TY  - THES
A1  - Schulze, Markus
T1  - Role of Chronophin for glioma cell migration and invasion
T1  - Die Rolle von Chronophin für die Migration und Invasion von Gliomzellen
N2  - Abstract
Glioblastomas, primary brain tumors, represent a tumor entity with a dismal prognosis and a median survival of only about one year. Invasion into the healthy brain parenchyma contributes substantially to the malignancy of this type of brain tumor. Therefore, a better understanding of the mechanisms promoting the invasive behavior of these brain tumors is needed to identify new therapeutic targets. 
Cofilin, an actin regulatory protein, has been shown to be an important regulator of the invasive behavior of tumor cells in other types of cancer and the actin cytoskeleton is involved in the formation of a variety of cellular structures important for cell migration and invasion. Cofilin is regulated by phosphorylation on a single residue, serine 3. The aim of this thesis was to examine the role of the cofilin regulatory phosphatase chronophin for glioma cell migration and invasion. 
First, it was established that chronophin depletion in the cell line GBM6840 leads to an increase in the ratio of phosphorylated cofilin to total cofilin. Higher chronophin levels were correlated with a decrease in F-actin in the cell lines GBM6840 and U87 as measured in an actin spin down assay and in a flow cytometry based assay.
Furthermore, it was shown that knockdown of chronophin in two different cell lines, GBM6840 and DBTRG-05-MG, strongly increased their invasiveness in vitro. Expression of human chronophin in the cell line U87 decreased its invasiveness substantially. There was no difference in cell proliferation between GBM6840 and DBTRG-05-MG cells expressing a chronophin targeting shRNA or a control shRNA and U87 cells transfected with an empty vector or a human chronophin encoding plasmid. The increase in invasiveness after chronophin depletion could be correlated with an increase in directionality in cell migration under 2D culture conditions in the cell lines U87 and GBM6840. Moreover, treatment with the ROCK inhibitor Y-27632 decreased directionality in GBM6840 cells under 2D culture conditions and reduced the invasiveness of GBM6840 chronophin shRNA cells back to control levels.
Expression of a non-phosphorylatable cofilin mutant, the S3A mutant, was able to reduce invasiveness and to reduce directionality under 2D culture conditions back to control levels in GBM6840 chronophin shRNA cells.
This provides important evidence for the involvement of cofilin phosphoregulation in the phenotypes described above. 
In vivo, when injected into NOD-SCID mice, chronophin depleted cells showed a dramatic growth reduction as compared to control and rescue cells. 
Transciptomic characterization of GBM6840 cells by microarray analysis and subsequent comparison of the data with microarray profiles of normal brain tissues and different glioma entities identified two specifically chronophin regulated transcripts potentially involved in tumor progression and invasion, MXI1 and EDIL3. Moreover, c-myc was identified as a significantly altered transcription factor after chronophin deregulation based on the number of c-myc target molecules in the microarray dataset.
MXI1 is a potential negative regulator of c-myc dependent transcription, and was strongly downregulated after chronophin knockdown in GBM6840. In line with this, the activity of a c-myc reporter plasmid was increased after chronophin depletion in GBM6840 and reduced after chronophin expression in U87 cells. 
However, the protein level of the c-myc protein was reduced after chronophin depletion in GBM6840. 
Finally, anaylsis of the expression of proteases known to be important for glioblastoma pathogenesis revealed no major changes in protease expression between chronophin depleted and control cells.
Therefore, a comprehensive analysis of chronophin in the context of glioma pathogenesis has been performed in this thesis. It has been shown that chronophin depletion strongly enhanced invasiveness of glioma cells and that it induced transcriptomic changes potentially involved in tumor progression. The proteins regulating cofilin phosphorylation are therefore valuable therapeutic targets for anti-invasive therapy in glioblastomas. Inhibitors for kinases upstream of cofilin, e.g. LIMKs and ROCKs, are available, and might be promising agents for anti-invasive therapy.
N2  - Zusammenfassung
Glioblastome sind primäre Gehirntumore, die eine besonders schlechte Prognose besitzen und bei denen die mediane Überlebenszeit nur ca. ein Jahr beträgt. Zur Malignität dieses Tumortyps trägt entscheidend das Eindringen der Tumorzellen in das gesunde Hirnparenchym bei. Daher ist es notwendig die molekularen Mechanismen zu verstehen, die diesem Phänomen zu Grunde liegen, um neue therapeutische Zielmoleküle zu identifizieren. 
Cofilin, ein Protein das das Aktinzytoskellet reguliert, ist in anderen Krebsarten als wichtiger Regulator des invasiven Verhaltens von Zellen bekannt und das Aktinzytoskellet ist an der Bildung einer Vielzahl von zellulären Strukturen beteiligt, die wichtig für die Zellmigration und –invasion sind. Cofilin wird über die Phosphorylierung einer einzigen Aminosäure, des Serin 3, reguliert. Das Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle der Cofilin regulatorischen Phosphatase Chronophin für Zellmigration und -invasion zu untersuchen. 
Zuerst konnte gezeigt werden, dass eine Chronophin Depletion in der Zelllinie GBM6840 zu einer Zunahme des Anteils von P-Cofilin am Gesamtcofilin führt. Ebenso war ein hohes Chronophin Level in den Zelllinien GBM6840 und U87 mit einer Abnahme des F-Actin Levels korreliert, was in einem Aktin spin down Assay als auch mittels Durchflusszytrometrie gemessen werden konnte. 
