TY - THES A1 - Lindner, Andreas T1 - Aktivierung und Zytotoxizität von gamma delta T-Lymphozyten gegenüber Tumorzellen hämatologischen Ursprungs - Untersuchungen in vitro T1 - Activation and cytotoxicity of gamma delta T lymphocytes against tumor cells of hematological origin N2 - Auf der Suche nach neuen Therapiemöglichkeiten für Tumorpatienten stellt die Immuntherapie mit gd T-Lymphozyten einen innovativen Ansatz dar. In vitro Zytotoxizität von Vg9Vd2 T-Lymphozyten wurde gegen eine Vielzahl von Tumorzellen belegt. Mit den Aminobisphosphonaten steht eine Reihe zugelassener und langjährig erprobter Medikamente zur Verfügung, die im Bereich therapeutisch verwendeter Dosierungen Vg9Vd2 T-Lymphozyten auch in vivo aktivieren können. Zudem ist Bromohydrin (BrHPP) als hochaffines synthetisches Phosphoantigen ein weiterer attraktiver Kandidat zur Aktivierung von gd T-Zellen und befindet sich am Menschen bereits in klinischen Studien. Strategien einer auf gd T-Zellen beruhenden Immuntherapie umfassen zum einen die in vitro Expansion von gd T-Lymphozyten mittels BrHPP oder Aminobisphosponaten mit anschließendem Transfer, dem so genannten adoptiven Zelltransfer auf den Patienten. Zum anderen kann die Anti-Tumoraktivität von Vg9Vd2 T-Lymphozyten auch direkt in vivo mittels Bisphosphonaten induziert werden, wie in einer Pilotstudie mit einem Anti-Lymphom- bzw. Anti-Myelom-Effekt bis hin zu einer klinischen partiellen Remission durch die Therapie mit einem Bisphosphonat (Pamidronat) und IL-2 eindrucksvoll gezeigt werden konnte. In der hier vorliegenden Arbeit wurde eine effektive Methode zur in vitro Proliferation von Vg9Vd2 T-Zellen mit Ausbildung ihrer Anti-Tumoraktivität durch BrHPP und durch das Bisphosphonat Zoledronat in Anwesenheit von IL-2 gezeigt. Weitergehend konnte mit Zytotoxizitätstestungen – basierend auf der Messung der Laktatdehydrogenase-Aktivität – die zytolytische Aktivität dieser expandierten gd T-Zellen gegenüber den primären Tumorzellen von insgesamt 8 Leukämie-Patienten, sowie je einem Patienten mit einem Lymphom und einem Plasmozytom nachgewiesen werden. Dadurch wurde einerseits das besondere Potential der gd T-Lymphozyten gegenüber hämatologischen Neoplasien unterstrichen, andererseits konnte ein Testverfahren gezeigt werden, mit dem das Spektrum empfindlicher Tumorzellen und Einflussgrößen untersucht werden können. In einem Experiment wurde dargestellt, wie die myelomonozytäre Zelllinie THP1 im Gegensatz zu ihrer sonst vorliegenden Anergie nach Vorbehandlung mit Zoledronat durch gd T-Zellen lysiert werden konnte. In einem autologen Versuchsansatz konnte die Anti-Tumoraktivität der gd T-Zellen eines Patienten mit der Diagnose eines follikuläres B-NHL durch Vorbehandlung der Lymphomzellen mit Zoledronat noch gesteigert werden. gd T-Zellen unterliegen als Teil des komplexen Immunsystems verschiedenen Regulationsmechanismen, die auch manipuliert werden können. In vitro Testverfahren – wie in dieser Arbeit – sind die Voraussetzung für eine Grundlagenforschung, mit deren Hilfe man in Zukunft zu einer hoffnungsvollen, auf gd T-Zellen basierenden Immuntherapie maligner Erkrankungen gelangen könnte. N2 - During the last few years, knowledge about the innate effector lymphocytes – such as natural killer (NK) cells, NK T cells and gd T cells – has advanced enormously, while immunotherapeutic strategies based on gd T cells have received increasingly more attention. The main subset of gd T cells in the human peripheral blood – the Vg9Vd2 T cells – possess a cytotoxic effector activity against a variety of tumor cells in vitro. Aminobisphosphonates – licensed and widely used antiresorptive drugs in malignant and nonmalignant bone disease – have been identified as potent synthetic stimulators of Vg9Vd2 T cells in vitro and in vivo. Furthermore, bromohydrin pyrophosphate (BrHPP) is another highly potent synthetic phosphoantigen for gd