila melanogaster ist das Gründungsmitglied einer phylogenetisch konservierten Proteinfamilie von unbekannter molekularer Funktion. Sap47 ist im gesamten Neuropil des adulten und larvalen Gehirns lokalisiert und mit glutamatergen, präsynaptischen Vesikeln in larvalen Motoneuronen assoziiert. Fliegen, denen das Protein fehlt, sind lebensfähig und fruchtbar und weisen keine schwerwiegenden strukturellen oder ausgeprägten verhaltensbezogenen Defizite auf, was darauf hinweist, dass Sap47 für eine basale synaptische Funktion entbehrlich ist beziehungsweise das Fehlen seiner Funktion durch andere, eventuell verwandte Proteine, kompensiert werden kann. Über Syap1 - das Säugetierhomolog von Sap47 - wurde berichtet, dass es in verschiedenen nicht-neuronalen Zellen eine essentielle Rolle in der Akt1 Phosphorylierung spielt, indem es die Assoziation von mTORC2 und Akt1 begünstigt, welche für den nachgeschalteten Signalweg bei der Adipogenese essentiell ist. Die Funktion von Syap1 im Vertebraten-Nervensystem ist dagegen bislang unbekannt. Die vorliegende Studie liefert die Erstbeschreibung von neuronalem Syap1 über die subzelluläre Lokalisation des Proteins in kultivierten Motoneuronen sowie die Verteilung in ausgewählten Strukturen des adulten Nervensystems der Maus und beschreibt initiale funktionelle Experimente. Allen beschreibenden Experimenten voran, wurden kommerziell erhältliche Syap1 Antikörper auf ihre Spezifität und Tauglichkeit für diese Studie getestet. Einer der Antikörper, der gegen das humane Protein hergestellt wurde, erkennt spezifisch sowohl das humane, als auch das murine Syap1 Protein und stellt somit ein unentbehrliches Werkzeug für alle biochemischen, immunzytochemischen und immunhistochemischen Untersuchungen dar. Im Zuge der Arbeit wurde eine Syap1-Knockout Maus untersucht, welche vital und fruchtbar ist und keine offensichtlichen Veränderungen in ihrem morphologischen Phänotyp aufweist. Wie auch Sap47 in Fliegen, ist Syap1 im synaptischen Neuropil weit verbreitet, insbesondere in Regionen, die reich an glutamatergen Synapsen sind, aber es wurde auch in einer deutlichen, Golgi-assoziierten Akkumulation in bestimmten Gruppen neuronaler Zellkörper beobachtet. In Motoneuronen wurde das Protein besonders in ähnlichen perinukleären Strukturen detektiert, welche zum Teil mit Golgi Markern überlappen und zudem in Axonen, Dendriten und Wachstumskegeln detektiert. Wie biochemische und immunhistochemische Untersuchungen ergaben, zeigt das Syap1 Protein eine weit verbreitete Expression im zentralen Nervensystem mit Regionen-spezifischem Verteilungsmuster wie es beispielsweise im Kleinhirn, dem Hippocampus oder dem olfaktorischen Bulbus beobachtet wurde. Neben der Expression in Neuronen wurde Syap1 auch in nicht neuronalen Geweben wie der Leber, Niere und im Muskel detektiert. Nicht-neuronalen Zellen im Gehirn fehlte dagegen die typische perinukleäre Akkumulation in immunhistochemischen Färbungen. Erste funktionelle Studien mit kultivierten primären Motoneuronen über entwicklungsbezogene, strukturelle und funktionelle Gesichtspunkte ergaben keinen Einfluss einer Syap1 Depletion auf das Überleben oder morphologische Merkmale wie Axon- oder Dendritenlänge. Entgegen den Erwartungen, wurde nach Syap1 Knockdown oder Knockout in neuronalem Gewebe oder kultivierten Motoneuronen keine Reduktion in der Akt1 Phosphorylierung an Ser473 oder Thr308 detektiert. KW - Synapse KW - Nervensystem KW - Motoneuron KW - Golgi-Apparat KW - Syap1 KW - Sap47 KW - Synapse-associated protein KW - Golgi apparatus KW - Synapsen assoziiert Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-147319 ER - TY - THES A1 - Massih, Bita T1 - Human stem cell-based models to analyze the pathophysiology of motor neuron diseases T1 - Humane Stammzell-basierte Modelle zur Analyse der Pathophysiologie von Motoneuronerkrankungen N2 - Motor neuron diseases (MNDs) encompass a variety of clinically and genetically heterogeneous disorders, which lead to the degeneration of motor neurons (MNs) and impaired motor functions. MNs coordinate and control movement by transmitting their signal to a target muscle cell. The synaptic endings of the MN axon and the contact site of the muscle cell thereby form the presynaptic and postsynaptic structures of the neuromuscular junction (NMJ). In MNDs, synaptic dysfunction and synapse elimination precede MN loss suggesting that the NMJ is an early target in the pathophysiological cascade leading to MN death. In this study, we established new experimental strategies to analyze human MNDs by patient derived induced pluripotent stem cells (iPSCs) and investigated pathophysiological mechanisms in two different MNDs. To study human MNDs, specialized cell culture systems that enable the connection of MNs to their target muscle cells are required to allow the formation of NMJs. In the first part of this study, we established and validated a human neuromuscular co-culture system consisting of iPSC derived MNs and 3D skeletal muscle tissue derived from myoblasts. We generated 3D muscle tissue by culturing primary myoblasts in a defined extracellular matrix in self-microfabricated silicone dishes that support the 3D tissue formation. Subsequently, iPSCs from healthy donors and iPSCs from patients with the progressive MND Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) were differentiated into