Es konnte weiter gezeigt werden, dass eine shRNA vermittelte Depletion des Chronphin zu einer starken Zunahme der Invasivität in den Zelllinien GBM6840 und DBTRG-05-MG in vitro führt. Chronophin Expression in der Zelllinie U87 führte zu einer starken Abnahme der Invasivität. Es gab hingegen keinen Chronophin abhängigen Unterschied in der Proliferation von GBM6840 und DBTRG-05-MG Zellen, die entweder eine Kontroll- oder eine Chronophin gerichtete shRNA exprimierten, sowie keinen zwischen U87 Zellen, die mit einem Leervektor oder einem Chronophin codierenden Konstrukt transfiziert worden waren. Die Zunahme der Invasion nach Chronophin Depletion konnte mit einer Zunahme der Direktionalität der Zellen bei der Migration in einer 2D Umgebung korreliert werden. Desweiteren konnte durch Behandlung mit dem ROCK-Inhibitor Y-27632 in GBM6840 Zellen eine Erniedrigung der Direktionalität bei der Migration in 2D Kultur ebenso erreicht werden, wie eine Reduktion der Invasivität von Chronophin shRNA exprimierenden GBM6840 Zellen auf Kontrollniveau.

Die Expression einer nicht-phosphorylierbaren Cofilin Mutante, der S3A Mutante, erniedrigte sowohl die Direktionalität in der 2D Migration als auch die Invasivität von GBM6840 Chronophin shRNA exprimierenden Zellen zurück auf Kontrollniveau.
Diese Experimente lieferten wichtige Hinweise darauf, dass die Phosphoregulation von Cofilin ursächlich an der Entstehung der Phänotypen beteiligt war, die nach Chronophin Knockdown beobachtet wurden. 
In vivo konnte nach Injektion in NOD-SCID Mäuse eine dramatische Wachstumsreduktion der Chronophin depletierten Zellen gemessen werden. 
Durch Charakterisierung des Transkriptoms der Zelllinie GBM6840 mittels Microarrays und nachfolgender Vergleich der Ergebnisse mit Microarray-Profilen von Normalhirngewebe und verschiedenen Gliomentitäten konnten zwei spezifisch Chronophin abhängig regulierte Transkripte identifiziert werden, MXI1 und EDIL3, die potentiell mit der Progression und Invasivität von Gliomen verknüpft sind. 
MXI1, ein potentieller negativer Regulator der c-myc abhängigen Transkription, war nach Chronophin Herunterregulation in GBM6840 stark herunterreguliert. In Übereinstimmung mit diesem Befund war die Aktiviät eines c-myc Reporterplasmids nach Chronophin Herunterregulation in GBM6840 erhöht, nach Chronophin Expression in U87 jedoch erniedrigt. Das c-myc Protein selbst wies eine deutliche Reduktion nach Chronophin Depletion in GBM6840 auf. 
Abschließend wurde die Expression von Proteasen untersucht, für die eine Rolle in der Gliominvasion bekannt ist. Hier wurden jedoch keine größeren Chronophin abhängigen Expressionsunterschiede gefunden.
Zusammenfassend gesagt konnte eine umfassende Charakterisierung der Rolle des Chronophin in der Gliompathogenese erreicht werden. Zum einen konnte gezeigt werden, dass Chronophin ein äußerst wichtiger Regulator der Invasion ist, zum anderen dass es zu Chronophin abhängigen transkriptomischen Veränderungen kommt, die potentiell zur Malignisierung des Tumors beitragen. 
Daher sind die Proteine die die Cofilinphosphorylierung regulieren potentielle therapeutische Zielmoleküle für eine anti-invasive Therapie im Glioblastom. Inhibitoren für die Kinasen, die Regulatoren des Cofilin sind, die ROCK- und LIM-Kinasen, sind verfügbar und stellen möglicherweise vielversprechende Substanzen für die anti-invasive Therapie dar.
KW  - Zellmigration
KW  - Chronophin
KW  - Invasion
KW  - Glioblastom
KW  - Gliom
KW  - PDXP
KW  - Glioma
KW  - Glioblastoma
KW  - Invasion
KW  - Migration
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109292
ER  - 
TY  - THES
A1  - Jarick [née Ottmüller], Katja Julika
T1  - Migration of allogenic T cells in intestinal lymphoid structures during acute Graft-versus-Host Disease
T1  - Migration allogener T-Zellen in intestinalen lymphoiden Strukturen während der akuten Graft-versus-Host Reaktion
N2  - T cell infiltration into the intestine occurs after priming and activation in the mesenteric lymph nodes and Peyer’s patches and subsequent trafficking via the blood circulation. We hypothesized that additionally to the vascular trafficking route, a fraction of T cells in the Peyer’s patches directly migrate into the adjacent lamina propria of the small intestine. To test this hypothesis, we employed a mouse model of acute Graft-versus-Host Disease to study the direct T cell migration from the Peyer’s patches to the adjacent lamina propria. 
First, we analyzed the border of Peyer’s patches on histological sections and found that the Peyer’s patch is not enclosed by a capsule or basement membrane. Thus, the tissue architecture allows for direct access to the surrounding tissue. With whole-mount light sheet fluorescence microscopy we quantified a three-dimensional gradient of T cells around Peyer’s patches on day 2.5 and day 3 after transplantation. This gradient evened out at day 4 and day 6 when high numbers of T cells started to evenly infiltrate the intestine from the blood circulation. We confirmed that gradient-forming T cells around Peyer’s patches resided within the tissue parenchyma of the lamina propria and not inside lymphatic vessels. 