T cells. Two strategies for the potential use of gd T cells in tumor immunotherapy are presently being envisaged. On one hand, in vitro expansion of gd T cells by aminobisphosphonates (ABP) or BrHPP in the presence of IL-2 with a resultant cell transfer – the so-called adoptive transfer – to the patient, has shown promising results in animal models. On the other hand, there is the possibility of in vivo therapeutic administration of gd-stimulating synthetical phosphoantigens (ABP or BrHPP) in combination with low dose IL-2 in cancer therapy. In a pioneer pilot study, treatment with a second-generation ABP, Pamidronate, in combination with IL- 2 induced an objective antitumor activity in patients with low-grade non-Hodgkin lymphoma or multiple myeloma. The correlation of expansion of gd T cells in vivo with the clinical response (tumor stabilization or partial remission) demonstrated in this study the feasability of gd T-cell immunotherapy. Phase 1 clinical trials designed to evaluate BrHPP combined with low-dose IL-2 in patients with renal cell carcinoma and relapsed lymphoma are ongoing. In the presented medical thesis, peripheral Vg9Vd2 T cells were activated and expanded to large in vitro clones by stimulation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) with BrHPP in the presence of low-dose IL-2. After 12 to 16 days, cultures derived from patient’s PBMCs contained a percentage of gd T cells ranging between 75 % and 92 % (from an initial 4 % – 6 %) with an accompanying 2 to 4-fold increase in the absolute cell counts. Through this protocol, numerous gd T cells can be made available for in vitro experiments or for potential adoptive cell transfers. Furthermore, the capacity of expanded gd T cells from healthy donors to lyse primary tumor cells from patients were analysed with a cytotoxicity assay, based on the release of the enzyme lactate dehydrogenase (LDH). Our examinations displayed a strong cytotoxic effector activity of gd T cells against tumor cells from eight patients with acute myeloid and acute lymphocytic leukemia. The CD69 expression – as an early activation marker – of native gd T-cells induced through the tumor cells was not correlated to the antitumor effect of BrHPP-activated gd T cells against these tumor cells. This may be a consequence of distinct pathways – a TCR-dependent pathway and a natural killer-like pathway - for antitumor immunity. In an autologous experiment, gd T cells of a patient with a non-Hodgkin’s lymphoma showed cytotoxicity against the malignant cells. Additionally, the gd T-cells from this patient exhibited a markedly enhanced cytotoxicity against lymphoma cells pretreated with Zoledronate – currently the most potent third-generation ABP – as compared with untreated lymphoma cells. Further, we showed that the THP-1 tumorline (myelomonocytic leukemia) became susceptible to gd T cell-mediated cytotoxicity following pretreatment with Zoledronate, while normal THP-1 cells remained resistant. These observations outline the critical role of gd T cell population in immune surveillance, particularly against hematopoietic malignancies and the possibility to benefit from synthetical phosphoantigens for this immunotherapeutic approach. In vitro analysis – as demonstrated here – are the presupposition for evaluating future immunotherapeutic strategies with gd T lymphocytes. KW - gamma delta T-Zellen KW - Zytotoxizität KW - Tumor Immuntherapie KW - bromohydrin pyrophosphat KW - zoledronat KW - gamma delta T cells KW - lactate dehydrogenase cytotoxicity assay KW - cancer immunotherapy KW - bromohydrin pyrophosphate KW - zoledronate Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23447 ER - TY - THES A1 - Banaszek, Agnes T1 - Dual Antigen-Restricted Complementation of a Two-Part Trispecific Antibody for Targeted Immunotherapy of Blood Cancer T1 - Von zwei Antigenen abhängige Komplementierung