MNs and used for 3D neuromuscular co-cultures. Using a combination of immunohistochemistry, calcium imaging, and pharmacological stimulations, we characterized and confirmed the functionality of the 3D muscle tissue and the 3D neuromuscular co-cultures. Finally, we applied this system as an in vitro model to study the pathophysiology of ALS and found a decrease in neuromuscular coupling, muscle contraction, and axonal outgrowth in co-cultures with MNs harboring ALS-linked superoxide dismutase 1 (SOD1) mutation. In summary, this co-culture system presents a human model for MNDs that can recapitulate aspects of ALS pathophysiology. In the second part of this study, we identified an impaired unconventional protein secretion (UPS) of Sod1 as pathological mechanisms in Pleckstrin homology domain-containing family G member 5 (Plekhg5)-associated MND. Sod1 is a leaderless cytosolic protein which is secreted in an autophagy-dependent manner. We found that Plekhg5 depletion in primary MNs and NSC34 cells leads to an impaired secretion of wildtype Sod1, indicating that Plekhg5 drives the UPS of Sod1 in vitro. By interfering with different steps during the biogenesis of autophagosomes, we could show that Plekhg5-regulated Sod1 secretion is determined by autophagy. To analyze our findings in a clinically more relevant model we utilized human iPSC MNs from healthy donors and ALS patients with SOD1 mutations. We observed reduced SOD1 secretion in ALS MNs which coincides with reduced protein expression of PLEKHG5 compared to healthy and isogenic control MNs. To confirm this correlation, we depleted PLEKHG5 in control MNs and found reduced extracellular SOD1 levels, implying that SOD1 secretion depends on PLEKHG5. In summary, we found that Plekh5 regulates the UPS of Sod1 in mouse and human MNs and that Sod1 secretion occurs in an autophagy dependent manner. Our data shows an unreported mechanistic link between two MND-associated proteins. N2 - Motoneuronerkrankungen (MNE) umfassen eine Vielzahl klinisch und genetisch heterogener Erkrankungen, die zur Degeneration von Motoneuronen (MN) und zu beeinträchtigten motorischen Funktionen führen. MN koordinieren und steuern Muskelbewegungen, indem sie ihr Signal an eine Zielmuskelzelle übertragen. Die synaptischen Endungen des MN-Axons und die Kontaktstelle der Muskelzelle bilden dabei die präsynaptischen und postsynaptischen Strukturen der neuromuskulären Endplatte (NME). Bei MNE zeichnen sich synaptische Dysfunktion und Synapseneliminierung bereits vor dem Verlust von MN ab, was darauf hindeutet, dass die NME ein frühes Ziel in der pathophysiologischen Kaskade ist, die zum MN-Tod führt. In dieser Studie haben wir neue experimentelle Strategien zur Analyse humaner MNE mithilfe von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSZ) entwickelt und pathophysiologische Mechanismen bei zwei verschiedenen MNE untersucht. Um humane MNE zu untersuchen sind Zellkultursysteme erforderlich, die die Verbindung von MN mit ihren Zielmuskelzellen ermöglichen, um NME zu bilden. Im ersten Teil dieser Studie haben wir ein humanes neuromuskuläres Co-Kultursystem etabliert und validiert, das aus iPSZ abgeleiteten MN und 3D Skelettmuskelgewebe aus Myoblasten besteht. Wir haben 3D Muskelgewebe erzeugt, indem wir primäre Myoblasten in einer definierten extrazellulären Matrix in selbst gefertigten Silikonschalen kultivierten, die die 3D-Gewebebildung unterstützen. Anschließend wurden iPSZ von gesunden Spendern und iPSZ von Patienten mit der MNE Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) in MN differenziert und für neuromuskuläre 3D Co-Kulturen verwendet. Mithilfe von immunhistochemischen Untersuchungen, Calcium-Imaging und pharmakologischen Stimulationen konnten wir die Funktionalität des 3D Muskelgewebes und neuromuskulären 3D Co-Kulturen charakterisieren und validieren. Anschließend wurde das System als in vitro Modell zur Untersuchung der Pathophysiologie von ALS verwendet. ALS Co-Kulturen mit MN, die eine Superoxid Dismutase 1 (SOD1)-Genmutation aufwiesen, zeigten eine Abnahme der neuromuskulären Verbindung, der Muskelkontraktion und des axonalen Wachstums. Zusammenfassend stellt dieses Co-Kultursystem ein humanes Modell für die Untersuchung von MNE dar, das Aspekte der ALS-Physiologie rekapitulieren kann. Im zweiten Teil dieser Studie konnten wir eine Beeinträchtigung der unkonventionellen Proteinsekretion (UPS) von Sod1 als pathologischen Mechanismus bei Pleckstrin homology domain-containing family G member 5 (Plekhg5)-assoziiertem MNE identifizieren. Sod1 ist ein cytosolisches Protein ohne Signalsequenz für konventionelle Sekretion. Stattdessen wird die UPS über sekretorische Autophagie-Mechanismen reguliert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Plekhg5-Depletion in primären MN und NSC34-Zellen zu einer beeinträchtigten Sekretion von Wildtyp-Sod1 führt, was darauf hinweist, dass die UPS von Sod1 Plekgh5 abhängig ist. Indem verschiedene Schritte während der Biogenese von Autophagosomen gestört wurden, konnten wir nachweisen, dass die Plekhg5-regulierte Sod1-Sekretion Autophagie abhängig ist. Um unsere Ergebnisse in einem klinisch relevanteren Modell zu analysieren, wurden humane iPSZ-MN von gesunden Spendern und ALS-Patienten mit SOD1-Mutationen untersucht. Hier fand sich, dass die Sekretion von mutiertem SOD1 in ALS-MN im Vergleich zu gesunden und isogenen Kontrollen verringert ist. Dabei konnten wir zeigen, dass eine verringerte SOD1 Sekretion in ALS-MNs mit einer verringerten Expression von PLEKHG5 einhergeht. Um diese Korrelation zu bestätigen, wurden Kontroll-MN nach PLEKHG5-Depletion untersucht und eine verminderte SOD1-Sekretion dokumentiert, was auf eine PLEKHG5 Abhängigkeit hindeutet. Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass Plekh5 die UPS von Sod1 in Maus MN und humanen MN reguliert und dass die Sod1-Sekretion Autophagie abhängig erfolgt. Unsere Daten belegen eine bislang noch nicht gezeigte mechanistische Verknüpfung zwischen zwei MNE-assoziierten Proteinen. KW - Tissue Engineering KW - NMJ (neuromuscular junction) KW - MND KW - SOD1 KW - ALS KW - PLEKHG5 KW - Co-culture KW - 3D muscle KW - Motoneuron KW - Stammzellen KW - Neuromuskuläre Endplatte KW - Induzierte pluripotente Stammzelle KW - Motoneuron-Krankheit KW - Myatrophische Lateralsklerose KW - Zellkultur KW - Motorische Endplatte KW - Induced pluripotent stem cells KW - Motor neuron disease KW - Amyotrophic lateral sclerosis KW - Cell culture Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-346374 PB - Frontiers in Cell and Developmental Biology ER - TY - THES A1 - Deng, Chunchu T1 - Dynamic remodeling of endoplasmic reticulum and ribosomes in axon terminals of wildtype and Spinal Muscular Atrophy motoneurons T1 - Dynamische Reorganization des endoplasmatischen Retikulums und der Ribosomen in Axonterminalen von Wildtyp- und Spinaler Muskelatrophie Motoneuronen N2 - In highly polarized neurons, endoplasmic reticulum (ER) forms a dynamic and continuous network in axons that plays important roles in lipid synthesis, Ca2+ homeostasis and the maintenance of synapses. However, the mechanisms underlying the regulation of axonal ER dynamics and its function in regulation of local translation still remain elusive. In the course of my thesis, I investigated the fast dynamic movements of ER and ribosomes in the growth cone of wildtype motoneurons as well as motoneurons from a mouse model of Spinal Muscular Atrophy (SMA), in response to Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) stimulation. Live cell imaging data show that ER extends into axonal growth cone filopodia along actin filaments and disruption of actin cytoskeleton by cytochalasin D treatment impairs the dynamic movement of ER in the axonal filopodia. In contrast to filopodia, ER movements in the growth cone core seem to depend on coordinated actions of the actin and microtubule cytoskeleton. Myosin VI is especially required for ER movements into filopodia and drebrin A mediates actin/microtubule coordinated ER dynamics. Furthermore, we found that BDNF/TrkB signaling induces assembly of 80S ribosomes in growth cones on a time scale of seconds. Activated ribosomes relocate to the presynaptic ER and undergo local translation. These findings describe the dynamic interaction between ER and ribosomes during local translation and identify a novel potential function for the presynaptic ER in intra-axonal synthesis of transmembrane proteins such as the α-1β subunit of N-type Ca2+ channels in motoneurons. In addition, we demonstrate that in Smn-deficient motoneurons, ER dynamic movements are impaired in axonal growth cones that seems to be due to impaired actin cytoskeleton. Interestingly, ribosomes fail to undergo rapid structural changes in Smn-deficient growth cones and do not associate to ER in response to BDNF. Thus, aberrant ER dynamics and ribosome response to extracellular stimuli could affect axonal growth and presynaptic function and maintenance, thereby contributing to the pathology of SMA. N2 - Das Endoplasmatische Retikulum (ER) bildet ein dynamisches und kontinuierliches Netzwerk in Axonen von stark polarisierten Neuronen und spielt dabei eine wichtige Rolle in der Lipidsynthese, dem Ca2+ Homöostase und der Aufrechterhaltung von Synapsen. Allerding sind die Mechanismen, die der Regulierung der axonalen ER-Dynamik und seiner Funktion bei der dynamischen Regulierung der lokalen Translation zugrunde liegen, nicht vollständig aufgeklärt. Im Rahmen meiner Dissertation habe ich die schnellen dynamischen Bewegungen des ERs und Ribosomen in Wachstumskegeln von Wildtyp- und Smn-defizienten Motoneuronen als Reaktion auf einen kurzen Puls von Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) untersucht. Daten der Bildgebung lebender Zellen zeigen, dass sich das ER in axonalen Filopodien des Wachstumskegels entlang von Aktin-Filamenten ausbreitet. Die Beeinträchtigung des Aktin-Zytoskeletts mittels Cytochalasin D Behandlung führt zu einer Einschränkung der dynamischen Bewegung des ERs in den axonalen Filopodien. Im Gegensatz zu den Filopodien scheinen die Bewegungen des ERs in Wachstumskegeln von einem koordinierten Zusammenspiel des Aktin- und Mikrotubuli- Zytoskeletts zu beruhen. Myosin VI ist insbesondere für die ER-Bewegungen in Filopodien erforderlich, während Drebrin A die Aktin/Mikrotubuli koordinierte ER-Dynamik vermittelt. Darüber hinaus zeigte sich, dass das BDNF/TrkB Signal die Bildung von 80S-Ribosomen in Wachstumskegeln in Sekundenschnelle auslöst. Aktivierte Ribosomen verlagern sich in das präsynaptische ER und vollziehen eine lokale Translation. Diese Ergebnisse beschreiben die dynamische Interaktion zwischen ER und Ribosomen während der lokalen