To positively prove that the recently activated donor T cells around Peyer’s patches have egressed directly from that patch, we established a protocol for intravital photoconversion of T cells inside Peyer’s patches. 12 h after photoconversion inside a single Peyer’s patch, photoconverted T cells resided only around this particular Peyer’s patch and not elsewhere in the small intestine. This indicated that the T cells did not infiltrate via the blood but migrated to the adjacent lamina propria of the small intestine. Dynamic intravital two-photon microscopy revealed that these T cells next to the Peyer’s patch migrated in a random pattern. This suggested that these cells did not follow a positive chemoattractive gradient once they had reached the lamina propria. Laser-capture microdissection combined with RNA sequencing of the mucosa near the Peyer’s patch identified a wide range of migration-promoting factors. These included chemokines, co-stimulatory receptors and migration-associated intracellular molecules, which are candidates to promote this direct migration from Peyer’s patches.
Altogether, we demonstrate for the first time that additionally to the vascular trafficking route, a fraction of T cells migrates directly from the Peyer’s patch to the surrounding mucosa. This mechanism implies so far unrecognized regional specification of Peyer’s-patch-primed T cells. Our findings may impact treatment strategies to avoid intestinal inflammation or foster immunity after oral vaccination.
N2  - T-Zell Infiltration in den Darm erfolgt nach Primen und Aktivierung in den mesenterialen Lymphknoten und Peyerschen Plaques durch Rezirkulation über die Blutbahn. Wir stellten die Hypothese auf, dass zusätzlich zur vaskulären Route ein Teil der T-Zellen im Peyerschen Plaque direkt in die angrenzende Lamina propria des Dünndarms wandert. Um diese Hypothese zu testen, setzten wir ein Mausmodell für eine akute Graft-versus-Host Reaktion ein, um die direkte Migration von T Zellen aus den Peyerschen Plaques in die angrenzende Lamina propria zu untersuchen. 
Zuerst analysierten wir die Randzonen um die Peyerschen Plaques mit histologischen Schnitten und konnten bestätigen, dass der Peyersche Plaque von keiner Kapsel oder Basalmembran umschlossen ist, sodass die Gewebearchitektur den direkten Zugang des umliegenden Gewebes zulässt. Mithilfe der Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie von Dünndarm-Komplettpräparaten quantifizierten wir einen dreidimensionalen T-Zell Gradienten um Peyersche Plaques an den Tagen 2,5 und 3 nach allogener Stammzelltransplantation. Dieser Gradient verschwand zwischen an Tag 4 und Tag 6, als eine hohe Anzahl an T-Zellen begann, den Darm gleichmäßig über die Blutbahn zu infiltrieren. Wir bestätigten, dass die Gradienten-bildenden T-Zellen im Gewebe der Lamina propria und nicht in lymphatischen Gefäßen saßen, um zirkulierende Zellen von der Gradientenbildung auszuschließen.
Um direkt zu beweisen, dass die T-Zellen um dem Peyerschen Plaque unmittelbar aus diesem Plaque ausgewandert sind, haben wir ein Protokoll für intravitale Photokonversion von T-Zellen im Peyerschen Plaque etabliert. 12 h nach der Photokonversion in einem einzelnen Peyerschen Plaque befanden sich die T-Zellen nur um diesen bestimmten Plaque herum. Dies zeigt, dass die T-Zellen das Gewebe nicht über die Blutbahn infiltrierten, sondern direkt in die angrenzende Lamina propria des Dünndarms gewandert waren. Dynamische intravitale Zweiphotonenmikrokopie offenbarte, dass diese T-Zellen um den Peyerschen Plaque nach zufälligem Schema wanderten. Dies legte nahe, dass diese T-Zellen keinem positiven Chemokingradienten folgten, sobald sie die Lamina propria erreicht hatten. Laser-Mikrodissektion kombiniert mit RNA-Sequenzierung der Mukosa nahe des Peyerschen Plaques identifizierte eine große Auswahl an migrationsfördernden Faktoren. Hierunter waren Chemokine, kostimulatorische Rezeptoren und intrazelluläre migrationsassoziierte Moleküle, welche Kandidaten sind, diese direkte Migration aus den Peyerschen Plaques zu fördern. 
In dieser Arbeit zeigen wir erstmalig, dass zusätzlich zur vaskulären Route ein Teil der T Zellen direkt vom Peyerschen Plaque in die umliegende Mukosa wandert. Dieser Mechanismus impliziert bislang unerkannte regionale Spezialisierung von T Zellen, welche in Peyerschen Plaques aktiviert wurden. Diese neuen Befunde können zukünftige Behandlungsstrategien gegen intestinale Entzündungserkrankungen oder für Immunreaktionen nach oraler Impfung beeinflussen.
KW  - T-Lymphozyt
KW  - Graft-versus-host-disease
KW  - Darm
KW  - Zellmigration
KW  - Peyer's patch
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-178758
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TY  - THES
A1  - König, Anika
T1  - The role of the transcriptional regulators NFATc1 and Blimp-1 in follicular T-cells
T1  - Die Rolle der Transkriptionsregulatoren NFATc1 und Blimp-1 in follikulären T-Zellen
N2  - The defense against invading pathogens is, amongst other things, mediated via the action of antibodies. Class-switched antibodies and antibodies of high affinity are produced by plasma cells descending from germinal center B (GCB) cells. GCB cells develop in the germinal center (GC), a specialized microstructure found in the B-cell follicle of secondary lymphoid organs. GCB-cell maturation and proliferation are supported by follicular T- helper (Tfh) cells. On the other hand, follicular regulatory T (Tfr) cells control this process in quantity and quality preventing, for instance, the formation of autoantibodies directed against endogenous structures. The development of GCB, Tfh and Tfr cells essentially depends on the migration into the GC, which is mediated via the expression of the chemokine receptor CXCR5.