eines zweiteiligen trispezifischen Antikörpers zur gezielten Immuntherapie von Blutkrebs N2 - Cancer cells frequently escape from immune surveillance by down-regulating two important components of the immune defence: antigen-presenting MHC and costimulatory molecules. Therefore several novel anti-tumour compounds that aim to assist the immune system in recognising and fighting cancer are currently under development. Recombinant bispecific antibodies represent one group of such novel therapeutics. They target two different antigens and recruit cytotoxic effector cells to tumour cells. For cancer immunotherapy, bispecific T cell-engaging antibodies are already well characterised. These antibodies target a tumour-associated antigen and CD3ε, the constant molecule of the T cell receptor complex. On the one hand, this study presents the development of a bispecific antibody targeting CD3ε and the rhabdomyosarcoma-associated fetal acetylcholine receptor. On the other hand, it describes a novel two-part trispecific antibody format for the treatment of leukaemia and other haematological malignancies in the context of haematopoietic stem cell transplantation (HSCT). For HSCT, an HLA-identical donor is preferred, but very rarely available. In an HLA-mismatched setting, the HLA disparity could be exploited for targeted cancer treatment. In the present study, a two-part trispecific HLA-A2 × CD45 × CD3 antibody was developed for potential cases in which the patient is HLA-A2-positive, but the donor is not. This holds true for about half the cases in Germany, since HLA-A2 is the most common HLA molecule found here. Combinatorial targeting of HLA-A2 and the leucocyte-common antigen CD45 allows for highly specific dual-antigen restricted tumour targeting. More precisely, two single-chain antibody constructs were developed: i) a single-chain variable fragment (scFv) specific for HLA-A2, and ii) a scFv against CD45, both linked to the VL and the VH domain of a CD3ε-specific antibody, respectively. It turned out that, after the concomitant binding of these constructs to the same HLA-A2- and CD45-expressing cell, the unpaired variable domains of a CD3ε-specific antibody assembled to a functional scFv. In a therapeutic situation, this assembly should exclusively occur on the recipient’s blood cancer cells, leading to T cell-mediated cancer cell destruction. In this way, a relapse of disease might be prevented, and standard therapy (radiation and chemotherapy) might be omitted. For both approaches, the antibody constructs were periplasmically expressed in E. coli, purified via His tag, and biochemically characterised. Their binding to the respective targets was proven by flow cytometry. The stimulatory properties of the antibodies were assayed by measuring IL-2 release after incubation with T cells and antigen-expressing target cells. Both the bispecific antibody against rhabdomyosarcoma and the assembled trispecific antibody against blood cancer mediated T-cell activation in a concentration-dependent manner at nanomolar concentrations. For the trispecific antibody, this effect indeed proved to be dual antigen-restricted, as it could be blocked by prior incubation of either HLA-A2- or CD45-specific scFv and did not occur on single-positive (CD45+) or double-negative (HLA-A2- CD45-) target cells. Furthermore, antibodies from both approaches recruited T cells for tumour cell destruction in vitro. N2 - Krebszellen entgehen der Immunüberwachung oftmals dadurch, dass sie zwei wichtige Komponenten der Immunabwehr, nämlich antigenpräsentierende MHC- und kostimulatorische Moleküle, herunter regeln. Zurzeit befindet sich daher eine Reihe neuartiger Anti-Krebs-Substanzen in der Entwicklung, die darauf abzielen, das Immunsystem beim Erkennen und Bekämpfen von Krebs zu unterstützen. Rekombinante bispezifische Antikörper stellen eine Gruppe solch neuartiger Therapeutika