Translation und zeigen eine neuartige potentielle Funktion des präsynaptischen ER bei der intra-axonalen Synthese von Transmembranproteinen wie die α-1β Untereinheit der N-Typ Ca2+ Kanäle in Motoneuronen auf. Darüber hinaus zeigen wir, dass in Smn-defizienten Motoneuronen die dynamischen ER-Bewegungen in axonalen Wachstumskegeln beeinträchtigt sind, was mit einer gestörten Polymerisation von Aktinfilamenten zusammenzuhängen scheint. Interessanterweise erfahren Ribosomen in Smn-defizienten Wachstumskegeln keine schnellen strukturellen Veränderungen und assoziieren nicht mit dem ER als Reaktion auf BDNF. Somit könnten eine abweichende ER-Dynamik und die Reaktion der Ribosomen auf extrazelluläre Reize das axonale Wachstum und die präsynaptische Funktion und Aufrechterhaltung beeinträchtigen und damit zur Pathologie von SMA beitragen. KW - Motoneuron KW - Endoplasmatisches Retikulum KW - Ribosom KW - Brain-derived neurotrophic factor KW - Spinale Muskelatrophie KW - ER dynamics in axon terminals KW - Dynamics of ribosome assembly KW - BDNF stimulation KW - Spinal Muscular Atrophy Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-264954 ER - TY - THES A1 - Moradi, Mehri T1 - Differential roles of α-, β- and γ-actin isoforms in regulation of cytoskeletal dynamics and stability during axon elongation and collateral branch formation in motoneurons T1 - Rolle der α-, β- und γ-Aktin Isoformen bei Regulation von Dynamik und Stabilität des Zytoskeletts während des Axonwachstums und beim Ausbilden von axonalen Verzweigungen in Motoneuronen N2 - In highly polarized cells like neurons, cytoskeleton dynamics play a crucial role in establishing neuronal connections during development and are required for adult plasticity. Actin turnover is particularly important for neurite growth, axon path finding, branching and synaptogenesis. Motoneurons establish several thousand branches that innervate neuromuscular synapses (NMJs). Axonal branching and terminal arborization are fundamental events during the establishment of synapses in motor endplates. Branching process is triggered by the assembly of actin filaments along the axon shaft giving rise to filopodia formation. The unique contribution of the three actin isoforms, α-, β- and γ-actin, in filopodia stability and dynamics during this process is not well characterized. Here, we performed high resolution in situ hybridization and qRT-PCR and showed that in primary mouse motoneurons α-, β- and γ-actin isoforms are expressed and their transcripts are translocated into axons. Using FRAP experiments, we showed that transcripts for α-, β- and γ-actin become locally translated in axonal growth cones and translation hot spots of the axonal branch points. Using live cell imaging, we showed that shRNA depletion of α-actin reduces dynamics of axonal filopodia which correlates with reduced number of collateral branches and impairs axon elongation. Depletion of β-actin correlates with reduced dynamics of growth cone filopoida, disturbs axon elongation and impairs presynaptic differentiation. Also, depletion of γ-actin impairs axonal growth and decreases axonal filopodia dynamics. These findings implicate that actin isoforms accomplish unique functions during development of motor axons. Depletions of β- and γ-actin lead to compensatory upregulation of other two isoforms. Consistent with this, total actin levels remain unaltered and F-actin polymerization capacity is preserved. After the knockdown of either α- or γ-actin, the levels of β-actin increase in the G-actin pool indicating that polymerization and stability of β-actin filaments depend on α- or γ-actin. This study provides evidence both for unique and overlapping function of actin isoforms in motoneuron growth and differentiation. In the soma of developing motoneurons, actin isoforms act redundantly and thus could compensate for each other’s loss. In the axon, α-, β- and γ-actin accomplish specific functions, i.e. β-actin regulates axon elongation and plasticity and α- and γ-actin regulate axonal branching. Furthermore, we show that both axonal transport and local translation of α-, β- and γ-actin isoforms are impaired in Smn knockout motoneurons, indicating a role for Smn protein in RNA granule assembly and local translation of these actin isoforms in primary mouse motoneurons. N2 - In stark polaren Zellen wie den Neuronen ist die Etablierung neuronaler Netzwerke ein entscheidender Faktor bei der Entwicklung des zentralen Nervensystems und spielt für die adulte Plastizität eine wesentliche Rolle. Besonders die Aktindynamik ist wichtig für das Neuritenwachstum, die axonale Wegfindung und Verzweigung, sowie die Synaptogenese. Motoneurone bilden mehrere tausend terminale Verzweigungen aus, um neuromuskuläre Endplatten (NMJ) zu innervieren. Die axonale Verzweigung ist ein fundamentales Ereignis bei Ausbildung synaptischer Verbindungen zwischen Motoneuron und innerviertem Muskel. Die Axonverzweigung geschieht durch die Polymerisierung von Aktin entlang des Axonschafts, was zur Entstehung von Filopodien und Lamellopodien führt. Allerdings ist die genaue Funktion der drei Aktin-Isoformen (α-, β- and γ-Actin), im Zusammenhang mit der Regulation der Filopodienstabilität und deren Dynamik, noch weitestgehend unbekannt. Somit konnten wir in dieser Arbeit mit Hilfe hoch sensitiver in situ Hybridisierungs- und qRT PCR