One transcription factor highly expressed in follicular T cells, comprising Tfh and Tfr cells, is NFATc1. Tfr cells additionally express the transcriptional repressor Blimp-1, which is not expressed in Tfh cells. We found that NFATc1 is transactivating Cxcr5 via response elements in the promoter and enhancer in vitro. Blimp-1 binds to the same elements, transactivating Cxcr5 expression in cooperation with NFATc1, whilst mediating Cxcr5- repression on its own. In Tfr cells Blimp-1 suppresses CXCR5 expression in the absence of NFATc1. Blimp-1 itself is necessary to restrict Tfr-cell frequencies and to mediate Tfr- cell function as in mice with Blimp-1-ablated Tregs high frequencies of Tfr cells do not reduce GCB- or Tfh cell frequencies. NFATc1 and Blimp-1 double deficient Tfr cells show additional loss of function, which becomes visible in clearly expanded antibody titers.
To evaluate the function of NFATc1 in Tfr cells, we not only deleted it, but also overexpressed a constitutive active form of NFATc1/aA (caNFATc1/aA) in regulatory T cells (Tregs). The latter is leading to an upregulation of CXCR5 per cell, without changing Tfh or Tfr-cell frequencies. However, the high density of surface CXCR5 enhances the migration of Tfr cells deep into the GC, which results in a tighter control of the antigen- specific humoral immune response. Additionally, caNFATc1/aA increases the expression of genes coding for Tfr effector molecules like Il1rn, Il10, Tigit and Ctla4. Interestingly, this part of the transcriptional change is dependent on the presence of Blimp-1. Furthermore, Blimp-1 regulates the expression of multiple chemokine receptor genes on the background of caNFATc1/aA.
In contrast, when caNFATc1/aA is overexpressed in all T cells, the frequencies of Tfh- and GCB cells are dominantly reduced. This effect seems to stem from the conventional T- cell (Tcon) side, most probably originating from increased secretion of interleukin-2 (IL- 2) via the caNFATc1/aA overexpressing Tcons. IL-2 is known to hinder the germinal center reaction (GCR) and it might in its abundance not be neutralizable by Tfr cells.
Taken together, NFATc1 and Blimp-1 cooperate to control the migration of Tfr cells into the GC. Tfr cells in the GC depend on NFATc1 and Blimp-1 to perform their proper function. Overexpression of caNFATc1 in Tregs strengthens Tfr function in a Blimp-1-dependent manner, whilst overexpression of caNFATc1 in all T cells dominantly diminishes the GCR.
N2  - Die Abwehr von Krankheitserregern durch das Immunsystem wird unter anderem (u.a.) durch die Wirkung von Antikörpern vermittelt. Antikörper, welche einen Klassenwechsel und eine hohe Affinität aufweisen, werden von Plasmazellen gebildet, welche sich von Keimzentrums-B (GCB) -Zellen ableiten. GCB-Zellen evolvieren innerhalb des Keimzentrums (GC), einer Mikrostruktur, welche sich innerhalb des B-Zellfollikels sekundärer lymphoider Organe bildet. Die GCB-Zell-Reifung und -Proliferation wird durch follikuläre T-Helfer (Tfh) -Zellen unterstützt und durch follikuläre regulatorische T (Tfr) -Zellen kontrolliert, wodurch u.a. die Bildung von Autoantikörpern, welche körpereigene Strukturen angreifen, unterbunden wird. Die Entwicklung von GCB-, Tfh- und Tfr-Zellen ist in entscheidender Weise abhängig von der Expression des Chemokinrezeptors CXCR5 und der damit verbundenen Migration in das GC.
NFATc1 ist ein Transkriptionsfaktor, welcher in follikulären T-Zellen, bestehend aus Tfh- und Tfr-Zellen, stark exprimiert wird. Im Gegensatz zu Tfh-Zellen exprimieren Tfr-Zellen zusätzlich den Transkriptionsrepressor Blimp-1. Wir haben herausgefunden, dass NFATc1 die Expression von Cxcr5 über die Bindung an Elemente innerhalb des Cxcr5-Promotors und -Enhancers in vitro transakiviert. Blimp-1 bindet an selbige Elemente und transaktiviert in Kooperation mit NFATc1 die Cxcr5-Expression, während es die Cxcr5- Expression alleine hemmt. In Tfr-Zellen supprimiert Blimp-1 die CXCR5-Expression in Abwesenheit von NFATc1. Blimp-1 beschränkt darüber hinaus das Vorkommen von Tfr-Zellen und spielt eine Rolle in der Effektorfunktion von Tfr-Zellen. Dies wird deutlich da das verstärkte Tfr-Zell-Vorkommen in Mäusen mit Blimp-1 defizienten Tregs nicht zu einer Reduktion der GCB-oder Tfh-Zellen führt. Der Verlust der Effektorfunktion akkumuliert in NFATc1 und Blimp-1 doppel-defizienten Tfr-Zellen, was sich in einem deutlichen Anstieg der Antikörpertiter im Serum immunisierter Tiere zeigt.