dar. Sie erkennen zwei unterschiedliche Antigene und rekrutieren gezielt zytotoxische Effektorzellen zu Tumorzellen. Zur Krebsimmuntherapie sind BiTE-Antikörper (bispecific T cell engager) bereits gut untersucht. Diese Antikörper sind gegen ein tumorassoziiertes Antigen sowie gegen CD3ε, das konstante Molekül des T Zell-Rezeptor-Komplexes, gerichtet. Diese Arbeit beschreibt zum einen die Entwicklung eines bispezifischen Antikörpers, der CD3ε und den mit Rhabdomyosarkom assoziierten fetalen Acetylcholinrezeptor erkennt. Zum anderen präsentiert sie ein neues, zweiteiliges trispezifisches Antikörperformat, das zur Behandlung von Leukämie und anderen bösartigen Erkrankungen des blutbildenden Systems im Zusammenhang mit hämatopoetischer Stammzelltransplantation (HSZT) genutzt werden könnte. Für eine HSZT wird ein HLA-identischer Spender bevorzugt. Dieser steht jedoch nur sehr selten zur Verfügung. In Fällen mit nur einer Unstimmigkeit in den HLA-Merkmalen zwischen Patient und Spender könnte diese HLA-Unstimmigkeit nun zur gezielten Krebsbehandlung ausgenutzt werden. In dieser Arbeit wurde ein trispezifisches HLA-A2 × CD45 × CD3 Antikörperkonstrukt speziell für solche Fälle entwickelt, in denen der Patient HLA-A2-positiv ist, der Spender jedoch nicht. Dies trifft in Deutschland auf ungefähr die Hälfte aller Fälle zu, da HLA-A2 hier als häufigstes HLA-Molekül vorkommt. Mit der Kombination aus HLA-A2 und dem Pan-Leukozytenmarker CD45 (leucocyte-common antigen) als Ziel, wird eine hochspezifische, von zwei Antigenen abhängige, zielgerichtete Tumoransteuerung (tumour targeting) möglich. Genauer gesagt wurden zwei Einzelketten-Antikörperkonstrukte entwickelt: i) ein HLA A2-spezifisches single-chain variable fragment (scFv) und ii) ein CD45-spezifisches scFv, jeweils verbunden mit der VL- bzw. der VH-Domäne eines CD3ε-spezifischen Antikörpers. Es stellte sich heraus, dass nach gleichzeitiger Bindung der beiden Konstrukte an dieselbe HLA-A2- und CD45-exprimierende Zelle sich die beiden einzelnen, ungepaarten variablen Domänen eines CD3ε-spezifischen Antikörpers zu einem funktionellen scFv zusammenfügen. Dieses Zusammenfügen sollte in einer therapeutischen Situation ausschließlich auf den Blutkrebszellen des Empfängers geschehen, was zur T-Zell-vermittelten Zerstörung der Krebszellen führen würde. Auf diese Weise könnte ein Rückfall der Erkrankung vermieden und eventuell sogar auf die Standardtherapie (Bestrahlung und Chemotherapie) verzichtet werden. Für die beiden beschriebenen Ansätze wurden die Antikörperkonstrukte periplasmatisch in E. coli exprimiert, über einen His-Tag aufgereinigt und biochemisch charakterisiert. Ihre Bindung an die jeweiligen Zielantigene wurde mittels Durchflusszytometrie nachgewiesen. Die stimulatorischen Eigenschaften der Antikörper wurden durch eine Messung der IL-2-Freisetzung nach Inkubation zusammen mit T-Zellen und antigenexprimierenden Zielzellen untersucht. Sowohl der gegen Rhabdomyosarkom gerichtete BiTE-Antikörper, als auch der zusammengefügte trispezifische Antikörper gegen Blutkrebs vermittelten konzentrationsabhängig eine T Zellaktivierung bei nanomolaren Konzentrationen. Für den trispezifischen Antikörper erwies sich dieser Effekt tatsächlich als abhängig von zwei Antigenen, da er durch eine vorausgehende Inkubation mit entweder einem HLA-A2- oder einem CD45-spezifischen scFv-Fragment geblockt werden konnte und nicht auf Zellen auftrat, die nur ein Antigen (CD45+) oder keins von beiden (HLA-A2- CD45-) tragen. Darüber hinaus rekrutierten die Antikörper beider Ansätze T-Zellen zur Zerstörung von Tumorzellen in vitro. KW - Immuntherapie KW - Antikörper KW - Cytotoxischer Antikörper KW - Leukämie KW - Rhabdomyosarkom KW - bispecific antibodies KW - antibody engineering KW - cancer immunotherapy KW - rekombinante Antikörper KW - bispezifische antikörper Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-90174 