Techniken zeigen, dass in primären Mausmotoneuronen alle drei Aktinisoformen (α-, β- und γ) exprimiert, und deren Transkripte entlang des axonalen Kompartiments transportiert werden. Unsere FRAP Daten weisen darauf hin, dass α-, β- und γ-Aktin sowohl im Wachstumskegel als auch an sogenannten „Translation Hot Spots“ innerhalb axonaler Verzweigungspunkte lokal synthetisiert werden. Anhand von „Live Cell Imaging“ Experimenten konnten wir dann zeigen, dass ein α-Aktin Knockdown die Dynamik axonaler Filopodien stark reduziert, und als Folge, die Anzahl von axonalen Verzweigungen und die Axonlänge verringert ist. Hingegen geht ein β-Aktin Knockdown mit reduzierter Filopodiendynamik im Wachstumskegel und betroffener Differenzierung präsynaptischer Strukturen einher. Veränderungen des axonalen Wachstum und der Filopodiendynamik sind ebenfalls bei einem γ-Aktin Knockdown zu beobachten. Diese Daten weisen darauf hin, dass die drei Aktinisoformen unterschiedliche Funktionen bei der Entwicklung von Motoraxonen haben. Darüber hinaus zeigen unsere Daten, dass die Herunterregulation einer Aktinisoform durch eine erhöhte Expression der beiden anderen Isoformen kompensiert wird. Dieser Kompensationsmechanismus erlaubt es, die gesamte Aktinmenge und somit die F-Aktin-Polymerisation in der Zelle aufrechtzuerhalten. Sehr interessant dabei ist die Beobachtung, dass nach einem α- oder γ-Actin Knockdown das G/F-Verhältnis verändert ist, so dass die Menge an β-Aktin im G-Aktin Pool steigt und im F-Aktin Pool abnimmt. Daher beruhen Polymerisation und Stabilität von β-Aktin auf den α-, und γ-Aktinisoformen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass alle drei Aktinisoformen übergreifende Funktionen während Wachstum und Differenzierung von Motoneuronen haben. Im Zellkörper von sich entwickelnden Motoneuronen übernehmen sie ähnliche Aufgaben und können sich somit gegenseitig kompensieren. Im Gegensatz dazu sind die Funktionen im axonalen Kompartiment wesentlich spezifischer. Hier reguliert β-Aktin axonales Wachstum und Plastizität, während α- und γ-Aktin eine entscheidende Rolle bei der Ausbildung axonaler Verzweigungen haben. Unsere Arbeit lässt nun Rückschlüsse über mögliche Funktionen des SMN Proteins beim Aufbau der sogenannten „RNA Granules“ und lokaler Proteinbiosynthese der verschiedenen Aktinisoformen in primären Mausmotoneuronen zu. KW - Motoneuron KW - Spinale Muskelatrophie KW - Actin KW - Actin Dynamics KW - Isomer KW - Motoneurons KW - Axon Branching KW - Spinal Muscular Atrophy Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-147453 ER - TY - THES A1 - Hochgräfe, Katja T1 - Cre-loxP based mouse models to study prionpathogenesis in the motor nervous system N2 - Prion diseases such as scrapie in sheep, bovine spongiform encephalopathy (BSE) in cattle or Creutzfeldt-Jakob disease (CJD) in humans are fatal neurodegenerative disorders characterized by brain lesions and the accumulation of a disease-associated protein, designated PrPSc. How prions proceed to damage neurons and whether all or only subsets of neurons have to be affected for the onset of the clinical disease is still elusive. The manifestation of clinical prion disease is characterized by motor dysfunctions, dementia and death. Furthermore loss of motor neurons (MN) in the spinal cord is a constant finding in different mouse models of prion disease, suggesting that MN are vulnerable cells for triggering the onset of clinical symptoms. To determine whether the protection of MN against prion induced dysfunctions is an approach for holding the disease at the sub-clinical level, we established a novel conditional model for Cre-mediated expression of a dominant-negative PrP mutant (PrPQ167R) in the cells of interest. Dominant-negative PrP mutants provide protection of prion induced dysfunctions by inhibiting prion replication. Transgenic mice were generated carrying a floxed LacZ marker gene followed by the coding sequence of PrPQ167R under control of the human ubiquitin C promoter. Two Cre strains have been used to direct PrPQ167R expression either to a subset of MN of the spinal cord (Hb9-Cre) or to various neuronal cell populations of the spinal cord and brain (NF-L-Cre). Transgenic mice were infected with mouse-adapted prions via different inoculation routes (intranerval, intracerebral and intraperitoneal) and monitored for effects on incubation time and pathology. Tg floxed LacZ-PrPQ167R/NF-L-Cre mice showed about 15% prolonged survival upon intraperitoneal low dose prion infection, whereas survival of Tg floxed LacZ-PrPQ167R/Hb9-Cre mice was comparable to control littermates. The results suggest that the protection of spinal MN prolongs the incubation period but is not sufficient to completely inhibit clinical prion disease. In a second approach, Cre was transferred into the hind limb muscles of transgenic mice via a double-stranded adeno-associated virus vector (dsAAV2-Cre). The goal of this strategy was to target a broader cell population and thus to enhance expression levels of protective PrPQ167R in the spinal cord of Tg floxed-LacZ-PrPQ167R mice. After intramuscular (i.m.) application of dsAAV2-Cre, exhibiting a physical titer of 5x1010 GP/ml, recombinant transgenic DNA was detected only in the muscle tissue, pointing out that functional Cre-recombinase was expressed at the side of virus application. However, dsAAV2-Cre did neither induce recombination of transgenic DNA in the spinal cord or brain nor expression of dominant-negative PrPQ167R. In conclusion the dsAAV2-Cre vectors system needs further improvement to achieve efficient transport from muscle tissue to the central nervous system (CNS). 