Zur Überprüfung der Funktion von NFATc1 in Tfr-Zellen untersuchten wir sowohl dessen Deletion, als auch die Überexpression einer konstitutiv aktiven Form von NFATc1/aA (caNFATc1/aA) in regulatorischen T-Zellen (Tregs). Letztere steigert die CXCR5- Expression pro Zelle ohne das Vorkommen von Tfh- oder Tfr-Zellen zu verändern. Jedoch führte die erhöhte Oberflächenexpression von CXCR5 zu einer verstärkten Migration der Tfr-Zellen in das GC, was in einer verstärkten Kontrolle der antigenspezifischen Antikörpertiter resultierte. Darüber hinaus erhöht caNFATc1/aA in Abhängigkeit von Blimp-1, die Expression der Gene Il1rn, Il10, Tigit und Ctla4, welche mit der Effektorfunktion von Tfr-Zellen assoziiert werden. Blimp-1 wirkt auf dem Hintergrund der Überexpression von NFATc1 vor allem regulierend auf die Expression von Chemokinrezeptorgenen.
Im Gegensatz zur Überexpression von caNFATc1/aA in Tregs allein, führt selbige Veränderung in allen T-Zellen zu einer deutlichen Reduktion des Vorkommens von Tfh- und GCB-Zellen nach Immunisierung. Dieser Effekt scheint durch konventionelle T-Zellen (Tcons) vermittelt zu sein und entsteht vermutlich durch eine erhöhte Sekretion von Interleukin-2 (IL-2) durch die caNFATc1/aA überexprimierenden Tcons. Dieses IL-2 scheint in seiner Menge nicht durch die vorliegenden Tfr-Zellen neutralisierbar zu sein und die Keimzentrumsreaktion (GCR) zu hemmen.
Die vorliegende Arbeit zeigt, dass NFATc1 und Blimp-1 kooperieren, um die Migration von Tfr-Zellen in das GC zu kontrollieren. Tfr-Zellen im GC sind in der Erfüllung ihrer ordnungsgemäßen Funktion abhängig von NFATc1 und Blimp-1. Die Überexpression von caNFATc1 in Tregs stärkt die Funktion von Tfr-Zellen in einer Blimp-1-abhängigen Weise, während die Überexpression von caNFATc1 in allen T-Zellen die GCR extrem minimiert.
KW  - Signaltransduktion
KW  - NFATc1
KW  - follikuläre regulatorische T-Zelle
KW  - T-Lymphozyt
KW  - Blimp-1
KW  - CXCR5
KW  - germinal center
KW  - follicular regulatory T cell
KW  - Keimzentrumsreaktion
KW  - Zellmigration
KW  - Immunisierung
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-209727
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TY  - THES
A1  - Fetiva Mora, Maria Camila
T1  - Changes in chromatin accessibility by oncogenic YAP and its relevance for regulation of cell cycle gene expression and cell migration
T1  - Änderungen der Chromatinzugänglichkeit durch onkogene YAP und seine Relevanz für die Genexpression während des Zellzyklus und für die Zellmigration
N2  - Various types of cancer involve aberrant cell cycle regulation. Among the pathways responsible for tumor growth, the YAP oncogene, a key downstream effector of the Hippo pathway, is responsible for oncogenic processes including cell proliferation, and metastasis by controlling the expression of cell cycle genes. In turn, the MMB multiprotein complex (which is formed when B-MYB binds to the MuvB core) is a master regulator of mitotic gene expression, which has also been associated with cancer. Previously, our laboratory identified a novel crosstalk between the MMB-complex and YAP. By binding to enhancers of MMB target genes and promoting B-MYB binding to promoters, YAP and MMB co-regulate a set of mitotic and cytokinetic target genes which promote cell proliferation. This doctoral thesis addresses the mechanisms of YAP and MMB mediated transcription, and it characterizes the role of YAP regulated enhancers in transcription of cell cycle genes. 

The results reported in this thesis indicate that expression of constitutively active, oncogenic YAP5SA leads to widespread changes in chromatin accessibility in untransformed human MCF10A cells. ATAC-seq identified that newly accessible and active regions include YAP-bound enhancers, while the MMB-bound promoters were found to be already accessible and remain open during YAP induction. By means of CRISPR-interference (CRISPRi) and chromatin immuniprecipitation (ChIP), we identified a role of YAP-bound enhancers in recruitment of CDK7 to MMB-regulated promoters and in RNA Pol II driven transcriptional initiation and elongation of G2/M genes. Moreover, by interfering with the YAP-B-MYB protein interaction, we can show that binding of YAP to B-MYB is also critical for the initiation of transcription at MMB-regulated genes. Unexpectedly, overexpression of YAP5SA also leads to less accessible chromatin regions or chromatin closing. Motif analysis revealed that the newly closed regions contain binding motifs for the p53 family of transcription factors. Interestingly, chromatin closing by YAP is linked to the reduced expression and loss of chromatin-binding of the p53 family member Np63. Furthermore, I demonstrate that downregulation of Np63 following expression of YAP is a key step in driving cellular migration.

Together, the findings of this thesis provide insights into the role of YAP in the chromatin changes that contribute to the oncogenic activities of YAP. The overexpression of YAP5SA not only leads to the opening of chromatin at YAP-bound enhancers which together with the MMB complex stimulate the expression of G2/M genes, but also promotes the closing of chromatin at ∆Np63 -bound regions in order to lead to cell migration.