ER - TY - JOUR A1 - Rydzek, Julian A1 - Nerreter, Thomas A1 - Peng, Haiyong A1 - Jutz, Sabrina A1 - Leitner, Judith A1 - Steinberger, Peter A1 - Einsele, Hermann A1 - Rader, Christoph A1 - Hudecek, Michael T1 - Chimeric Antigen Receptor Library Screening Using a Novel NF-kappa B/NFAT Reporter Cell Platform JF - Molecular Therapy N2 - Chimeric antigen receptor (CAR)-T cell immunotherapy is under intense preclinical and clinical investigation, and it involves a rapidly increasing portfolio of novel target antigens and CAR designs. We established a platform that enables rapid and high-throughput CAR-screening campaigns with reporter cells derived from the T cell lymphoma line Jurkat. Reporter cells were equipped with nuclear factor kappa B (NF kappa B) and nuclear factor of activated T cells (NFAT) reporter genes that generate a duplex output of enhanced CFP (ECFP) and EGFP, respectively. As a proof of concept, we modified reporter cells with CD19-specific and ROR1-specific CARs, and we detected high-level reporter signals that allowed distinguishing functional from non-functional CAR constructs. The reporter data were highly reproducible, and the time required for completing each testing campaign was substantially shorter with reporter cells (6 days) compared to primary CAR-T cells (21 days). We challenged the reporter platform to a large-scale screening campaign on a ROR1-CAR library, and we showed that reporter cells retrieved a functional CAR variant that was present with a frequency of only 6 in 1.05 x 10(6). The data illustrate the potential to implement this reporter platform into the preclinical development path of novel CAR-T cell products and to inform and accelerate the selection of lead CAR candidates for clinical translation. KW - NF-κB/NFAT reporter cells KW - chimeric antigen receptor KW - library screening KW - cancer immunotherapy KW - ROR1 Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-227193 VL - 27 IS - 2 ER - TY - JOUR A1 - Luu, Maik A1 - Schütz, Burkhard A1 - Lauth, Matthias A1 - Visekruna, Alexander T1 - The impact of gut microbiota-derived metabolites on the tumor immune microenvironment JF - Cancers N2 - Prevention of the effectiveness of anti-tumor immune responses is one of the canonical cancer hallmarks. The competition for crucial nutrients within the tumor microenvironment (TME) between cancer cells and immune cells creates a complex interplay characterized by metabolic deprivation. Extensive efforts have recently been made to understand better the dynamic interactions between cancer cells and surrounding immune cells. Paradoxically, both cancer cells and activated T cells are metabolically dependent on glycolysis, even in the presence of oxygen, a metabolic process known as the Warburg effect. The intestinal microbial community delivers various types of small molecules that can potentially augment the functional capabilities of the host immune system. Currently, several studies are trying to explore the complex functional relationship between the metabolites secreted by the human microbiome and anti-tumor immunity. Recently, it has been shown that a diverse array of commensal bacteria synthetizes bioactive molecules that enhance the efficacy of cancer immunotherapy, including immune checkpoint inhibitor (ICI) treatment and adoptive cell therapy with chimeric antigen receptor (CAR) T cells. In this review, we highlight the importance of commensal bacteria, particularly of the gut microbiota-derived metabolites that are capable of shaping metabolic, transcriptional and epigenetic processes within the TME in a therapeutically meaningful way. KW - tumor microenvironment (TME) KW - commensal bacteria KW - intratumoral microbiota KW - oncobiome KW - microbiota-derived metabolites KW - cancer immunotherapy Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-311005 SN - 2072-6694 VL - 15 IS - 5 ER -