105 7 SUMMARY The lymphoreticular system (LRS) is an early site of prion replication. In splenic tissue prion infectivity is associated with follicular dendritic cells (FDC) as well as with Band T-lymphocytes. However, it is still unknown if those cell types are able to replicate the infectious agent or if other PrP-expressing cell types are engaged. To investigate if neurons and in particular MN are involved, transgenic mice carrying one allele of floxed Prnp (lox2+=��) and either one allele of Hb9-Cre or NF-L-Cre were generated on a Prnp0=0 background. Therefore a conditional PrP knockout was established in a subset of MN of the spinal cord (Hb9-Cre) or in various neuronal populations of the spinal cord and brain (NF-L-Cre). Transgenic mice were inoculated with prions to study the accumulation of PrPSc and prion infectivity in spleen and spinal cord at an early time point after infection. The findings show that PrPSc accumulation in mice with MN-specific PrP depletion (lox2+=��/ Hb9-Cre) was comparable to control littermates, while pan-neuronal PrP deficient mice (lox2+=��/NF-L-Cre) were not able to accumulate PrPSc in splenic tissue until 50 days post inoculation. Moreover spleens of lox2+=��/NF-L-Cre mice exhibited a clearly reduced prion infectivity titer, suggesting that accumulation of prions in the spleen is dependent on PrP expression in the nervous tissue. N2 - Prionenerkrankungen, wie Scrapie beim Schaf, die bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE) beim Rind oder die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD) beim Menschen sind letale, neurodegenerative Erkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS). Typische Merkmale der Erkrankung sind neben Neuronenverlust die Akkumulation des mit der Krankheit assoziierten Proteins PrPSc im Gehirn infizierter Individuen. Wie die Akkumulation von Prionen zu Neurodegeneration führt und welche Regionen des ZNS für die klinische Erkrankung verantwortlich sind, ist bisher unbekannt. Charakteristische, klinische Symptome von Prionenkrankheiten sind motorische Störungen sowie Demenz in einem späten Stadium der Erkrankung. Außerdem ist der Verlust von Motoneuronen (MN) im Rückenmark ein konstanter Befund im Tiermodell, was eine Rolle des motorischen Nervensystems bei der Prionpathogenese vermuten lässt. In dieser Arbeit sollte daher untersucht werden, ob der Schutz von MN vor Prionen induzierten Dysfunktionen den Ausbruch der klinischen Erkrankung verzögern kann. Dazu wurde ein konditionales Mausmodell mit Cre-induzierbarer Expression einer dom- inant-negativen PrP-Mutante (PrPQ167R) hergestellt. Dominant-negative PrP Mutanten schützen vor Prionen induzierten Schädigungen, indem sie die Replikation von Prionen inhibieren. Das Transgen besteht aus dem humanen Ubiquitin C Promoter, einem „gefloxten” LacZ Markergen und der kodierenden Sequenz von PrPQ167R. Die Kreuzung von Tg floxed LacZ-PrPQ167R Mäusen mit der Hb9-Cre Linie bewirkt eine MNspezifische Expression von PrPQ167R im Rückenmark, während das Einkreuzen eines NF-L-Cre Allels die Expression von PrPQ167R in den meisten Neuronen des Rückenmarks sowie in verschiedenen motorischen Kerngebieten des Gehirns zur Folge hat. Transgenen Mäuse wurden auf verschiedenen Routen (intranerval, intrazerebral und intraperitoneal) mit Maus-adaptierten Prionen infiziert und der Effekt von PrPQ167R auf die Inkubationszeit und Pathologie der Tiere untersucht. Während Tg floxed LacZPrP Q167R/NF-L-Cre Mäuse eine um 15% verlängerte Inkubationszeit aufwiesen, war bei Tg floxed LacZ-PrPQ167R/Hb9-Cre Mäusen kein Überlebensvorteil zu beobachten. Somit verlängert der Schutz von MN des Rückenmarks zwar die Inkubationszeit, ist aber nicht ausreichend, um den klinischen Ausbruch der Erkrankung zu verhindern. Um eine größere Zellpopulation im Rückenmark von Tg floxed LacZ-PrPQ167R Mäusen und so eine stärkere Expression von PrPQ167R zu erreichen, wurde ein viraler Gentransfer von Cre-Rekombinase durchgeführt. Dazu wurden doppelsträngige, Creexprimierende Adeno-assoziierte Virus Vektoren (dsAAV2-Cre) bilateral in die Muskulatur der Hinterbeine von Tg floxed LacZ-PrPQ167R Mäusen injiziert. Die Applikation von dsAAV2-Cre, mit einem physikalischen Virus-Titer von 5x1010 GP/ml, führte ausschließlich im Muskelgewebe zur Expression von enzymatisch aktiver Cre-Rekombinase und folglich zur Rekombination der transgenen DNA. Im Rücken- 107 8 ZUSAMMENFASSUNG mark oder Gehirn war keine rekombinante DNA detektierbar. Auch auf Protein-Ebene konnte die Expression von PrPQ167R weder im Muskel noch im Rückenmark oder Gehirn nachgewiesen werden. Um den Transport von dsAAV2-Cre vom Applikationsort bis in das ZNS zu gewährleisten und Cre stabil zu exprimieren, ist demnach eine weitere Optimierung des dsAAV2-Cre Vektorsystems notwendig. Prionen replizieren im lymphoretikulären System (LRS) bereits in einem frühen Stadium der Erkrankung. In der Milz ist Prionen-Infektiosität in follikulär dendritischen Zellen (FDC) sowie in B- und T-Lymphozyten lokalisiert. Ob noch andere PrP exprimierende Zellen an der