N2  - Ein Kennzeichen vieler Tumoren ist die fehlerhafte Aktivierung von zellzyklusregulierenden Signalwegen. Ein für das Tumorwachstum wichtiger Signalwege ist der Hippo-Signalweg und das durch ihn regulierte Onkogen YAP, ein transkriptioneller Koaktivator. Durch die Regulierung von Zellzyklusgenen ist YAP verantwortlich für onkogene Prozesse wie Zellproliferation und Metastasierung. Der MMB-Multiproteinkomplex wiederum – er entsteht, wenn B-MYB an das MuvB-Kernmodul bindet – ist ein wichtiger Regulator der mitotischen Genexpression, welche ebenso mit der Tumorentstehung in Verbindung gebracht wurde. Unser Labor hat zuvor einen neuen Mechanismus der Regulation mitotischer Gene durch den MMB-Komplex und YAP identifiziert: Durch die Bindung an Enhancer der MMB-Zielgene und die Förderung der B-MYB-Bindung an Promotoren reguliert YAP eine Reihe von mitotischen und zytokinetischen Zielgenen, welche die Zellproliferation fördern. Diese Doktorarbeit befasst sich mit den Mechanismen der YAP- und MMB-vermittelten Transkription und charakterisiert die Rolle der YAP regulierten Enhancer während der Transkription von Zellzyklusgenen.

Die in dieser Dissertation dargelegten Ergebnisse zeigen, dass die Expression von konstitutiv aktivem, onkogenem YAP5SA zu weitreichenden Veränderungen in der Chromatinzugänglichkeit nicht-transformierter humaner MCF10A Zellen führt. ATAC-seq zeigte, dass ein grosse Anzahl YAP-gebundene Enhancer zugänglich und aktiviert werden. Gleichzeitig konnte festgestellt werden, dass die MMB-gebundenen Promotoren bereits vor der Expression von YAP zugänglich sind und während der YAP-Induktion offen bleiben. Mittels CRISP-Interferenz (CRISPRi) und Chromatin-Immunpräzipitationen (ChIP) konnten wir zeigen, dass YAP-gebundene Enhancer die Rekrutierung von CDK7 an MMB-regulierten Promotoren sowie die Initiation und Elongation der Transkription von G2/M Genen fördert. Durch die experimentelle Blockade der YAP-B-MYB Proteininteraktion konnten wir darüber hinaus belegen, dass auch die Bindung von YAP an B-MYB für die Initiation der Transkription an MMB-regulierten Genen entscheidend ist. Unerwarteterweise führte die Überexpression von YAP5SA auch dazu, dass bestimmte Regionen im Genom weniger zugänglich werden. Motivanalysen ergaben, dass diese neu geschlossenen Regionen Bindungsmotive für die p53-Familie von Transkriptionsfaktoren enthalten. Die Chromatinschließung durch YAP ist an eine reduzierte Expression und an den Verlust der Chromatinbindung des p53-Familienmitglieds Np63 gekoppelt. Schließlich konnte gezeigt werden, dass die Inhibition von Np63 durch YAP ein wichtiger Schritt in der YAP-abhängigen Förderung der Zellmigration ist.

Zusammenfassend liefern die Ergebnisse dieser Dissertation Einblicke in die Rolle von YAP bei Chromatinveränderungen welche zu den onkogenen Aktivitäten von YAP beitragen. Die Überexpression von YAP führt dabei einerseits zur Öffnung des Chromatins an YAP-gebundenen Enhancern, die zusammen mit dem MMB-Komplex die Expression von G2/M Genen stimulieren. Andererseits fördert YAP auch das Schließen von Chromatin an Np63-gebundenen Regionen, was wiederum Zellmigration nach sich zieht.
KW  - YAP
KW  - B-MYB
KW  - MMB
KW  - enhancers
KW  - transcription
KW  - chromatin accessibility
KW  - opening of chromatin
KW  - closing of chromatin
KW  - cell migration
KW  - G2/M genes
KW  - Chromatin
KW  - Genexpression
KW  - Zellzyklus
KW  - Zellmigration
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-302910
ER  - 
TY  - THES
A1  - Scheller, Lukas
T1  - Migrationsfördernde Faktoren im intestinalen T-Zell-Homing während der akuten Graft-versus-Host Erkrankung
T1  - Migration-promoting factors in the intestinal T-cell homing during acute graft-versus-host disease
N2  - Die akute Graft-versus-Host Erkrankung (GvHD), insbesondere die Darm GvHD, stellt weiterhin eine der Hauptursachen für Mortalität und Morbidität nach allogener SZT dar. Aktivierte, alloreaktive Spender T-Zellen infiltrieren dabei über die Blutbahn die intestinale Lamina Propria. Erst kürzlich konnten wir zeigen, dass neben der vaskulären Migration ein Teil der Spender T-Zellen auch direkt aus den PP in die angrenzende Lamina Propria migrieren. Um Faktoren, die diese direkte Migration fördern, zu untersuchen und die direkt migrierenden T-Zellen genauer zu charakterisieren, verwendeten wir ein MHC-inkompatibles Mausmodell zur Induktion einer akuten GvHD.

Durch RNA Sequenzierung und Massenspektrometrie lasermikrodissezierter Darmschleimhautproben konnte eine starke Expression der Chemokine CXCL9, CXCL10, CXCL11, CCL3, CCL4 und CCL5 während der akuten intestinalen GvHD aufgezeigt werden. Neben CCL4 und XCL1 wiesen verschiedene Faktoren der T-Zellaktivierung, wie CD3ζ, LAT, Lck und ZAP70, sowie Faktoren der zytoskelettalen Reorganisation, wie Dock2, Coro1α und Parvin-γ, eine vermehrte Expression insbesondere nahe der PP auf. Die Expression der migrationsfördernden Faktoren Coro1α und Parvin-γ in Spender T-Zellen nahe der PP konnte anschließend mittels histologischen Immunfluoreszenzfärbungen bestätigt werden. Durchflusszytometrische Analysen konnten weiterhin eine vermehrte Expression von CCR5, CCR9 und Intgerin α4β7 auf den vornehmlich Tbet+ Spender T-Zellen nahe der PP nachweisen. Funktionelle in vitro Migrationsversuche zeigten abschließend, dass in vivo aktivierte Spender T-Zellen eine gerichtete Migration in Richtung auf CXCL11 und zu späterem Zeitpunkt auch auf CCL4 vollziehen können. 

Zusammenfassend zeigt diese Arbeit die Bedeutung zahlreicher Chemokine für das sequenzielle T-Zell-Homing während der akuten intestinalen GvHD. Neben der insbesondere durch Faktoren der zytosekeletalen Reorganisation vermittelten amoeboiden Migration kann auch eine mesenchymale Fortbewegung über Faktoren wie CCR5, CCR9 und Integrin α4β7 die direkte Migration der T-Zellen fördern. Den direkt migrierenden vornehmlich TH1 polarisierten Zellen folgen weitere, CD27 und Integrin αLβ2 exprimierende, zytotoxische T-Zellen aus der Blutbahn. Die direkt migrierenden Zellen könnten als Initiator und Potentiator der intestinalen T-Zell Infiltration wirken und müssen für zukünftige therapeutische Strategien nicht nur der Darm GvHD, sondern der intestinalen Inflammation im Allgemeinen mitberücksichtigt werden.
N2  - Acute graft-verus-host disease (GvHD), especially intestinal GvHD, remains one of the main causes of mortality and morbidity after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. In this process activated alloreactive donor T cells infiltrate the intestinal lamina propria via the bloodstream. Our group could recently show that besides the vascular migration route some donor T cells migrate directly from the Peyer’s patches into the adjacent lamina propria. To investigate factors that could promote such a direct migration, and to characterize these direct migrating T cells we applied a major mismatch mouse model to induce acute GvHD.
Using RNA sequencing and mass spectrometry of lasermicrodissected lamina propria samples, we detected a strong upregulation of the chemokines CXCL9, CXCL10, CXCL11, CCL3, CCL4 and CCL5 during acute intestinal GvHD. Alongside CCL4 and XCL1, several factors of T cell activation, such as CD3ζ, LAT, Lck und ZAP70, as well as factors of cytoskeletal reorganization, such as Dock2, Coro1α und Parvin-γ, showed higher expression near the Peyer’s patches. Subsequently, we validated the expression of Coro1α and Parvin-γ on donor T cells near the Peyer’s patches with histological immunofluorescence stainings. Flow cytometry analysis further revealed high expression of CCR5, CCR9 and Intgerin α4β7 on the predominantly Tbet+ donor T cells near the Peyer’s patches. Conclusively, in vitro migration assays showed that in vivo activated donor T cells can directly migrate towards CXCL11 and subsequently also towards CCL4. 
The present study shows the relevance of several chemokines for the sequential T-cell homing during acute intestinal GvHD. Besides the amoeboid migration mode, which is particularly driven by cytoskeletal reorganization, a mesenchymal movement using factors, such as CCR5, CCR9 and Integrin α4β7, can promote the direct migration of donor T cells. The directly migrating cells, which are predominantly of a TH1 phenotype, are followed by cytotoxic T cells, expressing CD27 and Integrin αLβ2 (LFA-1), from the systemic circulation. Thus, these directly migrating cells may act like an initiator and potentiator for the intestinal T cell infiltration and must be considered for new therapeutic strategies not only of GvHD but of intestinal inflammation in general
KW  - T-Lymphozyt
KW  - Graft-versus-host-disease
KW  - Zellmigration
KW  - Peyersche Plaques
KW  - T-Zellmigration
KW  - Transplantat-Wirt-Reaktion
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-292909
ER  - 
TY  - THES
A1  - Peña Mosca, María Josefina
T1  - Local regulation of T-cell immunity in the intestinal mucosa
T1  - Lokale Regulation der T-Zell-Immunität in der Darmschleimhaut
N2  - After priming in Peyer's patches (PPs) and mesenteric lymph nodes (mLN) T- cells infiltrate the intestine through lymphatic draining and homing through the bloodstream. However, we found that in mouse models of acute graft-versus-host disease (GvHD), a subset of alloreactive T-cells directly migrates from PPs to the adjacent intestinal lamina propria (LP), bypassing the normal lymphatic drainage and vascular trafficking routes. Notably, this direct migration occurred in irradiated and unirradiated GvHD models, indicating that irradiation is not a prerequisite for this observed behavior.