Prionen-Replikation im LRS beteiligt sind, ist unklar. Um die Beteiligung von Neuronen und MN an der Akkumulation von Prionen im LRS zu untersuchen, wurden transgene, neuronal PrP defiziente Mäuse generiert. Ein Neuronen-spezifischer bzw. MN-spezifischer Knockout von PrP wurde durch Kreuzung von transgenen lox2+=�� Mäusen, welche ein „gefloxtes“ Prnp Allel Prnp auf einem Prnp0=0 Hintergrund tragen, mit NF-L-Cre oder Hb9-Cre Mäusen erreicht. Nach Prionen-Infektion von lox2+=��/NF-L-Cre und lox2+=��/Hb9-Cre Mäusen wurde die Akkumulation von PrPSc und Prionen-Infektiosität in der Milz und im Rückenmark am Tag 50 nach der Infektion analysiert. Während die Replikation von PrPSc in der Milz von Mäusen mit MN-spezifischem PrP Knockout (lox2+=��/Hb9-Cre) nicht beeinträchtigt war, war in pan-neuronal PrP defizienten Mäusen (lox2+=��/NF-L-Cre) keine Akkumulation von PrPSc nachweisbar. Zudem war die Prionen-Infektiosität in der Milz von lox2+=��/NF-L-Cre Mäusen deutlich reduziert. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Akkumulation von PrPSc und Prionen-Infektiosität in der Milz abhängig von neuronaler PrP Expression ist. KW - Prionkrankheit KW - Pathogenese KW - Maus KW - Motoneuron KW - Prion KW - pathogenesis Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-45967 ER - TY - THES A1 - Viswanathan, Aravindan T1 - Biochemical and structural characterisation of modules within the SMN complex T1 - Biochemische und strukturelle Charakterisierung von Modulen des SMN-Komplexes N2 - Cellular proteome profiling revealed that most biomolecules do not exist in isolation, but rather are incorporated into modular complexes. These assembled complexes are usually very large, consisting of 10 subunits on an average and include either proteins alone, or proteins and nucleic acids. Consequently, such macromolecular assemblies rather than individual biopolymers perform the vast majority of cellular activities. The faithful assembly of such molecular assemblies is often aided by trans-acting factors in vivo, to preclude aggregation of complex components and/or non-cognate interactions. A paradigm for an assisted assembly of a macromolecular machine is the formation of the common Sm/LSm core of spliceosomal and histone-mRNA processing U snRNPs. The key assembly factors united in the Protein Arginine Methyltransferase 5 (PRMT5) and the Survival Motor Neuron (SMN) complexes orchestrate the assembly of the Sm/LSm core on the U snRNAs. Assembly is initiated by the PRMT5-complex subunit pICln, which pre-arranges the Sm/LSm proteins into spatial positions occupied in the mature U snRNPs. The SMN complex subsequently binds these Sm/LSm units, displaces pICln and catalyses the Sm ring closure on the Sm-site of the U snRNA. The SMN complex consists of the eponoymous SMN protein linked in a modular network of interactions with eight other proteins, termed Gemins 2-8 and Unrip. Despite functional and structural characterisation of individual protein components and/or sub-complexes of this assembly machinery, coherent understanding of the structural framework of the core SMN complex remained elusive. The current work, employing a combined approach of biochemical and structural studies, aimed to contribute to the understanding of how distinct modules within the SMN complex coalecse to form the macromolecular SMN complex. A novel atomic resolution (1.5 Å) structure of the human Gemin8:7:6 sub-complex, illustrates how the peripheral Gemin7:6 module is tethered to the SMN complex via Gemin8’s C-terminus. In this model, Gemin7 engages with both Gemin6 and Gemin8 via the N- and C-termini of its Sm-fold like domain. This highly conserved interaction mode is reflected in the pronounced sequence conservation and identical biochemical behaviour of similar sub-complexes from divergent species, namely S. pombe and C. elegans. Despite lacking significant sequence similarity to the Sm proteins, the dimeric Gemin7:6 complex share structural resemblance to the Sm heteromers. The hypothesis that the dimeric Gemin7:6 functions as a Sm-surrogate during Sm core assembly could not be confirmed in this work. The functional relevance of the structural mimicry of the dimeric Gemin7:6 sub-complex with the Sm heterodimers therefore still remains unclear. Reduced levels of functional SMN protein is the cause of the devastating neurodegenerative disease, Spinal Muscular Atrophy (SMA). The C-terminal YG-zipper motif of SMN is a major hot-spot for most SMA patient mutations. In this work, adding to the existing inventory of the human and fission yeast YG-box models, a novel 2.2 Å crystal structure of the nematode SMN’s YG-box domain adopting the glycine zipper motif has been reported. Furthermore, it could be assessed that SMA patient mutations mapping to this YG-box domain greatly influences SMN’s self-association competency, a property reflected in both the human and nematode YG-box biochemical handles. The shared molecular architecture and biochemical behaviour of the nematode SMN YG-box domain with its human and fission yeast counterparts, reiterates the pronounced conservation of this oligomerisation motif across divergent organisms. Apart from serving as a multimerization domain, SMN’s YG-box also acts as interaction platform for Gemin8. A systematic investigation of SMA causing missense mutations uncovered that Gemin8’s incorporation