Next, we established a method termed serial intravascular staining (SIVS) in mouse models to systematically investigate the trafficking and migration of donor T- cells in the early stages of acute GvHD initiation. We found that the direct migration of T-cells from PPs to LP resulted in faster recruitment of cells after allogeneic hematopoietic cell transplantation (allo-HCT). These directly migrating T-cells were found to be in an activated and proliferative state, exhibiting a TH1/TH17-like phenotype and producing cytokines such as IFN-γ and TNF-α. Furthermore, we observed that the directly migrating alloreactive T-cells expressed specific integrins (α4+, αE+) and chemokine receptors (CxCR3+, CCR5+, and CCR9+). Surprisingly, blocking these integrins and chemokine-coupled receptors did not hinder the direct migration of T- cells from PPs to LP, suggesting the involvement of alternative mechanisms. Previous experiments ruled out the involvement of S1PR1 and topographical features of macrophages, leading us to hypothesize that mediators of cytoskeleton reorganization, such as Coro1a, Dock2, or Cdc42, may play a role in this unique migration process.

Additionally, we observed that directly migrating T-cells created a local inflammatory microenvironment, which attracts circulating T-cells. Histological analysis confirmed that alloreactive PPs-derived T-cells and bloodborne T-cells colocalized. We employed two experimental approaches, including either photoconversion of T-cells in PPs or direct transfer of activated T-cells into the vasculature, to demonstrate this colocalization. We hypothesize that cytokines released by migrating T-cells, such as IFN-γ and TNF-α, may play a role in recruiting T-cells from the vasculature, as inhibiting chemokine-coupled receptors did not impair recruitment.
N2  - Nach der Priming-Phase in den Peyer-Plaques (PPs) und mesenterialen Lymphknoten (mLN) migrieren T-Zellen über die lymphatische Drainage und den Blutkreislauf die Darmschleimhaut. Allerdings haben wir festgestellt, dass in Mausmodellen der akuten Graft-versus-Host Erkrankung (GvHD) eine Untergruppe alloreaktiver T-Zellen direkt von den Peyer-Plaques in das benachbarte intestinale Lamina propria (LP) migriert, ohne lymphatische Drainage- oder vaskuläre Transportwege zu nutzen. Bemerkenswert ist, dass diese direkte Migration sowohl in bestrahlten als auch in nicht bestrahlten GvHD-Modellen auftrat, was darauf hindeutet, dass Gewebeschaden durch ionisierende Strahlung keine Voraussetzung für dieses beobachtete T-Zell-Migrationsverhalten ist.

Anschließend haben wir die Methode der "serielle intravaskulären Zellmarkierung" (SIVS) für Mausmodelle etabliert, um systematisch das Migrationsverhalten von alloreaktiven Spender-T-Zellen in den frühen Stadien der akuten GvHD-Initiierung zu untersuchen. Wir beobachteten, dass die direkte Migration von T-Zellen von PPs zu LP zu einer schnelleren Rekrutierung von Zellen nach allogener hämatopoetischer Zelltransplantation (allo-HCT) führte. Diese direkt migrierenden T-Zellen befanden sich in einem aktivierten und proliferativen Zustand, wiesen einen TH1-/TH17- ähnlichen Phänotyp auf und produzierten Zytokine wie IFN- γ und TNF-α. Darüber hinaus beobachteten wir, dass die direkt migrierenden alloreaktiven T-Zellen spezifische Integrine (α4+, αE+) und Chemokinrezeptoren (CxCR3+, CCR5+ und CCR9+) exprimierten. Überraschenderweise verhinderte die Blockierung dieser Integrine und Chemokinrezeptoren nicht die direkte Migration von T-Zellen aus PPs in LP, was auf die Beteiligung alternativer T- Zellmigrationsmechanismen schließen lässt. Vorangegangene Experimente schlossen die Beteiligung von S1PR1 und topografischer Merkmale gewebeständiger Makrophagen aus, was uns zu der Hypothese führte, dass Mediatoren der Zytoskelett- Reorganisation wie Coro1a, Dock2 oder Cdc42 eine Rolle in diesem einzigartigen Migrationsprozess spielen könnten.

Zusätzlich beobachteten wir, dass direkt migrierende T-Zellen in der Darmschleimhaut ein lokales entzündliches Mikromilieu schaffen, welches zirkulierende T-Zellen anzieht. Die histologische Analyse bestätigte die Kolokalisation von direkt aus PP stammenden T-Zellen und T Zellen, welche über die Blutbahn in die Darmmukosa einwanderten. Um die direkte T-Zellmigration eindeutig zu bestätigen, wählten wir zwei experimentelle Ansätze: Die Photokonversion von T-Zellen in PPs während der Priming-Phase sowie den direkten Transfer aktivierter T-Zellen in das Gefäßsystem, um eine T-Zellkolokalisierung nachzuweisen. Aufbauend auf den Ergebnissen vermuten wir, dass Zytokine, die von migrierenden T-Zellen freigesetzt werden, wie zum Beispiel IFN-γ und TNF-α, möglicherweise eine Rolle bei der Rekrutierung von T-Zellen aus dem Gefäßsystem spielen, da die Hemmung von G- Protein-gekoppelter Rezeptoren (und somit aller Chemokinrezeptoren) die T-Zell- Rekrutierung nicht beeinträchtigte.
KW  - T-Lymphozyt
KW  - Transplantat-Wirt-Reaktion
KW  - Zellmigration
KW  - Darm
KW  - Peyer's patch
KW  - Graft versus Host disease
KW  - T-cell
KW  - Cell migration
KW  - Small intestine
KW  - Bone marrow transplantation
Y1  - 2024
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-352665
ER  -