into the SMN complex is influenced by the presence of certain SMA patient mutations, albeit independent of SMN’s oligomerisation status. Consequently, loss of Gemin8 association in the presence of SMA patient mutations would also affect the incorporation of Gemin7:6 sub-complex. Gemin8, therefore sculpts the heteromeric SMN complex by bridging the Gemin7:6 and SMN:Gemin2 sub-units, a modular feature shared in both the human and nematode SMN complexes. These findings provide an important foundation and a prospective structural framework for elucidating the core architecture of the SMN complex in the ongoing Cryo-EM studies. N2 - Systematische Untersuchungen von zellulären Bestandteilen haben gezeigt, dass viele Proteine nicht isoliert, sondern vielmehr in modularen Komplexen organisiert vorliegen. Mit durchschnittlich zehn Untereinheiten sind diese Komplexe sehr groß, wobei sie entweder ausschließlich aus Proteinen oder aber aus Proteinen und Nukleinsäuren bestehen können. Daher wird der Großteil zellulärer Aktivitäten nicht von einzelnen Biopolymeren, sondern von makromolekularen Komplexen verrichtet. Die Zusammenlagerung dieser Komplexe wird in vivo häufig von Hilfsfaktoren unterstützt, um die Aggregation der Einzelkomponenten und/oder unspezifische Wechselwirkungen zu verhindern. Ein Beispiel für eine derartige Zusammenlagerungshilfe ist die Bildung des Sm/LSm-Cores der mRNA-prozessierenden U snRNPs. Dabei wird die Anlagerung von Sm/LSm Proteinen an die U snRNAs durch eine Anzahl von Hilfsfaktoren orchestriert, die in Protein-Arginin-Methyltransferase 5 (PRMT5)- und dem Survival Motor Neuron (SMN)-Komplexen organisiert sind. Die Zusammenlagerung wird durch die PRMT5-Untereinheit pICln initiiert, die die räumliche Anordnung von Sm/LSm-Proteinen in höher-geordneten Komplexen stabilisiert. Diese werden anschließend auf den SMN-Komplex übertragen, wobei pICln verdrängt und die Verbindung mit der Sm-Seite der U snRNA sichergestellt wird. Der SMN-Komplex besteht aus dem SMN-Protein, das in einem modularen Netzwerk mit acht weiteren Proteinen (Gemins 2-8 und Unrip) interagiert. Auch wenn funktionale und strukturelle Charakterisierungen einzelner Proteinkomponenten und Module dieser Zusammenlagerungs-Maschinerie vorliegen, steht ein tiefergehendes Verständnis des strukturellen Organisation des Gesamt-Komplexes noch aus. In der vorliegenden Arbeit sollte unter Anwendung biochemischer und struktureller Techniken ein Beitrag dazu geleistet werden, die Interaktionen der verschiedenen Komponenten innerhalb des SMN-Komplexes zu verstehen, die so die dreidimensionale Organisation des SMN-Komplexes zu verstehen. Eine neuartige Kristallstruktur des humanen Gemin8:7:6-Subkomplexes bei einer Auflösung von 1.5 Å zeigt, wie der periphere Gemin7:6-Abschnitt durch den C-Terminus von Gemin8 zum SMN-Komplex dirigiert wird. In diesem Modell interagiert Gemin7 sowohl mit Gemin6 als auch Gemin8 über den N- und C-Terminus der Sm-ähnlichen Domäne. Dieser hochkonservierte Interaktionsmodus wird in der erwähnten konservierten Sequenz und dem gleichen biochemischen Verhalten ähnlicher Subkomplexe in divergenten Spezies einschließlich S. pombe und C. elegans widergespiegelt. Obwohl es keine signifikante Übereinstimmung mit der Sequenz von Sm-Proteinen gibt, weist der dimere Gemin7:6-Komplex markante strukturelle Ähnlichkeit mit dem einem Sm-Heterodimer auf. Die Annahme, der dimere Gemin7:6-Subkomplex würde als Hilfsfaktor über die direkte Interaktion mit Sm-Proteinen fungieren konnte in der vorliegenden Arbeit nicht bestätigt werden. Folglich bleibt die Funktion des dimeren Gemin7:6-Subkomplexes im Kontext der SMN-Zusammenlagerungsmaschinerie unklar. Verringerte Mengen des funktionellen SMN-Proteins sind die Ursache für die neurodegenerative Erkrankung Spinale Muskelatrophie (SMA). Das C-terminale YG-Zipper-Motiv von SMN stellt einen Hotspot für die meisten SMA-Mutationen dar. In dieser Arbeit wurde der bereits bekannten YG-Box aus H. sapiens und S. pombe eine neuartige Kristallstruktur der SMN YG-Box aus C. elegans mit einer Auflösung von 2.2 Å hinzugefügt. Zusätzlich wurde gezeigt, dass SMA-verursachende Missense-Mutationen in der YG-Box einen beträchtlichen Einfluss auf die Selbst-Interaktion von SMN haben, was aus biochemischen Versuchen mit der YG-Box aus H. sapiens und C. elegans ersichtlich wurde. Der molekulare Aufbau und das biochemische Verhalten der SMN YG-Box aus C. elegans, S. pombe und H. sapiens betont die Konservierung dieses Oligomerisierungsmotives über mehrere Organismen hinweg. Neben der Funktion als Multimerisationsdomäne dient die YG-Box von SMN auch als Interaktionsplattform für Gemin8. Eine systematische Untersuchung von SMA-verursachenden Missense-Mutationen ergab, dass die Einbindung von Gemin8 in den SMN-Komplex durch definierte Substitutionen massiv beeinflusst wird. Interessanterweise ist dieser Bindungsdefekt unabhängig vom SMN-Oligomerisierungsstatus. Demzufolge würde diese Klasse von SMA-Mutationen spezifisch die Inkorporation des Gemin7:6-Subkomplexes beeinflussen. Die Resultate dieser Arbeit bilden eine wichtige Grundlage für weitere strukturelle Untersuchungen des SMN-Komplexes über Kryo-Elektronenmikroskopie. KW - SMN complex KW - Macromolecular machine KW - Structural organisation KW - Proteom KW - Motoneuron Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-194749 ER -